DE3751576T2

DE3751576T2 - Virale Inaktivierung und Reinigung von aktiven Proteinen.

Info

Publication number: DE3751576T2
Application number: DE3751576T
Authority: DE
Inventors: Robert E Jordan; Jaleh Kilpatrick
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1987-06-27
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2007-06-28
Also published as: EP0252392B1; JPS6323896A; JPH0768275B2; AU7497587A; JPH06321994A; EP0252392A3; DE3751576D1; CA1341269C; JPH083197A; AU589868B2; US4749783A; EP0252392A2; JPH07116236B2

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Reinigung sicherer und wirksamer aktiver Proteinprodukte, bei denen ein viraler Inaktivierungsschritt einem Endreinigungsschritt des aktiven Proteins vorausgeht. Durch Umkehr der üblichen Abfolge von Reinigungsschritten, gefolgt von einer viralen Deaktivierung ist es möglich, inaktives oder denaturiertes Protein, das aus den relativ strengen Bedingungen des viralen Inaktivierungsschrittes stammt, zu entfernen. Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf ein spezifisches aktives Protein, bekannt als Antithrombin, erläutert. Wie im folgenden beschrieben, ist jedoch das offenbarte Verfahren auf andere biologisch aktive Proteine anwendbar.
Antithrombin, auch bekannt als Antithrombin ITT, AT-III oder Heparin-Cofaktor, ist ein Plasmaprotein mit der Fähigkeit zur Inhibierung des Gerinnungsprozesses. Antithrombin ist ein Inhibitor von Koagulationsproteasen, dessen inhibitorische Aktivität deutlich in Gegenwart von Heparin erhöht wird. Heparin ist ein sulfatiertes Glycosaminoglycan tierischen Ursprungs, das weit verbreitet als klinischer Gerinnungshemmer eingesetzt wird.
Es wurde gezeigt, daß Individuen, denen normale zirkulierende Spiegel an Antithrombin in ihrem Blutplasma fehlen, ein erhöhtes Risiko für eine Thrombose haben. Mangelzustände können entweder ererbt oder erworben sein.
Antithrombinspiegel unterhalb 70 % von Normalwert von gepooltem Plasma gehen einher mit einem thrombotischen Risiko. Ersatztherapie mit gereinigtem aus Plasma gewonnenem Antithrombin kann für Individuen mit solchen Mangeln von deutlichem Vorteil sein.
Verstärkung der Antithrombinaktivität durch Heparin beruht primär auf einer Bindungswechselwirkung zwischen Heparin und dem Inhibitor. Die Erkennung der engen und hochspezifischen Natur dieser Bindungswechselwirkung bewirkte die Verwendung von immobilisiertem Heparin als ein Affinitätsträger für die Adsorption von Antithrombin aus biologischen Flüssigkeiten. Siehe US-Patent Nr. 3 842 061, Anderson et al. Es wurde von einer Vielzahl von Forschern gezeigt, daß diese Technik ein hoch effektiver Schritt zur Erzielung einer deutlichen Reinigung von Antithrombin ist. Praktisch alle großmaßstäblichen Verfahren zur Isolierung von Antithrombin nutzen daher die Affinitätsadsorption an immobilisiertes Heparin. Andere Beispiele für Antithrombinreinigung sind gut bekannt.
Die Verwendung von Heparin-Affinitätschromatographie zur direkten Adsorption von Antithrombin aus Plasma in einem frühen Stadium in dem kommerziellen kalten Cohn-Ethanol- Verfahren ist jedoch aus mehreren Gründen kompliziert. Plasma ist eine hoch komplexe Mischung von Proteinen und anderen Bestandteilen mit variierenden Affinitäten für Heparin. Ein direkter Kontakt der immobilisierten Heparinträger mit dem Plasma führt zur Adsorption vieler dieser Komponenten. Da mehrere verschiedene Proteinprodukte aus der gleichen Plasmaquelle erhalten werden, sind ernste Vorsorgemaßnahmen notwendig hinsichtlich der Möglichkeit der Einführung schädlicher Veränderungen in diesen Produkten als Ergebnis des Affinitätskontaktschrittes.
Die Adsorption einer Vielzahl von Plasmakomponenten an das Affinitätsgel erfordert auch die selektive Desorption unerwunschter Verunreinigungen vor der Elution des Antithrombins selbst. Die Durchführung in einem einzelnen Affinitätschromatographieschritt hat sich als ziemlich schwierig herausgestellt und erfordert häufig zusätzliche Reinigungsschritte zur Entfernung dieser Verunreinigungen. Alternativ kann die Aufnahme intensiver Waschschritte vor der Elution des Antithrombins vom Heparingel die Reinigung auf ein akzeptables Maß erhöhen, jedoch nur unter einem deutlichen Verlust in der Antithrombinausbeute.
Wegen der großen Volumina, die üblicherweise während der kommerziellen Plasmafraktionierung eingesetzt werden, und wegen der möglichen Auswirkungen der Chromatographieschritte auf Produkte, die aus späteren Aufbereitungsschritten stammen, hat man unbenutzte Abfallfraktionen der Aufbereitung als Antithrombinquelle angesehen. Insbesondere wurde gefunden, daß die Plasmaquelle Cohn-Fraktion-IV-1, ein normalerweise verworf enes Präzipitat aus einem Zwischenschritt vor der Albuminreinigung, eine reiche Antithrombinquelle ist. Siehe Wickerhauser et al., Vox Sang. 36, 281-293 (1979). Solche eine Quelle stellt jedoch keine ideale Lösung für die Chromatographie (nach Resuspendierung) aufgrund des Vorliegens großer Mengen an Lipoproteinen und anderen denaturierten Komponenten dar. Es ist normalerweise sehr schwierig, hohe Reinigungsspiegel an Antithrombin durch direkte Chromatographie der Fraktion-IV-1-Lösungen auf immobilisierten Heparin ohne große Ausbeuteverluste zu erreichen. Ferner sagt das Dokument nichts zum Problem und der Lösung zur Abtrennung aktiven und inaktiven Formen einer Proteinspezies. Zusätzlich beschreibt dieses Dokument die Reinigung mit einer Aktivitätsausbeute von nur 16 %. EP 99445 beschreibt eine Sterilisierung von Blutplasma, so daß die wertvollen Proteine, die darin vorliegen, nicht in bemerkenswertem Ausmaß denaturiert werden. In solch einem Fall besteht kein Bedarf zur Abtrennung denaturierter Proteine.
Eine zusätzliche Überlegung zur Reinigung irgendeines Proteins aus einem gepoolten Blutplasma oder anderen Quellen für biologisch aktive Proteine ist die Möglichkeit einer viralen Kontamination. Hepatitis-B-Virus und AIDS-Virus bereiten insbesondere Sorge. Im Hinblick auf Hepatitis B wurde gezeigt, daß Erhitzen auf 60ºC für 10 Stunden in Gegenwart von 0,5 M Natriumcitrat zu einer kompletten Inaktivierung des Virus führt. Siehe Tabor et al., Thrombosis Research 22, 233-238 (1981). Der Hauptteil der Antithrombinaktivität wird während dieser Hitzebehandlung beibehalten, obwohl das Auftreten eines signifikanten und variierenden Ausmaßes an Inaktivierung beobachtet wurde. Siehe Tabor et al. oben und Barrowcliffe et al., Fr. J. Haematology, 55, 37-46 (1983). Daher ist das Bedürfnis der Gewährleistung von Sicherheit vor Viruskontamination durch ein gewisses Risiko der Verursachung einer Inaktivierung des Antithrombin selbst begleitet. Die letztere Möglichkeit bereitet Grund zur Sorge, da die Injektion Hitzedenaturierter Proteine eine Reaktion im Patienten aufgrund der potentiellen neo-antigenen Natur dieser Materialien auslösen kann.
Bis heute haben groß-maßstäbliche Herstellungsverfahren für klinische Antithrombinkonzentrate einen Pasteurisierungsschritt im Anschluß an den Affinitätsadsorptionsschritt an immobil isiertem Heparin umfaßt. Daher enthalten diese Produkte möglicherweise große Mengen an denaturiertem Antithrombin, wie von Barrowcliffe et al., siehe oben, gezeigt. Wir kennen keine Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Proteinprodukte, bei denen denaturierte oder inaktive Proteine und andere Verunreinigungen nach einem viralen Inaktivierungsschritt entfernt werden.
Wir beschreiben hier ein Verfahren zu Reinigung biologisch aktiver Proteine, welches jede der obigen Probleme anspricht. Dieses Verfahren soll für viele aktive therapeutische Proteine anwendbar sind. Wie im folgenden dargestellt, zeigen wir, daß unser Verfahren insbesondere für die Isolierung von Antithrombin aus einer Mischung von Plasmaproteinen, wie der Cohn-Fraktion-IV-1, geeignet ist. Die wesentlichen Bestandteile des Verfahrens umfassen zwei Abtrennstufen: einen einleitenden viralen Inaktivierungsschritt (z. B. Pasteurisation) und einen anschließenden Abtrennschritt für das biologisch aktive Protein. Im beispielhaften Fall von Antithrombin wird ein teilweise gereinigtes Antithrombinkonzentrat einem viralen Inaktivierungsschritt (z. B. Pasteurisierung in Gegenwart von 0,5 M Natriumcitrat, wie oben beschrieben, z. B. von Tabor et al., oben) unterworfen. Dann wird die hitzebehandelte Antithrombinlösung abgetrennt, z. B. direkt auf einen Heparin-Affinitätsgel (immobilisiertes Heparin). Dieser Affinitätschromatographieschritt stellt die Entfernung der meisten kontaminierenden Bestandteile aus der ersten Reinigung, wie auch die meisten der denaturierten Proteine, einschließlich des aktivierten Antithrombins selbst, das aus dem Hitzebehandlungsschritt stammt, sicher. Dann wird das Antithrombin eluiert und konzentriert. Dann wird das Konzentrat vorzugsweise weiter aufbereitet, so daß es z. B. die erwünschten Exzipienten enthält, und gefriergetrocknet. Das erhaltene lyophilisierte Protein (Antithrombin)- Konzentrat ist durch einen hohen Reinheitsgrad, einen bemerkenswerten Grad an Virussicherheit und durch ein praktisch vollständiges Fehlen von denaturiertem oder inaktivem Antithrombin gekennzeichnet. Plasmaquellen für aktive Proteine, wie Antithrombin sind gut bekannt. Unsere bevorzugte Quelle ist eine Lösung einer bislang verworfenen Fraktion, bekannt als Cohn-Fraktion-IV-I-Paste. Es wird vermutet, daß andere aktive Proteine, wie Blutplättchenfaktor-IV, Geringungsfaktoren II, V, VII, VIII, IX und X, Proteine C und S und Proteine (wie Antikörper, Wachstumsfaktoren alpha-1-PI und praktisch jedes Protein mit einer biologischen Aktivität, welches gereinigtwerden kann), die im Plasma gefunden werden oder aus gentechnisch veränderten Mikroorganismen oder Zellinien exprimiert werden, in gleicher Weise hergestellt und im wesentlichen frei von aktivem Virus und auch im wesentlichen frei von inaktiven Formen des Proteins gemacht werden können.
Bei der Antithrombinreinigung verwendet unser bevorzugter Abtrennschritt Heparin, das auf einen Kohlenhydratträger immobilisiert ist (z. B. Heparin, das kovalent an Sepharoseagarose gebunden ist). Unter Anwendung der Methoden dieser Offenbarung waren wir in der Lage, ein gereinigtes Antithrombinprodukt, das im wesentlichen frei von aktiven Viren ist, zu erhalten.
Die Erfindung ist gekennzeichnet durch ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Proteinproduktes, das im wesentlichen frei von aktiven Viren ist, umfassend die Schritte:
(a) Unterwerfen einer Quelle für ein gegebenes biologisch aktives Protein unter einem Virusinaktivierungsschritt unter Bedingungen, die zur Inaktivierung von allen vorhandenen Viren genügen und worin etwas von den therapeutischen Proteinen aufgrund der Bedingungen des viralen Inaktivierungsschrittes inaktiviert oder denaturiert ist, und
(b) Unterwerfen des Produkts aus Schritt (a) einem Proteinabtrennschritt unter Bedingungen, die zur Entfernung biologisch inaktiver Formen des Proteins genügen, so daß die inaktiven Formen weniger als 10 Gew.% des Gesamtproteins ausmachen.

BEISPIEL I

(ANTITHROMBINHERSTELLUNG)

Cohn-Fraktion-IV-1-Paste, 6 kg (gewonnen aus gepooltem Plasma und eingefroren gelagert bei -30ºC), wurde in einem Gesamtvolumen von 50 l eines Puffers aus 0,1 M Tris, 0,02 M Natriumchlorid, pH 8,1, gelöst. Nach 1-stündigem Rühren bei 5ºC wurde die Lösung auf 40ºC erwärmt und das Rühren eine weitere Stunde fortgesetzt. Die Lösung wurde auf 20ºC gekühlt. Heparin-Sepharosegel (ein immobilisiertes Heparin), 6 kg, zuvor in 0,02 M Tris, 0,15 M Nacl, pH 7,8, äquilibriert, wurde dann zu der Fraktion-IV-1-Lösung zugegeben und 20 Minuten gerührt. Die Suspension wurde in einen Filtertrichter überführt, und die Filtratfraktion-IV-1- Lösung gesainnelt und verwahrt. Dann wurde das Gel intensiv mit einem Puffer aus 0,02 M Tris, 0,3 M NaCl, pH 7,5, gewaschen, bis die Absorption des Eluats (280 nm) 0,36 erreichte. Dann erfolgt die Elution des Antithrombins durch Waschen des Gels mit einem Puffer aus 0,02 M Tris, 2,0 M NaCl, pH 7,5. Das gesamte Material, das mit einer Absorption von größer als 0,2 (280 nm) eluierte, wurde als Pool für die weitere Aufarbeitung gesammelt.
Das gepoolte Eluat aus der Heparin-Sepharose-Batch-Adsorption wurde dann in einer Hohlfaser-Ultrafiltrationsvorrichtung (Romicon) auf ein Endvolumen von 4,0 l konzentriert und auf einen Endpuffer, aus 0,02 M Natriumphosphat, 0,15 M Nacl, 0,5 M Natriumcitrat, pH 7,5, diafiltriert. Dann wurde die Lösung in einem mit einem Wassermantel versehenen Gefäß unter Bedingungen erhitzt, die ausreichten, um eine virale Inaktivierung sicherzustellen (z. B.10 Stunden bei einer Lösungstemperatur von 60ºC ± 0,5ºC).
Nach der Hitzebehandlung wurde die Lösung auf 20ºC gekühlt und durch ein 0,2-Mikrometerfilter unter Entfernung von partikulärem Material aus der Pasteurisierung filtriert. Die filtrierte Lösung, einschließlich einer Spüllösung für die Filterapparatur, wurde dann direkt auf eine Heparin- Sepharose-Säule (14x 21 cm), die zuvor mit einem Puffer aus 0,02 M Natriumphosphat, 0,15 M Nacl, pH 7,5, äquilibriert worden war, aufgegeben, und die Säule wurde mit diesem Puffer nach der Probenaufbringung gewaschen. Die Absorption der Eluatlösung wurde überwacht (280 nm) bis ein Grundlinienlevel erreicht wurde, und dann wurde die Säule mit Phosphatpuffer, der 2 M NaCl enthielt, eluiert. Das gesamte Materiale das mit einer Absorption von größer als 0,04 eluierte, wurde als Pool mit einem Gesamtvolumen von 3,05 l gesammelt. Eine Summe der Antithrombinausbeuten ist in der folgenden Tabelle angegeben. TABELLE REINIGUNG VON ANTITHROMBIN AUS KG FAKTOR-IV-1 Antithrombin-spezifische Aktivität Schritt Volumen (Liter Antithrombineinheiten/ml Gesamteinheiten Einheiten/A280 Ausbeute Fraktion-IV-1-Suspension Heparin-Sepharose-Batch-Eluat Pasteurisiertes Eluat Eluat aus der Haparin-Sepharose-Chromatographie

BEISPIEL 2

Die Schritte des Beispiels I, mit Ausnahme, daß das pasteuerisierte Antithrombin-Endprodukt anschließend mit einer Aminosäure (0,1 M Alanin) als Stabilisator lyophilisiert wurde.

BEISPIEL III

Die Schritte des Beispiels 1, jedoch mit einem zusätzlichen Waschschritt des Heparin-Agarosegels, worauf chargenweiser Kontakt der Fraktion-IV-1-Lösung mit einem Puffer, enthaltend 0,2 M Tris, 0, 15 M NaCl und l bis 2 g Dextransulfat pro Liter, pH 7,5, folgt.
Obwohl die obigen Beispiele die virale Inaktivierung und Reinigung eines sehr spezifischen aktiven Proteins, Antithrombin, beschreiben, sollte man beachten, daß die offenbarte Technik auch auf eine große Vielzahl aktiver Proteine, erhalten aus einer Vielzahl von Quellen (z. B. tierisches oder humanes Plasma, gentechnisch veränderte Mikroorganismen und Zellinien, usw.) anwendbar sein sollte. Die Haupterfordernisse für den Einsatz der offenbarten Technik sind 2-fach: (1) virale Inaktivierung in einem biologisch aktiven Proteinprodukt, und (2) ein aktives Proteinprodukt mit einer minimalen, falls überhaupt, denaturierten oder inaktivierten Form des aktiven Proteins.
Beispiele viraler Inaktivierungstechniken, die verwendet werden können, sind Pasteurisierung, chemische Behandlung (z. B. unter Verwendung von Mitteln wie Kupferphenanthrolin, wie in US-4 534 972, usw.) und Bestrahlung. Beispiele aktiver Proteinabtrennungstechniken umfassen Verfahren, die eine Abtrennung aufgrund der biologischen Aktivität des Proteins erlauben, so daß eine Unterscheidung zwischen aktiver und inaktiver Formen (z. B. Affinitätschromatographie oder jegliche Verwendung eines spezifischen Bindungsmittels, wie eines Antikörpers, der eine biologisch aktive Form des Proteins erkennt) besteht.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "biologisch aktiv", wenn auf Proteine angewandt, diejenige Form oder Konfiguration des Proteins, bei der das Protein seine beabsichtigte Funktion zeigt oder für einen beabsichtigten Zweck geeignet ist (im Gegensatz zum gleichen Protein in einem inaktiven denaturierten oder nutzlosen Stadium). Ob ein gegebenes Protein eine biologische Aktivität zur Demonstrierung seiner beabsichtigten Funktion oder zur Erreichung des beabsichtigten Ergebnisses besitzt, kann nach dem Fachmann bekannten Mitteln durchgeführt werden (z. B. einfacher Funktionsaktivitätstest, immunologisch, usw.).
Virale Inaktivierung oder im wesentlichen frei von aktiven Viren bedeutet Entfernung oder Inaktivierung von irgendwelchen vorhandenen Viren auf ein sicher akzeptierbares oder nicht nachweisbares Maß. "Eine pasteuerisierte Form einer gegebenen aktiven Proteinpräparation" bedeutet eine Präparation, die einer Pasteurisierung oder einer Hitzebehandlung unterzogen wurde, die zur Inaktivierung aller vorhandenen Viren ausreicht (z. B. Erhitzen auf 60ºC für mindesten ca. 10 Stunden). "Frei von denaturierten oder inaktiven Formen eines gegebenen Proteins" bedeutet, daß ein gegebenes Proteinprodukt hauptsächlich biologisch aktive Formen des Proteins enthält und die denaturierte oder inaktive Form abwesend ist oder in nicht nachweisbaren oder minimalen Mengen vorhanden ist (z. B. weniger als ca. 10 Gew.% im allgemeinen oder bei Antithrombin ist die inaktive Spezies des Antithroinbins weniger als 10 %, bestimmt durch Kreuz-Immunelektrophorese).
Im Lichte der obigen Offenbarung sind Variationen dem Fachmann offensichtlich. Demnach soll das obige Beispiel als erläuternd ausgelegt werden, und der Umfang der Erfindung sollte nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt sein.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven therapeutischen Proteinproduktes, das im wesentlichen frei von aktiven Viren ist, umfassend die Schritte:

(a) Unterwerfen einer Quelle für ein gegebenes biologisch aktives Protein einem Virusinaktivierungsschritt unter Bedingungen, die zur Inaktivierung aller vorhandenen Viren genügen, und worin etwas von den therapeutischen Proteinen aufgrund der Bedingungen des viralen Inaktivierungsschrittes inaktiviert oder denaturiert ist, und

(b) Unterwerfen des Produkts aus Schritt (a) einem Proteinabtrennschritt unter Bedingungen, die zur Entfernung biologisch inaktiver Formen des Proteins genügen, so daß die inaktiven Formen weniger als 10 Gew.% des Gesamtproteins ausmachen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das biologisch aktive Protein ausgewählt ist aus einem Plasmaprotein und einem Protein abgeleitet von einem Mikroorganismus oder Zellinie, die zur Expression des Proteins in der Lage ist.

3. Verfahren nach 1, worin das Produkt in Schritt (a) durch Erhitzen der Lösung auf eine Temperatur von mindestens ca. 60ºC für mindestens ca. 10 Stunden pasteurisiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Protein Antithrombin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die inaktivierten Formen des Antithrombins weniger als ca. 10 % des gesamten Antithrombins, bestimmt durch Kreuz-Immunelektrophorese und einem funktionalen AT-III-Aktivitätstest ausmachen.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Abtrennung in Schritt (b) das Inkontaktbringen einer Lösung des Produkts umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das immobilisierte Heparin an ein Kohlenhydrat-Trägermaterial gebundenes Heparin umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Antithrombin aus einer humanen Plasmalösung oder einem humanen Plasmafraktionsderivat, umfassend die Schritte:

(a) Inkontaktbringen der Lösung mit immobilisiertem Heparin unter Bedingungen, die zur Komplexierung des in der Lösung vorhandenen Antithrombins genügen;

(b) Elution des Antithrombins vom immobilisierten Heparin unter Bildung einer Antithrombinlösung;

(c) Pasteurisierung der Lösung aus Schritt (b);

(d) Inkontaktbringen der Lösung aus Schritt (c) mit immobilisiertem Heparin unter Bedingungen, die zur Komplexierung des Antithrombins mit dem immobilisierten Heparin genügen; und

(e) Elution des Antithrombins vom immobilisierten Heparin des Schritts (d).

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Antithrombin aus einem humanen Plasma-Fraktionsderivat, bekannt als Cohn- Fraktion-IV-1-Paste, gereinigt wird.

10. Hoch gereinigte Antithrombinpräparation, umfassend aktives Antithrombin, das im wesentlichen frei von aktiven Viren ist, enthaltend weniger als ca. 10 % deaktiviertes Antithrombin.

11. Präparation nach Anspruch 10 in lyophilisierter Form, einschließlich einem Alaninstabilisator.

12. Präparation nach Anspruch 10 in einer pharmazeutisch annehmbaren Form.

13. Antithrombinpräparation nach einem der Ansprüche 10 bis 12, enthaltend weniger als 10 % deaktiviertes Antithrombin, bestimmt durch Kreuz-Immunelektrophorese.