DE69002033T2

DE69002033T2 - Gelfiltration von wärmebehandeltem Faktor VIII.

Info

Publication number: DE69002033T2
Application number: DE90108993T
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Bockskopf; William Brockway; Christian Dr Goelker; Richard L Seng
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1989-05-24
Filing date: 1990-05-12
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2010-05-13
Also published as: AU635535B2; CA2017039A1; CA2017039C; AU5586890A; EP0399321A3; ATE90875T1; ES2042138T3; JPH0347199A; JP2931630B2; DK0399321T3; EP0399321B1; DE69002033D1; EP0399321A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung des Antihämophiliefaktors (AHF) aus menschlichem Plasma. Von AHF ist nunmehr bekannt, daß es aus verschiedenen Komponenten besteht, wobei diejenige Komponente, die bei der Behandlung von Hamophilie A wirksam ist, Faktor VIII:C ist.
Es gibt zahlreiche Patente und Veröffentlichungen die die Herstellung von AHF-Konzentraten als Teil der Fraktionierung von menschlichem Plasma betreffen. Diese Verfahren werden seit ca. 20 Jahren kommerziell genutzt, und es sind verschiedene Verfahrensvariationen beschrieben worden, von denen die überwiegende Mehrheit auf die diesen Verfahren innewohnenden Probleme gerichtet ist, nämlich Virus-Sicherheit, Ausbeute und spezifische Aktivität des sich ergebenden Konzentrats. Die spezifische Aktivität betrifft die Koagulationswirksamkeit des Faktors VIII, ausgedrückt in internationalen Einheiten, gemäß einem allgemein akzeptierten Standard, pro mg Gesamtprotein.
Obwohl Gelfiltration oder Chromatographie, ausgenommen eine Affinitätschromatographie, wie beschrieben von Zimmerman et al., Re. 32,011 (US 4,361,509), gemäß Wissen der Erfinder, gegenwärtig kommerziell nicht genutzt werden, sind verschiedene Chromatographieverfahren beschrieben worden. In diesem Zusammenhang ist es wichtig festzustellen, daß alle Affinitätschromatographie- oder rDNA-Verfahren zu einem AHF führen, der nachweisbare Mengen an nicht-menschlichem Protein aufweist.
Beispielsweise wird in der PCT-Anmeldung WO 86/04486 ein Verfahren zur Reinigung von AHF durch "Hydratationsadditive" beschrieben, d. h. unter Anwendung einer Säulenchromatographie in Gegenwart von Zuckern, Polyolen, Aminosäuren oder Salzen. Es wird die niedrige Ausbeute der Chromatographieverfahren des Standes der Technik beschrieben. Die Hydratationsadditive dienen der Stabilisierung des AHF. Kryopräzipitat wird in einem Puffer gelöst, Aluminiumhydroxid kann zugefügt werden, und der überstand wird gesammelt. Es wird eine PEG-Fällungsstufe durchgeführt. Danach werden eine oder zwei Säulenchromatographiestufen ausgeführt, und zwar unter Verwendung von Harzen wie QAE-Sephadex A-25, QAE-Sepharose 4B oder Aminohexyl (A-H) Sepharose. Die erste Chromatographiestufe beruht auf Anionaustausch, die zweite auf hydrophober Affinität.
Andersson, EP 197901, offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von AHF unter Anwendung einer Immunoaffinitätschromatographie und anschließender HPLC an einem Anionaustauschadsorbens. Das Anionaustauschadsorbens kann Mono Q Gel oder TSK DEAE 5 PW Gel sein. Die Fragmente werden danach durch Inkubation mit Thrombin erhalten.
Johnson, US 4,397,841, offenbart ein Herstellungsverfahren von Faktor VIII:C durch Fraktionierung von Plasma mit einer Abfolge von Adsorptionsstufen, wobei Polyelektrolyt-Copolymere in der Gegenwart von Heparin eingesetzt werden. Ein geeignetes Harz ist ein Copolymer von Ethylen und Maleinsäureanhydrid.
Chavin et al., US 4,495,175, offenbaren die Herstellung von hoch-gereinigtem AHF aus AHF-Konzentrat. Das Konzentrat wird einer Trennung auf der Basis des Stokes' Radius unterzogen, die beispielsweise mittels Gelpermeationschromatographie an vernetzter Agarose (wie Biogel A-15M oder Sepharose EL-4B) durchgeführt werden kann. Der Pool wird dann durch Ausfällung oder Diafiltration aufkonzentriert; Calcium- oder Magnesiumkationen werden zur Herabsetzung des Stokes' Radius zugefügt und es wird erneut eine Trennung auf der Basis des Stokes' Radius durchgeführt.
Verschiedene weitere Stufen, wie sie u. a. auch in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen können, sind im Stand der Technik offenbart worden. Allerdings werden durch die vorliegende Erfindung, wie nachfolgend beschrieben wird, neue und unerwartete Ergebnisse und Abänderungen umfaßt.
Liu et al., US 4,170,639, offenbaren z. B. ein Verfahren zur Herstellung von AHF, wobei man erneut aufgelöstes Kryopräzipitat an Aluminiumhydroxid bei einem sauren pH und 4ºC adsorbiert, filtriert, und gegebenenfalls, ultrafiltriert.
Rasmussen et al., US 4,650,858, offenbaren ein Verfahren zur Herstellung von AHF, wobei man eine Fällungsstufe mit 4 % PEG bei 18 - 22ºC zur Entfernung von Fibrinogen anwendet. Darauf folgt eine zweite PEG-Fällungsstufe bei 18 - 22ºC mit 12 % PEG in der Gegenwart einer Aminosaure wie 2M Glycin, um den AHF auszufällen.
Shanbrom, US 4,069,216, diskutiert eine PEG-Fällung, wie im Stand der Technik offenbart, z. B. in seiner US 3,631,018, wobei die Fällung bei Raumtemperatur eine anschließende Waschstufe und/oder eine Glycin- oder Alkohol-Fällungsstufe erforderlich macht, da das PEG in hohen Konzentrationen (10 bis 12 %) eingesetzt wird. Eine Fällung im Kalten unter Anwendung niedrigerer Konzentrationen an PEG (2,5 %) ergab ein weniger gereinigtes Produkt.
Liautaud et al., US 4,387,092, offenbaren eine Verbesserung der US 4,069,216 von Shanbrom, und zwar insofern, als die Fibrinogen-Fällungsstufe unterhalb 15ºC mit weniger als 4 % Polyol durchgeführt wird.
Polson, US 3,415,804, offenbart eine Plasmafraktionierung mit PEG bei Raumtemperatur, bei ca. 20ºC. Bei 0 bis 4 % PEG fiel Fibrinogen aus, gamma-Globulin fielen bei 4 bis 8 %, beta-Globulin bei 8 bis 12 % und alpha-1- und alpha-2-Globuline und Albumine beim mehr als 12 % PEG aus.
Schließlich gibt es einen relevanten Stand der Technik bezüglich der Virusinaktivierung von AHF-Konzentraten.
Neurath et al., US 4,540,573, offenbaren die virale Inaktivierung von Faktor VIII-Präpraten durch die Verwendung von Tri(n-butyl)phosphat (TNBP). Dort wird vorgeschlagen, daß TNBP dem Plasmapool zugefügt und AHF durch eine Fällungsstufe vom TNBP abgetrennt werden können, wie mit Glycin. In den Beispielen wird TNBP AHF-Lösungen zugefügt, die 8 bis 10 E/ml F.VIII-Aktivität aufweisen.
Andersson et al., US 4,168,300, offenbaren ein Verfahren zur Entfernung des Hepatitis-Virus aus Plasma, indem man das HBsAg oder Au-Antigen an einem geperlten Agarose-Gel oder einem Copolymer-Gel adsorbiert, welche eine daran gekuppelten hydrophoben Liganden aufweisen.
Lembach, US 4,534,792, offenbart die Verwendung von Kupfer-Phenanthrolin zur viralen Inaktivierung von AHF-Präparaten. Die Substanz wird nach der Fraktionierung zugefügt und kann durch Diafiltration entfernt werden.
Hohe Ausbeuten an antihämophilem Faktor (AHF) können erzielt werden, indem man mildere Verfahrensstufen in Kombination mit einer Wärmebehandlung zur viralen Inaktivierung und mit einer Gelfiltration zur Anwendung gelangen läßt, um hoch-gereinigten AHF bereitzustellen, der im wesentlichen frei von infektiösen Mitteln ist, und zwar ohne einen wesentlichen Verlust an therapeutischer oder immunologischer Aktivität.
In einer besonderen Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung wird Kryopräzipitat durch Zentrifugation aus aufgetauten Pools von frisch gefrorenem menschlichen Plasma gewonnen. Fremde nicht-AHF-Proteine werden entfernt durch saure Fällung und Adsorption mit Al(OH)&sub3; und PEG-Fällung, unter Bedingungen, unter denen eine hohe Ausfällung von nicht-AHF-Proteinen erzeugt wird. Als Ergebnis wird eine Kühlstufe nicht benötigt. Der AHF wird dann mit Glycin und Natriumchlorid ausgefällt. Das solubilisierte AHF-Konzentrat wird dann behandelt, um zusätzliche Verunreinigungen zu entfernen, es wird zur viralen Inaktivierung wärmebehandelt und dann gelfiltriert. Das bevorzugte Gel weist eine Schnittgrenze bei 5 Millionen Dalton und 200 bis 400 Mesh auf.
Der AHF wird dann nach Sterilfiltration in Gegenwart von Albumin lyophilisiert.
Fig. 1 zeigt graphisch die Wirkung von Wärme auf die F.VIII-Aktivität in der Gegenwart verschiedener Mengen an Sucrose in den Präparaten der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Kryopräzipitat (Kryo) aus einem normalen Plasmapool von plasmapherierten Spendern wurde gelbst durch Zugabe von 3 kg WFI/kg Kryo (WFI = Wasser für (zur) Injektion). Das WFI kann bis zu 60 E/ml an Natriumheparin enthalten, bevor das Kryo zugefügt wird. 30,2 kg Kryo wurden zu 90,5 kg WFI bei einer Temperatur von 27ºC gegeben und zur Auflösung des Kryo vermischt. Der Temperaturbereich des WFI beträgt vorzugsweise 17 bis 37ºC, am meisten bevorzugt 24 bis 30ºC. Obwohl ein Verhältnis von 1 Teil Kryo/3 Teile WFI im Beispiel angewandt wird, kann auch 1 Teil Kryo/4 Teile WFI angewandt werden, um dieselben Ergebnisse zu erhalten.
Die Kryo/WFI-Mischung wurde 30 Minuten lang bis zur Auflösung gerührt. Die sich ergebende Temperatur betrug 21ºC, wobei ein bevorzugter Bereich 18 bis 25ºC beträgt. Das A&sub2;&sub8;&sub0; betrug 41,2, wobei ein bevorzugter Bereich 38 bis 44 und der pH 7,75, vorzugsweise 7,6 bis 8,0, betragen.
Der pH der gelösten Kryo/WFI-Lösung wurde auf 7,0 eingestellt, wobei der bevorzugte Bereich 6,0 bis 8,0, am meisten bevorzugt 6,8 bis 7,2 betragen, wobei 270 ml 1N Essigsäure zugetropft und die Suspension 15 Minuten lang gerührt wurden. Die Durchschnittsausbeute betrug 116 %, bei einem Ausbeutebereich von 110 bis 127 %. Der offensichtliche Ausbeuteanstieg tritt auf wegen der Entfernung von Fibrinogen und weiterer Komponenten, welche in den AHF-Assay eingreifen. Die vorgenannten Stufen können bei Raumtemperatur ausgeführt werden, wobei eine Kühlstufe und eine zusätzliche Ausfällungsstufe sowie auch eine Proteindenaturierung vermieden werden.
Zur Durchführung der Adsorptionsstufe wurden 4826 ml Aluminiumhydroxid (Al(OH)&sub3;)-Gel zur sauren Kryo-Suspension gegeben und 10 Minuten lang gerührt, um die Vitamin K-abhängigen Faktoren zur binden. Die Menge an Al(OH)&sub3;-Gel stellt 160 ml Al(OH)&sub3;-Gel pro kg Ausgangs-Kryo dar, wobei ein bevorzugter Bereich 100 bis 250 ml Al(OH)&sub3;-Gel pro kg Kryo ausmacht. Die Durchschnittsausbeute bei dieser Stufe beträgt 94 %, mit einem Ausbeutebereich von 90 bis 100 %.
Zur Durchführung der Polyethylenglykol (PEG)-Fällungsstufe wurden 3,6 kg PEG 3350 (3 % PEG) zur Al(OH)&sub3;-saures Kryo-Suspension gegeben und der pH mit 16 ml 1 M Essigäsure auf 7,06 eingestellt. Der pH-Bereich beträgt 6,0 bis 8,0, bevorzugter 6,8 bis 7,3. Die Konzentration an PEG kann in einem Bereich von 2,5 bis 5 % liegen. Die Suspension wurde 23 Minuten lang vor der Zentrifugation gerührt. Die Temperatur der Suspension betrug 21,5ºC, vorzugsweise nicht weniger als 10ºC.
Die Suspension wurde unter Verwendung einer Westphalia BKA-6 Zentrifuge bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4 l/min zentrifugiert, wobei der bevorzugte Bereich 2 bis 6 l/min beträgt. Die Effluens-Temperatur wurde bei 20ºC gehalten, wobei der bevorzugte Bereich 18 bis 25ºC bei der Influens-Temperatur von 21,5ºC beträgt, wobei wiederum dieser bevorzugte Bereich 20 bis 25ºC beträgt.
Das sich ergebende Präzipitat wurde eingeholt, gewogen und abgelegt. Die 10,7 kg Präzipitat stellten 35,4 % des Ausgangs-Kryo dar, wobei das durchschnittliche Präzipitat 32,4 % betrug, mit einem Bereich von 29,0 bis 36,3 %.
Das PEG-Effluens wog 116,6 kg, wies ein A&sub2;&sub8;&sub0; von 10,4, pH 7,26 bei einer Temperatur von 20ºC, auf. Der Temperaturbereich beträgt vorzugsweise 20 bis 23ºC, und es kann, falls notwendig, eine Erwärmungsstufe für ein PEG-Effluens mit einer Temperatur unterhalb 20ºC angefügt werden. Die Durchschnittsausbeute an durch die PEG-Stufe gewonnenem AHF betrug 78 %, mit einem Bereich von 74,3 bis 86,1 %.
Ein wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß die Kühlstufe, die herkömmlicherweise bei der PEG-Fällungsstufe angewandt wird, wegfällt. Dies stellt insofern einen Vorteil dar, als eine Kühlstufe zur Ausfällung von Fibrinogen, Fibronektin usw. führt, wobei aber auch AHF ausfällt, was die Ausbeute herabsetzt.
Die sich am Ende ergebende AHF-Paste, die erhalten wird, stellt ein sehr gut zu verarbeitendes Pastengewicht dar, wobei Verluste an AHF oder ein hohes Volumen an Säulengel vermieden werden. Ein zu niedriges Pastengewicht führt zu einem Verlust an AHF, ein zu hohes Pastengewicht macht ein großes Volumen an Säulengel für die Gelfiltrationsstufe erforderlich.
Zum PEG-Effluens wurden 15,2 kg festes L-Glycin (oder 13 % Glycin) gegeben, wobei der pH bei 7,0, vorzugsweise 6,0 bis 8,0, durch die Zugabe von 200 ml 1 M Natriumhydroxid gehalten wurde. Durch die Zugabe von Glycin wurde die Temperatur des PEG-Effluens auf ca. 15ºC herabgesetzt. Die Lösung wurde auf 20ºC erwärmt, wobei der bevorzugte Bereich 20 bis 23ºC beträgt. Die Lösung wurde 20 Minuten lang bis zur Auflösung gerührt.
Zur Glycin-PEG-Effluenslösung wurden 16,3 kg festes NaCl (oder 14 % NaCl) gegeben, wobei man den pH bei 7,0, vorzugsweise 6,0 bis 8,0, mit 200 ml 1 M NaOH hielt. Die Endtemperatur wurde auf 20ºC eingestellt, mit einem bevorzugten Bereich von 20 bis 23ºC. Der endgültige pH betrug 7,03, mit einem bevorzugten Bereich von 6,9 bis 7,2. Die Lösung wurde 25 Minuten lang bis zur Auflösung gerührt.
Das Glycin-NaCl-PEG-Effluens wurde zentrifugiert, um die AHF-Paste bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2,0 l/min abzutrennen. Die Einlaßtemperatur betrug 20ºC, mit einem bevorzugten Bereich von 20 bis 23ºC.
Die Effluens-Temperatur wurde bei 21 bis 22ºC gehalten, mit einem bevorzugten Bereich von 18 bis 25ºC. Das A&sub2;&sub8;&sub0; des Effluens wurde mit 9,1 gemessen, und das Effluens wurde abgelegt.
Die eingeholte AHF-Paste wog 1,03 kg. Sie wurde in einem Puffer gelost, enthaltend 0,02 M L-Histidin, 0,10 M Ammoniumformiat, 1,5 % Mannit, 0,001 M CaCl&sub2; bei einem pH von 7,0, dessen bevorzugter Bereich 6,9 bis 7,1 beträgt. Der Puffer kann jeweils nicht mehr als 0,2 M Ammoniumformiat, 0,06 M L-Histidin, 0,003 M CaCl&sub2; und 3 % Mannit enthalten. Der Puffer sollte eine Proteinveränderung minimieren, d. h. eine nicht-spezifische Bindung von Kupfer-Phenanthrolin. Es können alternative Puffer verwendet werden, z. B.: Wasser für Injektion (WFI); 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,2; 0,05 M Imidazol, pH 7,0; oder 0,05 M Tris-HCl/0,15 M NaCl, pH 7,0, oder 0,02 M L-Histidin, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,2.
Das sich ergebende geloste AHF-Konzentrat wies ein A&sub2;&sub8;&sub0; von 33,2, ein Gewicht von 3,84 kg und eine Potenz von 432 E/ml auf. In früheren Durchläufen betrug die durchschnittliche Potenz 232 E/ml, mit einem Bereich von 130 bis 287,5 E/ml. Wegen dieser viel hoberen als der normalen Potenz, verglichen mit bisherigen PEG-Fällungsverfahren, werden die chemische Behandlung zur viralen Inaktivierung und die Gelfiltrationsstufen ohne die Notwendigkeit einer weiteren Konzentrationsstufe, durchgeführt, wie dies bisher erforderlich war, etwa durch eine Ultrafiltration. Die Gewinnung von Einheiten von AHF, verglichen mit dem gelösten Kryo, betrug 63,2 %, im Durchschnitt 67,3 %, mit einem Bereich von 56,7 bis 71,8 %. Bei früheren Durchläufen betrug die Ausbeute an AHF aus dem PEG-Effluens, bezogen auf gelöstes AHF-Konzentrat, im Durchschnitt 78,3 %, mit einem Bereich der Gewinnungsmenge von 68,3 bis 90,0 %.
Der solubilisierte AHF kann bei -20ºC oder kälter tiefgefroren und bei -70ºC aufbewahrt oder sofort verarbeitet werden.
Das tiefgefrorene (-70ºC) AHF-Konzentrat wurde in einem Wasserbad von 27ºC über annähernd 4 Sunden aufgetaut, bis die Temperatur des aufgetauten AHF-Konzentrats 25,2ºC betrug.
Wichtig ist es, in diesem Zusammenhang festzuhalten, daß alle Stufen bis zur gegebenenfalls durchzuführenden Gefrierstufe bei Raumtemperatur ausgeführt wurden.
Ein 40-fach aufkonzentrierter Kupfer-Phenanthrolin(CuPH)-Puffer wurde hergestellt, indem man 10 ml 0,1 M Histidin, 8 ml 0,01 M Kupfersulfat-Pentahydrat und 8 ml 0,5 M 1,10-Phenanthrolin vermischte. Das Endvolumen wurde auf 200 ml mit WFI eingestellt. Ein Volumen von 87,5 ml des CuPH-Puffers wurde zu 3500 ml des AHF-Konzentrats in einem in einen Autoklav eingeschlossenen Reaktionsgefäß gegeben. Das eingeschlossene CuPH-Reaktionsgefäß war so konstruiert, daß es von Ende zu Ende rotieren konnte, um alle inneren Oberflächen zu benetzen. Eine Besauerstoffung erfolgte durch Diffusion durch eine ca. 8 m (25 Fuß) lange silastische Leitung (medizinische Reinheit), die um eine Halterung innerhalb des Reaktionsgefäßes gewickelt war. Während der Reaktion wurde Sauerstoff medizinischer Reinheit mit ca. 17,5 kPa (2,5 psi) in das Reaktionsgefäß geleitet, das mit einer Geschwindigkeit von 3 Upm rotierte.
Die CuPH-Reaktion wurde durch die Zugabe von 35 ml 0,2 M L-Cystein-Hydrochlorid-Monohydrat gestartet, wie beschrieben in der oben zitierten US 4,534,972. Wie in dieser Patentschrift beschrieben, wurde eine zweite Zugabe von 17,5 ml 0,2 M L-Cystein-Hydrochlorid injiziert, nachdem die erste Zugabe erschöpft war. Es erfolgte ebenfalls eine Besauerstoffung.
Vor Entleerung und Spülen des Reaktionsgefäßes wurde das Reaktionsgefäß in einen virusfreien Raum übertragen, und das Äußere des Reaktionsgefäßes wurde init Natriumhypochlorit desinfiziert. Die CuPH-Reaktionsmischung wurde auf nicht mehr als 37ºC erwärmt und vorfiltriert. Die Vorfiltrierstufe ist nicht erforderlich, sie wird jedoch angewandt, um die Lebensdauer der Gelfiltrationssäule zu bewahren. Der vorfiltrierte AHF wurde auf eine 4 x 16 l Pharmacia Schichtsäule, befüllt mit Bio-Gel A-5M (100 bis 200 Mesh), mit 8,4 l/h gepumpt, wobei der Beladungsmengenbereich 6 bis 12 l/h betrug.
Vier Pharmacia KS 370/15 Schichtabschnitte wurden in Reihe verbunden und von unten nach oben unter Verwendung einer Master Flor-Pumpe durchlaufen.
Der aus dem CuPH-Reaktionsgefäß gewonnene AHF betrug 90 % des AHF im AHF-Konzentrat, mit einem Durchschnittswert von 88,3 %, mit einem Bereich von 80,7 bis 93,5 %. In offenen CuPH-Reaktionsgefäßen, wie in gerührten Bechern, wurde eine durchschnittliche Gewinnungsmenge von 93,7 % mit einem Bereich von 88 bis 98,7 % erhalten. Dies sind sehr hohe Ausbeuten, verglichen mit herkömmlicheren Naßwärme-Virusinaktivierungsstufen, wo annähernd 25 % Verlust an AHF-Aktivität durch Pasteurisierung, Diafiltration und Ultrafiltration nachgewiesen werden. Ferner minimieren die milden Verarbeitungsstufen ebenfalls die Wahrscheinlichkeit schädlicher Auswirkungen auf Proteine.
Die Schichtsäule wurde mit einem Puffer äguilibriert, enthaltend 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,16 bei 22ºC. Die Bereiche für den Puffer betragen nicht mehr als 0,2 M NaCl, nicht mehr als 0,003 M CaCl&sub2;, pH 6,8 bis 7,8, bei einer Temperatur von 16 - 26ºC. Nachdem die Gesamtheit der 3,9 kg des CuPH-behandelten AHF auf die Säule gepumpt war, wurde derselbe Puffer wie zur Äquilibrierung der Säule als Elutionspuffer verwendet. Der Elutionspuffer wurde in die Säule mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 9,0 l/h gepumpt, wobei der Bereich 6 bis 12 l/h betrug. Es können alternative Puffer eingesetzt werden, z. B. 0,05 M Trizma Base, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,4, oder 0,02 M L-Histidin, 0,15 M NaCl, 0,001 M CaCl&sub2;, pH 7,2. Da der Elutionspuffer im Endbehältnis vorhanden ist, sollten er nicht nicht-toxisch und die Ionenstärke nicht so hoch sein, daß sie den AHF vom Willebrand-Faktor dissoziiert.
Der vorfiltrierte CuPH-behandelte AHF, 3,9 kg, wurde unter Verwendung einer 64 l Bio-Rad's Biogel A5M (100 bis 200 Mesh) Säule, ins Gleichgewicht gesetzt mit dem oben beschriebenen Elutionspuffer, unter Ausnutzung von 6,1 % des Gelvolumens gelfiltriert, wobei der bevorzugte Bereich 5 bis 8,0 % des Gelvolumens für eine effiziente Trennung und Ausbeute betrug. Mehr Gelvolumen würde zu einer geringeren Potenz im AHF-Pool führen, ein geringeres Gelvolumen würde die Ausbeute erniedrigen. Die Zeit zwischen der Aufbringung des AHF auf die Säule bis zum Beginn des Sammelns des AHF-Pools betrug 2,35 h. Das Sammeln von AHF-Pool wurde begonnen, als der UV-Monitor anzeigte, daß A&sub2;&sub8;&sub0; eluierte. Das Leervolumen (Vo) betrug 20,03 kg.
Der AHF-Pool wurde gesammelt, bis direktes A&sub2;&sub8;&sub0; spektrophotometrisches Ablesen anzeigte, daß ein A&sub2;&sub8;&sub0; von 2,0 erhalten wurde. Es wurde ein Gewicht von 14,8 kg an AHF-Pool gesammelt. Die Gelfiltration stellt eine wirksame Maßnahme zur Entfernung der Kupfer-Phenanthrolin-Reaktionsteilnehmer dar, wie durch die Tatsache belegt, daß, sobald der AHF-Pool eluiert, die rosafarbenen CuPH-Reaktionsteilnebmer noch immer weniger als den halben Weg durch die Säule zurückgelegt haben. Ferner werden große Proteine wie Fibrinogen und Fibronektin ebenfalls durch die Gelfiltration abgetrennt.
Es wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um zu bestätigen, daß die CuPH-Reaktionsteilnehmer entfernt wurden, sowie um Restgehalte an Phenanthrolin (PH) zu bewerten, und zwar unter Verwendung von radiomarkiertem ¹&sup4;C. ¹&sup4;C-PH wurde hergestellt und dazu verwendet, die Entfernung der Verbindung während verschiedener Verfahrensstufen zu verfolgen und aufzuzeichnen. Diese Ergebnisse zeigten an, daß Gelfiltration eine wirksame Vorgehensweise zur Entfernung von freiem PH aus AHF und anderer Proteine darstellt. Weitere Untersuchungen zeigten, daß die Assoziation von PH mit Protein um annähernd das 4- bis 5-fache herabgesetzt wurde, wenn man die Reaktionsmischung in der Gegenwart von Ammoniumformiat, Histidin und Mannit laufen ließ. Diese Verbindungen wurden dem Verfahren zugefügt um das Vorhandensein kleiner Restmengen an mit dem Protein assoziiertem PH zu minimeren.
Der gewonnene AHF-Pool wies einen pH von 6,85, ein A&sub2;&sub8;&sub0; von 1,21, ein Gewicht von 14,8 kg und eine Potenz von 56,6 E/ml auf. Dies ergibt eine spezifische Aktivität von 56,6/1,21 = 46,8 Einheiten/A&sub2;&sub8;&sub0; Einheit und einen Reinigungsgrad von 46,8/13 (für AHF-Konzentrat) = 3,6-fach. Die Ausbeute durch die Säule betrug 75,5 %, mit einer Durchschnittsausbeute von 79,5 % und einem Bereich von 70,1 bis 89,9 aus bisherigen Durchläufen. Aufgrund der hohen Potenz des AHF-Pools (56,6 E/ml) wurde keine Ultrafiltration durchgeführt. Tatsächlich mußte der AHF-Pool mit Säulenpuffer herab auf annähernd 35 E/ml zur weiteren Verarbeitung verdünnt werden. Falls jedoch eine höhere Endbehältniskonzentration erwünscht ist, kann der AHF-Pool leicht ultrafiltriert werden auf 100 bis 300 E/ml.
Obwohl dieser besondere Durchlauf des AHF-Pools nicht eingefroren wurde, sind bisherige AHF-Pools aus der Gelfiltrationssäule eingefroren und bei -70ºC aufbewahrt worden, als eine Haltestufe, bis sie zusammengefaßt und gefriergetrocknet wurden.
Es wurde Normalserumalbumin zugefügt so daß die berechnete Endbehältnispotenz annähernd 25 E/ml sein würde. 492 ml 25 %-iges Albumin wurden zugefügt, um zur Endbehältniszubereitung beizutragen. Diese Menge an Albumin entspricht 5 mg Albumin/ml AHF-Lösung, mit einem Bereich bis 10 mg Albumin, bevorzugter 3 bis 5 mg Albumin/ml AHF. Zusätzlich zum Albumin kann das Endbehältnis Stabilisierungsmittel wie 0,2 M Glycin und 0,001 M CaCl&sub2; oder 0,15 M NaCl und 0,001 M CaCl&sub2; enthalten.
Der Humanserumalbumin(HSA)-Pool wurde sterilfiltriert, indem man einen 25,4 cm (10 inch) Duofine, einen 30,5 cm (12 inch) CWSS und als Sterilfilter einen 25,4 cm (10 inch) Millipore TP verwendete. Die Sterilfilter wurden mit frischem Säulenpuffer auf ein Zielgesamtgewicht von 14,6 kg gespült. Die AHF-Gewinnungsmenge durch die Sterilfiltration betrug 91,5 %, mit einem Durchschnitt von 85 %, und einem Bereich von 78 bis 92,6 %. Das A&sub2;&sub8;&sub0; des sterilfiltrierten AHF betrug 5,15.
Die sterile AHF-HSA-Lösung wurde in einem sterilen Massebehältnis vermischt und aseptisch in 50 cm³ Flaschen abgefüllt, 20 ml in jeder Flasche, und in einen Produktionsgefriertrockner gegeben und lyophilisiert. Die Ausbeute über die Gefriertrocknung betrug 89,8 %, bei einem Durchschnittswert von 89,4 % und einem Bereich von 78 bis 111 %.
Die Endbehältnisse wurden umfangreichen Analysen zur Qualitätskontrolle unterzogen, und es wurde belegt, daß eine stabile, pyrogenfreie, sterile, sichere Präparation mit nur sehr niedrigen Gehalten an IgG, IgM, IgA, Fibrinogen und Fibronektin vorlag.
Die Konzentration im Endbehältnis betrug 610 AHF Einheiten/20 ml, mit einer spezifischen Aktivität von 5,7 AHF Einheiten/mg Protein, und es wurden nur sehr geringe Gehalte an Kupfer und Phenanthrolin nachgewiesen.

Beispiel 2

Proben aus demselben Los einer niedrigen spezifischen Aktivität, nämlich ultrafiltriertes AHF-Endbehältniskonzentrat, wurden über verschiedene Gelfiltrations(GF)-Säulen gelfiltriert und bezüglich ihrer Wirksamkeit bei der Abtrennung von AHF vom Rest der anderen Begleitstoffe verglichen. Die verschiedenen Gelfiltrationsharze wurden in 2,6 x 25 cm Säulen gegossen, und es wurden 10 ml des Konzentrats aufgegeben und gelfiltriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Pool 1 stellt den AHF-Pool dar, der gesammelt wurde, indem man das A&sub2;&sub8;&sub0; vom Anstieg auf 2,0 verfolgte, wie oben beschrieben. Der Pool 2 stellt all den Rest des A&sub2;&sub8;&sub0; dar, der aus der besonderen Gelfiltrationssäule eluierte. Die Gesamtgewinnungsmenge stellt die Summe der Ausbeuten in Pool 1 und 2 dar.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß Pharmacia Cl-4B , Bio-Gel A-15M und LKB Ultrogel A4 ebenfalls Ergebnisse lieferten, die denjenigen der mit Bio-Rad's BioGel A5M erhaltenen ähnlich sind. In getrennten Versuchen wurde herausgefunden, daß das 100 bis 200 Mesh Bio-Gel A5M -Harz optimal war, verglichen mit den beiden anderen Mesh-Bereichen. Mesh betrifft die US-Standard-Naß-Mesh-Bezeichnung (hydratisiert).
Diese Gele sind ausgewählt, um Fraktionierungsbereiche aufzuweisen, die dazu befähigen, den AHF/Willebrand-Komplex abzutrennen von der Mehrheit anderer Verunreinigungen, wie Fibrinogen, Fibronektin usw..
Einige der in Tabelle 1 angegebenen Gele ergaben weniger als 50 % Ausbeute an AHF, wahrscheinlich wegen schwacher Fraktionierungsbereiche. Alle Harze würden geeignet sein, die chemischen Reaktionsteilnehmer aus den beschriebenen viralen Inaktivierungsstufen zu entfernen, da diese Reaktionsteilnehmer ein MW von weniger als 300 d aufweisen.
Die Pharmacia -Gele stellen alle vernetzte geperlte Agarose dar. Die Bio-Gel -Harze sind alle Agarose-basierte Gele. LKB Ultrogel A4R weist 4 % Agaroseperlen auf. Die Fractogele sind hydrophile halbharte kugelförmige Gele, hergestellt aus Vinylpolymeren. Die CPG-Reihe betrifft Glasperlen mit kontrollierter Pore. Tabelle I Gelfiltrations-Vergleichsharze Pool Nr. der Durchläufe Ausbeute Reinigung Gesamtgewinnung VIII:C Pharmacia Cl 2B Pharmacia Cl 4B Pharmacia Cl 6B BioGel A-50M (100 bis 200 Mesh) BioGel A-5M (100 bis 200 Mesh) BioGel A-5M (200 bis 400 Mesh) BioGel A-15M (200 bis 400 Mesh) BioGel A-50M (100 bis 200 Mesh) BioGel A-150M LKB Ultrogel A4 Fractogel TSK-65 Fractogel TSK-75

Beispiel 3

Eine 150 ml-Probe eines AHF-Pools aus einem BioGel A5M -Saulendurchlauf, wie oben beschrieben, wurde mit Säulenpuffer auf 700 ml verdünnt. Zum verdünnten AHF-Pool wurden 0,9 M L-Glycin, 0,8 M L-Lysin, 0,002 M CaCl&sub2; und 1,2 g/ml Sucrose gegeben, wie beschrieben in US 4,543,210. Nach Vermischen zur Solubilisierung wurde die Lösung in ein Wasserbad von 60ºC 10,5 h lang, 1/2 h Aufwärmung, gegeben (Naßwärmepasteurisierung). Nach der 60ºC-Inkubation wurde die pasteurisierte Lösung 1:1 mit Säulenpuffer verdünnt und durch ein AP25-Flachstockfilter vorfiltriert. Das Effluens wurde einer DF/UF gegen 8 l WFI bei Raumtemperatur unterzogen, gefolgt von 2 bis 3 Volumen Säulenpuffer. Der DF-pasteurisierte AHF wurde dann sterilfiltriert und gefriergetrocknet. Die Ausbeute durch die Pasteurisierungs-, DF/UF-Stufen betrug 75 %. Die spezifische Aktivität im Endbehältnis wurde mit 43,1 Einheiten pro A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheit ermittelt. Kein HSA ist bei diesem besonderen Durchlauf zugefügt worden.
Dieses Beispiel zeigt, daß ein AHF-Pool aus dem vorliegenden Gelfiltrationssäulenverfahren wärmebehandelt werden kann als eine zusätzliche oder alternative virale Inaktivierungsstufe.

Beispiel 4

Steigende Gehalte an Sucrose wurden einer Probe eines AHF-Pools aus einem BioGel A5M -Saulendurchlauf zugefügt. Zur Bestimmung der Auswirkung auf die Proteinkonzentration wurden sowohl unverdünnte als auch 1:1-verdünnte AHF-Pools herangezogen. Weitere Exzipienten schlossen entweder 0,3 M L-Glycin, 0,5 M L-Lysin(1) oder 0,9 M L-Glycin oder 0,5 M, 0,8 M L-Lysin(2) ein. Mengen von 0,2 g/ml Sucrose bis 1,2 g/ml Sucrose (horizontale Achse) wurden zugefügt und die Proben 10 h lang bei 60ºC in einem Wasserbad erwärmt. Prä- und Postfaktor VIII-Assays wurden an den Proben durchgeführt. In Fig. 1 zeigt die gegen den Gehalt an Sucrose aufgetragene AHF-Ausbeute an, daß der Gehalt an Sucrose von 1,2 g/ml auf 0,6 g/ml herabgesetzt werden kann, weil die AHF-Gewinnungsmengen annahernd dieselben sind aus 0,6 bis 1,2 g/ml Sucrose.
Was die Figur betrifft, bezeichnet die Legende "Old ST" einen unverdünnten AHF-Pool, enthaltend Exzipienten (1) vor der Sucrose-Zugabe. Die Legende "Old DIL" bezeichnet einen l:1-AHF-Pool, verdünnt mit Säulenpuffer in Exzipienten (1) vor der Sucrose-Zugabe. "New DIL" bezeichnet in ahnlicher Weise einen 1:1-verdünnten AHF-Pool in Exzipienten (2) vor der Sucrose-Zugabe. "New ST" bezeichnet einen unverdünnten AHF-Pool in Exzipient (2).
Sucrose-Gehalte herab zu 0,6 g/ml zeigten nicht mehr als 30 % Verlust an Aktivität mit beiden Exzipienten (1) oder (2).
Die Exzipienten (2) zeigten annähernd 20 % Ausbeuteverbesserung über die Exzipienten (1) bei 0,6 g Sucrose/ml.
Dieses Beispiel zeigt daß gelfiltrierter AHF einer Naßwärmebehandlung mit verminderten Sucrosegehalten unterzogen werden kann, d. h. unterhalb 1,2 oder mit 1,1 bis 0,6 mg/ml. Die Herabsetzung der Sucrosegehalte vermindert den Aufarbeitungsaufwand (DF/UF). Sie konnen auch die virale Inaktivierung steigern, da Sucrose Viruspartikel als auch AHF schützt. Der niedrigere Sucrosegehalt würde weniger Schutz für das virale Teilchen ohne Verlust an AHF-Aktivität ergeben. Identische Ergebnisse für die unverdünnten/verdünnten AHF-Proben wurden in beiden Puffersystemen beobachtet.

Beispiel 5

Der AHF-Pool aus einem Produktionssäulendurchlauf wurde ultrafiltriert (UF) unter Verwendung von Amicon Hohlfaserpatronen von 92,9 dm² (10 sq. ft.). Der AHF-Pool (16,2 kg) wurde in 1 h auf ein Gewicht von 4,8 kg ultrafiltriert. Die folgende Tabelle faßt die jeweiligen Meßergebnisse für die Ultrafiltrationsstufe zusammen. Tabelle II Ultrafiltration von gelfiltriertem AHF Stufe Ausbeute Gewicht (kg) Spezifische Aktivität Gesamt-AHF (Einheiten) AHF-Pool (1) U.F.-Pool (1)
Der AHF-Pool wurde sehr leicht ultrafiltriert, mit keinem Verlust an Reinheit und nur sehr wenig Verlsut an Ausbeute (etwa 5 %). Die AHF-Potenz wurde aufkonzentriert auf mehr als 180 Einheiten pro ml. In getrennten Versuchen ist es moglich gewesen, den AHF-Pool (1) auf mehr als 300 Einheiten an AHF pro ml zu ultrafiltrieren. Bei dieser hohen Potenz befähigt ein sehr geringes Volumen im zubereiteten Endbehältnis einen hämophilen Patienten dazu, eine große Menge an AHF rasch zu empfangen. Die Potenz im Endbehältnis hängt vom Ausmaß der Ultrafiltration ab. Der erwartete Bereich der Potenzen im Endbehältnis liegt zwischen 50 bis 300 Einheiten pro ml AHF.

Beispiel 6

Der ultrafiltrierte AHF-Pool (1) aus Beispiel 5 wurde mit Säulenpuffer verdünnt, und es wurde Normalserumalbumin zugefügt, so daß die berechnete Potenz im Endbehältnis annähernd 100 E/ml sein würde. Nach Sterilfiltration (wie in Beispiel 1) und Lyophilisierung wurde das Endbehältnis-AHF-Konzentrat einem Assayverfahren unterzogen, und einige dieser Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt. Tabelle III Endbehältnis-Testergebnisse an TNBP/Tween -AHF Test Ergebnisse AHF-Potenz Willebrand-Faktor Spezifische Aktivität Tween 80 Kaninchen-Pyrogen Sterilität Sicherheit Fibronektin Fibrinogen Einheiten/mg Protein erfüllt
Wie aus der Tabelle ersichtlich, kann ein AHF-Konzentrat mit dem 4-fachen der üblichen 25 E/ml-Dosis hergestellt werden, und die Eigenschaften im Endbehältnis sind nicht beeinträchtigt. Es bestand kein Problem bei der Sterilfiltration dieses AHF-Pools. Der Kaninchen-Pyrogentest wurde durchgeführt, indem man 100 Einheiten AHF pro kg Kaninchen injizierte, und der gesamte Temperaturverbrauch in drei Kaninchen betrug lediglich 0,3ºC. Das berechnete Verhältnis von AHF zum Willebrand-Faktor von 1,1 beinhaltet ein nahezu ideales Plasmaverhältnis von 1,0 im Endbehältnis. Nicht nachweisbares TNBP und Tween 80 wurden in diesem Endbehältnis-AHF-Konzentrat festgestellt. Tabelle IV Abfüllgröße, ml/Röhrchen Protein, mg/ml Pool 1 spezifische Aktivität Spezifische Aktivität Verhältnis VIII RcoF/VIII : C Glycin % Einheiten AMF/mg Fibrinogen Fibronektin, mg/ml Fibrinogen, mg/ml
Tabelle IV zeigt zusätzliche Assayergebnisse aus verschiedenen Losen. Das Verhältnis von AHF zu WF (Willebrand-Faktor) ist angegeben als Verhältnis VIII RcoF/VIII:C.
Nach alldem ist ein Verfahren zur Herstellung von AHF beschrieben worden, welches eine Abfolge von Fällungs-, Solubilisierungs-, Gelfitrations- und viraler Inaktivierungsstufen umfaßt. Ohne zu bestreiten, daß auf spezifische bevorzugte Ausgestaltungsformen Bezug genommen wurde, ist es verständlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese, sondern vielmehr auf den recht- und gesetzlichen Rahmen der angefugten Ansprüche eingeschränkt sein soll.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats von antihämophilem Faktor (AHF) aus Kryopräzipitat ohne wesentlichen Verlust an therapeutischer oder immunologischer Aktivität, wobei die folgenden aufeinanderfolgenden Stufen umfaßt sind:

(a) Auflösen des genannten Kryopräzipitats;

(b) Entfernen von nicht-AHF-Proteinen durch Ausfällung mit Polyethylenglykol (PEG) ohne eine Kühlstufe;

(c) Wärmebehandeln des genannten AHF zur viralen Inaktivierung in der Gegenwart von Sucrose, wobei die Menge an Sucrose 1,2 bis 0,6 g/ml gepooltes Konzentrat beträgt; und dann

(d) Laufenlassen des genannten AHF durch eine Gelfiltrationssäule, enthaltend ein Großenausschlußharz von 300 bis 15.000 Daltons, um den genannten AHF auf mindestens 35 Einheiten an Faktor VIII-Aktivität pro ml gepooltes Konzentrat aufzukonzentrieren.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ferner die Stufe einer Ausfällung von AHF mit einer Mischung aus Glycin und NaCl vor der genannten Gelfiltration umfaßt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin PEG in Stufe (b) in einer Menge von 2 % bis 5 % zugefügt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ferner die Stufe einer Ultrafiltration des genannten Konzentrats umfaßt ist, um mindestens 100 Einheiten an Faktor VIII-Aktivität pro ml Konzentrat zu erhalten.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Antihämophilfaktor-Konzentrats (ARF) aus Kryopräzipitat ohne wesentlichen Verlust an therapeutischer oder immunologischer Aktivität, wobei die folgenden aufeinanderfolgenden Stufen umfaßt sind:

(a) Herstellen eines Kryopräzipitats;

(b) Entfernen von nicht-AHF-Proteinen durch Ausfällung mit Polyethylenglykol (PEG) ohne eine Kühlstufe, um einen solubilisierten AHF-Pool zu bilden;

(c) Erwärmen des aus der Säule zur viralen Inaktivierung erhaltenen AHF in der Gegenwart von Sucrose, wobei die Menge an Sucrose 1,2 bis 0,6 g/ml gepooltes Konzentrat beträgt; und dann

(d) Laufenlassen des genannten AHF-Pools durch eine Gelfiltrationssäule, enthaltend ein Großenausschlußharz von 300 bis 15.000 Daltons, um den genannten AHF auf mindestens 35 Einheiten an Faktor VIII-Aktivität pro ml gepooltes Konzentrat aufzukonzentrieren.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei ferner zwischen den Stufen (b) und (c) die Stufe einer Aufkonzentrierung des genannten Pools durch Ultrafiltration umfaßt ist.