PL164754B1 - Sposób wytwarzania koncentratu kompleksu czynnika krzepniecia krwi VIII z czynnikiemWlllebranda PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania koncentratu kompleksu czynnika krzepniecia krwi VIII z czynni- kiem Willebranda o wysokiej aktywnosci swoistej przez stracanie zanieczyszczonych bialek srodkami chemicznymi i chromatografie anionowymienna, znamienny tym, ze pelna plazme oczyszcza sie wstepnie przez podwójne traktowanie chlorkiem baru i wodorotlenkiem glino- wym, nastepnie odsala sie przez ultrafiltracje roztworu wobec buforu podstawowego stosowa- nego w chromatografii opartego na cytrynianie sodowym i chlorku wapniowym z dodatkiem heparyny albo przez chromatografie na kolumnie Sephadex G 50 eluowanej buforem podsta- wowym uzywanym w chromatografii z dodatkiem heparyny, a nastepnie supernatant plazmy z etapu wstepnego oczyszczania nanosi sie na kolumne chromatograficzna wypelniona zelem zywicy anionowymiennej opartym na polimerze winylowym, do którego wprowadzono grupy funkcyjne dietyloaminoetylowe, trimetyloaminoetylowe lub dimetyloaminoetylowe i kompleks czynnika krzepniecia krwi VIII z czynnikiem Willebranda desorbuje sie z kolumny przez zwiekszenie sily jonowej buforu do 0,27 M chlorku sodowego i ewentualnie oczyszcza sie i zateza bialka zawarte w wycieku z kolumny chromatograficznej. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania z pełnej plazmy koncentratu kompleksu czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda o wysokiej aktywności swoistej.

Leczenie hemofilii A iniekcjami czynnika krzepnięcia krwi VIII jest często stosowane w praktyce lekarskiej. Wymaga to stosowania preparatów o wysokiej czystości zarówno ze względu na zmniejszenie ryzyka zakażeń wirusowych z jednej strony jak i dlatego, że te iniekcje muszą być często powtarzane i każda pozostałość zanieczyszczająca preparat mogłaby wywołać niepożądane reakcje immunologiczne, groźne dla pacjenta.

W przemyśle stosuje się obecnie szereg metod przerobu plazmy ludzkiej dla oczyszczenia czynnika krzepnięcia krwi VIII. Do metod tych należą: strącanie zanieczyszczających białek różnymi środkami chemicznymi, chromatografia przenikania przez żel, chromatografia powinowactwa immunologicznego, chromatografia jonowymienna i różne kombinacje tych metod.

Czynnik krzepnięcia krwi VIII występuje w plaźmie w bardzo małych ilościach, co powoduje, że wydajność procesu oczyszczania jest głównym problemem, z którym borykają się producenci. Ponadto, czynnik VIII jest białkiem nietrwałym i takim, które może być aktywowane przez inne czynniki krwi. W stanie aktywacji traci jednak swą wartość leczniczą, dlatego dawka końcowego preparatu musi być dostosowana do danego procesu oczyszczania.

W opisie zgłoszenia patentowego Francji nr 88 07 530 ujawniony jest sposób oczyszczania z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej. Sposób ten umożliwia uzyskanie koncentratu czynnika krzepnięcia krwi VIII o wysokiej czystości. Jednak, tak jak w metodach stosowanych przez innych wytwórców, jako materiał wyjściowy stosuje się w nim frakcję plazmy po krioprecypitacji. Stadium krioprecypitacji powoduje jednakże 30 - 40 procentową stratę czynnika krzepnięcia krwi VIII, pozostającego w supernatancie.

Celem wynalazku było zatem opracowanie takiego sposobu, w którym materiałem wyjściowym byłaby pełna plazma nie poddawana krioprecypitacji, co pozwoliłoby zmniejszyć straty czynnika VIII. Taki uproszczony proces byłby poza tym bardzo korzystny dla ubogo wyposażonych w urządzenia wydziałów produkcyjnych, gdzie prowadzenie procesu krioprecypitacji może stanowić dużą trudność.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano prosty sposób oczyszczania czynnika krzepnięcia krwi z pełnej plazmy, który umożliwia uzyskanie koncentratu o wysokiej stabilności i wysokiej czystości, z bardzo dobrą wydajnością.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób wytwarzania koncentratu czynnika krzepnięcia krwi VIII z pełnej plazmy, polegający na wstępnym oczyszczaniu w celu usunięcia składników kompleksu protrombiny (czynnik II, VII, IX i X) i następnym oczyszczaniu w procesie chromatografii jonowymiennej, w którym przez dobór odpowiedniego żelu i buforu eluującego uzyskuje się kompleks czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda o wysokiej czystości.

Sposób wytwarzania stabilnego koncentratu kompleksu czynnika krzepnięcia krwi z czynnikiem Willebranda o wysokiej aktywności swoistej przez strącanie zanieczyszczających białek środkami chemicznymi i chromatografię anionowymienną, polega na tym, że pełną plazmę oczyszcza się wstępnie przez podwójne traktowanie chlorkiem baru i wodorotlenkiem glinowym, następnie odsala się przez ultrafiltrację roztworu wobec buforu podstawowego w chromatografii opartego na cytrynianie sodowym i chlorku wapniowym z dodatkiem heparyny albo przez chromatografię na kolumnie Sephadex G50 eluowanej buforem podstawowym używanym w chromatogra4

164 754 fii z dodatkiem heparyny, a następnie supernatant plazmy z etapu wstępnego oczyszczania nanosi się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żelem żywicy anionowymiennej opartym na polimerze winylowym, do którego wprowadzono grupy funkcyjne dietyloaminoetylowe, trimetyloaminoetylowe lub dimetyloaminoetylowe i kompleks czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda desorbuje się z kolumny przez zwiększenie siły jonowej buforu do 0,27 M chlorku sodowego i ewentualnie oczyszcza się i zatęża białka zawarte w wycieku z kolumny chromatograficznej. Sposób ten może być również wykorzystany, po dodatkowym etapie oczyszczania, do wytwarzania oczyszczonych roztworów innych białek plazmy, takich jak fibrynogen, fibronektyna, albumina, immunoglobuliny i antytrombina III.

W sposobie według wynalazku stosuje się plazmę ludzką, ale równie dobrze nadaje się do przerobu plazmy pochodzenia zwierzęcego.

W sposobie według wynalazku jako materiał wyjściowy stosuje się pełną plazmę, świeżą albo zamrożoną w celu jej konserwacji ale nie plazmę po krioprecypitacji. Korzystnie, plazmę tę zbiera się i przechowuje z dodatkiem roztworu anty-koagulującego lub stabilizującego, zazwyczaj mieszaniny cytrynianu, glukozy i fosforanu. Można jednak użyć dowolny środek będący specyficznym stabilizatorem dla czynnika VIII oprócz lub zamiast powyższej mieszaniny.

Jako roztwór stabilizujący materiał wyjściowy plazmy stosuje się korzystnie mieszaninę 0,2 - 2 jednostki/ml heparyny, 1 - 5mM kwasu dietylenotetraoctowego (EDTA) i 1 - 10 mM CaCl2 i ewentualnie glukozy w stężeniu 5-60 g/litr.

W sposobie według wynalazku etap wstępnego oczyszczania polega, jak wspomniano, na strącaniu chlorkiem baru i adsorpcji na żelu wodorotlenku glinu.

W procesie traktowania chlorkiem baru, korzystnie odczyn plazmy doprowadza się do wartości pH = 6,5, następnie dodaje się 1 M roztwór chlorku baru do czasu osiągnięcia końcowego stężenia 0,08 M mieszając, po czym mieszaninę wiruje się w temperaturze 5 - 10°C w celu usunięcia strąconych białek i zbiera się supernatant. Zebrane, strącone białka korzystnie stosuje się do wytwarzania kompleksu protrombiny lub jego składników.

Supernatant kontaktuje się z 3 procentowym żelem wodorotlenku glinu przy pH równym 6,5. Żel adsorbuje pozostałe zanieczyszczające białka. Po schłodzeniu do temperatury 5 - 8°C w kriostacie i wirowaniu w temperaturze 5°C zbiera się supernatant, który przechowuje się w temperaturze 5 - 8°C. Supernatant poddaje się odsoleniu. Odsolenie prowadzi się albo przez ultrafiltrację wobec buforu podstawowego stosowanego w następnym etapie chromatografii, z dodatkiem 0,5 - 2 jednostek heparyny/ml, albo przez chromatografię na Sephadex'sie G25 w tym samym buforze.

Następnym etapem sposobu według wynalazku jest rozdział metodą chromatografii anionowymiennej. W opisie zgłoszenia patentowego Francji 88 07 530 zgłaszający podał korzyści wynikające z zastosowania żywicy o małej sile wymiany jonowej i dużych rozmiarach porów, co pozwala na zatrzymywania cząsteczek o bardzo dużych rozmiarach. Ta przedłużona retencja pozwala na utworzenie lekko hydrofobowych wiązań z żywicą, a dobór odpowiedniej siły jonowej buforu umożliwia desorpcję zatrzymanych w żywicy cząsteczek. Żywice tego typu są dostępne w handlu pod ogólną nazwą „Fractogel“. Żywice tego typu są również znane jak Toyopearl, czyli pod japońską nazwą handlową pochodzącą od nazwisk wynalazców Toyo i Soda, które są kopolimerami glikolu oligoetylenowego, metakrylanu glicydylu i dimetyloakrylanu pentaerytrytu. W sposobie można zastosować żywice DEAE-Fractogel 650 i T- albo D-MAE-Fractogel (Merck), czyli żywice mające grupy funkcyjne dietyloaminoetylowe (DEAE), trimetyloaminoetylowe (T-MAE) lub dimetyloaminoetylowe (D-MAE). Ostatnio, te same żywice są dostępne w formie opisanej przez dostawcę jako „żywice mackowate“ (tentacular type resins). Żywice te mają zmodyfikowaną strukturę matrycy w kierunku zwiększenia powierzchni wiązania ładunków dodatnich, co może korzystnie wpływać na zwiększenie pojemności właściwej żelu.

Jako bufor podstawowy dla kolumny chromatograficznej stosuje się bufor oparty na cytrynianie sodowym i chlorku sodowym, doprowadzony do pH o wartości 7 i korzystnie zawierający chlorek wapniowy w stężeniu 0,5 - 6mM, lizynę w stężeniu 2 - 4 g/litr i glicynę w stężeniu 8 -11 g/litr, albo bufor oparty na cytrynianie sodowym i chlorku wapniowym, zawierający glicynę i lizynę, do którego dodaje się 0,11 M chlorku sodowego i doprowadza się jego pH do wartości 7.

W praktycznym wykonaniu sposobu stosuje się określony wzrost stężenia chlorku sodowego.

164 754

W etapie oczyszczania wtryskuje się wstępnie oczyszczony preparat na kolumnę chromatograficzną. W określonych warunkach (0.11MNaCl) kolumna wiąże cząsteczki o bardzo dużych rozmiarach, takie jak kompleks czynnika Willebranda z czynnikiem krzepnięcia krwi VIII a fibrynogen, albumina, immunoglobuliny, antytrombina III i fibronektyna wyciekają z kolumny z filtratem.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, w którym celem jest uzyskanie optymalnej wydajności odzysku czynnika krzepnięcia krwi VIII, zwiększa się siłę jonową buforu do eluowania z kolumny chromatograficznej tylko do wartości 0,27 M chlorku sodowego. W innym wykonaniu wynalazku ten etap eluowania jest poprzedzony wymywaniem wstępnym, ze zwiększeniem siły jonowej do 0,13 M chlorku sodowego, co pozwala na usunięcie fibronektyny. Desorbowany i eluowany z kolumny w tych warunkach kompleks czynnika VIII z czynnikiem Willebranda posiada aktywność swoistą rzędu co najmniej 5 - 10 jednostek/mg. Całkowita wydajność procesu wynosi co najmniej 350 jednostek/litr wyjściowej plazmy, a jeśli do wyjściowej plazmy dodaje się mieszaninę stabilizacyjną opisaną powyżej, wówczas można uzyskać co najmniej 500 jednostek/litr.

Zależnie od przeznaczenia, roztwór kompleksu czynnika VIII z czynnikiem Willebranda można dalej oczyszczać w dodatkowym etapie oczyszczania, a zwłaszcza zatężenia w procesie chromatografii. Tak jak i poprzednio, tak i ten proces można prowadzić na żywicy DEAE- albo T-DMAE-Fractogel lub na innych żywicach. Można również stosować inne nośniki, takie jak siarczan dekstranu, immobilizowaną heparynę i żywice sulfopropylowe oraz żywice do chromatografii powinowactwa i do chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Ten dodatkowy etap chromatografii prowadzi się w tym samym buforze podstawowym jaki stosuje się w poprzednim etapie. W korzystnym, praktycznym rozwiązaniu wynalazku, w którym celem jest uzyskanie czynnika VIII w postaci jak najbardziej stężonej tę dodatkową chromatografię prowadzi się w tych samych warunkach co pierwszą, to znaczy z jednym etapem desorpcji, zwiększając siłę jonową buforu do 0,27MNaCl. W innym rozwiązaniu wynalazku, początkowo zwiększa się siłę jonową buforu do 0,13 M, usuwając pozostałe białka zanieczyszczające, po czym zwiększa się siłę jonową buforu do 0,27 M dla odzyskania kompleksu czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda o aktywności swoistej równej co najmniej 10 - 20 jednostek/mg. Można również stosować etap dodatkowej chromatografii przy użyciu buforu o stężeniu 0,17 M chlorku sodowego, po czym zwiększa się raz siłę jonową tego buforu do 0,27 M.

Inne białka z pierwszego wycieku z kolumny, takie jak immunoglobuliny, albumina, antytrombina III, fibrynogen i fibronektyna może również oczyszczać i sporządzać stężone roztwory, wykorzystując konwencjonalne techniki chromatograficzne.

W sposobie według wynalazku prowadzi się również inaktywację wirusów znanymi technikami. W przypadku zastosowania środka chemicznego, na przykład działania rozpuszczalnikiemdetergentem, zaleca się przeprowadzenie tej operacji przed którymkolwiek etapem chromatograficznym, ponieważ chromatografia zapewnia usunięcie środków inaktywujących.

Jak wspomniano, sposobem według wynalazku wytwarza się koncentraty kompleksu czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda oraz koncentraty innych białek plazmy. Z koncentratów tych sporządza się formy leku zgodnie z wymaganiami farmakopealnymi i stosuje się je w celach leczniczych.

Następujące przykłady ilustrują przedmiot wynalazku.

Przykład I. Użyto 250 ml świeżej plazmy lub plazmy mrożonej, którą rozmrożono i doprowadzono do temperatury 22 - 25°C, zebranej w obecności antykoagulanta (środka stabilizującego, na przykład cytrynianu-dekstrozy-fosforanu), którą doprowadzono kwasem octowym do pH 6,5.

a) Oczyszczanie wstępne.

Do plazmy dodano 20 ml 1M chlorku baru przy pH 6,5 przy pomocy perystaltycznej do czasu uzyskania końcowego stężenia 0,08 M. Chlorek baru dodano z szybkością 4-8 ml/minutę, a następnie całość mieszano 15 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę wirowano następnie 20 minut w temperaturze 8°C przy 2700 rpm i odzyskano supernatant.

Supernatant adsorbowano na żelu wodorotlenku glinu [Alhydrogel Eurobio z 3% Al(OH)3] w proporcji 2,3 g/l plazmy. Doprowadzono pH do 0,5 i w kriostacie obniżono temperaturę do 5°C. Mieszaninę wirowano 20 minut w temperaturze 5°C przy 2700 rpm i odzyskano supernatant w temperaturze 5°C. Obróbka ta umożliwia usunięcie składników kompleksu protrombiny (czynniki II, VII, IX, X), które zbiera się i oczyszcza stosując znane metody.

164 754

Szczególnie korzystne wyniki można uzyskać przez połączenie tych dwóch typów obróbki, natomiast sama obróbka Alhydrogelem nie umożliwia całkowitej eliminacji protrombiny i innych składników PPSB, czyli kompleksu protrombiny złożonego z protrombiny, prokonwertyny, czynnika Stuarta i czynnika B przeciw hemofilii lub czynnika IX, a obróbka chlorkiem baru jako taka będzie pozostawiała pewną ilość czynnika X, protrombiny i poza wszystkim czynnik VII. Zebrany w ten sposób supernatant odsalano albo przez ultrafiltrację w obecności buforu z następującego etapu chromatografii (patrz niżej), do którego dodano 1 U/ml heparyny, albo przez chromatografię na Sephadex G25 w takim samym buforze.

Następnie stosowano znane traktowanie w celu dezaktywacji wirusów z zastosowaniem rozpuszczalnika - środka powierzchniowo czynnego, w ciągu 6 godzin, w temperaturze 24°C. Proces ten jest opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 131 740.

b) Oczyszczanie chromatograficzne.

Wstępnie oczyszczony, dializowany supernatant przechodzi etap oczyszczania chromatograficznego. Stosowano kolumnę K26/30 (Pharmacia-Uppsala, Szwecja) o średnicy 2,6 cm i użytecznej wysokości 30 cm, z których 10 cm wypełniono żywicą DEAE-Fractogel-TSK (Merck).

Skład w kolumnie i próbka buforu rozpuszczającego są następujące: cytrynian sodu 10 mM, chlorek wapnia 1 mM, glicyna 9 g/l, lizyna 3 g/l. Do tego buforu dodano chlorek sodu doprowadzony do końcowego stężenia 0,11 i do pH 7.

Próbkę nanoszono na kolumnę z szybkością 100 ml/h. Kolumnę przemywano buforem podstawowym w celu usunięcia niezaadsorbowanych białek, którymi były fibrynogen, albumina, immunoglobuliny, antytrombina III i fibronektyna, jak również czynniki dezaktywujące wirusy.

Następnie desorbowano kompleks czynnika VIII z czynnikiem Willebranda przez podwyższenie siły jonowej buforu do 0,27 M chlorku sodu. Otrzymany w ten sposób roztwór czynnika VIII ma aktywność swoistą 5-10 IU/mg i skuteczność oczyszczania w stosunku do plazmy wprowadzonej na kolumnę pomiędzy 60 i 80%.

Stosunek bliski 1U/1U występuje zawsze dla stężenia tych dwóch czynników, czynnika VIII i czynnika Willebranda, przy czym ten drugi jest wyrażony w jednostkach współczynnika rystocetyny. Czystość tego roztworu czynnika VIII może być dalej nieco poprawiona przez dodatkowy etap rozdziału chromatograficznego, który umożliwia zatężenie produktu. Stosuje się na przykład drugą kolumnę DEAE-Fractogel, w takich samych warunkach obciążenia jak powyższe, a wstępne przemywanie prowadzi się 0,13 M NaCl, które usuwa resztkowe białka zanieczyszczające. Siłę jonową buforu podwyższa się następnie tylko raz do 0,27 M chlorku sodu w celu zdesorbowania i wyeluowania wysoce oczyszczonego i zatężonego kompleksu czynnika VIII z czynnikiem Willebranda.

Drugi etap natężania chromatograficznego może być zastąpiony przez ultrafiltrację.

Zgodnie ze zwykłym procesem wykonywania sposobu według wynalazku pierwszy etap oczyszczania chromatograficznego prowadzi się na żywicy DEAE-Fractogel. Jednak również bardzo dobre wyniki mogą być uzyskane przy zastosowaniu nowych żywic sprzedawanych przez firmę Merck, takich jak T-MAE-Fractogel lub T-MAE-Faractogel, które mają właściwości odpowiadające właściwościom DEAE-Fractogel. Można również zastosować żywice typu „tentacular rozwijane przez tę firmę a prezentowane przez W. Mullera i wsp. na Konferencji o chromatografii cieczowej w czerwcu 1989 r. w Sztokholmie.

Przykład II. Inny proces wykonywania sposobu według wynalazku również pozwala na otrzymanie koncentratów fibrynogenu i fibronektyny, dając jednak koncentrat czynnik VIII, czynnik von Willebranda z niższą wydajnością i o nieco poprawionej aktywności swoistej. Sposób jest taki sam jak w przykładzie I do chwili eluowania kompleksu czynnika VIII z czynnikiem von Willebranda z pierwszej kolumny z DEAE-Fractogelem.

Fibrynogen, antytrombina III, albumina i immunoglobuliny nie są zatrzymywane przez kolumnę i można je odzyskać w przesączu.

Kompleks czynnika VIII z czynnikiem von Willebranda można oczyszczać i zatężać w drugim etapie rozdziału chromatograficznego na kolumnie z DEAE-Fractogelem przez zastosowanie buforu o sile jonowej 0,17 M chlorku sodu, żeby nie osadzać resztkowych białek zanieczyszczających. Wzrost siły jonowej do 0,27 M chlorku sodu pozwala na desorbcję i eluowanie kompleksu czynnika VIII z czynnikiem von Willebranda. Otrzymuje się w ten sposób aktywność swoistą od 10 do 20 IU/mg.

164 754

Fibrynogen i fibronektynę można następnie oczyszczać i zatężać stosując znane procesy chromatograficzne, przy czym otrzymuje się roztwory o jakości wymaganej do zastosowania terapeutycznego, opisanych we francuskim zgłoszeniu patentowym nr 8 807 530.

Inne białka plazmy można oczyszczać i zatężać stosując znane procesy frakcjonowania.

Przykład III. Wydajność oczyszczania można poprawić jeszcze bardziej przez stabilizowanie początkowej plazmy począwszy od ogrzania jej do 25°C przez dodanie następującej mieszaniny: Heparyna: 1 U/ml; EDTA: 2mM albo 0,74 g/l; Chlorek wapnia: 6mM albo 0,67 g/l. Glikoza w stężeniu pomiędzy 5 i 60 g/l może być dodatkowo wprowadzona do tej mieszaniny.

Następnie przez dodanie kwasu octowego obniża się pH do 6,5.

Następnie przeprowadza się etapy oczyszczania takie jak w przykładzie I lub II. W tych warunkach całkowita wydajność procesu oczyszczania jest co najmniej równa 500 U czynnika VIII: C/litr plazmy początkowej. Odpowiada to całkowitemu odzyskowi 55 do 65% aktywności czynnika VIII dla aktywności swoistej pomiędzy 10 i 30 jednostek czynnika VIII: C/mg białka.

164 754

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania koncentratu kompleksu czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda o wysokiej aktywności swoistej przez strącanie zanieczyszczonych białek środkami chemicznymi i chromatografię anionowymienną, znamienny tym, że pełną plazmę oczyszcza się wstępnie przez podwójne traktowanie chlorkiem baru i wodorotlenkiem glinowym, następnie odsala się przez ultrafiltrację roztworu wobec buforu podstawowego stosowanego w chromatografii opartego na cytrynianie sodowym i chlorku wapniowym z dodatkiem heparyny albo przez chromatografię na kolumnie Sephadex G50 eluowanej buforem podstawowym używanym w chromatografii z dodatkiem heparyny, a następnie supernatant plazmy z etapu wstępnego oczyszczania nanosi się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żelem żywicy anionowymiennej opartym na polimerze winylowym, do którego wprowadzono grupy funkcyjne dietyloaminoetylowe, trimetyloaminoetylowe lub dimetyloaminoetylowe i kompleks czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda desorbuje się z kolumny przez zwiększenie siły jonowej buforu do 0,27 M chlorku sodowego i ewentualnie oczyszcza się i zatęża białka zawarte w wycieku z kolumny chromatograficznej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako pełną plazmę stosuje się plazmę świeżą lub zamrożoną.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do plazmy dodaje się mieszaninę stabilizującą zawierającą 0,2 - 2 jednostek/ml heparyny, 1-5 mM kwasu dietylenotetraoctowego (EDTA) i 1 - 10 mM chlorku wapnia.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę stabilizującą zawierającą ponadto glukozę w stężeniu 5-60 g/litr.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie strącania chlorkiem baru dodaje się 1 M roztwór chlorku baru przy wartości pH równej 6,5, w trakcie mieszania, a powstałą mieszaninę wiruje się w temperaturze 5 - 10°C.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że do adsorpcji na żelu wodorotlenku glinu stosuje się 3% żel, operację prowadzi się przy pH o wartości 6,5, po czym szybko schładza się mieszaninę do temperatury 5°C i wiruje się ją w temperaturze 5°C.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako żel anionowymienny stosuje się żywicę będącą kopolimerem glikolu oligoetylenowego, metakrylanu glicydylu i dimetakrylanu pentaerytrytu.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako bufor podstawowy dla kolumny chromatograficznej stosuje się bufor oparty na cytrynianie sodowym i chlorku wapniowym, zawierający glicynę i lizynę, do którego dodaje się 0,11 M chlorku sodowego i doprowadza się jego pH do wartości 7.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się bufor zawierający 8 - 10g/litr glicyny i 2 - 4 g/litr lizyny.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że zwiększa się siłę jonową buforu do 0,13 M chlorku sodowego wymywając z kolumny chromatograficznej fibronektynę, a następnie do 0,27 M chlorku sodowego.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że kompleks czynnika krzepnięcia krwi VIII z czynnikiem Willebranda desorbowany z kolumny chromatograficznej dodatkowo oczyszcza się i zatęża chromatograficznie.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że dodatkową chromatografię prowadzi się na żywicy jonowymiennej, takiej jak żywica będąca kopolimerem glikolu oligoetylenowego, metakrylanu glicydylu i dimetakrylanu pentaerytrytu mająca grupy funkcyjne dietyloaminoetylowe albo trimetyloaminoetylowe, bądź taka żywica mająca grupy funkcyjne dimetyloaminoetylowe, immobilizowana żywica amino-heksylowa, immobilizowana heparyna, siarczan dekstranu, żywica sulfopropylowa, żywica do chromatografii powinowactwa albo żywica do chromatografii powinowactwa immunologicznego.

    164 754
13. 13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że etap dodatkowej chromatografii prowadzi się stosując bufor o stężeniu 0,11 M chlorku sodowego, po czym zwiększa się dwa razy siłę jonową buforu kolejno do 0,13 M i 0,27 M.
14. 14. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że etap dodatkowej chromatografii prowadzi się stosując bufor o stężeniu 0,17 M chlorku sodowego, po czym zwiększa się raz siłę jonową tego buforu do 0,27 M.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed którymkolwiek z etapów chromatograficznych prowadzi się inaktywację wirusów działając rozpuszczalnikiem-detergentem.