JPH0768275B2 - ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 - Google Patents
ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製Info
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- JPH0768275B2 JPH0768275B2 JP62171330A JP17133087A JPH0768275B2 JP H0768275 B2 JPH0768275 B2 JP H0768275B2 JP 62171330 A JP62171330 A JP 62171330A JP 17133087 A JP17133087 A JP 17133087A JP H0768275 B2 JPH0768275 B2 JP H0768275B2
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Description
【発明の詳細な説明】 この開示は、一般に、ウイルスの不活性化工程を最後の
活性蛋白質精製工程の前に実施する、安全な効率の高い
活性蛋白質生成物の精製に関する。精製および引続くウ
イルスの不活性化の普通の順序を逆転することによっ
て、比較的過酷な条件のウイルスの不活性化工程から生
ずる不活性または変性された蛋白質を除去することが可
能である。本発明は、アンチトロビンとして知られてい
る特別の活性蛋白質を使用して例示する。しかしなが
ら、後述するように、開示する方法は他の生物学的に活
性な蛋白質に適用することができる。
活性蛋白質精製工程の前に実施する、安全な効率の高い
活性蛋白質生成物の精製に関する。精製および引続くウ
イルスの不活性化の普通の順序を逆転することによっ
て、比較的過酷な条件のウイルスの不活性化工程から生
ずる不活性または変性された蛋白質を除去することが可
能である。本発明は、アンチトロビンとして知られてい
る特別の活性蛋白質を使用して例示する。しかしなが
ら、後述するように、開示する方法は他の生物学的に活
性な蛋白質に適用することができる。
アンチトロンビンは、また、アンチトロンビンIII、AT
−IIIまたはヘパリンコファクターとして知られてお
り、凝固プロセスを阻害する能力をもつ血漿蛋白質であ
る。アンチトロンビンは凝固プロテアーゼ類の阻害剤で
あり、その阻害剤活性はヘパリンの存在下の顕著に増大
される。ヘパリンは、臨床的に抗凝固剤として広く使用
されている動物起源の硫酸化グリコサミノグリカンであ
る。
−IIIまたはヘパリンコファクターとして知られてお
り、凝固プロセスを阻害する能力をもつ血漿蛋白質であ
る。アンチトロンビンは凝固プロテアーゼ類の阻害剤で
あり、その阻害剤活性はヘパリンの存在下の顕著に増大
される。ヘパリンは、臨床的に抗凝固剤として広く使用
されている動物起源の硫酸化グリコサミノグリカンであ
る。
血液血漿中のアンチトロンビンの正常の循環レベルに欠
ける患者は、血栓症の危険が増大しているＫとが示され
た。欠乏した状態は先天性または後天性であることがあ
る。プールした正常血漿のそれの70％より低いアンチト
ロンビンレベルは、血栓症の危険に関連する。精製され
た血漿誘導アンチトロンビンを使用する置換の治療は、
このような欠乏を有する固体にとって、かなり有益であ
ることがる。
ける患者は、血栓症の危険が増大しているＫとが示され
た。欠乏した状態は先天性または後天性であることがあ
る。プールした正常血漿のそれの70％より低いアンチト
ロンビンレベルは、血栓症の危険に関連する。精製され
た血漿誘導アンチトロンビンを使用する置換の治療は、
このような欠乏を有する固体にとって、かなり有益であ
ることがる。
ヘパリンによるアンチトロンビン活性の増強は、主とし
てヘパリンと阻害剤との間の結合の相互作用に起因す
る。この結合の相互作用の厳密な高度に特異的な性質の
認識は、生物学的流体からのアンチトロンビンの吸着の
ための親和性支持体として、固定化されたヘパリンを使
用することを誘発した。アンダーソン（Anderson）らへ
の米国特許第3,842,061号参照。この技術は、多数の研
究者らによって、アンチトロンビンの十分な精製を達成
するための高度に有効な工程であることが示された。し
たがって、アンチトロンビンのための事実上大規模な分
離方法は、固定化されたヘパリン上への親和吸着を用い
る。アンチトロンビン精製の他の例はよく知られてい
る。
てヘパリンと阻害剤との間の結合の相互作用に起因す
る。この結合の相互作用の厳密な高度に特異的な性質の
認識は、生物学的流体からのアンチトロンビンの吸着の
ための親和性支持体として、固定化されたヘパリンを使
用することを誘発した。アンダーソン（Anderson）らへ
の米国特許第3,842,061号参照。この技術は、多数の研
究者らによって、アンチトロンビンの十分な精製を達成
するための高度に有効な工程であることが示された。し
たがって、アンチトロンビンのための事実上大規模な分
離方法は、固定化されたヘパリン上への親和吸着を用い
る。アンチトロンビン精製の他の例はよく知られてい
る。
しかしながら、商業的コーン冷エタノール法（Cohn col
d ethanol process）における初期の時点における血漿
からのアンチトロンビンの直接吸着のためのヘパリン親
和クロマトグラフィーの使用は、いくつかの理由で複雑
である。血漿は蛋白質と、ヘパリンに対する親和性を変
化させる他の成分との高度に複雑な混合物である。固定
化されたヘパリン支持体を血漿と直接接触させると、こ
れらの成分の多くは吸着する。同一源の血漿からいくつ
かの異なる蛋白質生成物が得られるので、親和接触工程
の結果として、これらの生成物における悪い変化を導入
する可能性に関して重要な考慮がなされる。
d ethanol process）における初期の時点における血漿
からのアンチトロンビンの直接吸着のためのヘパリン親
和クロマトグラフィーの使用は、いくつかの理由で複雑
である。血漿は蛋白質と、ヘパリンに対する親和性を変
化させる他の成分との高度に複雑な混合物である。固定
化されたヘパリン支持体を血漿と直接接触させると、こ
れらの成分の多くは吸着する。同一源の血漿からいくつ
かの異なる蛋白質生成物が得られるので、親和接触工程
の結果として、これらの生成物における悪い変化を導入
する可能性に関して重要な考慮がなされる。
親和ゲルへの多数の血漿成分の吸着は、また、アンチト
ロンビンそれ自体の溶離の前に、望ましくない汚染物質
の選択的吸着を必要とする。これは単一の親和クロマト
グラフィー工程において達成することが非常に困難であ
ることが立証されそして、しばしば、これらの不純物を
除去するための追加の精製工程を含めることを必要とす
る。あるいは、ヘパリンのゲルからアンチトロンビンを
溶離するる前に、広範な洗浄工程を含めることは、純度
を許容されうるレベルに増加するが、アンチトロンビン
の収量をかなり減少させるだけである。
ロンビンそれ自体の溶離の前に、望ましくない汚染物質
の選択的吸着を必要とする。これは単一の親和クロマト
グラフィー工程において達成することが非常に困難であ
ることが立証されそして、しばしば、これらの不純物を
除去するための追加の精製工程を含めることを必要とす
る。あるいは、ヘパリンのゲルからアンチトロンビンを
溶離するる前に、広範な洗浄工程を含めることは、純度
を許容されうるレベルに増加するが、アンチトロンビン
の収量をかなり減少させるだけである。
商業的血漿の分画の間に通常用いられる大きい体積およ
び処理の後の工程から誘導される生成物に対するクロマ
トグラフィーへ強い影響を及ぼす可能性のために、処理
の未使用廃棄画分はアンチトロンビン源として考慮され
てきた。とくに、アンブミンの精製前の中間工程から誘
導される、通常廃棄される沈殿である血漿源コーンフラ
クションIV−１は、アンチトロンビンに富んだ源である
ことが発見された。参照、ウィッカーハウゼル（Wicker
hauser）ら、ボックス・サング（Vox Sang.）36、281−
293（1979）。しかしながら、このような源は、多量の
リポ蛋白質および他の変性された成分のために、クロマ
トグラフィー（再懸濁後）のための理想的な溶液ではな
い。収量を大量に犠牲にしないで、固形化されたヘパリ
ンのコーンフラクションIV−１の溶液の直接クロマトグ
ラフィーにより、高いレベルのアンチトロンビンの純度
を得ることは通常非常に困難である。
び処理の後の工程から誘導される生成物に対するクロマ
トグラフィーへ強い影響を及ぼす可能性のために、処理
の未使用廃棄画分はアンチトロンビン源として考慮され
てきた。とくに、アンブミンの精製前の中間工程から誘
導される、通常廃棄される沈殿である血漿源コーンフラ
クションIV−１は、アンチトロンビンに富んだ源である
ことが発見された。参照、ウィッカーハウゼル（Wicker
hauser）ら、ボックス・サング（Vox Sang.）36、281−
293（1979）。しかしながら、このような源は、多量の
リポ蛋白質および他の変性された成分のために、クロマ
トグラフィー（再懸濁後）のための理想的な溶液ではな
い。収量を大量に犠牲にしないで、固形化されたヘパリ
ンのコーンフラクションIV−１の溶液の直接クロマトグ
ラフィーにより、高いレベルのアンチトロンビンの純度
を得ることは通常非常に困難である。
プールした血漿または生理学的に活性な蛋白質の他の源
から蛋白質を精製するための追加の考慮は、ウイルスの
汚染の可能性である。肝炎Ｂ型ウイルスおよびエイズの
ウイルスがとくに考えられる。肝炎Ｂ型ウイルスに関す
ると、0.5モルのクエン４酸ナトリウムの存在下に60℃
に10時間加熱すると、ウイルスは完全に不活性化するこ
とが示された。参照、テイバー（Tabor）ら、血栓症の
研究（Thrombosis Research）22、233−238（1981）。
アンチトロンビンの活性の大部分はこの熱処理の間に維
持されるが、有意なかつ変化する量の不活性化が起こる
ことが観測された。参照、上のテイバー（Tabor）ら、
およびバロウクリッフェ（Barrowcliffe）ら、Fr.J.Hae
matology）、55、37−46（1983）。こうして、ウイルス
の汚染からの安全性を確保する必要は、アンチトロンビ
ン自体の不活性化を引き起こす危険を多少伴なう。この
後者の可能性は、熱変性された蛋白質の注射が、これら
の物質の潜在的に新しい抗原性のために患者に応対を誘
発することがあるので、面倒である。
から蛋白質を精製するための追加の考慮は、ウイルスの
汚染の可能性である。肝炎Ｂ型ウイルスおよびエイズの
ウイルスがとくに考えられる。肝炎Ｂ型ウイルスに関す
ると、0.5モルのクエン４酸ナトリウムの存在下に60℃
に10時間加熱すると、ウイルスは完全に不活性化するこ
とが示された。参照、テイバー（Tabor）ら、血栓症の
研究（Thrombosis Research）22、233−238（1981）。
アンチトロンビンの活性の大部分はこの熱処理の間に維
持されるが、有意なかつ変化する量の不活性化が起こる
ことが観測された。参照、上のテイバー（Tabor）ら、
およびバロウクリッフェ（Barrowcliffe）ら、Fr.J.Hae
matology）、55、37−46（1983）。こうして、ウイルス
の汚染からの安全性を確保する必要は、アンチトロンビ
ン自体の不活性化を引き起こす危険を多少伴なう。この
後者の可能性は、熱変性された蛋白質の注射が、これら
の物質の潜在的に新しい抗原性のために患者に応対を誘
発することがあるので、面倒である。
現在まで、臨床的アンチトロンビン濃縮物のための大規
模な調製法は、固定化されたヘパリン上の親和吸着工程
に引続いて、低温殺菌工程を組込んだ。こうして、これ
らの生成物は、上のバロウクリッフェ（Barrowcliffe）
らが示すように、大量の変性されたアンチトロンビンを
潜在的に含有する。われわれは、変性または不活性化さ
れた蛋白質および他の不純物をウイルスの不活性化後に
除去する、生物学的に活性な蛋白質生成物を調製する方
法を知らない。
模な調製法は、固定化されたヘパリン上の親和吸着工程
に引続いて、低温殺菌工程を組込んだ。こうして、これ
らの生成物は、上のバロウクリッフェ（Barrowcliffe）
らが示すように、大量の変性されたアンチトロンビンを
潜在的に含有する。われわれは、変性または不活性化さ
れた蛋白質および他の不純物をウイルスの不活性化後に
除去する、生物学的に活性な蛋白質生成物を調製する方
法を知らない。
上の問題の各々を処理する、生物学的に活性な蛋白質の
精製法を、ここに記載する。この方法は、多くの活性な
治療的蛋白質について適用可能であると考えられる。後
に例示するように、本発明の方法は、血漿蛋白質の混合
物、例えば、コーンフラクションIV−１からアンチトロ
ンビンを分離するためにとくに適する。この手順の必須
の成分は、２つの工程を含む：初期のウイルスの不活性
化（例えば、低温殺菌）工程および引続く生物学的に活
性な蛋白質の調製工程。アンチトロンビンの例示する場
合において、部分的に精製されたアンチトロンビンの濃
縮物をウイルスの不活性化工程（例えば、テイバー（Ta
bor）らが前に記載したような、0.5モルのクエン酸ナト
リウムの存在下の低温殺菌）にかける。次いで、この熱
処理したアンチトロンビン溶液を、例えば、ヘパリン親
和ゲル（固定化されたヘパリン）の直接のクロマトグラ
フィーによって、分離する。この親和クロマトグラフィ
ーは、最初の精製から誘導される汚染物質の大部分の除
去ならびに、熱処理工程から生ずる、不活性なアンチト
ロンビン自体を包含する変性された蛋白質の大部分の除
去を確実にする。次いで、アンチトロンビンを溶離し、
そして濃縮する。次いで、濃縮物は、好ましくは、さら
に処理して、例えば、所望の賦形剤を含め、そして凍結
乾燥する。得られる凍結乾燥された蛋白質（アンチトロ
ンビン）濃縮物は、非常に高いレベルの純度、かなりの
程度のウイルスの安全性、および変性されたまたは不活
性のアンチトロンビンの事実上の不存在によって特徴づ
けられる。活性蛋白質、例えば、アンチトロンビンのた
めの血漿源はよく知られている。本発明の好ましい源
は、コーンフラクションIV−１ペーストとして知られて
いる現在廃棄される分画である。血漿中に存在するか、
あるいは遺伝子工学に付される微生物または細胞系から
発現される、他の活性蛋白質、例えば、血小板因子IV、
凝固因子II、Ｖ、VII、VIII、IXおよびＸ、プロテイン
ＣおよびＳならびに蛋白質類（例えば、抗体、成長因子
α１−PI、および精製のために利用できる生物学的親和
性を有する事実上任意の蛋白質）を、同様に調製し、そ
して活性ウイルスを実質的に含有せずかつ不活性な形態
の蛋白質を実質的に含有しないようにすることができ
る。
精製法を、ここに記載する。この方法は、多くの活性な
治療的蛋白質について適用可能であると考えられる。後
に例示するように、本発明の方法は、血漿蛋白質の混合
物、例えば、コーンフラクションIV−１からアンチトロ
ンビンを分離するためにとくに適する。この手順の必須
の成分は、２つの工程を含む：初期のウイルスの不活性
化（例えば、低温殺菌）工程および引続く生物学的に活
性な蛋白質の調製工程。アンチトロンビンの例示する場
合において、部分的に精製されたアンチトロンビンの濃
縮物をウイルスの不活性化工程（例えば、テイバー（Ta
bor）らが前に記載したような、0.5モルのクエン酸ナト
リウムの存在下の低温殺菌）にかける。次いで、この熱
処理したアンチトロンビン溶液を、例えば、ヘパリン親
和ゲル（固定化されたヘパリン）の直接のクロマトグラ
フィーによって、分離する。この親和クロマトグラフィ
ーは、最初の精製から誘導される汚染物質の大部分の除
去ならびに、熱処理工程から生ずる、不活性なアンチト
ロンビン自体を包含する変性された蛋白質の大部分の除
去を確実にする。次いで、アンチトロンビンを溶離し、
そして濃縮する。次いで、濃縮物は、好ましくは、さら
に処理して、例えば、所望の賦形剤を含め、そして凍結
乾燥する。得られる凍結乾燥された蛋白質（アンチトロ
ンビン）濃縮物は、非常に高いレベルの純度、かなりの
程度のウイルスの安全性、および変性されたまたは不活
性のアンチトロンビンの事実上の不存在によって特徴づ
けられる。活性蛋白質、例えば、アンチトロンビンのた
めの血漿源はよく知られている。本発明の好ましい源
は、コーンフラクションIV−１ペーストとして知られて
いる現在廃棄される分画である。血漿中に存在するか、
あるいは遺伝子工学に付される微生物または細胞系から
発現される、他の活性蛋白質、例えば、血小板因子IV、
凝固因子II、Ｖ、VII、VIII、IXおよびＸ、プロテイン
ＣおよびＳならびに蛋白質類（例えば、抗体、成長因子
α１−PI、および精製のために利用できる生物学的親和
性を有する事実上任意の蛋白質）を、同様に調製し、そ
して活性ウイルスを実質的に含有せずかつ不活性な形態
の蛋白質を実質的に含有しないようにすることができ
る。
アンチトロンビンの精製の場合において、本発明の好ま
しい分離工程は、炭水化物の支持体上に固定化されたヘ
パリン（例えば、セファロース（Sepharose）アガロー
スへ共有結合したヘパリン）を使用する。この開示の方
法を使用して、活性ウウイルスを実質的に含有ぜず、そ
して総アンチトロンビン蛋白質1mgにつき少なくとも約
６国際単位の生理学的に活性なアンチトロンビンの活性
を有する、精製されたアンチトロビン生成物を得ること
ができた。
しい分離工程は、炭水化物の支持体上に固定化されたヘ
パリン（例えば、セファロース（Sepharose）アガロー
スへ共有結合したヘパリン）を使用する。この開示の方
法を使用して、活性ウウイルスを実質的に含有ぜず、そ
して総アンチトロンビン蛋白質1mgにつき少なくとも約
６国際単位の生理学的に活性なアンチトロンビンの活性
を有する、精製されたアンチトロビン生成物を得ること
ができた。
実施例Ｉ （アンチトロンビンの精製） コーンフラクションIV−１ペースト、6kg（プールした
血漿から集め、そして−30℃に凍結して貯蔵したもの）
を、0.1モル濃度（以下、モル濃度を、単に「モル」と
略記する。）のトリス、0.02モルの塩化ナトリウムから
成る緩衝液、pH8.2、の合計50リットル中に溶解した。
５℃において１時間撹拌した後、この溶液を40℃に加温
し、そしてさらに１時間撹拌した。この溶液を20℃に冷
却した。次いで、0.02モルのトリス、0.15モルのNaCl、
pH7.8、中で前もって平衡化した、ヘパリン−セファロ
ースゲル（固定化されたヘパリン）、6kgを、コーンフ
ラクションIV−１の溶液に添加し、そして20分間撹拌し
た。この懸濁液をフィルターの漏斗に移し、そして濾液
のコーンフラクションIV−１の溶液を集め、保存した。
次いで、ゲルを0.02モルのトリス、0.3モルのNaClから
成る緩衝液、pH7.5、で、溶離液の吸収（280nm）が0.36
に到達するまで、よく洗浄した。次いで、0.02モルのト
リス、２モルのNaClから成る緩衝液、pH7.5、でゲルを
洗浄することによって、アンチトロンビンを溶離した。
0.2（280nm）より大きい吸収で溶離される物質のすべて
を、さらに処理するために、プールとして集めた。
血漿から集め、そして−30℃に凍結して貯蔵したもの）
を、0.1モル濃度（以下、モル濃度を、単に「モル」と
略記する。）のトリス、0.02モルの塩化ナトリウムから
成る緩衝液、pH8.2、の合計50リットル中に溶解した。
５℃において１時間撹拌した後、この溶液を40℃に加温
し、そしてさらに１時間撹拌した。この溶液を20℃に冷
却した。次いで、0.02モルのトリス、0.15モルのNaCl、
pH7.8、中で前もって平衡化した、ヘパリン−セファロ
ースゲル（固定化されたヘパリン）、6kgを、コーンフ
ラクションIV−１の溶液に添加し、そして20分間撹拌し
た。この懸濁液をフィルターの漏斗に移し、そして濾液
のコーンフラクションIV−１の溶液を集め、保存した。
次いで、ゲルを0.02モルのトリス、0.3モルのNaClから
成る緩衝液、pH7.5、で、溶離液の吸収（280nm）が0.36
に到達するまで、よく洗浄した。次いで、0.02モルのト
リス、２モルのNaClから成る緩衝液、pH7.5、でゲルを
洗浄することによって、アンチトロンビンを溶離した。
0.2（280nm）より大きい吸収で溶離される物質のすべて
を、さらに処理するために、プールとして集めた。
次いで、バッチのヘパリン−セファロース吸着からプー
ルした溶離液を、中空繊維の限外濾過装置（ロミコン
（Romicon））で4.0リットルの最終体積に濃縮し、そし
て0.02モルのリン酸ナトリウム、0.15モルのNaCl、0.5
モルのクエン酸ナトリウムから成る最終緩衝液、pH7.
5、に対して透析した。次いで、この溶液を、ウイルス
の不活性化を確実にするために十分な条件下に加熱した
（例えば、60℃±0.5℃の溶液温度に10時間）。
ルした溶離液を、中空繊維の限外濾過装置（ロミコン
（Romicon））で4.0リットルの最終体積に濃縮し、そし
て0.02モルのリン酸ナトリウム、0.15モルのNaCl、0.5
モルのクエン酸ナトリウムから成る最終緩衝液、pH7.
5、に対して透析した。次いで、この溶液を、ウイルス
の不活性化を確実にするために十分な条件下に加熱した
（例えば、60℃±0.5℃の溶液温度に10時間）。
この熱処理後、溶液を20℃に冷却し、そして0.2ミクロ
ンのフィルターで濾過して、低温殺菌から生じたかもし
れない粒状物質を除去した。次いで、濾過装置の洗浄得
を含む、濾過した溶液を、0.02モルのリン酸ナトリウ
ム、0.15モルのNaCl、pH7.5、中で前もって平衡化し
た、ヘパリン−セファロースのカラム（14×21cm）上に
直接適用し、そしてこのカラムを試料の適用後同一緩衝
液で洗浄した。基線の水準に到達するまで、溶離した溶
液の吸収を監視し（280nm）、次いでこのカラムを２モ
ルのNaClを含有するリン酸塩緩衝液で溶離した。0.04よ
り大きい吸収で溶離する物質のすべてを、合計の体積が
3.05リットルのプールとして集めた。アンチトロンビン
の回収の要約を、下表に表わす。
ンのフィルターで濾過して、低温殺菌から生じたかもし
れない粒状物質を除去した。次いで、濾過装置の洗浄得
を含む、濾過した溶液を、0.02モルのリン酸ナトリウ
ム、0.15モルのNaCl、pH7.5、中で前もって平衡化し
た、ヘパリン−セファロースのカラム（14×21cm）上に
直接適用し、そしてこのカラムを試料の適用後同一緩衝
液で洗浄した。基線の水準に到達するまで、溶離した溶
液の吸収を監視し（280nm）、次いでこのカラムを２モ
ルのNaClを含有するリン酸塩緩衝液で溶離した。0.04よ
り大きい吸収で溶離する物質のすべてを、合計の体積が
3.05リットルのプールとして集めた。アンチトロンビン
の回収の要約を、下表に表わす。
実施例II 実施例Ｉの工程を反復したが、ただし最終の低温殺菌し
たアンチトロンビン生成物を引続いて安定剤としてアミ
ノ酸（0.1モルのアラニン）と一緒に凍結乾燥した。
たアンチトロンビン生成物を引続いて安定剤としてアミ
ノ酸（0.1モルのアラニン）と一緒に凍結乾燥した。
実施例III 実施例Ｉの工程を反復したが、ただしコーンフラクショ
ンIV−１の溶液のバッチ式接触後に、0.02モルのトリ
ス、0.15モルのNaClおよび１〜2g/lの硫酸デキストラン
を含有する緩衝液で、ヘパリン−アガロースゲルをさら
に洗浄した。
ンIV−１の溶液のバッチ式接触後に、0.02モルのトリ
ス、0.15モルのNaClおよび１〜2g/lの硫酸デキストラン
を含有する緩衝液で、ヘパリン−アガロースゲルをさら
に洗浄した。
上の実施例はウイルスの不活性化および非常に特定の活
性蛋白質の精製を記載するが、当業者は理解するよう
に、開示した技術は種々の源（例えば、動物またはヒト
の血漿、遺伝子工学された微生物または細胞系など）か
ら得られる非常に広範な種類の活性蛋白質に適用するこ
とができる。開示した技術を使用するための主な要件
は、２つの組み合わせにある：（１）生物学的に活性な
蛋白質生成物中のウイルスの不活性化、および（２）変
性されたまたは不活性な形態の活性蛋白質が、存在する
場合、最小である、活性蛋白質生成物。
性蛋白質の精製を記載するが、当業者は理解するよう
に、開示した技術は種々の源（例えば、動物またはヒト
の血漿、遺伝子工学された微生物または細胞系など）か
ら得られる非常に広範な種類の活性蛋白質に適用するこ
とができる。開示した技術を使用するための主な要件
は、２つの組み合わせにある：（１）生物学的に活性な
蛋白質生成物中のウイルスの不活性化、および（２）変
性されたまたは不活性な形態の活性蛋白質が、存在する
場合、最小である、活性蛋白質生成物。
使用できる生物学的に不活性な技術は、低温殺菌、化学
的処理（薬剤、例えば、米国特許第4,534,972号などに
記載されているよう銅フタロシアニンの使用）および照
射である。活性蛋白質の分離技術の例は、活性な形態と
不活性な形態とを識別するように、蛋白質の生物学的活
性に基づく分離を可能とする方法（例えば、親和クロマ
トグラフィーまたは適用結合因子、例えば、生物学的に
活性な形態の蛋白質を認識する抗体の使用）を包含す
る。
的処理（薬剤、例えば、米国特許第4,534,972号などに
記載されているよう銅フタロシアニンの使用）および照
射である。活性蛋白質の分離技術の例は、活性な形態と
不活性な形態とを識別するように、蛋白質の生物学的活
性に基づく分離を可能とする方法（例えば、親和クロマ
トグラフィーまたは適用結合因子、例えば、生物学的に
活性な形態の蛋白質を認識する抗体の使用）を包含す
る。
ここで使用するとき、用語「生物学的に活性」は、蛋白
質に適用するとき、（不活性な、変性されたまたは無用
の状態の同一蛋白質と反対に）蛋白質がその意図する機
能を示すが、あるいは意図する結果に有用である蛋白質
の形態または形状を意味する。所定の蛋白質がその意図
する機能を示すか、あるいは意図する結果を達成するた
めの生物学的活性を有するかどうかは、当業者に知られ
た手段（例えば、簡単な機能的活性のアッセイ、免疫学
的手段など）によって決定することができる。
質に適用するとき、（不活性な、変性されたまたは無用
の状態の同一蛋白質と反対に）蛋白質がその意図する機
能を示すが、あるいは意図する結果に有用である蛋白質
の形態または形状を意味する。所定の蛋白質がその意図
する機能を示すか、あるいは意図する結果を達成するた
めの生物学的活性を有するかどうかは、当業者に知られ
た手段（例えば、簡単な機能的活性のアッセイ、免疫学
的手段など）によって決定することができる。
「ウイルスの不活性化または活性ウイルスを実質的に含
有しない」は、存在するウイルスを除去または不活性化
して、供されうるレベルまたは菌株不可能なレベルに安
全にすることを意味する。所定の活性蛋白質の調製物の
「低温殺菌した形態」は、存在するかも知れないウイル
スを不活性化するために十分な低温殺菌または熱処理
（例えば、60℃における少なくとも10時間の加熱）にか
けた調製物を意味する。所定の蛋白質の「変性されたま
たは不活性な形態を含まない」は、所定の蛋白質生成物
が生物学的に活性な蛋白質を主として含み、かつ変性さ
れたまたは不活性な形態が存在しないか、あるいは検出
できない少量で存在する（例えば、交差免疫電気泳動に
より決定して、一般に約10重量％より少ないか、あるい
は、アンチトロンビンの場合において、アンチトロンビ
ンの不活性種が約10重量％より少ない）ことを意味す
る。
有しない」は、存在するウイルスを除去または不活性化
して、供されうるレベルまたは菌株不可能なレベルに安
全にすることを意味する。所定の活性蛋白質の調製物の
「低温殺菌した形態」は、存在するかも知れないウイル
スを不活性化するために十分な低温殺菌または熱処理
（例えば、60℃における少なくとも10時間の加熱）にか
けた調製物を意味する。所定の蛋白質の「変性されたま
たは不活性な形態を含まない」は、所定の蛋白質生成物
が生物学的に活性な蛋白質を主として含み、かつ変性さ
れたまたは不活性な形態が存在しないか、あるいは検出
できない少量で存在する（例えば、交差免疫電気泳動に
より決定して、一般に約10重量％より少ないか、あるい
は、アンチトロンビンの場合において、アンチトロンビ
ンの不活性種が約10重量％より少ない）ことを意味す
る。
上に与えた開示から種々の形態が、当業者にとって明ら
かであろう。したがって、上の実施例は例示をのみ目的
とし、そして本発明の範囲は特許請求の範囲によっての
み限定される。
かであろう。したがって、上の実施例は例示をのみ目的
とし、そして本発明の範囲は特許請求の範囲によっての
み限定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−22022（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−145615（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−48930（ＪＰ，Ａ) 特開 昭48−35017（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−189228（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−59018（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】（ａ）所定の生物学的に活性なアンチトロ
ビンのための源を、存在するすべてのウイルスを不活性
化するために十分な条件下で処理するウイルス不活性化
工程、および （ｂ）工程（ｃ）の生成物を、生物学的に不活性な形態
のアンチトロンビンが総アンチトロンビンの10重量％よ
り少なくなるようにそれらの不活性な形態のアンチトロ
ンビンを除去するのに十分な条件下で、蛋白質分離工程
にかける工程、 を含んでなることを特徴とする活性ウイルスを実質的に
含有しない生物学的に活性な治療用アンチトロンビン生
成物を製造する方法。 - 【請求項２】生物学的に活性なアンチトロンビンが、血
漿蛋白質およびアンチトロンビンを発現することのでき
る微生物または細胞系から誘導されたアンチトロンビン
から選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】工程（ａ）の生成物が、溶液中に存在する
すべてのウイルスの不活性化を確実にするために十分な
条件下に、低温殺菌される特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - 【請求項４】低温殺菌工程が、少なくとも約60℃の温度
において少なくとも約10時間、溶液を加熱することを含
む特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】工程（ｂ）の分離が、工程（ａ）の生成物
の溶液を固定化されたヘパリンと接触することを含む特
許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】固定化されたヘパリンが、炭水化物の支持
体へ結合されたヘパリンを含む特許請求の範囲第５項記
載の方法。
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| US884446 | 1986-07-11 | ||
| US06/884,446 US4749783A (en) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | Viral inactivation and purification of active proteins |
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|---|---|---|---|
| JP6119509A Division JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
| JP7023347A Division JPH083197A (ja) | 1986-07-11 | 1995-01-19 | ウイルスの不活性化および活性蛋白質の精製 |
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| JPS6323896A JPS6323896A (ja) | 1988-02-01 |
| JPH0768275B2 true JPH0768275B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=25384645
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|---|---|---|---|
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| JP6119509A Expired - Lifetime JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
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|---|---|---|---|
| JP6119509A Expired - Lifetime JPH07116236B2 (ja) | 1986-07-11 | 1994-05-09 | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 |
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| EP (1) | EP0252392B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0768275B2 (ja) |
| AU (1) | AU589868B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341269C (ja) |
| DE (1) | DE3751576T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA1341379C (en) | 1988-04-28 | 2002-07-23 | Welfide Corporation | Purified antithrombin-iii and methods of producing the same |
| JPH03215430A (ja) * | 1990-01-19 | 1991-09-20 | Kita Kiyoshi | 関節腔抗凝固剤 |
| WO1991001367A1 (en) * | 1989-07-20 | 1991-02-07 | Bioeng, Inc. | Supercritical fluid disruption of and extraction from microbial cells |
| FR2679251B1 (fr) * | 1991-07-18 | 1993-11-12 | Nord Assoc Essor Transfusion San | Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique. |
| US5610285A (en) | 1994-08-24 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
| ES2094701B1 (es) * | 1995-07-12 | 1997-09-01 | Grifols Grupo Sa | Procedimiento para la produccion de antitrombina iii |
| US6632648B1 (en) * | 1996-05-14 | 2003-10-14 | Elan Drug Delivery Limited | Methods of terminal sterilization of fibrinogen |
| AT405739B (de) | 1997-09-19 | 1999-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur reinigung von antithrombin iii |
| US6093804A (en) * | 1998-09-24 | 2000-07-25 | American National Red Cross | Method for purification of alpha-1 proteinase inhibitor |
| DE19923027C2 (de) | 1999-05-19 | 2002-09-19 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Inaktivierung von Viren |
| NZ526940A (en) | 2000-12-14 | 2005-06-24 | Bayer Healthcare Llc | Method of preparing alpha-1 proteinase inhibitor |
| US7777006B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| SI1664123T2 (sl) * | 2003-09-22 | 2012-03-30 | Kamada Ltd | Priprava inhibitorja alfa proteinaze v velikem merilu in njegova uporaba |
| US9624260B2 (en) | 2004-06-07 | 2017-04-18 | Therapure Biopharma Inc. | Process for isolation of plasma or serum proteins |
| ES2294976B1 (es) * | 2007-11-12 | 2008-12-16 | Grifols, S.A. | "procedimiento de obtencion de albumina humana de alta eficacia para su uso en terapia de detoxificacion". |
| EP3446710A1 (en) | 2017-08-25 | 2019-02-27 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Methods of inactivating viral contaminants |
| WO2023052556A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Ichnos Sciences SA | Methods of inactivating viral contaminants with a mixture of solvent and detergent |
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|---|---|---|---|---|
| SE392038B (sv) * | 1971-09-08 | 1977-03-14 | Kabi Ab | Forfarande for isolering av antitrombin ur blod eller blodprodukter |
| JPS5359018A (en) * | 1976-11-10 | 1978-05-27 | Green Cross Corp:The | Concentrated xiii-th blood coagulating factor derived from human placentaand its preparation |
| CH630243A5 (fr) * | 1978-05-11 | 1982-06-15 | Nestle Sa | Procede de recuperation des proteines du lactoserum. |
| DE2916711A1 (de) * | 1979-04-25 | 1980-11-06 | Behringwerke Ag | Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung |
| US4305871A (en) * | 1980-09-02 | 1981-12-15 | Edward Shanbrom | Method of selectively increasing yield and purity of certain cryoprecipitate proteins by heating |
| DE3037600C2 (de) * | 1980-10-04 | 1982-07-22 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Faktor zur Stimulation der Proliferationsrate von Leberzellen |
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| US4481189A (en) * | 1982-04-14 | 1984-11-06 | New York Blood Center Inc. | Process for preparing sterilized plasma and plasma derivatives |
| JPS6048930A (ja) * | 1983-08-24 | 1985-03-16 | Nippon Sekijiyuujishiya | アンチトロンビン３の精製法 |
| JPS6122022A (ja) * | 1983-12-28 | 1986-01-30 | Green Cross Corp:The | 血漿蛋白の加熱処理方法 |
| JPS61189228A (ja) * | 1985-02-19 | 1986-08-22 | Nippon Sekijiyuujishiya | 血液凝固第８因子製剤の製法 |
| US4673733A (en) * | 1985-04-11 | 1987-06-16 | Sudhish Chandra | Treatment of biological and pharmaceutical products adsorbed on a solid phase with virus and pyrogen inactivating agents |
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| EP0288841B1 (en) * | 1987-04-27 | 1992-12-30 | Miles Inc. | Method of preparing highly purified alpha-1-proteinase inhibitor |
-
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-
1987
- 1987-06-27 DE DE3751576T patent/DE3751576T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-27 EP EP87109274A patent/EP0252392B1/en not_active Revoked
- 1987-06-30 AU AU74975/87A patent/AU589868B2/en not_active Expired
- 1987-07-10 CA CA000541758A patent/CA1341269C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-10 JP JP62171330A patent/JPH0768275B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
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- 1994-05-09 JP JP6119509A patent/JPH07116236B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
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- 1995-01-19 JP JP7023347A patent/JPH083197A/ja active Pending
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| CA1341269C (en) | 2001-07-10 |
| US4749783A (en) | 1988-06-07 |
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