WO2002030983A2 - Bikunin enthaltende plasmafraktion, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung - Google Patents

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    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors

Definitions

  • Plasma fraction containing bikunin process for its preparation and its use
  • the invention relates to a method for producing a bikunin-containing plasma fraction, the available product and its use in septic conditions.
  • Bikunin is a proteinase inhibitor with a number of physiological functions. It is mostly present in plasma as a subunit of pre- and inter- ⁇ -tr ⁇ spin inhibitor (I ⁇ l). However, less bikunin activity is found in the bound form than in the free form.
  • the diverse activities of Bikunin also include the inhibition of plasmin on the cell surface and the stimulation of neutrophils by lipopolysaccharides, which indicates a role in inflammatory reactions. The structure and function of Bikunin is discussed in "The International Journal of Biochemistry Cell Biology" 32, 125-137 (2000).
  • Bikunin is often referred to as the light chain of l ⁇ l or as its subunit 1.
  • l ⁇ l family of plasma proteins which consists of various structurally related molecules. An overview of this is provided by J.P. Salier et ai (Biochem. J. 315, 1-9 (1996)).
  • Bikunin is integrated with various heavy (H) chains by covalent bonding to form l ⁇ l.
  • H heavy chains by covalent bonding to form l ⁇ l.
  • a protein glycosaminoglycan-protein bond is formed via chondroitin-4-sulfate.
  • an inter- ⁇ -trypsin inhibitor concentrate is described in US Pat. No. 5,777,081, which consists of three peptide chains and has a molecular weight of approximately 220 kD.
  • This molecule consists of the two heavy chains Hl and H2, as well as the light chain, Bikunin, bound by a glycosaminoglycan chain.
  • Heparin affinity chromatography is used to obtain the concentrate.
  • the technical problem on which the invention is based is the provision of a plasma fraction with antitrypsin activity which is distinguished by a simple production process and the effectiveness in septic conditions.
  • this problem is solved by a new production process for a human bikunin plasma fraction. Due to the bikunin content, this plasma fraction has antitrypsin activity. It has been found that molecular exclusion chromatography is extremely suitable for obtaining the bikunin plasma fraction. A variety of proteins from the l ⁇ l family can thus be obtained together. Among them is the native inter- ⁇ -trypsin inhibitor, which is often found in plasma associated with other high molecular weight proteins containing bikunin.
  • a pure inter- ⁇ -trypsin inhibitor is also obtainable with the method according to the invention, which essentially consists only of the molecule with the three peptide chains (Hl, H2 and bikunin), bound by a glycosaminoglycan chain, and a molecular weight of about 220 has kDa.
  • Free unbound bikunin has a molecular weight of less than 70 kDa and is easily removed by the process according to the invention.
  • the free unbound bikunin has the disadvantage of a short half-life of around 30 minutes. Bikunin in the plasma fraction according to the invention proves to be considerably more stable in vivo; a half-life of several hours could be demonstrated.
  • bikunin which is present in bound form in the plasma fraction produced according to the invention, is found in an in vivo Model shows as a valuable therapeutic against sepsis.
  • cryoprecipitate as the starting material for the production of the bikunin plasma fraction according to the invention has the advantage that, in addition to the bikunin plasma fraction, a further therapeutically relevant plasma fraction containing purified complex of blood coagulation factor VIII (FVIII) and von Willebrand factor (vWF) is included in the molecular exclusion chromatography. the FVIII / vWF, can be won.
  • FVIII blood coagulation factor VIII
  • vWF von Willebrand factor
  • Molecular exclusion chromatography preferably follows purification of the FVIII / vWF by ion exchange chromatography.
  • the particularly preferred combination of purification and manufacturing processes is anion exchange chromatography for purification of plasma proteins from cryoprecipitate, e.g. the FVIII and / or the vWF, and a subsequent gel permeation.
  • the purification of factors of the prothrombin complex and the gel permeation are also preferred.
  • chromatography processes can be used to increase the purity of the proteins containing bikunin. These include ion exchange, affinity, molecular exclusion chromatography and / or hydrophobic chromatography.
  • Chromatography materials based on hydrophilic supports are preferably used for gel permeation or molecular exclusion chromatography. These are preferably polysaccharides, in particular dextrans, cellulose, agarose, modified polysaccharides, hydrophilic, synthetic polymers, preferably so-called tentacle gels, silica gels modified with hydrophilic groups or combinations thereof.
  • the bikunin plasma fraction is eluted primarily with buffers with an increased salt concentration in a pH range of about 6 to 9.
  • Polysaccharides such as Sephadex, Sepharose, Agarose, etc. are used as commercially available carriers.
  • Preferred synthetic polymers are those based on polyglycidyl methacrylate, in particular modified with hydrophilic arms (tentacles).
  • Patentacles For further description, reference is made to EP-A-0 337 144 and EP-A-0 320 023.
  • the support materials from EP-A-0 377 144 are particularly preferred as tentacle chromatography materials.
  • inorganic materials such as silica gels can also be used.
  • TSK gels and so-called SW gels silicon wide pore, Toso Haas, Stuttgart
  • the carrier material used in the method according to the invention in particular has a large-pore structure.
  • Particulate material in particular has a grain size of 0.5 to 350 ⁇ m.
  • So-called compact block materials, membranes and / or monoliths, as described in EP-A-0 320 023, can also be used.
  • the compact block material has the advantage that it. is stable due to its monolithic structure and can be operated in a radial flow or in a continuous process.
  • the process time is significantly reduced, which has the advantage that an unstable protein, such as the l ⁇ l, can possibly also be purified without the use of process stabilizers, and the native state is essentially maintained.
  • the Rapid chromatographic separation on such materials is also used on a small scale.
  • the method according to the invention is therefore not only made available for large-scale industrial use, but also for analysis, for example as part of a process control during the production of plasma fractions.
  • the pore size of the carrier material is usually in the range from 5 nm to 10 ⁇ m, in particular greater than 50 ⁇ m.
  • ion exchangers on an organic or inorganic basis ie cation or anion exchangers
  • strong cation exchangers are supports with SO 3 groups and weak carboxymethyl cation exchangers.
  • the strong anion exchangers that may be used include, for example, the gels provided with TMAE or QA groups; to the strong anion exchangers, for example, those with DEAE groups. In general, tentacle gels or membranes can be used.
  • affinity materials with different ligands such as heparins, dextransuates, hydroxyapatites, lectins, receptors and low-molecular substances with affinity for l ⁇ l or bikunin, can also be used.
  • affinity materials with different ligands such as heparins, dextransuates, hydroxyapatites, lectins, receptors and low-molecular substances with affinity for l ⁇ l or bikunin
  • supports are used which are modified with linear hydrocarbons with Cl to C10 or their derivatives, including phenyl groups and the like.
  • a particularly suitable method according to the invention uses immunoaffinity chromatography using a monoclonal antibody against bikunin. This further enriches molecules that have bound Bikunin.
  • a preferred monoclonal antibody is a mouse. Antibody directed against an epitope in the active center of Bikunin. Such an antibody, such as Mab 69.31, in particular blocks the plasmin-inhibiting effect of the light chain of l ⁇ l.
  • the monoclonal antibody that binds to the bikunin-containing proteins of the l ⁇ l family is particularly suitable for the production and further purification of the bikunin plasma fraction according to the invention.
  • polyclonal antibodies can also be obtained by immunizing suitable systems with the bikunin plasma fraction according to the invention.
  • Analysis of the bikunin plasma fraction using electrophoretic and immunochemical methods shows a number of bikunin-containing proteins, at least those that contain bikunin associated with at least one heavy chain of the l ⁇ l. Free bikunin could not be found.
  • the bikunin plasma fraction or l ⁇ l plasma fraction obtained according to the invention is thus essentially free of unbound, separate bikunin.
  • the bikunin plasma fraction according to the invention can also be characterized in that it largely consists of proteins which have an antitrypsin activity.
  • a preferred plasma fraction therefore contains at least 70% proteins with an antitrypsin activity, preferably at least 80%, most preferably at least 90%.
  • Specific purification steps can also be used to express a specific activity, expressed in trypsin inhibiting units per milligram protein, which is a multiple of the activity of human plasma.
  • the antitrypsin activity can be achieved at least 50 times more than in plasma, preferably more than 100 times, most preferably more than 200 times as much as in human plasma.
  • the method according to the invention provides a method which is gentle on proteins, so that the bikunin plasma fraction obtained contains largely native, bound bikunin or native inter-alpha-trypsin inhibitor.
  • the activity obtained based on inter-alpha-trypsin inhibitor protein, measured as antigen is quite comparable to the activity in human plasma.
  • the plasma fraction according to the invention therefore preferably contains bikunin-containing proteins, such as inter-alpha-trypsin inhibitor, which are at least 80% active, preferably at least 90%. Most preferably the ratio of activity to antigen is about the same.
  • the molecular exclusion chromatography used in the production process according to the invention is a prerequisite for the characterization of the molecular weight of the proteins contained.
  • a preferred plasma fraction essentially contains proteins with an apparent molecular weight in the range from 100 kDa to 500 kDa, preferably 100 to 250 kDa, and should not contain any further essential components.
  • the apparent molecular weight is determined by molecular exclusion chromatography using standard proteins with a certain molecular weight as reference material.
  • the proteins of the l ⁇ l family predominantly contained in the plasma fraction according to the invention are the inter-alpha-trypsin inhibitor itself and preferably at least one further high-molecular protein containing bikunin, that is to say with an apparent molecular weight of at least 100 kDa like the pre-alpha inhibitor.
  • a highly purified I ⁇ l preparation can also be readily obtained by the method according to the invention, the resulting plasma fraction or I ⁇ l preparation according to the invention containing no further bikunin-containing constituent, in particular being essentially free of separate bikunin.
  • “Substantially free” here means less than 10%, preferably less than 5%, based on the total protein.
  • the bikunin plasma fraction is used as the basis for a pharmaceutical preparation.
  • This can be obtained by further purification of the Bikunin proteins and by formulation, measures for sterilization or sterile filtration and inactivation of any pathogens that may be present.
  • the pharmaceutical preparation is preferably provided as a lyophilisate, for example formulated with stabilizing polyols, sugar, sugar alcohols, amino acids or inorganic salts, which formulation is suitable for intravenous administration.
  • the pharmaceutical use of plasma products carries a risk of transmission of pathogens which may be present in the starting plasma, e.g. of blood-borne viruses. These include the hepatitis viruses A, B, C, the HI viruses and parvovirus.
  • pathogens which may be present in the starting plasma
  • these include the hepatitis viruses A, B, C, the HI viruses and parvovirus.
  • various measures are therefore taken in the production of the plasma derivatives to reduce any viruses that may be present by inactivating or depleting or removing them.
  • heat treatment in aqueous solution or in the lyophilisate is used, the heating being preferably carried out in the cleaned product ("bulk") or in the final container.
  • Stabilizers such as inorganic salts, sugars, sugar alcohols, polyols in general or amino acids can have an advantageous effect on maintaining bikunin activity.
  • TNBP trin-butyl phosphate
  • surfactants such as Triton, Tween, Cholat, and the like
  • Other methods see different chemicals, such as Thiocyanates, monochloroacetic acid or organic acids. Alcohols also have a virus-inactivating effect.
  • Nanofiltration is particularly suitable for the depletion or removal of viruses, for example in cross-flow (tangential flow) or in the "dead-end” (Flow) method.
  • the filter materials used for this are on the one hand membranes or depth filters or ultrafilters.
  • filters with a pore size in the range from 15 to 30 nm are used.
  • the therapeutic applicability of the plasma fraction or pharmaceutical preparation according to the invention is initially tested in suitable animal models.
  • a recognized model was, for example, a rat model of polymicrobial sepsis (see Yang S. et al, Am. J-Physiol 277, H1036-H1044 (1999) and Wang P, et al, J-Surg. Res. 85, 59- 65 (1999)).
  • the bikunin plasma fraction according to the invention with a dose of, for example, 30 mg / kg significantly reduced the mortality of the animals.
  • the therapeutic dose is assumed to be in the range of 3 to 300 mg / kg, depending on the degree of sepsis and the time of administration.
  • bikunin plasma fraction or the pharmaceutical preparation especially those consisting essentially of the proteins which have an apparent molecular weight of 100 to 500 kDa or also verified by methods other than gel permeation, for the treatment of septic conditions , comprising severe inflammatory processes in the context of sepsis or septic shock, is therefore another promising subject of the invention.
  • Plasma cryoprecipitate was treated with TNBP and Triton to inactivate viruses.
  • the mixture was then separated using the anion exchanger EMD-TMAE-Sephadex, a tentacle gel, a fraction containing factor VIII and the vWF being obtained.
  • This fraction was further separated using molecular exclusion chromatography on Superose 6 (Pharmacia).
  • the high molecular fraction vWF containing and the FVIII / vWF complex was separated and the fraction containing molecules with the apparent molecular weight in the range of 100 to 500 kDa was obtained.
  • a mouse monoclonal antibody Mab 69.31 produced on the basis of a purified plasma fraction from Example 1, with an inhibiting action against bikunin activity, was produced and selected using conventional methods. This antibody was immobilized on a support suitable for immunoaffinity chromatography.
  • a Bikunin plasma fraction could thus be isolated from the following sources: human plasma, plasma cryoprecipitate, plasma cryoprecipitate purified by ion exchanger and the Bikunin plasma fraction from Example 1 to obtain a further purified fraction.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Bikunin-Plasmafraktion mit Antitrypsin Aktivität, wobei eine die Bikunin-Plasmafraktion enthaltende Quelle mittels Molekularausschluss-Chromatographie in Komponenten getrennt wird und eine Fraktion mit Antitrypsin Aktivität gesammelt wird.

Description

Bikunin enthaltende Plasmafraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Bikunin-enthaltenden Plasmafraktion, das erhältliche Produkt sowie dessen Verwendung bei septi- sehen Zuständen.
Bikunin ist ein Proteinase Inhibitor mit einer Reihe von physiologischen Funktionen. Es liegt in Plasma zumeist als Untereinheit von Prä- und Inter-α- Trγspininhibitor (Iαl) vor. In der gebundenen Form wird jedoch eine geringere Bikunin-Aktivität als in der freien Form gefunden. Zu den vielfältigen Aktivitä- ten des Bikunin zählt auch die Inhibition des Plasmin an der Zelloberfläche sowie die Stimulation von Neutrophilen durch Lipopolysaccharide, was auf eine Rolle bei Entzündungsreaktionen hindeutet. In "The International Journal of Biochemistry Cell Biology" 32, 125-137 (2000) wird die Struktur und Funktion von Bikunin diskutiert.
Das Bikunin wird oftmals als leichte Kette des lαl bezeichnet bzw. als dessen Untereinheit 1. Man spricht auch von der lαl Familie der Plasma Proteine, die aus verschiedenen strukturell verwandten Molekülen besteht. Eine Übersicht dazu wird von J.P. Salier et ai (Biochem. J. 315, 1-9 (1996)) vorgestellt. Bikunin wird zur Bildung von lαl mit verschiedenen schweren (H) Ketten durch kovalente Bindung integriert. Dabei wird über Chondroitin-4-Sulfat eine Protein Glycosaminoglycan - Protein Bindung gebildet.
Zur therapeutischen Verwendung bei schweren Entzündungen wird in der US- A-5,777,081 ein Inter-α-Trypsininhibitor Konzentrat beschrieben, welches aus drei Peptidketten besteht und ein Molekulargewicht von etwa 220 kD aufweist. Dieses Molekül besteht aus den zwei schweren Ketten Hl und H2, sowie der leichten Kette, Bikunin, gebunden durch eine Glycosaminoglycan-Kette. Zur Gewinnung des Konzentrates wird eine Heparin-Affinitätschromatographie herangezogen. Das der Erfindung zu Grunde liegende technische Problem liegt in der Bereitstellung einer Plasmafraktion mit Antitrypsin Aktivität, die sich durch ein einfaches Herstellungsverfahren sowie die Wirksamkeit bei septischen Zuständen auszeichnet.
Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch ein neues Herstellungsverfahren für eine humane Bikunin-Plasmafraktion gelöst. Aufgrund des Bikunin-Gehalts weist diese Plasmafraktion eine Antitrypsin Aktivität auf. Es hat sich herausgestellt, dass sich zur Gewinnung der Bikunin-Plasmafraktion die Molekularaus- schluss-Chromatographie hervorragend eignet. Damit kann eine Vielfalt von Proteinen der lαl Familie gemeinsam erhalten werden. Darunter ist auch der native Inter-α-Trypsininhibitor, der in Plasma oftmals vergesellschaftet mit weiteren Bikunin-enthaltenden hochmolekularen Proteinen gefunden wird. Ebenso ist auch ein reiner Inter-α-Trypsininhibitor mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich, der im wesentlichen nur aus dem Molekül mit den drei peptidischen Ketten besteht (Hl, H2 und Bikunin), gebunden durch eine Glycosaminoglycan-Kette, und ein Molekulargewicht von etwa 220 kDa aufweist. Freies ungebundenes Bikunin hat ein Molekulargewicht von unter 70 kDa und wird in einfacher Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren abgetrennt. Es ist durch die Molekularausschluss-Chromatographie, auch ge- nannt Gelpermeation, jedenfalls möglich die Bikunin-enthaltenden Proteine in einer Fraktion enthaltend Proteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 500 kDa, vorzugsweise 100 bis 250 kDa, zu erhalten, die im wesentlichen frei von ungebundenem Bikunin sind.
Das freie ungebundene Bikunin hat nämlich den Nachteil der kurzen Halb- wertszeit von etwa 30 min. Bikunin in der erfindungsgemäßen Plasmafraktion erweist sich in vivo als wesentlich stabiler; es konnte eine Halbwertszeit von mehreren Stunden nachgewiesen werden.
Es war zudem überraschend, dass Bikunin, welches in der erfindungsgemäß hergestellten Plasmafraktion in gebundener Form vorliegt, sich in einem in vivo Modell als wertvolles Therapeutikum gegen Sepsis zeigt. Man konnte eher annehmen, dass das freie ungebundene Bikunin stärker wirksam wäre.
Die Herstellung durch Molekularausschluss-Chromatographie ist einerseits direkt aus Plasma möglich oder aus einer Plasmafraktion, also beispielsweise aus Fraktionen, die durch Fällungen oder Adsorptionen aus Humanplasma erhalten werden können. Als vorteilhafterweise verwendetes Startmaterial kann Kryopräzipitat oder Kryoüberstand eingesetzt werden. Die Verwendung von Kryopräzipitat als Ausgangsmaterial zur Herstellung der erfindungsgemäßen Bikunin-Plasmafraktion hat den Vorteil, dass bei der Molekularausschluss- Chromatographie neben der Bikunin-Plasmafraktion eine weitere therapeutisch relevante Plasmafraktion enthaltend gereinigten Komplex aus Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) und von Willebrand Faktor (vWF), also den FVIII/vWF, gewonnen werden kann.
Dabei folgt die Molekularausschluss-Chromatographie vorzugsweise auf eine Reinigung des FVIII/vWF durch lonenaustauschchromatographie. Die besonders bevorzugte Kombination von Reinigungs- und Herstellungsverfahren ist eine Anionenaustauschchromatographie zur Reinigung von Plasmaproteinen aus Kryopräzipitat, wie z.B. den FVIII und/oder den vWF, und einer darauffolgenden Gelpermeation. Ebenso bevorzugt ist die Reinigung von Faktoren des Prothrombinkomplex und die Gelpermeation.
Nach Trennung der Bikunin-Plasmafraktion durch Molekularausschluss- Chromatographie können Chromatographieverfahren zur höheren Reinheit der Bikunin enthaltenden Proteine eingesetzt werden. Dazu zählen die Ionenaustausch-, Affinitäts-, Molekularausschluss-Chromatographie und/oder hyd- rophobe Chromatographie.
Diese Verfahren können sich der Säulenchromatographie, als kontinuierliches oder diskontinuierliches Verfahren, in einer Axialsäule oder Radialsäule, oder auch des "Batch" Verfahren bedienen. Für die Gelpermeation oder Molekularausschluss-Chromatographie werden vorzugsweise Chromatographiematerialien auf Basis von hydrophilen Trägern eingesetzt. Diese sind vorzugsweise Polysaccharide, insbesondere Dextrane, Cellulose, Agarose, modifizierte Polysaccharide, hydrophile, synthetische Poly- mere, vorzugsweise sogenannte Tentakelgele, mit hydrophilen Gruppen modifizierte Silicagele oder Kombinationen davon. Die Elution der Bikunin- Plasmafraktion erfolgt vornehmlich mit Puffern erhöhter Salzkonzentration in einem pH-Bereich von etwa 6 bis 9.
Als kommerziell erhältliche Träger werden beispielsweise Polysaccharide, wie Sephadex, Sepharose, Agarose, etc. eingesetzt. Bevorzugte synthetische Polymere sind solche auf Polyglycidylmethacrylat-Basis, insbesondere mit hydrophilen Armen (Tentakeln) modifizierte. Zur weiteren Beschreibung wird auf die EP-A-0 337 144 und die EP-A-0 320 023 verwiesen. Als Tentakel- Chromatographiematerialien sind insbesondere die Trägermaterialien aus der EP-A-0 377 144 bevorzugt. Neben den organischen Trägermaterialien kommen auch anorganische Materialien, wie Silicagele in Betracht. Hier sind beispielsweise TSK-Gele sowie sogenannte SW-Gele (Silica Wide pore, Toso Haas, Stuttgart) zu nennen.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Trägermaterial weist insbe- sondere eine großporige Struktur auf. Partikuläres Material besitzt insbesondere eine Korngröße von 0,5 bis 350 μm.
Ebenfalls Verwendung finden können sogenannte kompakte Blockmaterialien, Membranen und/oder Monolithen, wie sie in der EP-A-0 320 023 beschrieben sind. Das kompakte Blockmaterial hat den Vorteil, dass es. aufgrund seiner monolithischen Struktur druckstabil ist und im radialen Fluss bzw. im kontinuierlichen Verfahren betrieben werden kann. Die Prozessdauer wird dadurch wesentlich herabgesetzt, was den Vorteil hat, dass ein labiles Protein, wie der lαl unter Umständen auch ohne Verwendung von Prozessstabilisatoren gereinigt werden kann, und der native Zustand im wesentlichen erhalten wird. Die rasche chromatographische Trennung an derartigen Materialien wird auch im kleinen Maßstab ausgenutzt, es wird daher das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur für den großtechnischen, industriellen Einsatz zur Verfügung gestellt, sondern auch für die Analytik, z.B. im Rahmen einer Prozess-Kontrolle wäh- rend der Produktion von Plasmafraktionen.
Die Porengröße des Trägermaterials ist üblicherweise im Bereich von 5 nm bis 10 μm, insbesondere größer als 50 μm.
Für die weitere chromatographische Reinigung werden etwa Ionenaustauscher auf organischer oder anorganischer Basis, also Kationen- oder Anionenaustau- scher, eingesetzt. Als starke Kationenaustauscher sollen beispielhaft Träger mit SO3-Gruppen und als schwache Carboxymethyl-Kationenaustauscher genannt werden. Zu den möglicherweise verwendeten starken Anionenaustau- schern zählen etwa die mit TMAE-, oder QA-Gruppen versehenen Gele; zu den starken Anionenaustauscher etwa diejenigen mit DEAE-Gruppen. Im Allgemei- nen können etwa Tentakelgele oder auch Membranen eingesetzt werden.
Ebenso können auch Affin itätsmaterialien mit verschiedenen Liganden, etwa Heparine, Dextransuifate, Hydroxyapatite, Lektine, Rezeptoren und niedermolekulare Substanzen mit Affinität zu lαl bzw. Bikunin zur Anwendung kommen. Zur hydrophoben Chromatographie werden etwa Träger eingesetzt, die mit linearen Kohlenwasserstoffen mit Cl bis C10 oder deren Derivate, darunter Phenylgruppen und dergleichen, modifiziert sind.
Ein besonders geeignetes erfindungsgemäßes Verfahren bedient sich der Im- munaffinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Bikunin. Damit werden Moleküle, die Bikunin gebunden haben, weiter angereichert. Ein bevorzugter monoklonaler Antikörper ist ein Maus- . Antikörper, der gegen ein Epitop im aktiven Zentrum von Bikunin gerichtet ist. Ein solcher Antikörper, wie z.B. der Mab 69.31, blockiert insbesondere die Plasmin inhibierende Wirkung der leichten Kette von lαl. Der monoklonale Antikörper, der an die Bikunin-enthaltenden Proteine der lαl Familie bindet eignet sich besonders für die Herstellung und weitere Reinigung der erfindungsgemäßen Bikunin-Plasmafraktion. Dieser ist dann vorteilhafterweise an einem festen Träger immobilisiert, zum Einsatz in der Säulenchro- matographie, für ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Verfahren, in einer Axialsäule oder Radialsäule, oder auch im "Batch" Verfahren. Dabei ist unumgänglich, dass der Antikörper auch nach seiner Immobilisierung noch eine ausreichende Affinität zu Inter-α-Trypsininhibitor zeigt.
Weiterhin können auch polyklonale Antikörper durch Immunisierung von ge- eigneten Systemen mit der erfindungsgemäßen Bikunin-Plasmafraktion erhalten werden. Die Analyse der Bikunin-Plasmafraktion mittels elektrophoreti- scher und immunchemischer Methoden zeigt eine Reihe von Bikunin- enthaltenden Proteinen, jedenfalls solche, die Bikunin an mindestens eine schwere Kette des lαl assoziiert enthalten. Freies Bikunin konnte nicht gefun- den werden. Die erfindungsgemäß gewonnene Bikunin-Plasmafraktion oder lαl Plasmafraktiori ist somit im wesentlichen frei von ungebundenem, separatem Bikunin.
Nachdem die Antitrypsin Aktivität der Bikunin Untereinheit der Proteine zugeordnet wird, kann die erfindungsgemäße Bikunin-Plasmafraktion auch dadurch gekennzeichnet werden, dass sie zum Großteil aus Proteinen besteht, die eine Antitrypsin Aktivität aufweisen. Eine bevorzugte Plasmafraktion enthält daher mindestens zu 70% Proteine mit einer Antitrypsin Aktivität, vorzugsweise mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90%.
Speziell durch weitere Reinigungsschritte kann auch eine spezifische Aktivität, ausgedrückt in Trypsin inhibierenden Einheiten pro Milligramm Protein, die ein Vielfaches der Aktivität von Humanplasma beträgt. Beispielsweise kann die Antitrypsin-Aktivität mindestens 50 mal mehr als in Plasma erreicht werden, vorzugsweise mehr als 100 mal, am meisten bevorzugt mehr als 200 mal soviel als in Humanplasma. Es wurde auch überraschenderweise gefunden, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein derart Protein schonendes Verfahren bereitgestellt wird, so dass die erhaltene Bikunin-Plasmafraktion weitgehend natives, gebundenes Bikunin bzw. natives Inter-alpha-Trypsininhibitor enthält. So ist die erhaltene Aktivität bezogen auf Inter-alpha-Trypsininhibitor Protein, gemessen als Antigen, mit der Aktivität in Humanplasma durchaus vergleichbar. Die erfindungsgemäße Plasmafraktion enthält also vorzugsweise Bikunin enthaltende Proteine, wie Inter-alpha-Trypsininhibitor, die zumindest 80% aktiv sind, vorzugsweise mindestens 90%. Am meisten bevorzugt ist das Verhältnis der Aktivität zu Antigen etwa gleich.
Die im erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren eingesetzte Molekularaus- schluss-Chromatographie ist Voraussetzung für die Charakterisierung des Molekulargewichtes der enthaltenden Proteine. Eine bevorzugte Plasmafraktion enthält im wesentlichen Proteine mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 100 kDa bis 500 kDa, vorzugsweise 100 bis 250 kDa, und sollte darüber hinaus keine weiteren wesentlichen Bestandteile enthalten. Das scheinbare Molekulargewicht wird durch die Molekularausschluss- Chromatographie bestimmt, wobei Standardproteine mit einem bestimmten Molekulargewicht als Referenzmaterial eingesetzt werden.
Die in der erfindungsgemäßen Plasmafraktion vorwiegend enthaltenen Proteine der lαl Familie sind der Inter-alpha-Trypsininhibitor selbst und vorzugsweise mindestens ein weiteres Bikunin enthaltendes hochmolekulares Protein, also mit einem scheinbaren Molekulargewicht von mindestens 100 kDa wie der Präalpha-Inhibitor. Aber auch eine hochgereinigte lαl-Präparation kann durch das erfindungsgemäße Verfahren ohne weiteres erhalten werden, wobei die resul- tierende erfindungsgemäße Plasmafraktion bzw. lαl-Präparation keinen weiteren Bikunin-enthaltenden Bestandteil enthält, insbesondere im wesentlichen frei ist von separatem Bikunin. "Im wesentlichen frei" bedeutet hier weniger als 10%, bevorzugterweise weniger als 5% bezogen auf das Gesamtprotein. Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird die Bikunin-Plasmafraktion als Basis für eine pharmazeutische Zubereitung eingesetzt. Diese ist durch die gegebenenfalls weitere Reinigung der Bikunin-Proteine und durch Formulierung, Maßnahmen zur Sterilisierung bzw. Sterilfiltration sowie Inaktivierung von möglicherweise vorhandenen Pathogenen erhältlich. Vorzugsweise wird die pharmazeutische Präparation als Lyophilisat zur Verfügung gestellt, beispielsweise formuliert mit stabilisierenden Polyolen, Zucker, Zuckeralkoholen, Aminosäuren oder anorganischen Salzen, welche Formulierung für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.
Die pharmazeutische Anwendung von Plasmaprodukten birgt ein Risiko der Übertragung von möglicherweise im Ausgangsplasma vorhandenen Pathogenen, wie z.B. von durch Blut übertragbare Viren mit sich. Dazu zählen die Hepatitisviren A, B, C, die HI-Viren und Parvovirus. Um das Risiko zu mindern, werden daher bei der Herstellung der Plasmaderivate verschiedene Maßnah- men zur Reduktion von möglicherweise vorhandenen Viren durch Inaktivierung oder Abreicherung bzw. Entfernung eingesetzt. Zur Inaktivierung von Viren wird etwa die Hitzebehandlung in wässriger Lösung oder im Lyophilisat eingesetzt, wobei das Erhitzen vorzugsweise des gereinigten Produktes ("bulk") oder im Endbehälter vorgenommen wird. Dabei können Stabilisatoren wie anorganische Salze, Zucker, Zuckeralkohole, Polyole im allgemeinen oder Aminosäuren einen vorteilhaften Effekt zum Erhalt der Bikunin-Aktivität zeigen. Weiter ist die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, etwa mit TNBP (Tri- n-Butylphosphat), gegebenenfalls in Anwesenheit von Detergenzien, oder Tensiden, wie Triton, Tween, Cholat, und dergleichen, eine bevorzugte Maß- nähme zur Inaktivierung von Viren. Weitere Methoden sehen verschiedene Chemikalien, wie z.B. Thiocyanate, Monochloressigsäure oder organische Säuren vor. Auch Alkohole haben eine Virus inaktivierende Wirkung.
Zur Abreicherung bzw. Entfernung von Viren eignet sich insbesondere die Nanofiltration, etwa im cross-flow (tangentialer Fluss) oder im "dead-end" (Durchfluss) Verfahren. Die dazu verwendeten Filtermaterialien sind einerseits Membranen bzw. Tiefenfilter oder Ultrafilter. Etwa werden Filter mit einer Porengröße im Bereich von 15 bis 30 nm eingesetzt.
Die Testung der therapeutischen Einsetzbarkeit der erfindungsgemäßen Plas- mafraktion oder pharmazeutischen Zubereitung erfolgt vorerst in geeigneten Tiermodellen. Als anerkanntes Modell wurde etwa ein Rattenmodell der poly- mikrobiellen Sepsis (vergleiche Yang S. et al, Am. J- Physiol 277, H1036- H1044 (1999) and Wang P, et al, J- Surg. Res. 85, 59-65 (1999)) eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die erfindungsgemäße Bikunin-Plasmafraktion mit einer Dosis von beispielsweise 30 mg/kg die Mortalität der Tiere signifikant herabsetzte. Die therapeutische Dosis wird etwa im Bereich von 3 bis 300 mg/kg vermutet, je nach Grad der Sepsis und des Zeitpunktes der Verabreichung.
Eine erfindungsgemäße Verwendung der Bikunin-Plasmafraktion oder der pharmazeutischen Zubereitung, vor allem derjenigen, die im wesentlichen aus den Proteinen besteht, die ein scheinbares bzw. auch durch andere Methoden als die Gelpermeation verifiziertes Molekulargewicht von 100 bis 500 kDa aufweisen, zur Behandlung von septischen Zuständen, umfassend schwere entzündliche Prozesse im Rahmen einer Sepsis oder septischen Schock, ist daher ein weiterer vielversprechender Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele noch weiter beschrieben.
1. Herstellung der Bikunin-Plasmafraktion
Plasma-Kryopräzipltat wurde mit TNBP und Triton zur Inaktivierung von Viren behandelt. Anschließend wurde das Gemisch über den Anionenaustauscher EMD - TMAE - Sephadex, einem Tentakelgel, aufgetrennt, wobei eine Fraktion enthaltend den Faktor VIII sowie den vWF gewonnen wurde. Diese Fraktion wurde weiter aufgetrennt unter Einsatz der Molekularausschluss- Chromatographie an Superose 6 (Pharmacia). Die hochmolekulare Fraktion enthaltende vWF und den FVIII/vWF Komplex wurde abgetrennt und die Fraktion enthaltend Moleküle mit dem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 500 kDa wurde gewonnen.
Nach elektrophoretischer Analyse und immunchemischer Auswertung konnte nachgewiesen werden, dass 80% der Proteine dieser Plasmafraktion der Familie des lαl mit Bikunin Aktivität zuzuordnen ist.
2. Reinigung der Bikunin-Plasmafraktion durch Immunaffinitätschromatoαraphie
Ein Maus-monoklonaler Antikörper Mab 69.31, hergestellt auf Basis einer gereinigten Plasmafraktion aus Beispiel 1, mit inhibierender Wirkung gegen die Bikunin-Aktivität, wurde mit konventionellen Methoden hergestellt und selek- tioniert. Dieser Antikörper wurde an einem Träger, geeignet zur Immunaffini- tätschromatographie, immobilisiert. Eine Bikunin-Plasmafraktion konnte damit aus den folgenden Quellen isoliert werden: Humanes Plasma, Plasma- Kryopräzipitat, über Ionenaustauscher gereinigtes Plasma-Kryopräzipitat sowie die Bikunin-Plasmafraktion aus Beispiel 1 zum Erhalt einer weiter gereinigten Fraktion.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer Bikunin-Plasmafraktion mit Antitrypsin Aktivität, wobei eine die Bikunin-Plasmafraktion enthaltende Quelle mittels Mole- kularausschluss-Chromatographie in Komponenten getrennt wird und eine Fraktion mit Antitrypsin Aktivität gesammelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bikunin-Plasmafraktion enthaltende Quelle Kryopräzipitat oder Kryoüberstand ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei in der Bikunin- Plasmafraktion vorhandene Proteine ein Molekulargewicht von 100 bis 500 kDa aufweisen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bikunin-Plasmafraktion durch Immunaffinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Bikunin weiter gereinigt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bikunin-Plasmafraktion durch Ionenaustausch-, Affinitäts-, Molekularaus- schluss-Chromatographie und/oder hydrophober Chromatographie weiter gereinigt wird.
6. Humane Bikunin-Plasmafraktion erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welche das Bikunin assoziiert mit mindestens einer schweren Kette von Inter- α-Trypsininhibitor enthält, im wesentlichen frei von freiem Bikunin.
7. Bikunin-Plasmafraktion nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 70% der Proteine eine Antitrypsin -Aktivität aufweisen.
8. Bikunin-Plasmafraktion nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 90% der Proteine eine Antitrypsin-Aktivität aufweisen.
9. Bikunin-Plasmafraktion nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Antitrypsin-Aktivität mindestens 50 mal höher als in Humanplasma ist.
10. Bikunin-Plasmafraktion nach einem der Ansprüche 6 bis 9, mit Proteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht von 100 bis 500 kDa aufweisen.
11. Bikunin-Plasmafraktion nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie Inter-α-Trypsininhibitor enthält.
12. Bikunin-Plasmafraktion nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie Inter-α-Trypsininhibitor und mindestens ein weiteres Bikunin enthaltendes hochmolekulares Protein enthält.
13. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Bikunin-Plasmafraktion nach einem der Ansprüche 6 bis 12.
14. Antikörper, erhältlich durch Immunisierung von geeigneten Systemen mit einer Bikunin-Plasmafraktion nach einem der Ansprüche 6 bis 12.
15. Träger mit einem Antikörper nach Anspruch 14, der eine Affinität zu Inter-α- Trypsininhibitor aufweist.
16. Träger mit einem monoklonalen Antikörper gerichtet gegen Bikunin, der zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 4 geeignet ist..
17. Verwendung einer Bikunin-Plasmafraktion nach einem der Ansprüche 6 bis 12, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Sepsis.
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