CH643861A5

CH643861A5 - Verfahren zum reinigen eines gamma-globulinderivats.

Info

Publication number: CH643861A5
Application number: CH35280A
Authority: CH
Inventors: Akinobu Funatsu; Shuzoh Oyama; Yoshinori Akimoto; Komei Ohashi
Original assignee: Chemo Sero Therapeut Res Inst
Priority date: 1979-01-17
Filing date: 1980-01-16
Publication date: 1984-06-29
Also published as: IT7928295A0; FR2446839B1; GB2039490A; CA1128418A; NL7909110A; US4302384A; SE435786B; IT1127308B; FR2446839A1; DE3001187A1; JPS5598117A; JPS647050B2; DE3001187C2; SE7909897L; ATA19180A; GB2039490B; AT368887B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem, S-sulfoniertem y-GIobulin, welches im wesentlichen darin besteht, dass man S-sulfoniertes y-Globulin mit einem Ionenaustauscher behandelt,

durch welches agglutinierte Moleküle des S-sulfonierten y-Globulins in ausreichender Weise entfernt werden, um den Gehalt an einzelnen Molekülen der Verbindung zu erhöhen, und die unerwünschte antikomplementäre Aktivität in ausreichender Weise herabgesetzt wird, um das gewünschte, biologisch und physikalisch beständige, S-sulfonierte y-Globulin zu liefern.

Es ist bestens bekannt, dass aus einem Blutplasmagemisch fraktioniertes y-Globulin Antikörperwirkungen gegen verschiedene infektiöse Krankheiten besitzt und als sogenanntes Immunoglobulinpräparat für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von verschiedenen infektiösen Krankheiten wertvoll ist. Die üblichen Immunoglobulinpräparate enthalten aber agglutinierte Moleküle, welche während der Reinigung entstehen, weswegen man sie nicht intravenös, sondern nur intramuskulär verabreichen kann. Es ist auch bekannt, dass bei der intravenösen Verabreichung von y-Glo-bulinpräparaten, welche eine grosse Menge agglutinierter Moleküle enthalten, beim Patienten rasch ein Komplement aktiviert wird, wodurch verschiedene Nebenwirkungen, wie z.B. das Sinken des Blutdruckes, die Steigerung der Körpertemperatur, Störungen im Zirkulationssystem und dergl. bewirkt werden. Andererseits sind beim intramuskulären Verabreichen von y-Globulin die verabreichte Menge und das Eindringungsvermögen von y-Globulin in den Blutgefässen beschränkt, so dass sich die intramuskuläre Verabreichung in jenen Fällen nicht eignet, in denen ein rascher Anstieg des Blutspiegels an Antikörper erforderlich ist. Demzufolge war es erforderlich, ein verbessertes y-Globulin herzustellen, welches ohne auf der antikomplementären Aktivität beruhende Nebenwirkungen intravenös verabreicht werden kann.

Es sind verschiedene Methoden für die Herstellung von intravenös verabreichbarem y-Globulin vorgeschlagen worden, wie z.B. die Behandlungsmethode mit Pepsin [cf. H.E. Schultze; Deutsche Medizinische Wochenschrift, Bd. 87, S. 1643 (1962)], und die Behandlungsmethode mit Plasmin [cf. J.T. Sgouris; Vox Sanguinis, Bd. 13, S. 71 (1967)]. Bei der Anwendung der Methode unter Behandlung mit einer Protease, wie z.B. Pepsin, wird aber das y-Globulin in zwei oder mehrere niedrigmolekulare Verbindungen gespalten, wodurch der erzeugte Antikörper in kürzester Frist verschwindet. Ferner wird die biologische Aktivität des Fc-Teiles des y-Globulinmoleküls durch Abspalten des Fc-Teiles verringert.

Es wurde auch vorgeschlagen, ein intravenös verabreichbares y-Globulin ohne die vorgenannten Nachteile herzustellen, wobei man davon ausging, das gewünschte y-Glo-bulin ohne wesentliche Änderung der Struktur des y-Globulins zu erzeugen. Ein solches Verfahren für die Behandlung von y-Globulin bei einem pH-Wert von 4 ist beispielsweise von S. Barundun et al; Vox Sanguinis, Bd. 13, S. 93 (1967), beschrieben worden. Ein weiteres Verfahren für die Behandlung mit ß-Propiolacton ist von W. Stephan; Vox Sanguinis, Bd. 28, S. 422 (1975) geoffenbart worden. Beim Verfahren mit der Behandlung bei einem pH-Wert von 4 wird aber der Gehalt an aglutinierten Molekülen während der Lagerung des so erhaltenen y-Globulins erhöht, wodurch sich eine Zunahme der antikomplementären Aktivität ergibt. Ausserdem wird festgehalten, dass das durch Behandeln mit ß-Propiolacton erzeugte y-Globulin beim Verabreichen möglicherweise die Funktion eines Antigens übernehmen könnte.

Es wurde kürzlich durch Masuho et al berichtet, dass ein zur intravenösen Verabreichung geeignetes y-Globulin durch Sulfonierung der S-S-Kette von y-Globulin erzeugt werden kann (cf. U.S. Patentschrift 4 059 571, Japanische Offenlegungsschrift Nr. 1630/1976). Das gemäss Masuho et al

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erzeugte S-sulfonierte y-Globulin behält die ursprüngliche hohe Molekülstruktur und zwar wegen der Wasserstoffbindung, während andererseits die S-S-Bindung aufgebrochen wird. Daraus ergibt sich wiederum eine beachtenswerte Verringerung der antikomplementären Aktivität bei vollständiger Aufrechterhaltung der Antikörperaktivität, Masuho et al behaupten, dass der antikomplementäre Aktivitätsspiegel bei einer Proteinkonzentration von 5 Gew.-% (nachstehend als «CHmi» bezeichnet) 30% oder weniger beträgt. Es wird ferner ausgesagt, dass das S-sulfonierte y-Globulin sich leicht reduzieren und dann oxydieren lässt und zwar unter Bildung des ursprünglichen y-Globulins, wenn man es dem Menschen verabreicht [vgl. Masuho et al. Journal of Biochemi-stry, Bd. 19, S. 1377 (1976)]. Es wurde auch durch klinische Versuche bewiesen, dass das S-sulfonierte y-Globulin an Patienten unverändert verabreicht werden kann, welche einen niedrigen y-Globulingehalt oder kein y-Globulin im Blut aufweisen (cf. Noboru Kobayashi, International Aca-demy of Blood Transfusion (Paris), 1978).

Somit eignet sich das S-sulfonierte y-Globulin in hervorragender Weise als ein intravenös verabreichbares y-Globulin-präparat, dem man die nötige Beachtung zu schenken hat. Dieses Produkt weist aber den Nachteil auf, dass es kaum in industriellem Ausmasse erzeugt werden kann. Gemäss dem weiter oben erwähnten Verfahren von Masuho et al lässt sich wohl nach einem ausreichenden Reinigen des als Ausgangsmaterial verwendeten y-Globulins mit weniger agglutinierten Molekülen das gewünschte S-sulfonierte y-Globulin mit niedriger antikomplementärer Aktivität herstellen, doch muss man feststellen, dass bei Verwendung des industriell verwendeten y-Globulins als Ausgangsmaterial, wie es nach der Cohn'schen Fraktionierungsmethode unter Verwendung von Äthanol bei niedriger Temperatur erhalten wird, das so erzeugte S-sulfonierte y-Globulin eine antikomplementäre Aktivität aufweist, welche nicht so niedrig ist (im Minimum GH-» = ca. 30-20%). Daraus ergibt sich, dass das Verfahren von Masuho et al im Prinzip hervorragend ist, aber einer zusätzlichen Behandlung bedarf, um das gewünschte Produkt von hoher Beständigkeit in industriellem Massstab zu erhalten.

Es wurde daher nach einem verbesserten Verfahren für die Herstellung des gewünschten S-sulfonierten y-Globulins mit ausreichend niedriger antikomplementärer Aktivität geforscht, und dies auch für jene Fälle, in denen als Ausgangsmaterial ein beliebiges bekanntes y-Globulin, welches erheblich agglutinierte Moleküle enthält, verwendet wird. Dabei wurde festgestellt, dass man das gewünschte S-sulfonierte y-Globulin mit ausserordentlich niedriger antikomplementärer Aktivität erhalten kann, wenn man nach der Sulfo-nierungsreaktion das entstandene S-sulfonierte y-Globulin mit einem Ionenaustauscher behandelt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren y-Globulins auf industrieller Ebene. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines gereinigten S-sulfonierten y-Globulins, welches vorwiegend einzelne Moleküle mit weniger agglutinierten Molekülen und eine ausserordentlich niedrige antikomplementäre Aktivität besitzt.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Anspruch 1 definiert.

Im Besonderen wird das durch Sulfonieren von üblichem y-Globulin nach einer bekannten Methode erzeugte S-sulfonierte y-Globulin durch einen Ionenaustauscher geleitet, um eine vorwiegend agglutinierte Moleküle aufweisende Fraktion und eine andere Fraktion, welche vorwiegend aus einzelnen Molekülen bestehendes y-Globulin enthält, zu erhalten, worauf man die letztere Fraktion sammelt, um das erwünschte S-sulfonierte y-Globulin, welches eine ausserordentlich niedrige antikomplementäre Aktivität besitzt, zu gewinnen. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältliche, aus einzelnen Molekülen bestehende, S-sulfonierte y-Globulin besitzt einen CHso-Wert von weniger als 10% und eignet sich somit als ein intravenös verabreichbares Immunoglobulinpräparat.

Das als Ausgangsmaterial verwendete S-sulfonierte y-Globulin kann unter Verwendung von üblichem y-Globulin, wie es üblicherweise nach der Cohn'schen Fraktionierungsmethode erhalten wird, hergestellt werden. Die Cohn'-sche Fraktionierungsmethode ist für die Herstellung von y-Globulin international weit verbreitet [cf. J. Am. Chem. Soc., Bd. 68, S. 459 (1946)]. Das y-Globulin wird durch Behandeln mit einem Oxydationsmittel, wie z.B. einem Alkalimetalltetrat-hionat, einem Alkalimetalliodosobenzoat, einem molekularen Sauerstoff enthaltenden Gas, z.B. Luft, oder einer Sulfitionen erzeugenden Verbindung, z.B. schweflige Säure, (cf. US-Patentschrift 4 059 571, Japanische Offenlegungsschriften 1630/1976 und 76418/1976) sulfoniert. Das S-sulfo-nierte y-Globulin kann gewünschtenfalls nach einer bekannten Methode, z.B. durch Dialyse, gereinigt werden.

Der beim vorliegenden Verfahren verwendeten Ionenaustauscher besteht vorzugsweise aus einer wiederholt verwendbaren Säule ohne spezifische Aktivierung und besitzt ein grosses Bindungsvermögen vorzugsweise aus einem im Autoklaven haltbaren Gel von guter Stabilität unter verschiedenen Bedingungen, wie z.B. bei verschiedenen pH-Werten, Ionenstärken usw.

Der Ionenaustauscher umfasst Anionenaustauscher und Kationenaustauscher, doch wird man wegen der biologischen und physikalischen Beständigkeit des Produktes vorzugsweise Anionenaustauscher einsetzen. Der Anionenaustauscher kann in Kombination mit dem Kationenaustauscher verwendet werden.

Geeignete Beispiele von Anionenaustauschern sind Agarose-Gel, in welchen ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, z.B. DEAE-Sepharose CL-6B, Dextran-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, z.B. DEAD-Sephadex, QAE-Sephadex, Cellulose-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, z.B. DEAE-Cellulose, TEAE-Cellulose, Polyvinyl-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, z.B. DEAE-TOYOPEAL, Amylose-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, oder dergl. Der anionische Substituent umfasst Diäthylaminoäthyl (DEAE), Triäthylaminoäthyl (TEAE) und Diäthyl-(2-hydroxypropyl) aminoäthyl (QAE).

Geeignete Beispiele von Kationenaustauschern sind Aga-rose-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, z.B. CM-Sepharose CL-6B, Dextran-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, wie z.B. CM-Sephadex, SP-Sephadex, Cellulose-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, z.B. CM-Cellulose, Polyvinyl-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, CM-TOYOPEAL, Amylose-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, oder dergl. Der kationische Substituent umfasst Carboxymethyl (CM), Sulfopropyl (SP) und Sulfo-äthyl (SE).

Die Adsorption des S-sulfonierten y-Globulins auf einem Ionenaustauscher kann in folgender Weise durchgeführt werden. Das S-sulfonierte y-Globulin wird mit einem Ionenaustauscher in einer zur Entwicklung dienenden Pufferlösung, welche im allgemeinen einen optimalen Wasserstoffionenwert (pH-Wert) und eine optimale Ionenstärke aufweist, behandelt, wodurch das aus einzelnen Molekülen bestehende S-sulfonierte y-Globulin auf dem Ionenaustauscher adsor5

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biert wird. Mittels dieser Behandlung werden die agglutinierten Moleküle des S-sulfonierten y-Globulins und überdies das nichtsulfonierte y-Globulin durch den Ionenaustauscher geleitet, ohne aber darauf absorbiert zu werden. Nach erfolgter Absorption wird der Ionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, um das agglutinierte y-Globulin und andere Verunreinigungen vollständig zu entfernen.

Die für die Absorption des aus einzelnen Molekülen bestehenden, S-sulfonierten y-Globulins verwendete Pufferlösung besitzt vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10 und insbesondere von 7 bis 8 und eine Ionenstärke (jj.) von vorzugsweise 0,01 bis 0,15 und insbesondere von 0,03 bis 0,09 bei Verwendung eines Anionenaustauschers. Verwendet man andererseits einen Kationenaustauscher, so besitzt die Pufferlösung vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 6,5 und insbesondere von 5 bis 6 und eine Ionenstärke von vorzugsweise 0,01 bis 0,1 und insbesondere von 0,035 bis 0,07. Die Konzentration des der Absorptionsbehandlung zu unterziehenden S-sulfonierten y-Globulins ist nicht von Bedeutung. Im Hinblick auf die Austauschkapazität des Ionenaustauschers wird aber das S-sulfonierte y-Globulin vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 12 Gew./Vol.-% verwendet.

Die zur Entwicklung dienende Pufferlösung umfasst insbesondere eine Phosphatpufferlösung, eine Citratpufferlösung, eineTris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Phosphatpufferlö-sung, eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Phosphat-pufferlösung, eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung, eine Boratpufferlösung, eine Acetatpufferlö-sung oder dergl.

Das aus einzelnen Molekülen bestehende, auf dem Ionenaustauscher adsorbierte S-sulfonierte y-Globulin lässt sich leicht aus dem Ionenaustauscher durch Eluieren mit einer Pufferlösung, welche zweckmässig einen anderen pH-Wert und eine andere lonenstärke als die erste Pufferlösung hat, gewinnen. Die für die Eluierung verwendete Pufferlösung besitzt mit Vorteil einen pH-Wert von 3 bis 4, sofern ein Anionenaustauscher verwendet wird, und mit Vorteil einen pH-Wert von 6 bis 9, sofern ein Kationenaustauscher verwendet wird. Die Ionenstärke (u) der für die Eluierung verwendeten Pufferlösung sollte in der Regel höher sein als der Wert der ersten Pufferlösung und liegt vorzugsweise im Bereiche von 0,05 bis 0,8. Die für die Eluierung verwendete Pufferlösung umfasst insbesondere Phosphatpufferlösungen, Glycin-HCl-Pufferlösungen, Citratpufferlösungen, wässrige Natriumacetatlösungen oder dergl. Diese Pufferlösungen können Natriumchlorid enthalten.

Die erfindungsgemässe Reinigungsbehandlung erfolgt üblicherweise bei Zimmertemperatur, doch kann man auch unter Kühlen reinigen.

Das nach dem vorliegenden Verfahren gereinigte S-sulfo- . nierte y-Globulin besitzt einen höheren Gehalt an einzelnen Molekülen, eine niedrigere antikomplementäre Aktivität und eine grössere Beständigkeit als das zur Reinigung eingesetzte Produkt. So konnte man beispielsweise feststellen, dass beim Reinigen des gemäss nachstehendem Beispiel 1 verwendeten S-sulfonierten y-Globulins nach dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung von DEAE-Sepharose CL-6B und CM-Sepharose CL-6B und nach der Behandlung des so erhaltenen Produktes in solcher Weise, dass eine Proteinkonzentration von 5% erzielt wird, die erhaltenen Produkte die in der Tabelle I erwähnten antikomplementären Aktivitätswerte (CHso), die Werte für den Gehalt an einzelnen Molekülen (gemessen mittels einer Ultrazentrifugenanalyse) und die Werte für die Schüttelbeständigkeit (gemessen mittels der Differenz der Lichtstreuung nach dem Schütteln mit einer Schüttelvorrichtung nach Kahn) besitzen.

Tabelle 1

Portion Vorder Nach der Reinigung

Nr. Reinigung

Unterder Unterder Verwendung Verwendung von von

DEAE— CM-Sepharose

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Antikomplemen i

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Bemerkungen:

Gemessen nach dem Kabat Mayer-Verfahren [cf. Expérimental Immuno-chemistry, Seite 225 ( 1961 )].

" Gemessen nach dem Zentrifugieren während 50 Minuten bei 60.000 Umdrehungen pro Minute mit einer Backmann-Ultrazentrifugenvorrichtung. *■' Gemessen durch Schütteln des Produktes mit einer Amplitude von 3,4 cm/' Sek. und 3,7 Zyklen/Sek. während 4 Stunden, Bestrahlen mit Licht und anschliessendem Messen der Differenz der Lichstreuung vor und nach dem Schütteln (cf. Standard for Biological Préparations, herausgegeben von Mi-nistry of Health and Weifare, Japan).

Wie aus den Resultaten der obigen Tabelle 1 eindeutig hervorgeht, besitzt das nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigte, S-sulfonierte y-Globulin eine ausserordentlich verringerte antikomplementäre Aktivität, d.h. von 10% oder weniger bei einer Proteinkonzentration von 5%, verglichen mit jener des Produktes, welches nicht gereinigt worden ist. Bei Verwendung eines Anionenaustauschers wird dieser Wert besonders stark verringert. Der Gehalt an einzelnen Molekülen wird von 75 bis 80% (vor der Reinigung) auf 90 bis 95% (nach der Reingigung) erhöht. Durch Ultrazentrifugierana-lyse lassen sich die stark agglutinierten Moleküle kaum erfassen, weil sie unmittelbar nach Beginn der Zentrifugie-rung ausgefällt werden. Durch die Gelchromatographieanalyse (z.B. Dünnschichtgelchromatographie) lassen sich die agglutinierten Moleküle in Polymere und Oligomere trennen. Durch diese Gelchromatographieanalyse wird bestätigt, dass der Gehalt an Monomere (einzelne Molekühle) von 60 bis 70% vor der Reinigung auf 85% oder mehr nach der Reinigung erhöht wird. Überdies zeigt beim Messen der Lichtstreuung vor und nach der Reinigung das nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigte S-sulfonierte y-Globulin eine äusserst starke Beständigkeit, wobei selbst beim Schütteln keine unlösliche Substanz ausfällt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, worin die Prozente jeweils Gew.-%e besagen, sofern nichts anderes ausgesagt wird.

Beispiel 1

248 g Natriumtetrathionat und 408 g Natriumsulfit wurden getrennt in 1.500 ml bzw. 3.500 ml Phosphatpufferlösung (pH 7,6), welche Natriumchlorid enthält, gelöst, worauf die Lösungen filtriert und sterilisiert werden. Jede so erhaltene Lösung wird einer 15%igen wässrigen y-Globulinlösung (10 Liter) hinzugegeben, die man aus menschlichem Blutplasma durch Äthanol-Fraktionierungsmethode erhalten hat. Das Gemisch wird dann langsam während 4Vi Stunden bei 43°C gerührt, um die Sulfonierung durchzuführen.

Nach erfolgter Umsetzung wird das Reaktionsgemisch gegen eine physiologische Kochsalzlösung dialysiert, um das

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überschüssige Sulfonierungsmittel zu entfernen, worauf mit einer zur Entwicklung dienenden Pufferlösung (Phosphatpufferlösung, p. = 0,06, pH 7,5) versetzt wird.

Die Lösung des S-sulfonierten y-Globulins in der Phosphatpufferlösung wird so eingestellt, dass eine Proteinkonzentration von ungefähr 8% erzielt wird. Dann wird die Lösung (15 Liter) entwickelt, indem sie durch eine Säule (16 Liter) geleitet wird, welche mit der gleichen Phosphatpufferlösung, wie sie oben genannt wird, behandelten DEAE-Sepharose CL-6B der Firma Pharmacia beschickt ist. Die Fraktion (P-I), welche ohne Absorption auf dem Ionenaustauscher durch die Säule hindurchfliesst, ist eine Lösung mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2% (16 Liter).

Die Säule wird gründlich mit der gleichen Phosphatpufferlösung, wie sie oben erwähnt worden ist, gewaschen und, nachdem man praktisch kein Protein mehr feststellen kann, wird eine Acetatpufferlösung (ji=0,1, pH 4,0) durch die Säule geleitet und die eluierte Fraktion (P-II) gesammelt. Diese Fraktion (P-II) besteht aus einer Lösung mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2,5% (32 Liter). Jede der beiden nach den obigen Angaben erhaltenen Fraktionen wird mit einer wässrigen Natriumhydroxydlösung neutral gestellt, dann eingeengt, bis die Proteinkonzentration ungefähr 5% beträgt, und anschliessend gegen eine 2,25% Glycin enthaltende, isotone Phosphatpufferlösung dialysiert. Die verschiedenen Eigenschaften der so erhaltenen Produkte werden in der gleichen Weise wie dies in der Tabelle 1 gezeigt ist,

gemessen. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle ->

Tabelle 2

Vorder Reinigung

Nach der Reinigung P-I P-II

Antikomplementäre

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Aktivität (CHso) (%)

Gehalt an einzelnen

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Molekülen (%)

Schüttelbeständigkeit

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Aus den vorliegenden Resultaten geht einwandfrei hervor, dass die Fraktion P-I eine hohe antikomplementäre Aktivität aufweist und eine grosse Menge an agglutinierten Molekülen enthält und überdies eine schlechtere Schüttelbeständigkeit aufweist. Andererseits besitzt die erwünschte P-II-Fraktion eine ausreichend niedrige antikomplementäre Aktivität,

einen hohen Gehalt an einzelnen Molekülen und eine ausserordentlich erhöhte Schüttelbeständigkeit. Daraus ergibt sich, dass die unerwünschte Eigenschaften aufweisenden Komponenten in wirksamer Weise entfernt werden können und in der Fraktion P-I verbleiben.

Die Trennung der Fraktionen im obigen Beispiel 1 geht aus der beiliegenden Zeichnung, Fig. 1, hervor, worin die Abszisse die Fraktionszahl und die Ordinate die optische Dichte einer jeden Fraktion bei einer Wellenlänge von 280 nm wiedergeben.

Ausserdem werden die Lösung des S-sulfonierten y-Globulins vor der Reinigung (A), die Fraktion P-I (B) und die Fraktion P-II (C) einer Ultrazentrifugenanalyse (X) und einer Dünnschichtgelfiltrierungsanalyse (Y) unterworfen. Diese Analysenaufzeichnungen finden sich in Fig. 2. Die Ultrazentrifugenanalyse erfolgt unter Bedingungen einer Proteinkonzentration von ungefähr 1,67% bei 60 000 Umdrehungen pro Minute während 50 Minuten unter Verwendung einer Beck-mann-Ultrazentrifugenvorrichtung, während die Dünn-schichtgelfiltrierungsanalyse gemäss der Migita Methode [cf.

Annual Report of Inst. Virus Research, Kyoto Univ., Bd. 8, S. 130 (1965)] durchgeführt wird. In der Fig. 2 stellt «a» eine einzelne Moleküle aufweisende Substanz (7S) dar, während «b», «c» und «d» Oligomere (9S, 1 IS bzw. 13S) und «p» ein Polymer bedeuten. Wie aus der Fig. 2 eindeutig hervorgeht, zeigen beide Analysen ähnliche Aufzeichnungen. Die Menge an stark agglutinierten Molekülen erscheint aber höher in der Dünnschichtgelfiltrierungsanalyse als in der Ultrazentrifugenanalyse. Bei der Aufzeichnung der Ultrazentrifugenanalyse erscheint das Polymer nicht. Beide Analysen zeigen, dass die Fraktion P-I eine grosse Menge an agglutinierten Molekülen und die Fraktion P-II eine erhöhte Menge an einzelnen Molekülen besitzen.

Beispiel 2

Eine 15%ige wässrige y-Globulinlösung wird sulfoniert und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 einer Dialyse unterworfen. Die so erhaltene S-sulfonierte y-Globulinlö-sung wird so eingestellt, dass sie eine Proteinkonzentration von ungefähr 7% aufweist. Ungefähr 100 Liter dieser Lösung werden dann durch eine Säule (150 Liter) geleitet, welche mit einer Citratpufferlösung (jx = 0,03, pH 7,5) behandelten DEAE-Sepharose CL-6B beschickt ist. Die Fraktion P-I, welche, ohne auf dem Ionenaustauscher absorbiert zu werden, durch die Säule fliesst, besteht aus einer Lösung mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 1,5% (ungefähr 125 Liter).

Nach dem Waschen der Säule in gleicher Weise wie in Beispiel 1 wird eine Natriumchlorid enthaltende Glycin-HCl-Pufferlösung ([i = 0,55, pH 3,5) durch die Säule geleitet und die eluierte Fraktion P-II gesammelt. Diese Fraktion P-II besteht aus einer Lösung mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2% (ungefähr 245 Liter).

Die so erhaltenen Fraktionen werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt und die verschiedenen Eigenschaften in ähnlicher Weise gemessen. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 3.

Tabelle 3

Vorder Reinigung

Nach der Reinigung P-I P-II

Antikomplementäre

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Aktivität (CHso) (%)

Gehalt an einzelnen

82

50 94

Molekülen (%)

Schüttelbeständigkeit

137

238 3

Beispiele 3

Man geht in der gleichen Weise vor wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied, dass anstelle der Phosphatpufferlösung (|j. = 0,06, pH 7,5) eine Citratpufferlösung (jj. = 0,03, pH 7,5) als zur Entwicklung dienende Pufferlösung verwendet wird. Es wird eine Lösung (ungefähr 15 Liter) von S-sulfoniertem y-Globulin mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 7% durch Durchleiten durch eine Säule (16 Liter), welche mit DEAE-Sepharose CL-6B beschickt ist, entwickelt. Auf diese Weise erhält man die Fraktion P-I (15,6 Liter) mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 1,7%. Unter Verwendung einer Citratpufferlösung (|i = 0,614, pH 6,0) als Pufferlösung für die Eluierung erhält man die Fraktion P-II (31 Liter) mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2,2%.

Beispiel 4

Das obige Beispiel 3 wird wiederholt mit dem Unterschied, dass eine Phosphatpufferlösung (|j. = 0,06, pH 7,5) verwendet

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wird. Daraus ergibt sich eine Fraktion P-I von ungefähr 14 Litern mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 1,8%. Durch anschliessendes Eluieren mit einer Glycin-HCl-Puf-ferlösung (u. = 0,542, pH 3,5) gelangt man zur Fraktion P-II von ungefähr 29 Litern mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2,4%.

Beispiel 5

Das obige Beispiel 3 wird wiederholt mit dem Unterschied, dass man eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puf-ferlösung (ji = 0,0175, pH 8,5) als zur Entwicklung dienende Pufferlösung und eine Natriumchlorid enthaltende Phosphatpufferlösung (ji. = 0,45, pH 6,0) als Pufferlösung für die Eluierung einsetzt. Dabei gelangt man zur Fraktion P-I von ungefähr 22 Litern mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 1,2% und zur Fraktion P-II von 27 Litern mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2,6%.

Beispiel 6

Eine wässrige Lösung von in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhaltenem S-sulfoniertem y-Globulin wird durch Dialyse gegen eine Acetatpufferlösung (jj, = 0,05, pH 5,3) ins Gleichgewicht gebracht. Die Lösung wird dann so eingestellt, dass eine Konzentration an S-sulfoniertem y-Globulin von ungefähr 7% vorhanden ist, worauf man die so erhaltene Lösung (15 Liter) durch eine Säule (16 Liter), welche mit CM-Sepharose CL-6B der Fa. Pharmacia beschickt ist und mit der gleichen Acetatpufferlösung, wie sie oben beschrieben worden ist, ins Gleichgewicht gebracht ist, geleitet. Die Fraktion P-I, welche durch die Säule, ohne darauf absorbiert zu werden, fliesst, ist eine Lösung mit einer Proteinkonzentra-s tion von ungefähr 1,9% (13 Liter).

Nach dem Waschen der Ionenaustauschersäule in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wird eine wässrige Natrium-acetatlösung (u. = 0,2) durch diese Säule geleitet und die eluierte Fraktion P-II gesammelt. Diese Fraktion P-II besteht io aus einer Lösung mit einer Proteinkonzentration von ungefähr 2,5% (27 Liter).

Jede der so erhaltenen Fraktionen wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei die verschiedenen Eigenschaften in ähnlicher Weise gemessen werden. Die i5 Resultate finden sich in der folgenden Tabelle.

Tabelle 4

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Vorder Reinigung

Nach der Reinigung P-I P-II

Antikomplementäre

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Aktivität (CHso) (%)

Gehalt an einzelnen

83

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Molekülen (%)

Schüttelbeständigkeit

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1 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten S-sulfo-nierten y-Globulins, dadurch gekennzeichnet, dass man ein S-sulfoniertes y-Globulin zur Entwicklung in einer Pufferlösung mit einem Ionenaustauscher behandelt und dadurch aus einzelnen Molekülen bestehendes, S-sulfoniertes y-Globulin auf dem Ionenaustauscher adsorbiert und dann das aus einzelnen Molekülen bestehende, S-sulfonierte y-Globulin mit einer als Eluiermittel dienenden Pufferlösung eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Ionenaustauscher ein Anionenaustauscher, z.B. Agarose-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, Dextran-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, Cellulose-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, Polyvinyl-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, oder Amylose-Gel, in welches ein anionischer Substituent eingeführt worden ist, verwendet wird, wobei der anionische Substituent Diäthylaminoäthyl, Triäthylamino-äthyl oder Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthyl ist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Entwicklung eine Pufferlösung verwendet wird, welche einen pH-Wert von 4 bis 10 und eine Ionenstärke von 0,01 bis 0,15 aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Eluiermittel eine Pufferlösung verwendet, welche einen pH-Wert von 3 bis 4 und eine höhere lonenstärke als jene der zur Entwicklung verwendeten Pufferlösung aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenstärke der als Eluiermittel verwendeten Pufferlösung im Bereich von 0,05 bis 0,8 liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ionenaustauscher einen Kationenaustauscher, z.B. Agarose-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, Dextran-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, Cellulose-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, Polyvinyl-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, oder Amylose-Gel, in welches ein kationischer Substituent eingeführt worden ist, verwendet, wobei der besagte kationische Substituent Carboxymethyl, Sulfopropyl oder Sulfoäthyl ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Entwicklung eine Pufferlösung verwendet, welche einen pH-Wert von 4 bis 6,5 und eine Ionenstärke von 0,01 bis 0,1 aufweist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Eluiermittel eine Pufferlösung verwendet, welche einen pH-Wert von 6 bis 9 und eine höhere Ionenstärke als jene der zur Entwicklung verwendeten Pufferlösung aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Entwicklung verwendete Pufferlösung eine Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 0,8 aufweist.

10. Gereinigtes S-sulfoniertes y-Globulin, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an einzelnen Molekülen von 90% oder mehr und eine antikomplementäre Aktivität CHso von 10% oder weniger aufweist.