LT3418B

LT3418B - Process for the preparing a concentrate of blood coagulation factor vii-von willebrand factor complex from total plasma

Info

Publication number: LT3418B
Application number: LTIP263A
Authority: LT
Inventors: Miryana Burnouf; Thierry Burnouf
Original assignee: Centre Regional De Transfusion
Priority date: 1989-09-05
Filing date: 1992-12-29
Publication date: 1995-09-25
Also published as: DE69002427D1; DK0416983T3; CZ277939B6; YU203490A; SI9012034B; FI95654C; AU627618B2; EP0416983B1; ATE91896T1; UA26847C2; LV10053B; HRP920768A2; HRP920768B1; NO903865D0; SK431290A3; NO903865L; FR2651437A1; FI904381A0; CA2024667A1; US5679776A

Description

Išradimas apima komplekso VIII faktorius-von Willebrand'o faktorius koncentrato, turinčio aukštą specifinį aktyvumą, gavimo būdą, panaudojant kraujo plazmą.

Hemofilijos A gydymas VIII faktoriaus injekcija yra įprasta praktika ir reikalauja didelio švarumo preparatų, kad, iš vienos pusės, sumažinti preparatų užteršimo virusais galimybę, iš kitos pusės - kadangi injekcijos yra dažnai kartojamos - kad išvengti pavojingų pacientui nepageidaujamų imuninių pasekmių dėl preparate susikaupusių liekamųjų teršalų.

Norint išgryninti VIII faktorių, techniniuose centruose yra naudojami įvairūs žmogaus plazmos apdorojimo metodai. Tokie metodai apima teršiančiųjų baltymų išsodinimą, naudojant įvairius cheminius agentus geliųfiltracinę chromatografiją bei įvairius šių skirtingų metodų derinius.

Kadangi plazmoje randami kiekiai, valymo proceso spręstina problema. Be baltymas, Vienok, nedideli VIII faktoriaus išeiga yra svarbiausia to, VIII faktorius yra kurį gali aktyvuoti kiti kraujo aktyvuojant, jis praranda savo sprendimui galutinis nestabilus faktoriai.

gydomąją galią. Tokiu būdu problemos reikalingi specialūs valymo metodai ir dozavimas.

Pareiškėjas jau išvystė valymo būdą, naudojant jonų mainų chromatografiją, kuri aprašyta Prancūzijos patentinėje paraiškoje No 88 07530; šis būdas leidžia gauti aukšto valymo laipsnio VIII faktoriaus koncentratą.

Vienok, kaip tai praktikavo kiti gamintojai, džiantys analogiškus preparatus, pagal šį išleimetodą pradinė žaliava buvo plazmos krioprecipituota frakcija. Šioje krioprecipitacijos stadijoje prarandama 30-40% VIII faktoriaus, kuris lieka supernatante.

Būtų tikslinga sukurti paruošimo iš nekrioprecipituotos visos plazmos būdą, kad apriboti VIII faktoriaus nuostolius. Be to, toks metodas būtų labai parankus įranga nevienodai aprūpintiems centrams, kuriuose kartais būna sunku atlikti krioprecipitaciją.

Štai kodėl siūlomas paprastas VIII faktoriaus išskyrimo iš visos plazmos būdas, kuris leidžia gauti labai išvalytą stabilų koncentratą su labai aukšta produkto išeiga.

Tokiu būdu šis išradimas liečia VIII faktoriaus koncentrato gavimą, naudojant visą plazmą. Šis būdas apima išankstinį valymą, pašalinant protrombino komplekso sudedamąsias dalis (II, VII, IX, X faktorius), taip pat valymą jonų mainų chromatografijos pagalba, parenkant gelį ir eliucijos buferį, norint gauti aukšto valymo laipsnio VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktorius kompleksą.

Šis būdas (įvedus papildomas valymo stadijas) taip pat gali būti naudojamas kitų plazmos baltymų, kaip fibrinogenas, fibrinonektinas, albuminas, imunoglobulinai ir III antitrombinas, valytų tirpalų gavimui.

Šis būdas sukurtas naudojant žmogaus plazmą, bet jis vienodai tinkamas ir gyvulinės kilmės plazmai.

Remiantis šiuo išradimu, būdas tinkamas, kaip pradinę žaliavą naudojant visą kraujo plazmą, kuri gali būti šviežia ar užšaldyta (išsaugojimo tikslu), bet tiktai nekriopricipituota. Tikslinga, kad ši plazma būtų surinkta, esant koaguliantui ar stabilizuojančiam tirpalui. Paprastai šiam reikalui naudojama citratodekstrozės-fosfato mišinys. Naudinga taip pat naudoti bet koki, specifini, VIII faktoriaus stabilizatorių, įvedamą į mišinį ar jį pakeičiantį.

Kaip plazmos pradinę medžiagą stabilizuojantį tirpalą tikslinga naudoti mišinį, susidedantį iš 0,2-2 v/ml heparino, 1-5 mM EDTA, 1-10 mM CaCl₂, su galimu 5-60 g/1 gliukozės priedu.

Sutinkamai su šiuo išradimu būdas turi išankstinio valymo stadiją, kuri derina išsodinimą bario chloridu ir adsorbciją ant aliuminio hidroksido gelio.

Tikslinga plazmos apdorojimą bario chloridu atlikti prie pH 6.5, dedant 1 M bario chlorido tirpalą iki galutinės 0.08 M koncentracijos, nepertraukiamai maišant, po to centrifuguoti 5-10%C temperatūroje, kad pašalinti precipituotus baltymus ir tada surinkti supernatantą. Precipituotus baltymus naudinga surinkti, nes iš jų galima pagaminti protrombino kompleksą ar jo sudėtines dalis.

Supernatantas tada apdorojamas 3% aliuminio hidroksido geliu (pH 6.5), adsorbuojančiu pasilikusius baltyminius teršalus. Šis apdorojimas atliekamas, supernatantą atšaldžius kriostate iki 5-8°C, po to centrifuguojant 5°C temperatūroje ir surenkant supernatantą, kuris laikomas 5-8°C temperatūroje.

Iš gauto supernatanto reikalinga pašalinti druskas. Tai galima atlikti arba ultrafiltracijos būdu, esant buferiui, kuris naudojamas sekančioje chromatografijos stadijoje ir į kurį pridedama 0.5-2 v/ml heparino, arba chromatografuojant ant Sephadex G25 tame pačiame buferyje.

Šis išradimas taip pat apima atskyrimą anijonų mainų chromatografijos pagalba. Prancūzijos patento paraiškoje No 88 07530 aprašyti privalumai, kuriuos turi žemos jonų mainų galios ir didelių porų dydžių dervos, dėka ko ant jų užsilaiko labai didelės molekulės. Šitas prailgėjęs užsilaikymas įgalina susidaryti silpniems hidrofobiniams molekulių ryšiams su derva ir, parenkant buferių joninę jėgą, leidžia selektyviai desorbuoti surištas molekules.

Šio tipo dervos pardavime figūruoja bendrų Fractogel vardu. Galima naudoti DEAE - Fractogel 650 (R) bei Tar D-MAE-Fractogel (Merck) dervas. Kai kurios iš šių dervų paprastai yra tokioje modifikacijoje, kurią tiekėjas charakterizuoja kaip čiulptuvėlio tipo dervos. Jų matricų struktūra yra modifikuota, norint padidinti teigiamus krūvius surišantį paviršių, kuris padidina gelio talpumą.

Chromatografinės kolonėlės užkrovimo buferis yra buferis, kurio pagrindą sudaro natrio citratas ir natrio chloridas, nureguliuotas iki pH 7. Tikslinga, kad šis buferis turėtų 0.5-6 mM kalcio chlorido, 2-4 g/1 lizino ir 8-11 g/1 glicino. Būdas realizuojamas iš anksto didinant natrio chlorido koncentraciją.

Valymo būdo pagal šį išradimą įgyvendinimas apima anksčiau aprašyto valyto preparato užnešimą ant chromatografinės kolonėlės. Nustatytomis sąlygomis (0.11 M NaCl) kolonėlė gali surišti labai dideles molekules, pav., VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus kompleksą, leisdama į filtratą pereiti fibrinogenui, albumidui, imunoglobulinams, antitrombinui III ir fibronektinui.

Sutinkamai su išradimo įgyvendinimo pageidautinu variantu, kurio tikslas yra pasiekti VIII faktoriaus išskyrimo optimalų efektyvumą, chromatografinės kolonėlės buferio-eliuento joninė jėga buvo padidinta vieną kartą iki 0.27 M natrio chlorido koncentracijos. Sutinkamai su išradimo įgyvendinimo kitu variantu ši eliucijos stadija seka po kolonėlės perplovimo su 0.13 M natrio chloridu, kuris pašalina fibronektiną.

Šiomis sąlygomis desorbuoto ir eliuuoto VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus komplekso specifinis aktyvumas mažiausiai lygus 5-10 v/mg. Bendra produkto išeiga lygi 350 v/1 pradinės plazmos ir gali būti lygi mažiausiai 500 v/1, pridėjus į pradinę plazmą aukščiau aprašyto stabilizuojančio mišinio.

Priklausomai nuo būsimo panaudojimo šis VIII faktoriaus-von Willebrand’o faktoriaus komplekso tirpalas gali būti papildomai valomas, ypač, koncentruojant ir papildomai chromatografuoj ant. Analogiškai prieš tai buvusiai chromatografijai, ši chromatografija gali būti atliekama ant DEAE- ar T/DMAE-Fractogel ar kitų dervų. Galima naudoti kitus nešiklius, pav., dekstrano sulfatą, imobilizuotą aminoheksiną, imobilizuotą hepariną, sulfopropilo dervas, afinines ar imuno-afinines dervas.

Šis papildomas chromatografavimas gali būti atliekamas tame pačiame buferyje, kaip ir anksčiau. Sutinkamai su vienu pageidautinu išradimo įgyvendinimo variantu, kurio tikslas yra gauti kiek galima koncentruotesnį VIII faktorių, papildomas chromatografavimas atliekamas tomis pačiomis sąlygomis kaip anksčiau, per vieną desorbcijos stadiją buferio joninę jėgą padidinus iki 0,27 M NaCl. Sutinkamai su kitu išradimo įgyvendinimo variantu pirmas buferio joninės jėgos padidinimas iki 0.13 M turi pašalinti liekamuosius teršiančius baltymus, antras buferio jojinės jėgos padidinimas iki 0.27 M įgalina išskirti aukštai valytą VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus komplekso koncentratą, kurio specifinis aktyvumas mažiausiai lygus 10-20 v/mg.

pirmo filtrato baltymai, kaip albuminas, III antitrombinas, fibronektinas, taip pat gali būti naudojant įprastus

Kiti kolonėlės imunoglobulinai, fibrinogenas ir valomi ir koncentruojami, chromatografijos metodus.

Būdas sutinkamai su šiuo išradimu taip pat apima virusinę inaktyvaciją, atliekamą įprastu būdu. Naudojant cheminį agentą, pav., veikiant tirpikliu detergentu, virusinę inaktyvaciją tikslinga atlikti prieš kiekvieną chromatografijos stadiją, bet tokiu būdu, kad vėliau būtų užtikrintas inaktyvuoj ančių agentų pašalinimas.

Šio išradimo objektų taip pat yra VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus komplekso bei kitų plazmos baltymų koncentratai, gaunami naudojant anksčiau aprašytą būdą.

Paminėti koncentratai yra suformuluoti pagal Farmakopėjos standartus ir gali būti naudojami terapiniams tikslams.

Sekantys pavyzdžiai iliustruoja išradimo įgyvendinimo variantus, bet neapriboja išradimo.

PAVYZDYS

Imama 250 ml šviežios plazmos arba užšaldytos ir iš anksto atšildytos iki 20-25°C plazmos. Plazma surenkama, esant antikoaguliantui/stabilizatoriui (pav., citratuidekstrozei-fosfatui) ir acto rūgštimi nustatomas pH 6.5.

a) Išankstinis valymas

Į plazmą peristaltiniu siurbliu esant pH 6.5 supilama 20 ml 1 M bario chlorido iki galutinės 0.08 M koncentracijos. Bario chloridas yra supilamas 4-8 ml/min. greičiu ir tada mišinys kambario temperatūroje yra maišomas 15 min.

Po to mišinys yra centrifuguojamas prie 2700 aps./min. 20 min. 8°C temperatūroje ir surenkamas supernatantas.

iki 5°C. Mišinys 2700 aps./min., esant supernatantas laikomas

Supernatantas tuomet adsoruojamas ant aliuminio hidroksido gelio (Alhydrogel Eurobio su 3% A1(OH)₃), imant 2.3 g gelio 11 plazmos. Nustatomas pH lygus ir kriostate atšaldoma centrifuguojamas 20 min. temperatūrai ir surinktas temperatūroje.

6.5 yra

5°C

Šis apdorojimas Įgalina pašalinti protrombino komponentus (II, VII, IX, X faktoriai), kuriuos galima surinkti ir išvalyti žinomais metodais.

Ypatingai gerus rezultatus galima gauti, derinant šiuos du apdorojimo metodus, kai tuo tarpu apdorojimas vien Alhydrogel nepakankamas, kad pilnai būtų pašalintas protrombinas ir kiti PPSB komplekso komponentai, o apdorojimas vien bario chloridu praleidžia kokį tai kiekį X faktoriaus, protrombino ir daugiausia VIII faktorių.

Surinktas tokiu būdu supernatantas nudruskinamas ultrafiltracijos pagalba, esant buferiui, kuris naudojamas sekančioje chromatografijos stadijoje (žiūr. žemiau), pridėjus 1 V/ml heparino, ar chromatografuojant ant Sephadex 625 tame pačiame buferyje.

Po to atliekama įprasta virusinė inaktyvacija tirpiklio-detergento pagalba 24°C temperatūroje 6 vai. laikotarpyje (šis metodas aprašytas Europos patento paraiškoje No 0 131 740).

b) Chromatografinis valymas

Iš anksto valytas dializuotas supernatantas valomas chromatografiškai. Tam naudojama K 26/30 kolonėlė (Pharmacia - Uppsala Sweden), kurios diametras 2.6 cm ir darbinis aukštis 30 cm, 10 cm kurio užpildyta DEAEFractogel TSK 650 (R) derva (Merck).

Kolonėlę praplaunančio ir pavyzdį ištirpinančio buferio sudėtis: 10 mM natrio citrato, 1 mM kalcio chlorido, 9 g/1 glicino, 3 g/1 lizino. Į šį buferį yra pridedama natrio chlorido iki galutinės 0.11 M ir pH nustatomas lygus 7.

Pavyzdys užnešamas ant kolonėlės 100 ml/val. greičiu. Kolonėlė yra plaunama buferiu, norint pašalinti neadsorbuotus baltymus: fibrinogeną, albuminą, imunoglobulinus, III antitrombiną ir fibronektiną, o taip pat virusus aktyvuoj ančių agentus.

VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus kompleksas tada desorbuojamas, padidinus buferio joninę jėgą iki 0.27 M natrio chlorido.

Šiuo būdu gautas VIII faktoriaus tirpalas turi

5-10 TV/mg specifinį aktyvumą, o valymo efektyvumas užneštos ant kolonėlės plazmos atžvilgiu yra 60-80%.

Šio VIII faktoriaus tirpalo švarumą galima truputį padidinti, panaudojus chromatografinio atskyrimo stadiją, kurios dėka gaunamą produkciją reikia koncentruoti. Pav., imama antroji kolonėlė su DEAELT 3418 B

Fractogel ir, laikantis tų pačių užkrovimo sąlygų, praplaunama 0.13 M NaCl, kuris pašalina likusius teršiančius baltymus. Po to buferio joninė jėga padidinama iki 0.27 M NaCl, norint desorbuoti ir eliuuoti labai valytą ir koncentruotą VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus kompleksą.

Antrą chromatografinio koncentravimo stadiją galima pakeisti ultrafiltravimu.

Sutinkamai su šio išradimo įprastiniu įgyvendinimo variantu, pirma chromatografinio valymo stadija yra atliekama ant DEAE-Fractogel derbos. Be to, labai geri rezultatai buvo gaunami, naudojant tokias Merck firmos dervas, kaip TMAE-Fractogel (TMAE=Tri-Metil-AminoEtilas) ir DMAE-Fractogel (DMAE=Di-MAE), kurių savybės ekvivalentiškos DEAE-Fractogel dervos savybėms. Taip pat gali būti naudojamas čiulptuvėlio tipo naujos dervos, sukurtos Merck kompanijoje ir W. Muller pristatytos skystos chromatografijos konferencijoje, kuri vyko 1989 m. birželio mėn. Stokholme.

PAVYZDYS

Kitas šio išradimo įgyvendinimo variantas leidžia gauti fibrinogeno ir fibronektino koncentratus tuo pačiu metu, kaip VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus koncentratą, tik su žemesne išeiga ir truputį geresniu specifiniu aktyvumu.

Technologinis procesas analogiškas 1 pavyzdžio procesui, išskyrus VIII faktoriaus-von Willebrand’o faktoriaus komplekso eliuciją iš pirmos kolonėlės, užkrautos DEAE-Fractogel derva.

io

Fibrinogenas, III antitrombinas, albuminas ir imunoglobulinai ant kolonėlės neužsilaiko ir aptinkami filtrate.

VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus kompleksas gali būti išvalytas ir koncentruotas antroje chromatografinio atskyrimo stadijoje kolonėlėje su DEAEFractogel derva, naudojant buferį, kurio joninė jėga yra 0.17 M natrio chlorido ir kuris nesulaiko užteršiančiųjų baltymų. Padidinus buferio joninę jėgą iki 0.27 M natrio chlorido, užtikrinama VIII faktoriaus-von Willebrand'o faktoriaus komplekso desorbcija ir eliucija. Tokiu būdu gauto preparato specifinis aktyvumas lygus 10-20 TV/mg.

Toliau galima valyti ir koncentruoti fibrinogeną ir fibronektiną, naudojant žinomus chromatografinius metodus, norint gauti tirpalus, savo kokybe tinkamus terapiniam naudojimui ir aprašytus Prancūzijos patento paraiškoje No 88 075 30.

Kiti plazmos baltymai gali būti valomi ir koncentruojami, naudojant įprastinius frakcionavimo metodus.

PAVYZDYS

Valymo efektyvumas gali būti padidintas, stabilizuojant pradinę plazmą (prieš tai atšildžius iki 25°C) sekančio mišinio priedu:

Heparinas: 1 v/ml, Etilendiamintetraacto rūgštis (EDTA): 2 mM arba 0.74 g/1, Kalcio chloridas: 6 mM arba 0.67 g/1.

Į šį mišinį papildomai pridėta 5-60 g/1 gliukozės.

Po to acto rūgštimi pH yra pažeminamas iki 6.5. Toliau valymo stadijos yra atliekamos kaip išdėstyta 1 ir 2 pavyzdyje.

Šiomis sąlygomis valymo proceso bendra išeiga mažiausiai lygi 500 v VIII faktoriaus: C/l pradinės plazmos.

Tai atitinka VIII faktoriaus 55-65% bendro aktyvumo, 10 esant 10-30 v VIII faktoriaus: C/mg baltymo specifiniam aktyvumui.

Claims

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. Būdas VIII faktoriaus - von Willebrand'o faktoriaus komplekso stabiliam koncentratui, turinčiam aukštą specifinį aktyvumą, gauti, besiskiriantis tuo, kad visą plazmą iš anksto valo dviem stadijom, pirma apdorojant bario chloridu, o po to aliuminio hidroksidu, o po to valo chromatograf iškai, naudojant anijonų mainų gelį, užtikrinantį labai didelių molekulių surišimą ir užlaikymą.
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad visa plazma yra šviežia arba užšaldyta.
3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad į plazmą deda stabilizuojančio mišinio, susidedančio iš 0.2-2 v/ml heparino, 1-5 mM etilendiamintetraacto rūgšties ir 1-10 mM kalcio chlorido.
4. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad stabilizuojantis mišinys taip pat turi 5-60 g/1 gliukozės.
5. Būdas pagal vieną iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad išankstini valymą sudaro:

a) išsodinimas bario chloridu, centrifugavimas ir supernatanto surinkimas,

b) adsorbcija ant aliuminio hidroksido gelio, centrifugavimas žemoje temperatūroje ir supernatanto surinkimas,

c) nudruskinimas.
6. Būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad išsodinimą bario chloridu atlieka dedant 1 M bario chlorido tirpalą esant pH 6.5, nepertraukiamai maišo, po to centrifuguoj a 5-10°C temperatūroje ir surenka supernatantą.
7. Būdas pagal 5 arba 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad adsorbciją ant aliuminio hidroksido gelio atlieka, naudojant 3 % gelį pH 6.5, po to seka greitas atšaldymas iki 5°C, centrifugavimas 5°C temperatūroje ir supernatanto surinkimas.
8. Būdas pagal vieną iš 5-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad nudruskinimą atlieka ultrafiltracij a, esant buferiui, kuris naudojamas sekančioje chromatografijos stadijoje ir į kurį prideda heparino.
9. Būdas pagal vieną iš 5-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad nudruskinimą atlieka chromatografuojant ant Sephadex G25 kolonėlės buferyje, kuris naudojamas sekančioje chromatografijos stadijoje ir į kurį pridedama heparino.
10. Būdas pagal vieną iš 1-9 punktų, besiskiriantis tuo, kad iš anksto valytą plazmos supernatantą užneša ant chromatografinės kolonėlės, užkrautos anijonų mainų geliu, nepraleidžiančiu labai didelių molekulių, bet leidžiančiu pereiti į filtratą fibrinogenui, albuminui, imunoglobulinams, antitrombinui III ir fibronektinui.
11. Būdas pagal vieną iš 1-10 punktų, besiskiriantis tuo, kad chromatografinis gelis yra vinil-polimerinio tipo gelis, prie kurio funkcinių grupių yra prijungtos DEAE arba tri-, arba dimetilaminoetilo tipo grupės.
12. Būdas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad polimerinis gelis yra Fractogel.
13. Būdas pagal vieną iš 10-12 punktų, besiskiriantis tuo, kad chromatografinės kolonėlės užkrovimo buferį sudaro natrio citrato ir kalcio chlorido buferis, turintis glicino ir lizino, į kurį pridėta natrio chlorido iki 0.11 M koncentracijos ir kurio pH lygus 7.
14. Būdas pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad buferis turi 8-11 g/1 glicino ir 2-4 g/1 lizino.
15. Būdas pagal vieną iš 10-14 punktų, besiskiriantis tuo, kad norint desorbuoti iš chromatografinės kolonėlės VIII faktoriaus - von Willebrand'o faktoriaus kompleksą, buferio joninę jėgą padidina iki 0.27 M natrio chlorido koncentracijos.
16. Būdas pagal vieną iš 10-14 punktų, besiskiriantis tuo, kad norint eliminuoti fibronektiną, buferio joninę jėgą padidina iki 0.13 M natrio chlorido koncentracijos ir po to - iki 0.27 M natrio chlorido koncentracijos,desorbuojant iš chromatografinės kolonėlės VIII faktoriaus - von Willebrand’o faktoriaus kompleksą.
17. Būdas pagal vieną iš 1-16 punktų, besiskiriantis tuo, kad VIII faktoriaus - von Willebrand'o faktoriaus kompleksą, desorbuotą iš pirmos chomatografinės kolonėlės, papildomai valo ir koncentruoja chromatografijos pagalba.
18. Būdas pagal vieną iš 1-17 punktų, besiskiriantis tuo, kad papildomą chromatografiją atlieka ant jonų mainų dervos, pasirinktos iš: DEAE arba T/D-MAE-Fractogel, imobilizuoto heparino, dekstrano sulfato, sulfopropilo, arba ant afininės ar imunoafininės dervos.
19. Būdas pagal 17 arba 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomą chromatografiją atlieka, naudojant buferį su 0.11 M natrio chlorido ir taikant 2 sekančius vienas po kito joninės jėgos didinimus - pirma iki 0.13 M, po to iki 0.27 M.
20. Būdas pagal 17 arba 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomą chromatografiją atlieka, naudojant buferį su 0.17 M natrio chlorido ir vienąkart padidinant joninę jėgą iki 0.27 M.
21. Būdas pagal vieną iš 1-14 punktų, besiskiriantis tuo, kad baltymus, esančius chromatografiniame filtrate pagal punktą 10, papildomai valo ir koncentruoja.
22. Būdas pagal vieną iš 1-21 punktų, besiskiriantis tuo, kad prieš kiekvieną chromatografijos stadiją atlieka įprastą virusų inaktyvavimą, naudojant tirpiklį - detergentą.
23. VIII faktoriaus - von Willebrand'o faktoriaus komplekso koncentratas, besiskiriantis tuo, kad jis yra gaunamas būdu pagal vieną iš 1-22 punktų.
24. Baltymų koncentratai, gauti iš plazmos, besiskiriantys tuo, kad jie gaunami būdu pagal vieną iš 1-14 ir 21 arba 22 punktų.
25. Koncentratai pagal 23 arba 24 punktą, besiskiriantys tuo, kad jie yra gaminami terapiniam naudoj imui.