DD298110A5 - Verfahren zur herstellung eines konzentrats des blutgerinnungsfaktor-viii-von-willebrand-faktor-komplexes aus gesamten plasma - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Konzentrats des Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplexes mit hoher spezifischer Aktivitaet aus gesamtem (nicht-cryopraezipitiertem) Plasma. Das Verfahren umfaszt Vorreinigen durch eine doppelte Behandlung mit Bariumchlorid und mit Aluminiumhydroxid. Das Verfahren umfaszt dann Reinigen durch Chromatographie an einem Ionenaustauscher-Harz des DEAE-Fractogel-Typs. Das Verfahren schlieszt einen Schritt der Virusinaktivierung durch eine Behandlung mit Loesungsmittel-Detergens ein. Das Verfahren ermoeglicht es auch, Fibrinogen, Albumin, Immunglobuline, Antithrombin III, Fibronectin und Prothrombin-Komplex aus demselben Plasma zu gewinnen. Die verschiedenen Konzentrate, die unter Verwendung des erfindungsgemaeszen Verfahrens erhalten wurden, sind speziell fuer die therapeutische Verwendung geplant.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Konzentrats des Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplexes mit hoher spezifischer Aktivität aus gesamtem Blutplasma.
Die Behandlung von Hämophilie A durch die Injektion von Faktor VIII wird normalerweise praktiziert und macht die Verwendung von Präparationen hoher Reinheit notwendig, um einerseits das Risiko viraler Verunreinigungen zu verringern und andererseits, weil die Injektionen regelmäßig wiederholt werden müssen und jedes restliche verunreinigende Material könnte unerwünschte, für den Patienten gefährliche Immunantworten induzieren.
Mehrere Methoden werden bereits zum Behandeln von menschlichem Plasma zum Reinigen von Faktor VIII in industriellen Zentren verwendet. Solche Methoden schließen die Präzipitation von kontaminierenden Proteinen unter Verwendung verschiedener chemischorAgentien, Gelpermeationschromatografie, Immunaffinitätschromatografie, lonenauatauschchromatografie und verschiedener Kombinationen dieser unterschiedlichen Methoden ein.
Da nur eine kleine Menge an Faktor VIII in dem Plasma vorhanden ist, ist die Ausbeute des Reinigungsverfahrens das zu lösende Hauptproblem. Weiterhin ist Faktor VIII ein instabiles Protein und eines, das durch andere Elutfaktoren aktiviert werden kann; jedoch verliert es im aktivierten Zustand seinen therapeutischen Wert; die Reinigungsverfahren und die endgültige Dosierung müssen somit angepaßt werden, um dieses Problem zu bewältigen.
Der Anmelder hat bereits ein Reinigungsverfahren unter Verwendung von lonenaustauschchromatografie entwickelt, das in der FR-A-8807530 beschrieben ist, und das es ermöglicht, ein Faktor-Vlll-Konzentrat hoher Reinheit zu erhalten.
Jedoch ist bei diesem Verfahren, wie bei solchen anderer Hersteller, das verwendete Ausgangsmaterial eine cryopräzipitierte Fraktion des Plasmas. Diese Cryoprä^initationsstufe führt zu einem Verlust von 30 bis 40% an Faktor VIII, der in dem Überstand verbleibt.
Es waro deshalb vorteilhaft, ein Herstellungsverfahren aus nicht-cryopräzipitiertem gesamtem Plasma zu entwickeln, um die Faktor-Vlll-Verluste zu begrenzen. Weiterhin würde ein solches Verfahren eine sehr vorteilhafte Vereinfachung darstellen für nicht adäquat ausgestattete Herstellungszentren, in denen es schwierig sein kann, Cryopräzipitation durchzuführen.
Deshalb hat der Anmelder ein einfaches Verfahren zum Reinigen von Faktor VIII aus gesamtem Plasma entwickelt, das es ecmöglicht, ein stabiles Konzentrat mit hoher Reinheit zu erhalten, und das o>ne sehr gute Ausbeute liefert.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Herstellen eines Faktor-Vlll-Konzentrats aus gesamtem Plasma. Dieses Verfahren schließt Vorreinigen ein, um die Bestandteile des Prothrombin-Komplexes (Faktoren II, VII, IX, X) zu entfernen, und Reinigen durch Anionenaustauschchromatografii}, die es durch die Wahl des Gels und Elutionspuffers ermöglicht, einen Faktor· Vlll-von-Willebrand-Faktor-Komplex hoher Reinheit zu erholten.
Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, urr. nach einem zusätzlichen Reinigungsschritt gereinigte Lösungen der anderen Plasmaproteine zu erhalten, wie Fibrinogen, Fibronectin, Albumin, Immunglobuline und Antithrombin III.
Das Verfahren wurde entwickelt unter Verwendung von menschlichem Plasma, aber es ist gleichermaßen anwendbar auf ein Plasma tierischen Ursprungs.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es somit, Gesamtplasma als ein Ausganpsmaterial zu verwenden, d. h. ein Plasma, das entweder frisch oder zur Konservierung gefroren ist, aber kein Plasma, das cryopräzipitiert ist. Vorteilhafterweise wird das Plasma in der Anwesenheit eines Antikoagulanzes oder einer stabilisierenden Lösung gesammelt. Herkömmlicherweise wird eine Zitrat-Dextrose-Phosphat-Mischung verwendet; jeder spezifische Stabilisator von Faktor VIII kann vorteilhafterweise dieser zugesetzt werden oder diese ersetzen.
Eine Mischung aus 0,2 bis 2 U/ml an Heparin, 1 bis 5mM an EDTA und 1 bis 10mM an CaCI2 mit dem möglichen Zusatz an Glukose in einer Konzentration von 5 bis 60g/l kann vorteilhafterweise als stabilisierende Lösung für das Plasma-Ausgangsmaterial verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt einen Vorreinigungsschritt, der die Präzipitation mit Barlumchlorid und die Adsorption an Aluminiumhydroxid-Gel kombiniert.
Vorteilhafterweise wird die Bariumchloridbehandlung mit dem Plasma durchgeführt, dessen pH auf 6,5 eingestellt ist, und durch Zusetzen einer 1M Bariumchloridlösung eine Endkonzentration von 0,08 M erreicht ist unter Rühren, und der Behandlung folgt Zentrifugieren bei 6 bis 1O0C, um die präzipitierten Proteine zu entfernen, und dann Ernten des Überstands. Die präzipitierten Proteine können vorteilhafterweise geerntet werden zum Herstellen des Prothrombin-Komplexes oder seiner Bestandteile.
Der Überstand wird dann mit einem 3%-Aluminiumhydroxid-Gel bei einem pH von 6,5, das die restlichen kontaminierenden Proteine adsorbiert, in Kontakt gebracht; dieser Behandlungs folgt ein Abkühlen auf 5 bis 80C in einem Crvostaten, Zentrifugieren bei 5°C und Ernten des Überstands, der bei 5 bis 8°C gehalten wird.
Dieser Überstand muß eine Entsalzung durchlaufen, die durchgeführt werden kann entweder durch Ultrafiltration in der Anwesenheit des Beladungspuffers für den folgenden Chromatografieschritt, dem 0,5 bis 2 U/ml an Heparin zugesetzt worden sind, oder durch Chromatografie an Sephadex G 25 in dem gleichen Puffer.
Das erfindiingsgemäße Verfahren schließt dann eine Trennung durch Anionenaustauschchromatografie ein. Der Anmelder hat bereits in der FR-A-8807530 die Vorteile beschrieben, die erhalten wurden durch einen Harztyp mit geringer lonenaustauschkraft und großen Poren, wobei die letzteren die Retention sehr großer Moleküle erlauben. Diese verlängerte Retention erlaubt die Bildung leicht hydrophober Bindungen mit dem Harz, und die Wahl der lonenstärke des Puffers ertaubt die selektive Desorption der gebundenen Moleküle.
Harze dieses Typs sind käuflich unter dem allgemeinen Namen Fractogel. DEAE-Fractogel 650* und T- oder D-MAE-Fractogel (Merck) können somit verwendet werden. Diese gleichen Harze sind gegenwärtig erhältlich in einer Form, wie vom Hersteller beschrieben, als „Tentaculär-Typ-Harze". Die Struktur ihrer Matrix ist modifiziert, um die bindende Oberfläche der positiven Ladungen zu erhöhen, das eine Zunahme in der Kapazität fördern kann.
Der Beladungspuffer der Chromatografiesäule ist ein Natriumzitrat- und Natriumchlorid-basierter Puffer, der auf pH eingestellt ist, und vorteilhafterweise enthält Calciumchlorid in einer Konzentration von 0,5 bis 6mM, Lysin in einer Konzentration in dem Bereich von 2 bis 4g/l und Glycin in einer Konzentration von 8 bis 11 g/l. Die Durchführung des Verfahrens umfaßt vorab bestimmte Steigerungen in der Natriumchlorid-Konzentration.
Durchführen des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens umfaßt Injektion der oben beschriebenen, vorgereinigten Präparation auf die Chromatografiesäule. Unter den definierten Bedingungen (0,11M NaCI) kann die Säule sehr große Moleküle wie den von-Willebrand-Faktor-VIII-Komplex binden, und erlaubt dem Fibrinogen, Albumin, Immunglobulinen, Antithrombin Il und Fibronectin, in das Filtrat auszufließen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, die darauf abzielt, optimale Faktor-Vlll-Wiedergewinnungseff izienz zu erreichon, wird die lonenstärke des Puffers zur Elution der Chromatografiesäule nur einmal auf 0,27 M Natriumchlorid gesteigert. Gemäß einer anderen Ausführungsform erfolgt vor diesem Elutionsschritt ein Vorwaschschritt durch Steigern der lonenstärke auf 0,13M Natriumchlorid, was das Fibronectin entfernt.
Der Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex, der unter diesen Bedingungen desorbiert und eluiert wurde, hat eine spezifische Aktivität, die mindestens 5 bis 10 U/mg beträgt. Die Gesamtausbeute des Verfahrens beträgt mindestens 350U/I des ursprünglichen Plasmas und kann mindestens 500U/l betragen, wenn die oben beschriebene stabilisierende Mischung dem ursprünglichen Plasma zugesetzt wird.
Abhängig von seiner folgenden Verwendung kann diese Lösung des Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplexes einen zusätzlichen Reinigungsschritt und insbesondere einen Konzentrationsschritt durchlaufen durch eine weitere Chromatografie.
Wie die vorherige kann diese auf DEAE-oder T/D-MAE-Fractogel oder anderen Harzen durchgeführt werden; andere Träger, wie Dextransulfat, immobilisiertes Amino-Hexyl, immobilisiertes Heparin und Sulfopropylharze und Affinitäts- oder Immunaffinitätsharze können auch verwendet werden.
Der zusätzliche Chromatografieschritt wird in dem gleichen basischen Puffer wie dem vorhergehenden durchgeführt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, die darauf abzielt, Faktor VIII, der möglichst konzentriert ist, herzustellen, wird die zusätzliche Chromatografie unter den gleichen Bedingungen wie die erste durchgeführt, d. h. mit einem einzigen Desorptionsschritt durch Steigern der lonenstärke des Puffers auf 0,27 M NaCI. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erste Steigerung in der lonenstärke des Puffers auf 0,13M durchgeführt, um restliche kontaminierende Proteine zu entfernen, und eine zweite Steigerung auf 0,27 M wird durchgeführt, um das Konzentrat des Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplexes mit hoher Reinheit zu gewinnen, das dann eine spezifische Aktivität von mindestens 10 bis 20U/mg besitzt.
Die anderen Proteine des ersten Filtrats von der Säule, wie Immunglobuline, Albumin, Antithrombin III, Fibrinogen und Fibrinectin, können auch gereinigt und konzentriert werden unter Verwendung herkömmlicher chromatografischer Methoden.
Das erfindungsgemäße Verfahren schließt auch eine Behandlung zur Virusinaktivierung gemäß einer bekannten Technik ein. In dem Fall, daß ein chemisches Agens verwendet wird, z. B. eine Behandlung mit einem Lösungsmittel-Detergens, ist es empfehlenswert, eine solche Behandlung vor jedem der Chromatografieschritte durchzuführen, so daß letzterer das Entfernen der inaktivierenden Agentien sicherstellt.
Die Konzentrate des Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplexes und der anderen plasmatischen Proteine, die unter Verwendung des obigen Verfahrens erhalten wurden, sind auch Gegens and der vorliegenden Erfindung.
Die Konzentrate werden formuliert in Übereinstimmung mit den Standards des Arzneibuchs und können für therapeutische Zwecke verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
250 ml an frischem Plasma oder gefrorenem Plasma, das bei 22-25°C aufgetaut wurde, werden verwendet, wobei es in der Anwesenheit von Antikoagulans/stabilisierendem Mittel (z. B. Zitrat-Dextrose-Phosphat) gesammelt wurde und auf einen pH von 6,5 mit Essigsäure eingestellt wurde.
a) Vorreinigung
20ml an 1M Bariumchlorid mit pH 6,5 werden dem Plasma zugesetzt durch eine peristaltische Pumpe, bis eine Endkonzentration von 0,08m erreicht ist. Das Bariumchlorid wird mit einer Rate von 4 bis 8ml pro Minute zugesetzt, und dann wird die Mischung unter Rühren bei Raumtemperatur für 15 Minuten gehalten.
Die Mischung wird dann bei 2700Upm 20 Minuten lang bei 80C zentrifugiert, und dann wird der Überstand gewonnen. Der Überstand wird dann an ein Aluminiumhydroxid-Gel (Alhydrogel Eurobio mit 3% AI(OH)3) adsorbiert in einem Anteil von 2,3g/l Plasma. Der pH wird auf 6,5 eingestellt, und die Temperatur wird in einem Cryostaten auf 50C erniedrigt. Die Mischung wird zentrifugiert bei 5°C bei 2700Upm für 20 Minuten, und der Überstand wird gewonnen und bei 5°C gehalten. Diese Behandlung macht es möglich, die Bestandteile des Prothrombin-Komplexes (Faktoren II, VII, IX, X) zu entfernen, die geerntet und gereinigt werden können unter Verwendung bekannter Verfahren.
Besonders zufriedenstellende Ergebnisse können erhalten werden durch Kombinieren dieser zwei Behandlungen, wohingegen eine Alhydrogel-Behandlung alleine d<e vollständige Entfernung des Prothrombine und der anderen Bestandteile des PPSB nicht ermöglicht, und eine Bariumchlorid-Behandlung alleine etwas Faktur X, Prothrombin und vor allem Faktor VII zurückläßt. Der so gesammelte Überstand wird entsalzt, entweder durch Ultrafiltration in der Anwesenheit des Puffers des nachfolgenden Chromatografieschritts (siehe unten), dem 1 U/ml Heparin zugesetzt worden ist, oder durch Chromatografie an Sephadex G 25 in dem gleichen Puffer.
Eine herkömmliche Behandlung zur Virusinaktivierung mit Lösungsmittel-Detergens wird dann angewendet für 6 Stunden bei 24°C. (Dieses Behandlungsverfahren ist in EP-A-01321740 beschrieben), b) Reinigung durch Chromatografie
Der vorgereinigte, dialysierte Überstand durchläuft einen Chromatografie-Reinigungsschritt. Eine K26/30 Säule (Pharmacia-Uppsala, Schweden) wird verwendet mit einem Durchmesser von 2,6cir <md einer zweckmäßigen Höhe von 30cm, bei der 10cm mit DEAE-Fractogel-TSK 650» Harz (Merck) gefüllt sind.
Die Zusammensetzung des Säulenbeladungspuffer3 und des Puffers zum Lösen der Probe ist wie folgt: Natriumzitrat 1OmM; Calciumchlorid, 1 mM; Glycin, 9g/l; Lysin, 3g/l. Diesem Puffer wird Natriumchlorid zugesetzt, das auf eine Endkonzentration von 0,11M und einem pH von 7 eingestellt ist
Die Probe wird mit einer Rate von 100ml/h auf die Säule injiziert.
Die Säule wird mit Beladungspuffer gewaschen, um nicht-absorbierte Proteine, die Fibrinogen, Albumin, Immunglobuline, Antithrombin III und Fibronectin einschließen, wie auch die virusinaktivierenden Agentien zu entfernen. Der Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex wird dann desorbiert durch Steigerung der lonenstärke des Puffers auf 0,27 M Natriumchlorid.
Die unter Verwendung dieses Verfahrens erhaltene Faktor-Vlll-Lösung besitzt eine spezifische Aktivität von 5 bis 10lU/mg und die Reinigungseffizienz im Verhältnis zu dem auf die Säule injizierten Plasma beträgt zwischen 60 und 80%. Ein Verhältnis nahe 1 U/1 U wird immer für die Konzentration der beiden Faktoren Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor beobachtet, wobei letzterer in Ristocetin-Cofaktor-Einheiten ausgedrückt wird.
Die Reinheit der Faktor-Vlll-Lösung kann weiterhin leicht verbessert werden durch einen zusätzlichen chromatografischen Trennungsschritt, der es ermöglicht, das Produkt zu konzentrieren. Es wird z. B. von einer zweiten Säule DEAE-Fractogel Gebrauch gemacht unter den gleichen Beladungsbedingungen wie zuvor, und das Vorwaschen wird mit 0,13 M NaCI durchgeführt, was die restlichen kontaminierenden Proteine entfernt. Die lonenstärke des Puffers wird dann auf 0,27 M Natriumchlorid gesteigert, um den hochgoreinigten und konzentrierten Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex zu desorbieren und zu eluieren.
Gemäß der üblichen Ausführungsform wird der erste Reinigungsschritt durch Chromatografie an einem DEAE-Fractogelharz ausgeführt. Jedoch sind auch sehr gute Ergebnisse erzielt worden mit neuen von Merck vermarkteten Harzen, wie TMAE-Fractogel (TMAE = Tri-Methyl-Amino-Ethyl) oder DMAE-Fractogel (DMAE = Di-MAE), die Eigenschaften entsprechend demjenigen von DEAE-Fractogel haben. Es können auch die neuen Harze des „Tentakulär"-Typs verwendet werden, wie sie von der Firma Merck entwickelt wurden und von W. Müller bei der «Conference on Liquid Chromatography", Juni 1989, in Stockholm gezeigt wurden.
gleichzeitig ein Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Konzentrat bereitgestellt wird mit einer niedrigeren Ausbeute und leichtverbesserter spezifischer Aktivität.
ersten Säule mit DEAE-Fractogel.
dem Filtrat gewonnen werden.
chromstografischen Trennschritt auf einer Säule mit DEAE-Fractogel, wobei der Beladungspuffer eine lonenstärke von 0,17 M
auf 0,27 M Natriumchlorid ermöglicht, den Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex zu desorbieren und zu eluieren. Einespezifische Aktiv'r ät von 10 bis 20IU/mg wird so erhalten.
chromatografischer Verfahren, um Lösungen zu ergeben mit einer Qualität, die geeignet ist zur therapeutischen Verwendung,und in FR-A-8807530 beschrieben ist.
Die Reinigungseffizienz kann noch weiter gesteigert werden durch Stabilisieren des ursprünglichen Plasmas von seinem Auftauen bis 25°C durch Zusetzen der folgenden Mischung:
| Heparin: | 1U/ml |
| EDTA: | 2 mM, oder 0,74 g/l |
| Calciumchlorid: | 6 mM oder 0,67 g/l. |
Glukose mit einer Konzentration von 5 bis 60g/l kann weiterhin der Mischung zugesetzt werden.
Der pH wird dann durch Zusetzen von Essigsäure auf 6,5 erniedrigt.
Die Reinigungsschritte werden dann wie in Beispiel 1 oder 2 angewendet.
Unter diesen Bedingungen beträgt die Gesamtausbeute des Reinigungsverfahrens mindestens 500U an FVIII: C/Liter ursprünglichen Plasmas.
Dies entspricht einer gesamten Ausbeute von 55 bis 65% der Aktivität an Faktor VIII für eine spezifische Aktivität zwischen 10 und 30 Einheiten an FVIII: C/mg Protein.
Claims (25)
1. Verfahren zum Herstellen eines stabilen Konzencrats des Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplexes mit hoher spezifischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß ein gesamtes Plasma einer Vorreinigung unterzogen wird durch eine doppolte Behandlung mit Bariumchlorid und mit Aluminiumhydroxid und einer Reinigung durch Chromatografie an einem Anionenaustauscher-GeI, das die Retention sehr großer Moleküle erlaubt.
2. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gesamte Plasma ein frisches oder gefrorenes Plasma ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine stabilisierende Mischung, umfassend 0,2 bis2U/ml an Heparin, 1 bis5mM an ETDAund 1 bis 1OmM an CaCI2, dem Plasma zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Mischung weiterhin Glukose in einer Konzentration von 5 bis 60 g/l enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorreinigung umfaßt:
a) Präzipitation mit Bariumchlorid, gefolgt von Zentrifugieren und Ernten des Überstände,
b) Adsorption an Aluminiumhydroxid-Gel, gefolgt von kaltem Zentrifugieren und Ernten des Überstands,
c) Entsalzungsbehandlung.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitation mit Bariumchlorid bewirkt wird durch Zusetzen einer Lösung an 1M Bariumchlorid bei einem pH von 6,5 unter Rühren, und sie gefolgt wird von Zentrifugieren bei 5 bis 100C und Ernten des Überstands.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorption an Aluminiumhydroxid-Gel mit einem 3%igen Gel bei einem pH von 6,5 durchgeführt wird und gefolgt wird von raschem Kühlen auf 50C, Zentrifugieren bei 50C und Ernten des Überstands.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Entsalzungsbehandlung durchgeführt wird durch Ultrafiltration in der Anwesenheit des Beladungspuffers für den folgenden Chromatografieschritt, dem Heparin zugesetzt worden ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Entsalzungsbehandlung durchgeführt wird durch Chromatografie an einer Säule aus Sephadex G 25 in dem Beladungspuffer für den folgenden Chromatografieschritt, dem Heparin zugesetzt worden ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Überstand des Plasmas, das die Vorreinigung durchlaufen hat, aufeineChromatografiesäule injiziert wird, die ein Anionenaustauscher-Gel enthält, das sehr große Moleküle nicht ausschließt und dem Fibrinogen, Albumin, Immunglobulinen, Antithromin III und Fibronectin erlaubt, in das Filtrat auszufließen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromatograpfie-Gel ein Gel ist vom Vinylpolymertyp, an das Gruppen des DEAE- oder T- oder D-MAE-Typs gebunden sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer-Gel Fractogel ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Chromatografiesäulen-Beladungspuffer ein Natriumzitrat oder Kalziumchlorid-basierender Puffer ist, enthaltend Glycin und Lysin, dem 0,11M Natriumchlorid zugesetzt wird und der auf einen pH von 7 eingestellt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer 8 bis 11 g/l an Glycin und 2 bis 4g/l an Lysin enthält.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die lonenstärke des Puffers auf 0,27 M Natriumchlorid gesteigert wird, um den Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex von der Chromatografiesäule zu desorbieren.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die lonenstärke des Puffers auf 0,13 M Natriumchlorid gesteigert wird, was das Fibronectin entfernt, und denn auf 0,27 M Natriumchlorid gesteigert wird, um den Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex von der Chromatografiesäule zu desorbieren.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex, der von der Chromatografiesäule desorbiert ist, einen weiteren Reinigungs- und Konzentrationsschritt durch Chromatografie durchläuft.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Chromatografie an einem lonenaustauscherharz durchgeführt wird, das aus den folgenden ausgewählt ist: DEAE- oder T/D-NAE-Fractogel, immobilisiertem Amino-Hexyl, immobilisiertem Heparin, Dextransulfat, Sulfopropyl oder an einem Affinitäts- oder Immunaffinitätsharz.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Chromatografie durchgeführt wird mit einem auf 0,11 M Natriumchlorid eingestellten Puffer und zwei sukzessive Steigerungen in der lonenstärke auf 0,13 M und dann auf 0,27 M einschließt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Chromatografie durchgeführt wird mit einem Puffer, der auf 0,17 M Natriumchlorid eingestellt ist, und eine einzige Steigerung in der lonenstärke auf 0,27H umfaßt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Chromatografie-Filtrat nach Anspruch 10 vorhandenen Proteine einen zusätzlichen Reinigungsund Konzentrationsschritt durchlaufen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine herkömmliche Behandlung zur Virusinaktivierung durchgeführt wird unter Verwendung von Lösungsmittel-Detergens vor jedem der Chromatograf ieschritte.
23. Faktor-VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex-Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, daß es erhalten wird durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22.
24. Proteinkonzentrate von Plasma abstammend, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhalten werden durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und 21 oder 22.
25. Konzentrate nach einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur therapeutischen Verwendung formuliert werden.
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