SE435786B - Rening av gammaglobulinderivat - Google Patents

Description

in 1en9s97~e 10 15 20 25 30 35 H0 ett behövligt antal i patienten, vilka framkallar olika sidoverk- ningar, såsom sänkning av blodtrycket, ökning av kroppstemperatu- ren, sjukdomar i. cirkulationssystemet eller liknande. Å andra sidan, när gammaglobulín administreras på intramuskulärt sätt, begränsas administreringsmängden och penetreringshastigheten av gammaglobulin in i blodkärl och följaktligen är den intramuskulä- ra administreringen inte lämplig, när snabb ökning av ölodnivån av antikroppen behövs. Följaktligen har det erfordrats att finna ett förbättrat gammaglobulin, som kan administreras intravenöst utan besvär beroende på antikomplementverkan.

Det har föreslagits olika metoder för.framställningen av intravenöst administrerbam;gammaglobulin, t.ex. en behandlings- metod med pepsin {cf. H.E. Schultze; Deutsch Medizinische wocnemscnrift, vol 87, sid 16H3 (1962)} och en behandlingsmetod med plasmin (ef. J.T. Sgouris; Vox Sanguinis, vol. 13, sid 71 (l967)}. Emellertid sönderdelas enligt behandlingsmetoden med en proteas, såsom pepsin, gammaglobulinet i två eller flera lägre molekylära föreningar, och följaktligen försvinner den alstrade antikroppen inom en kortare tidsperiod och ytterligare minskas den biologiska verkan av Fc-delen av gammaglobulin-molekylen beroende på avskärning av Fc-delen. I I Det har även föreslagits att ge ett intravenöst administr rerbart gammaglobulin utan ovanstående nackdelar, dvs för att tillhandahålla det önskade gammaglobulinet utan att väsentligen ändra strukturen av gammaglobulin, t.ex. en behandlingsmetod av gammaglobulin vid pH Ä (ef. S. Barundun et al; Vox Sanguinis, vol. l3. sid 93 (1967)) och en behandlingsmetod mæ.ß-propiolakton {cf. W. Stephan; Vox Sanguinis, vol. 28. sid H22 (l975)}. Enligt behandlingsmetoden vid pH H ökas emellertid innehållet av agglu- tinerade molekyler under förvaringen av sålunda erhållet gamma- globulin och den tenderar att igen öka antikomplementverkan.

Dessutom säjs det, att gammaglobulinet, som alstrats genom be- handlingen med ß-propiolaktonat, kan om möjligt fungera såsom en antigen, när det administreras. ü Det har nyligen rapporterats av Masuho et al, att ät lämp- ligt intravenöst administrerbat gammaglobulin kan alstras genom sulfonering av S-S-kedja av gammaglobulin (cf. amerikanska pa- tentskriften 4 059 571, japanska patentpublikationen 1630/1976).

Det S-sulfonerade gammaglobulinet alstrat av Masuho et al beva- rar den ursprungliga höga molekylen beroende på vätebindning, 10 15 20 mi \J'i 30 Ä0 under det att S-S bindningen är bruten, och följaktligen visar det anmärkningsvärd minskad antikomplementverkan med full- ständigt bevarad antikroppverkan (man säger att den antikomplet- terande verkningsnivån vid en proteinkoncentration av 5 viktpro- cent (härefter hänförd till såsom "CH5Û") är 30 % eller mindre) och vidare reduceras S-sulfonerat gammaglobulin lätt och oxide- ras sedan för att alstra ursprunglkm gammaglobulin, när det ad- ministreras till människokroppen {cf; Masuho et al, Journal of Biochemistry, vol 19, sid 1377 (l976)}. Det visade sig även att S-sulfonerat gammablogulin kan administreras stabilt för att sänka gammaglobulínemiska eller agammaglobulinemiska föremål ge- nom kliniska tester (of. Noboru Kobayashi, International Academy of Bloood Transfusion (Paris), 1978).

Sålunda är S-sulfonerat gammaglobulin utmärkt och använd- bart såsom ett intravenöst adminístrerbart gammaglobulinpreparat och uppmärksamhet ges därtill. Emellertid har denna produkt en nackdel, att den knappast kan alstras i en industriell skala.

Dvs, enligt förfarandet för framställning därav av Masuho et al, såsom nämndes här förut, när utgångsgammaglobulinet är tillräck- ligt renat och har mindre agglutinerade molekyler, kan man erhål- la önskat S-sulfonerat gammaglobulin med en låg antikomple- mentverkan,men när det konventionella gammaglobulinet, som använ- des~ industriellt,, t.ex. gammaglobulinet alstrat genom Cohn's fraktioneringsmetod under användning av etanol vid en låg tempe- ratur, användes såsom utgångsmaterial, har alstrat S-sulfonerat gammaglobulin en antikomplementverkan, som inte är så låg (som lägst CH50 = ca 30 till 20 %). Sålunda är i princip förfarandet enligt Masuho et al utmärkt, men den skall följas av någon yt- terligare behandling för att erhålla önskad produkt med en hög stabilitet i en industriell skala.

Under den omständigheten har man studerat intensivt för att finna ett förbättrat förfarande för framställning av det önskade S-sulfonerade gammaglobulinet med en tillräckligt låg antikomplementverkan även om något konventionellt gammaglo- bulin, som innehåller mycket agglutinerade molekyler, användes såsom utgångsmaterialet. Såsom ett resultat, har det nu visat sig, att efter sulfoneringsreaktionen, erhållet S-sulfonerat gammaglobulin behandlas med en jonbytare och därvid kan man er- hålla önskat S-sulfonerat gammaglobulin med en extremt låg anti- komplementverkan. 791098 97- 6 10 15 20 25 30 35 Vaotsfàevå-s H En avsikt med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för framställning av ett renat S-sulfonerat gamma- globulin. Denna och andra avsikter och fördelar med förellggandr uppfinning kommer att vara tydliga från följande beskrivning.

Enligt föreliggande uppfinning får S-sulfonerat gammaglo- bulin, som alstrats genom sulfonering av konventionellt gammaglo- bulin genom en känd metod behandlas med en jonbytare í en buffert- lösning som absorberar enkelmolekylärt, S-sulfonerat gammaglobulin på jonbytaren, och sedan eluerar man det enkelmolekylära, S-sul- fonerade gammaglobulinet med en buffertlösning för eluering, var- vid jonbytaren utgöres av en anjonbytare och buffertlösningen för absorbtion av ett pH-värde från 7 till 8 och en jonstyrka av 0,01 till 0,15, eller jonbytaren utgöres av en katjonbytare och buffert- lösningen för absorbtion har ett pH-värde från Ä till 6,5 och en jonstyrka av 0,01 till 0,1. Det enkla molekylära S-sulfonerade gammaglobulinet erhållet genom förfarandet enligt föreliggande uppfinning har ett CHSO på mindre-än 10 % och är följaktligen lämpligt såsom ett intravenöst administrerbart immunoglobulin- preparatf Utgångs-S-sulfonerat gammaglobulin kan framställas genom att använda ett konventionellt gammaglobulin, som vanligen fram- 'ställes genom Cohn's fraktioneringsmetod, som internationellt i vida kretsar har använts för framställningen av gammaglobulin {cf. J. Am. Chem. Soc., vol. 68, sid H59 (l9H6)}. net sulfoneras genom behandling med ett Qxidationsmedel, Såsom ett alkalimetalltetrajonat, ett alkalimetalljodobensoat, en mole- kylärt syre-innehållande gas (t.ex. luft) eller en sulfitjonalst- rande förening (t.ex. svavelsyrlighet) (ef. amerikanska patent- skriften H 059 571, japanska patentpublikationen 1630/1976 och 76Ul8/1976). S-sulfonerat gammaglobulin kan eventuellt renas med en konventionell metod, såsom dialys.

Jonbytaren, som användes i föreliggande uppfinning, är Gammaglobuli- t lämpligen en upprepade gånger användbar kolonn utan specifik ver- kan och har en stor bindníngskapacitet och är lämpligen en auto- klavbar gel med god stabilitet under olika förhållanden, t.ex. vid olika pH-nivåer, jonstyrkor, etc.

Jonbytaren omfattar anjonbytare och katjonbytare, men an- 10 15 20 °s 50 35 1909897-6 jonbytare är lämpliga sett från synpunkten av produktens biolo- giska och fysikaliska stabiliteter. Anjonbytaren kan användas i kombination med katjonbytaren.

Lämpliga exempel på anjonbytaren är agarosgel, i vilken in- förts en anjonisk. substituent (t.ex."DEAE-Sepharose CL-65"), dextrangel, i vilken införts en anjonisk substituent (t.ex."DEAE- Sephade¶§"QAE-Sephadex“L cellulosagel, i vilken införts en anjo- nisk substituent (t.ex.'%EAEßcellulosa,"TEAEWcellulosa), polyvi- nylgel, i vilken införts en anjonisk substituent (t.ex.

"DEAE-TOYOPEAL"), amylosgel, i vilken införts en anjonisk substi- tuent eller liknande. Den anjoniska substituenten omfattar di- etylaminoetyl (DEAE), trietylaminoetyl (TEAE) och dietyl-(2-hyd- roxipropyl)aminoetyl (QAE).

Lämpliga exempel på katjonbytaren är agarosgel, i vilken införts en katjonisk substituent, (t.ex. CM-Sepharose CL-6B"), dextrangel, i vilken införts en katjonisk substituent (t.ex.

"CM-Sephadexfl“SP-Sephadex"L cellulosagel, i vilken införts en kat- jonisk substituent (t.ex."CMWcellulosa), polyvinylgel, i vilken införts en katjonisk substituent (t.ex. "CM-TOYOPEAL"), amylos- gel, i vilken införts en katjonisk substituent, eller liknande- Den katjoniska substituenten omfattar karboximetyl (CM), sulfo- propyl (SP) och sulfoetyl (SE).

Absorptionen av det S-sulfonerade gammaglobulinet på en jonbytare kan utföras på följande sätt: Det S-sulfonerade gamma- globulinet behandlas med en jonbytare i en buffertlösning för absorbtion, vilken lösning har en optimal vätejonnivå (pH-nivå) och en optimal jonstyrka, och därvid absorberas det enkla moleky- lära S-sulfonerade gammaglobulinet på jonbytaren. Genom denna behandling passerar agglutinerade molekyler av S-sulfonerat gam- maglobulin och även osulfonerat gammaglobulin genom jonbytaren utan att absorberas. Efter absorptíonen, tvättas jonbytaren med samma buffertlösníng för att fullständigt borttaga det aggluti- nerade gammaglobulinet och andra orenheter.

Buffertlösningen, som användes för absorptionen av det enkla molekylära S-sulfonerade gammaglobulinet,har pH-nivå från H till 10, lämpligen 7 till 8, och en jonisk styrka (u) från 0,01 till 0,15, lämpligen 0,03 till 0,09, vid fallet anjonbytare.

När dessutom en katjonbytare användes, har buffertlösningen en pH-nivå från U till 6,5, lämpligen 5 till 6, och en jonisk styr- ka från 0,01 till 0,1, lämpligen 0,035 till 0,07. Koncentration~n venfaøàv-e 10 15 20 _. “5 BO av det S-sulfonerade gammaglobulinet, som skall underkastas ab- sorptionsbehandlingen, är inte kritisk, men med hänsyn till jon- bytarens utbyteskapacitet användes lämpligen S-sulfonerat gamma- globulin i en koncentration från 2 till 12 vikt/volym Z.

Buffertlösningen för absgrbfiion omfattar en fosfatbuf~ fertlösning, en citratbuffertlösning, en tris-fosfatbuffertlös- ning, en tris-HCl-buffertlösning, en boratbuffertlösning, en acetatbuffertlösning, eller liknande.

Det enkla molekylära S-sulfonerade gammaglobulinet, som ab- sorberææ på jonbytaren, utvinnes lätt därifrån genom utelueríng med en buffertlösning, som har en pH-nivå och jonisk styrka skild från de hos buffertlösningen för absorbtionen. Buffertlösning- en för elueringen har en pH-nivå från 3 till 4 vid det fall, att man använder en anjonbytare, och en pH-nivå från 6 till 9, vid fal- fallet att man använder en katjonbytare. Den joniska styrkan(u) hos buffertlösningen för eluering skall vara högre än den för buffertlösningen för absorbtion 'och den är lämpligen i området från 0,05 till 0,8. Buffertlösningen för eluering omfattar en fosfatbuffertlösníng, en glycin-H01-buffertlösning, en citratbuf- fertlösning, en vattenhaltig lösning av natriumacetat, eller lik- Dessa buffertlösningar kan innehålla natriumklorid.

Reningsbehandlinëen hos föreliggande uppfinning utföres vanligen vid rumstemperatur, men kan utföras under kylning.

Sesulfonerat gammaglobulin, som renats genom föreliggande uppfinning, har ett högre innehåll av enkel molekyl, en mindre antikomplementverkan och en större stabilitet i jämförelse med produkten innan rening. Exempelvis, när det S-sulfonerade gamma- globulinet, som användes i exempel 1 härefter (tre prov), renades enligt förfarandet enligt föreliggande uppfinning under använd- ning av"DEAE-Sepharose CL-6E'och'CM-Sepharose CL~6B"och erhâllen produkt reglerades så att den erhöll en proteinkoncentration av 5 %, visade produkterna en sådan antikomplementverkan (CH50), innehållet av en enkel molekyl (mätt genom ultracentrifugalana~ lys) och skak-stabilitet (mätt med hjälp av skillnaden av ljus- spridning efter skakning med Kahn's skakmaskin) såsom visas i tabell l. nande. 10 15 20 7999897-6 7 gíbell 1 d "- Efter rening Använd- Använd- Prov Innan ning av ning av Nr. rening '®EAE- "CM- Sepharose" Sepharoæ' Antikomplement- xl i 25 6 8 Verk?2)(°H50) ii 20 3 10 iii 22 5 7 Innehåll av *2 i 82 92 9o enkeä)molekyl ii Su 92 92 iii 85 9Ä 95 skaxscapilitet *5 1 1oo 5 ha ii 80 8 38 iii 136 2 30 {Anmärkningar}: *l) Den mättes enligt Kabat Mayer förfarandet {jfr. Experimental Immunochemistry, sid 225 (l96l)}. ga) Det mättes efter centrifugering vid 60 000 varv/minut under 50 minuter med Beckman ultracentrifugalmaskin.

KB) Den mättes genom att skaka produkten vid en amplitud av 3,U cm/sek och 5,7 perioder/sek i U timmar, därtill bestnålning med ljus och sedan mätning av skillnaden i ljusspridning innan och efter skakningen (cf. Standard for Biological Preparations, utgiven av Ministry of Health and welfare, Japan).

Såsom är klart från resultaten, som visas i tabell l, vi- sar S-sulfonerat gammaglobulin renat med föreliggande uppfinning, en extremt minskad antikomplementverkan, dvs 10 % eller mindre vid en proteinkoncentration på 5 %, i jämförelse med den för produkten innan reningen. Vid fallet av att man använder anjonbytare, minskas den särskilt mycket. Innehållet av enkel molekyl ökas från 75 % till 80 % (innan rening) till 90 till 95 % (efter rening). Enligt ultracentrifugalanalys, analyseras knap- past de högligen agglutinerade molekylerna, emedan de utfälles omedelbart efter igångsättandet av centrifugeringen, men enligt gelkromatografisk analys (t.ex. tunnskiktsgelkromatografi) kan de agglutinerade molekylerna separeras i polymerer och oligome- rer. Enligt denna gelkromatografiska analys, bestämdes det, att innehållet av monomer (enkel molekyl) ökats från 60 till 70 1 10 15 20 'æ 30 35 H0 ' tig glycin-innehållande isotonisk fosfatbuffertlösning. 79098 97- 6 8 (innan rening) till 85 % eller mera (efter rening). Dessutom en- ligt mätning av ljusspridningen innan och efter rening visar S-sulfonerat gammaglobulin renat enligt föreliggande uppfinning en extremt hög stabilitet och inte någon olöslig substans utfäl- les ens genom skakning.

Föreliggande uppfinning belyses genom följande exempel, vari % betecknar viktprocent såvida inte annat anges. gšempel 1 " Natriumtetrationat (248 g) och natriumsulfit (H08 g) lös- tes separat i fosfatbuffertlösning, som innehåller natriumklorid, (pH 7,6) (1500 ml respektive 3500 ml) följt av filtrering för att sterilisera. Varje sålunda framställd lösning sattes till en 15-procentig vattenhaltig lösning av gammaglobulin (10 liter), som framställts från human blodplasma genom etanol-fraktione- ringsmetoden och blandningen omrördes sakta vid Ä3°C i 4,5 timmar för fortsättning av sulfoneringen.

Efter reaktionen dialyserades reaktionsblandningen mot en fysiologisk saltlösning för att borttaga överskottet sulfone- ringsmedel och bringades sedan i jämvikt med en buffertlösning för framkallning (en fosfatbuffertlösning; p = 0,06, pH 7,5).

Lösningen av S-sulfonerat gammaglobulin i fosfatbuffert reglerades för erhållande av en proteinkoncentration på ca 8 % eoch lösningen (15 liter) framkallades genom att passera genom en kolonn (16 liter) packad med'®EAE-Sepharose CL-6H'(gjord av Pharmacia), som bringades i jämvikt med samma fosfatbuffertlös- ning, såsom användes ovan. Fraktionen (P-I), som passerade ge- nom kolonnen utan att absorberas på jonbytaren, var en lösning med en proteinkoncentration på ca 2 % (16 1iter)f -Kolonnen tvättades väl med samma fosfatbuffertlösning, som användes ovan, och när proteinet nästan inte upptäcktes läng- re, fick en acetatbuffertlösning (u = 0,1, pH fl,0) passera genom kolonnen och den eluerade fraktionen (P-II) uppsamlades. Frak- tionen (P-II) var en lösning med en proteinkoncentration på ca -2,5 % (32 liter).

Varje fraktion erhållen ovan neutraliserades med en vatten- haltig natriumhydroxidlösning, koncentrerades tills proteinkon- centrationen blev 5 % och dialyserades sedan mot en 2,25-procen- Olika egenskaper hos sålunda erhållna produkter mättes på samma sätt, som visas i tabell 1. Resultaten visas i tabell 2. 10 15 20 25 79098 97 - 6 9 Tabell 2 Innan Efter rening rening P_I P_II Antikomple- mentverkan 2H 52 H H (c 50) cm Innehåll av enkel molekyl 82 50 9" (%) Skakstabilitet 120 207 3 Såsom är klart från ovanstående resultat, har P-I frak- tionen en hög antikomplementverkan och innehåller en stor mängd av agglutinerade molekyler och är lägre i skakstabilítet. Å andra sidan har önskad P-II fraktion en tillräckligt låg anti- komplementverkan, och ett högt innehåll av enkel molekyl och en extremt ökad skakstabilitet. Såluna borttages komponenterna med icke önskade egenskaper effektivt såsom P-I fraktion.

Separationsmönstret av fraktionerna i ovanstående exempel l visas i bifogade figur l, vari abskissaaxeln är fraktionstalet och ordinataaxeln är den optiska tätheten hos varje fraktion vid en våglängd av 280 nm.

Dessutom underkastades lösningen av S-sulfonerat gammaglo- bulin innan rening (A), P-I fraktíonen (B) och P-II fraktíonen (C) ultracentrífugalanalys (X) och tunnskiktsgelfiltreringsana- lys (Y).

Ultracentrifugalanalysen utfördes under förhållandena av en pro- teinkoncentration på ca 1,67 % vid 60 000 varv/minut under 50 mi- nuter genom användning av en Beckmann ultracentrifugalmaskin och tunnskiktsgelfiltreringsanalys utfördes i enlighet med Migitas metod (of. Annual Report of Inst. Virus Research, Kyoto Univ., vol. 8, sid 130 (l965)}. I figur 2 betecknar "a" en enkel mole- kylär substans (7S) och "b", "c" och "d" är oligomerer (95, llS respektive 138) och "p" betecknar en polymer. Såsom är klart från figur 2, visar båda analyser liknande mönster, men mängden av de starkt agglutinerade molekylerna tycks högre i tunnskikts- gelfiltreringsanalysen än i ultracentrifugalanalysen. I mönst- ren av Ältracentrifugalanalysen, framträder inte polymeren. Bå- da analyserna visar att P-I fraktionen innehåller en stor Mönstrena i dessa analyser visas i bifogade figur 2. 10 15 20 25 7909897-6 10 mängd agglutinerade molekylerna och P-II fraktionen innehåller en ökad mängd enkel molekyl.

Exempel 2 En 15-procentig vattenhaltig lösning av gammaglobulín sul- fonerades och_följdes av dialys på samma sätt som beskrives i Sålunda erhållen S-sulfonerad gammaglobulinlösning Lös- ningen (ca 100 liter) får pasera genom en kolonn (150 liter) packad med"DEAE-Sepharose CL-6B2 som bringades i jämvikt med en citratbuffertlösning (u = 0,03, pH 7,5). Fraktionen (p-I), som passerade genom kolonnen utan att absorberas på jonbytaren, var en lösning med en proteinkoncentration på ca 1,5 % (ca 125 liter).

Efter tvättning av kolonnen pâ samma sätt, som beskrives i exempel l, fick en glycin-H01-buffertlösning, som innehöll nat- riumklorid (u = 0,55, pH 3,5L passera genom kolonnen och den eluerade fraktionen (P-II) uppsamlades. Fraktionen (P-II) var en lösning med en proteínkonoentration pâ ca 2 % (ca 2Ä5 liter).

Sålunda erhållna fraktioner behandlades på samma sätt som beskrevs i exempel l och de olika egenskaperna därav mättes li- kaledes. exempel l. reglerades för att få en proteinkoncentration på ca 7 %.

Resultaten visas i tabell 3.

Tabell 3 Innan Efter reningl r°“i“g P-I P~II Antikomple- mentverkan 25 58 5 (cnso) (%) Innehåll av enkel molekyl 82 50 94 (%) - Skakstabilitet 137 258 3 Exempel 3 På samma sätt, som beskrives i exempel , med undantag av att en citratbuffertlösning (p = 0,03, pH_735) användes i stället för fosfatbuffertlösningen (p = 0,06, PH 7,5) såsom buffertlÖS~ ning för framkallning, framkallades en lösning (ca 15 liter) av S-sulfonerat gammaglobulin med en proteinkoncentration på ca 7 % genom att passera genom en kolonn (16 liter), som var packad med "DEAE-Sepharose_CL-6B¥. Såsom ett resultat, erhöll man P-I frak- 10 15 20 25 30 35 7909897-6 11 tion (l5,6 liter) med en proteinkoncentration på ca 1,7 %. Genom att använda en citratbuffertlösning (U =0,6lN, pH 6,0) såsom buf- fertlösning för eluering, erhöll man P-II fraktion (31 liter) med en proteinkoncentration på ca 2,2 1. Éxempel H Ovanstående exempel 3 upprepades med undantag av att en fosfatbuffertlösning (u = 0,06, pH 7,5) användes. Såsom ett re- sultat erhöll man P-I fraktion (ca lä liter) med en proteinkon- oentration på ca 1,8 %. Dessutom genom att eluera med en glycin- H01 buffertlösning (u = O,5U2, pH 3,5) erhöll man P-II fraktion (29 liter) med en proteinkoncentration på ca 2,U %.

Exempel 5 Ovanstående exempel uppreapdes med undantag av att en tris- HCl-buffertlösning (p = 0,0l75, pH 8,5) användes såsom buffert- lösning för framkallning och en fosfatbuffertlösning, som inne- höll natriumklorid (u = O,Ä5, pH 6,0),användes såsom buffertlös- ning för eluering. Såsom ett resultat erhöll man P-I fraktion (22 liter) med en proteinkoncentration på ca l,2 % och P-II frak- tion (27 liter) med en proteinkoncentration på ca 2,6 %.

Exempel 6 En vattenhaltig lösning av S-sulfonerat gammaglobulin framställd på samma sätt som beskrives i exempel l bringades i jämvikt genom dialys mot en acetatbuffert (u = 0,05, pH 5,3).

Lösningen reglerades så för att erhålla en koncentration av S-sulfonerat gammaglobulin på ca 7 % och erhållen lösning (15 li- ter) fick passera genom en kolonn (16 liter; packad med "CM-Sepharose CL-6B"(tillverkad av Pharmacia), som bringades i jäm- vikt med samma acetatbuffertlösning som användes ovan. Fraktio- nen (P-I), som passerade genom kolonnen utan att absorberas där- till var en lösning med en proteinkoncentration på ca 1,9 % (13 liter).

Efter tvättning av jonbytarkolonnen på samma sätt som be- skrevs i exempel l fick en vattenhaltig lösning av natriumacetat (p = 0,2) passera genom kolonnen och den eluerade fraktionen (P-II) uppsamlades. teinkoncentration av ca 2,5 % (27 liter).

Varje sålunda erhållen fraktion behandlades på samma sätt som beskrevs i exempel l och olika egenskaper därav mättes lika- ledes. Resultaten visas i tabell Ä.

P-II fraktionen var-en lösning med en pro- :an:-xx:|1:-=-:::==:::-:..:..::-.;:i=-:.-zl 7909891-6 12 Tabell 4 Innan Efter rening rening P_I P_II Antíkomplement~ verkan (CH ) 25 32 8 50 (%) Innehåll av enkel molekyl 85 48 95 (%) Skakstabilitefi 102 180 32 ---_-_----_-_-_-__-_

Claims (7)

7909897-6 13 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av ett renat, S-sulfone- rat gammaglobulin, k ä n n e t e c k n a t därav, att man behandlar ett S-sulfonerat gammaglobulin med en jonbytnre i en buffertlösning som absorberar enkelmolckylärt, S~su1fonerat gammaglobulin på jonbytaren, och sedan eluerar det enkelmole- kylära, S-sulfonerade gammaglobulinet med en buffertlösning för eluering, varvid jonbytaren utgöres av en anjonbytare och buffertlösningen för absorbtíon har ett pH-värde från 7 till 8 och en jonstyrka av 0,01 till 0,15, eller jonbytaren utgöres av en katjonbytare och buffertlösningen för absorbtíon har ett pH-värde från 4 till 6,5 och en jonstyrka av 0,01 till 0,1. 1

2. Z. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att anjonbytaren utgöres av agarosgel i vilken införts en anjonisk substituent, dextrangel, i vilken införts en anjonísk substituent, cellulosagel, i vilken införts en anjonísk substituent, polyvinylgel, i vilken införts en anjonisk substituent, och amylosgel, i vilken införts en anjonisk substituent, varvid den anjoniska substituenten ut- göres av dietylaminoetyl, trietylaminoetyl eller díetyl-(2- hydroxipropy1)aminoetyl.

3. Förfarande enligt krav 1 eller Z, k ä n n e t e c k - n a t därav, att en buffertlösning med en pH-nivå från 3» till 4 och en jonstyrka högre än den för buffertlösningen för absorbtíon _ användes såsom buffertlösning för eluering.

4. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att jonstyrkan hos buffertlösningen för elueríng ligger inom omrâdet från 0,05 till 0,8.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att katjonbytaren utgöres av agarosgel, i vilken in- förts en katjonisk substituent, dextrangel, i vilken införts en katjonisk substituent, cellulosagel, i vilken införts en katjonisk substituent, polyvínyl, i vilken införts en katjonisk substituent och amylosgel, i vilken införts en katjonisk substituent, varvid den katjoniska substituenten utgöres av karboximetyl, sulfopropyl eller sulfoetyl.

6. 0. Förfarande enligt något av krav 1 eller 5, k ä n n e - t 0 c k n n t därav, att en huffertlösning med pH-nivå rensas?-6 w från 6 till 9 och en jonstyrka högre än den för buffertlösníngen användes såsom buffertlösning för elueríng. för absorbtíon k ä n n e t e c k n a t

7. Förfarande enligt krav 10, därav, att jonstyrkan hos buffertlösníngen för absorbtioñ ligger inom området från 0,05 till 0,8.