DE69823931T2

DE69823931T2 - Chromatographieverfahren für Reinigung von IgG mit hoher Ausbeute und Virusinaktivierung

Info

Publication number: DE69823931T2
Application number: DE69823931T
Authority: DE
Inventors: Wytold R. Clayton Lebing; Patricia Oakland Alred; Doug C. Apex Lee; Hanns-Ingolf Cary Paul
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2018-06-10
Also published as: USRE44558E1; CA2239237A1; US6307028B1; CA2676074C; JP4359347B2; EP0893450A1; AU749336B2; ES2221096T3; USRE43655E1; ATE267214T1; US20020177693A1; CA2239237C; US5886154A; CA2676074A1; EP0893450B1; PT893450E; DE69823931D1; AU7009998A; JPH1129494A; DK0893450T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet: Die vorliegende Offenbarung betrifft ganz allgemein die Reinigung von Proteinen sowie die Inaktivierung/Beseitigung von Viren und ganz besonders ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von γ-Globulinen aus Blutplasma und weiteren Quellen.
Hintergrund: Carbonsäuren wie Caprylsäure sind sowohl zur Herstellung von Plasmaprodukten (Ausfällung von Proteinen) als auch zur Inaktivierung von Viren verwendet worden. Siehe z. B. die Zusammenfassung derartiger Verwendungen bei Seng et al. (1990).
Fraktionierung mit Caprylat
Zur Herstellung von Humanimmunoglobulin ist Caprylsäure ganz allgemein als ein wirkungsvolles Ausfällungsmittel für die meisten Plasmaproteine bei pH = 4,8 anerkannt, solange Parameter wie die Temperatur und Ionenstärke optimiert werden. Steinbuch et al. (1969) haben die Ausfällung der Hauptmasse der Plamaproteine mit Caprylsäure beschrieben, ohne dass IgG, Ceruloplasmin und IgA beeinflusst wurden. Steinbuch et al. isolierten IgG aus Säugetierseren mit Caprylsäure und berichteten, dass eine umfängliche Nicht-Immunoglobulin-Fällung am besten bei leicht sauren pH-Werten, aber nicht unterhalb pH = 4,5 erhalten wurde. Plasma wurde auf 2:1 mit 0,06 M Acetat-Puffer, pH = 4,8, verdünnt und dann mit 2,5 Gew.% Caprylat behandelt, um die Ausfällung auszulösen. In Charge durchgeführte Adsorption des Überstands an DEAE-Cellulose wurde zur Klärung weiterer Verunreinigungen aus der isolierten IgG-Fraktion angewandt. Spätere Arbeiten von Steinbuch et al. zeigten die Verwendung von Caprylsäure, um die meisten Proteine und Lipoproteine (die sich von den Immunoglobulinen unterscheiden) auszufällen, die in Cohn-Ethanol-Fraktion III vorlagen (Steinbuch et al., 1973).
Das obige Verfahren von Steinbuch wurde an Zellkulturmedium und Ascites-Flüssigkeit von Mäusen unter Verwendung von 0,86 Gew.% Caprylsäure zur Rückgewinnung von IgG angewandt (Russo et al., 1983). Das gleiche Verfahren wurde an verdünntem Humanplasma mit 2,16 Gew.% Caprylat angewandt (Habeeb et al., 1984). Habeeb et al. ließen auf die Caprylsäure-Fällung eine Fraktionierung an DEAE-Cellulose folgen. Das entstandene Plasma-stämmige IgG war frei von Aggregaten, Plasmin und Plasminogen. Außerdem wies das erhaltene IgG eine nur niedrige Antikomplement-Aktivität auf und war relativ stabil während der Aufbewahrung.
Als Ergebnis dieser Studien haben die Wissenschaftler verschiedene Verfahrenstechniken zur Reinigung von IgA, IgG, α-1-Säureglycoprotein und von Präalbumin entwickelt und dabei gefolgert, dass die Fällungsreaktion in hohem Maße Temperatur- und pH-abhängig war (Steinbuch et al., 1969; Steinbuch et al., 1973, siehe auch Tenold, 1996).
Beispielsweise ist IgA als Routine-Fraktionierungsnebenprodukt aus Cohn-Fraktion III auf Basis der IgA-Löslichkeit mit Caprylsäure bei pH = 4,8 hergestellt worden (Pejaudier et al., 1972). IgA, das aus kalter Ethanol-Fraktion III durch DEAE-Cellulose-Adsorption und Elution isoliert wurde, wurde durch Caprylsäure-Fällung weiter gereinigt. Die Bedingungen zur Fällung waren 1,5 bis 2 % Protein-Konzentration, 0,9 % Natriumchlorid, pH = 5,0, 1,12 Gew.% Caprylsäure.
Eine zweistufige Reinigung von Immunoglobulinen aus Säugetierseren und Ascites-Flüssigkeit ist beschrieben worden (McKinney et al., 1987). Zuerst wurden Albumin und weitere Nicht-IgG-Proteine mit Caprylsäure ausgefällt, worauf Ammoniumsulfat zum Überstand gegeben wurde, um das IgG auszufällen. US 5,164,487 von Kothe et al. (1992) betrifft die Verwendung von Caprylsäure zur Herstellung einer intravenös tolerierbaren IgG-Zubereitung, die frei von Aggregaten, vasoaktiven Substanzen und von proteolytischen Enzymen ist. Bei dem Verfahren wird das Ausgangsmaterial, das IgG enthält, in Kontakt mit 0,4 bis 1,5 % Caprylsäure vor der chromatographischen Reinigung mit einer Ionenaustausch- oder hydrophoben Matrix gebracht.
Natriumcaprylat ist ebenfalls zur Reinigung von Albumin verwendet worden. Gemäß diesen Verfahren wird Natriumcaprylat zugegeben, um Plasma zu verarbeiten, und es schützt das Albumin, wenn der Verfahrensstrom hohen Temperaturen ausgesetzt wird. Extreme Temperaturen denaturieren nicht nur Verfahrensstrom-Globuline, sondern können auch kontaminante Neo-Antigene erzeugen (Schneider et al., 1979; Condie, 1979; siehe auch Plan, 1976).
Tenold (1996) zeigt die Verwendung von Caprylat als Verteilungsmittel zur Isolierung von Albumin aus Cohn-Fraktion II+III- oder IV-1-Effluens. Wiederum wird das Natriumcaprylat zur Denaturierung (und Ausfällung) von Globulinen verwendet.
Virale Inaktivierung
US 4,939,176 von Seng et al (1990) berichtet über ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Lösungen biologisch aktiver Proteine, wobei die Lösungen mit Caprylsäure in Kontakt gebracht werden. Die für das Verfahren angegebenen bevorzugten Bedingungen waren pH = 4 bis 8 und 0,07 bis 0,001 % der nicht-ionisierten Form der Caprylsäure.
Weitere virale Inaktivierungsverfahren durch Verwendung chemischer Mittel sind bekannt. US 4,540,573 von Neurath (1985) lehrt die Verwendung von Di- oder Trialkylphosphaten als antivirale Mittel. US 4,534,972 von Lembach (1985) beschreibt ein Verfahren, mit welchem Lösungen therapeutisch oder immunologisch aktiver Proteine im Wesentlichen frei von infektiösen Mitteln gemacht werden. Beim Verfahren von Lembach wird eine Protein-Lösung in Kontakt mit einem Übergangsmetall-Komplex, z. B. mit Kupferphenanthrolin, und mit einem reduzierenden Mittel gebracht, um die Inaktivierung von Viren durchzuführen, ohne die Aktivität des Proteins wesentlichen zu beeinflussen.
Anionaustausch-Chromatographie
Bloom et al. (1991) geben ein Beispiel für die Anwendung von Anionaustausch-Chromatographie zur Reinigung von Antikörper-Zubereitungen. In deren Verfahren wird eine Lösung, die Antikörper und kontaminierendes Protein A enthält, mit einem Anionaustausch-Harz in Kontakt gebracht, worauf die Antikörper aus dem Harz unter Bedingungen steigender Ionenstärke eluiert werden.
CA 1.201.063 von Friesen lehrt die Zubereitung eines IgG, das sich zur intravenösen Anwendung eignet, wobei eine Plasma-Fraktion einem zweistufigen Trennverfahren mit zwei verschiedenen Anionaustausch-Harzen unterzogen wird. In jeder Stufe wird der Puffer, der dazu verwendet wird, das Anionenaustausch-Harz ins Gleichgewicht zu setzen, auch dazu verwendet, die IgG enthaltende Fraktion aus dem Harz zu eluieren.
Ein Verfahren zur Isolierung einer Human-IgG- und Albumin enthaltenden Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung ist von Kimura et al. (1984) beschrieben worden. Das Verfahren beinhaltet Fällungsstufen unter gesteuerten Bedingungen des pH, der Ethanol-Konzentration, der Ionenstärke und der Temperatur.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist durch ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von Antikörpern des IgG-Typs aus Humanplasma und weiteren Quellen dargestellt. In dem Verfahren werden die Antikörper bei pH = 3,8 bis 4,9 suspendiert, worauf Caprylsäure (oder eine weitere Caprylat-Quelle) zugegeben und der pH-Wert auf 5,0 bis 5,2 verschoben werden. Ein Niederschlag aus kontaminierenden Proteinen, Lipiden und von Caprylat bildet sich und wird entfernt, während der Hauptteil der Antikörper in Lösung bleibt. Natriumcaprylat wird erneut auf eine Endkonzentration von nicht weniger als ca. 15 mM zugegeben. Diese Lösung wird unter Bedingungen, die hinreichen, den Titer an aktivem Virus wesentlich herabzusetzen, inkubiert (z. B. 1 h lang bei 25°C). Ein Niederschlag (hauptsächlich aus Caprylat) wird entfernt, und die klare Lösung wird mit gereinigtem Wasser zur Verringerung der Ionenstärke verdünnt. Anionaustausch-Chromatographie unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Harzen wird angewandt, um eine außergewöhnlich reine Antikörper-Zubereitung mit einer Antikörper-Unterklassenverteilung zu erhalten, die ähnlich der Ausgangsverteilung ist.
Das vorliegende Verfahren unterscheidet sich von denen des Standes der Technik insofern, als es die Virus-Inaktivierung und die Beseitigungsmaßnahme als integralen Teil des Verfahrensschema kombiniert und die Post-Virus-Behandlungsmanipulation der γ-Globulin-Lösung minimiert. Durch Integration der Virus-Behandlung in das Verfahrensschema werden durch das Verfahren die Ausbeute maximiert und ein γ-Globulin mit einer Reinheit von größer als 99 % erzeugt.
Kurze Beschreibung der Figuren.
1 ist ein Fließschema, das das Verfahren der Erfindung beschreibt.
2 ist ein Fließschema, das das Verfahren des Standes der Technik zur Isolierung von Antikörpern zeigt.
Spezifische Ausgestaltungen Materialien und Methoden
Die pH-Werte wurden mit 1 M Essigsäure, 2 M Essigsäure, 6 % NaOH, 1 M NaOH oder mit 1 M HCl eingestellt. Natriumcaprylat-Vorratslösung wurde durch Auflösen von 30 % Natriumcaprylat in Wasser zur Injektion durch Vermischen hergestellt. Humanplasma-Fraktion II+III wurde hergestellt, wie beschrieben von Lebing et al. (1994). Alle Reagenzien waren vom USP-Grad oder besser. Nephelometrie wurde mit einem Beckman Array 360 Nephelometer und Beckman Kits durchgeführt. Analytische HPLC wurde mit HP 1050-Systemen mit Tosohaas G3000SW- und G4000SW SEC-Säulen durchgeführt. Protein wurde mit dem Biuret-Verfahren bestimmt.
Das vorliegende Verfahren ist robust und einfach (siehe 1). Das Verfahren beginnt mit der Wiederauflösung gefällter Antikörper in gereinig tem Wasser bei einem pH-Wert von ca. 4,2. In der Praxis ergibt die Erhöhung der Wassermenge pro Einheit der Paste eine erhöhte Ausbeute. Allerdings ist es, wenn Hunderte von kg Paste verarbeitet werden, praktisch, etwas an Ausbeute einzubüßen, um den Maßstab der Gefäße und Säulen in bearbeitbaren Grenzen zu halten. Die Ausbeuten über die Auflösungsstufe, die virale Inaktivierung und die Chromatographie hinweg sind relativ wichtig, da die Nachfrage nach Immunoglobulin deren Angebot im Allgemeinen weit übersteigt.
Die Inaktivierung umhüllter Viren macht es erforderlich, dass die Hauptmasse des pH-empfindlichen Niederschlags vor der Inaktivierungsstufe beseitigt und entfernt wird. Außerdem sollte der Natriumcaprylat-Gehalt 15 bis 60 mM während der Haltestufe bei 25°C betragen, um eine vollständige Inaktivierung der umhüllten Viren zu erzielen. Virus-Inaktivierungsstudien haben bestätigt, dass Caprylat mit 16 mM oder 18 mM mehr als 4 log-Einheiten bei Rinder-Viral Diarrhae-Virus und Pseudorabies-Virus (beide sind umhüllte Viren) in 30 min bei 24°C inaktiviert. Diese zusätzliche chemische Virus-Inaktivierung ergänzt die Virus-Inaktivierung einer Haltestufe bei pH = 4,25, die ebenfalls in das Herstellverfahren eingeschlossen ist.
Die Primärstufen des Verfahrens sind wie folgt definiert:

1) Suspendieren eines Zusammensetzung, enthaltend gefällte Immunoglobuline in gereinigtem Wasser zur Injektion (WFI) bei 5°C, unter kräftiger Vermischung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Fraktion II+III-Paste eingesetzt, es können aber auch weitere Quellen verwendet werden, wie Ascites-Flüssigkeit, Gewebe-Kulturmedien, die Antikörper enthalten, weitere Humanplasma-Fraktionen oder tierische Plasma-Fraktionen.
2) Auflösung der Immunoglubuline zu einer Lösung durch Erniedrigung des pH-Wertes der Mischung auf 3,8 bis 4,5, vorzugsweise auf 4,2, durch Zugabe einer Säure, vorzugsweise von Essigsäure, unter weiterer kräftiger Vermischung.
3) Zugabe einer Quelle von Caprylat-Ionen (z. B. 40 % G/V Natriumcaprylat in Wasser) auf eine Endkonzentration von 15 bis 25 mM, vorzugsweise von 20 mM, und Einstellung des pH-Wertes auf 5,0 bis 5,2, vorzugsweise auf 5,1, mit einer Base (wie mit 1 M NaOH).
4) Entfernung gefällter Proteine, Lipide und von Caprylat durch Filtration bei Umgebungstemperatur (z. B. bei 5 bis 25°C). Die Filtration macht die Zugabe einer Filterhilfe erforderlich (beispielsweise ist in diesem Fall die Filterhilfe 2 bis 5 % Diatomeenerde). Die Lösung wird mittels Normalflussfiltration filtriert. Diese Stufe führt zu einer deutlichen Verringerung nicht-umhüllter Viren. Zentrifugation kann die Filtration ersetzen.
5) Zugabe von weiterem Caprylat zur Ergänzung der Konzentration auf ca. 15 bis ca. 60 mM, vorzugsweise auf 20 mM, wobei der pH bei 5,0 bis 5,2, vorzugsweise bei 5,1, durch die Zugabe von Säure (z. B. von 1 M Essigsäure) gehalten wird.
6) Die Temperatur wird auf ca. 25 bis 35°C, vorzugsweise auf 25°C, angehoben und dort über eine Dauer von ca. 15 min bis ca. 6 h, vorzugsweise ca. 1 h lang, gehalten. Längere Inkubationszeiten können unter etwas Einbuße bei der Ausbeute angewandt werden. Ein Niederschlag aus hauptsächlich Caprylat und etwas zusätzlichem Protein wird bei dieser Stufe gebildet.
7) Filterhilfe (Diatomeenerde) wird zugegeben, und der Niederschlag wird durch Normalflussfiltration entfernt. Umhüllte Viren werden durch das gehaltene Caprylat inaktiviert, und nicht-umhüllte Viren werden auf der Filterhilfe eingefangen.
8) Die geklärte Lösung wird mit gereinigtem Wasser zur Verringerung der Leitfähigkeit auf 1 bis 8 und vorzugsweise auf weniger als 5 mS/cm verdünnt.
9) Leiten der Lösung durch zwei Anionaustausch-Chromatographiesäulen, die in Serie verbunden sind. Die Anionaustauscher werden bezüglich ihrer Befähigung zur Beseitigung von IgA, IgM, Albumin und von weiteren verbleibenden Protein-Verunreinigungen ausgewählt. Nach Beladung werden die Säulen mit Äquilibrationspuffer gewaschen. Der Durchfluss und die Wasch-Fraktion werden als gereinigtes IgG gesammelt. Beide Säulen werden mit dem gleichen Puffer und beim gleichen pH-Wert ins Gleichgewicht gesetzt.

Mehrere Anionaustausch-Harzkombinationen können in Abhängigkeit von der Selektivität der Harze angewandt werden. Die Anionaustausch-Harze werden bezüglich ihrer Befähigung zur selektiven Entfernung der Verunreinigungen ausgewählt, die in Alkohol/pH-gefällten Plasma-Fraktionen vorgefunden werden. Bei der Entwicklung des vorliegenden Verfahrens wurden genügend gute Reinigungsergebnisse mit Kombinationen aus Pharmacia Biotech Q & ANX-Harzen und E. Merck TMAE-Fractogel erzielt.
Die für die Chromatographie beschriebenen Bedingungen liegen ganz allgemein in einem pH-Bereich von 5,0 bis 5,2. Bei pH < 5,0 laufen die Verunreinigungen durch die Säulen. Bei pH >5,2 gibt es Einbußen bei der Ausbeute. Die Ionenstärke ist bei der Chromatographie relativ wichtig, da eine verringerte Reinheit beobachtet wird, wenn die Ionenstärke während der Chromatographie ansteigt.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Lösung direkt auf den ersten Anionaustauscher gegeben, der mit 20 mM Natriumacetat bei pH = 5,1 ins Gleichgewicht gesetzt worden ist. Im Anschluss daran wird die nicht-bindende Fraktion (der Durchfluss) aus der ersten Anionaustausch-Säule direkt auf die zweite Anionaustausch-Säule gegeben. Diese Säule ist mit 20 mM Acetat-Puffer bei pH = 5,1 ins Gleichgewicht gesetzt worden. Die Protein-Lösung wird in typischer Weise auf die erste Säule mit einem Verhältnis von 50 bis 110 mg IgG/ml Packungsharz gegeben. Die Protein-Lösung wird in typischer Weise auf die zweite Säule mit einem Verhältnis von 75 bis 95 mg IgG/mL Packungsharz gegeben. Das Protein-zu-Harz-Verhältnis kann jenseits dieser Grenzen eingestellt werden, dies hat aber eine Auswirkung auf Ausbeute und Reinheit. Auf die Protein-Lösung folgen annähernd 2 Säulenvolumina des Äquilibrationspuffers, der jegliches nicht-gebundene IgG aus den Säulen auswäscht. Die ungebundene Fraktion wird als hoch gereinigtes IgG gesammelt, das dann diafiltriert wird, worauf das Protein auf die endgültigen Formulierungswerte eingeengt bzw. aufkonzentriert wird.
Die bevorzugten Bedingungen für das Endprodukt werden auf der Grundlage von Patenten des hier auftretenden Herstellers ausgewählt. Diese Bedingungen (niedriger pH-Wert und niedriger Salzgehalt) würden, theoretisch, für jedes IgG-Produkt von Vorteil sein. Das gesammelte Produkt wird auf pH = 4,2 eingestellt. Es wird auf eine Konzentration von ca. 5 % (G/V) eingestellt. Es wird dann mit gereinigtem Wasser diafiltriert.
Das gereinigte IgG wird entweder auf eine stabile flüssige Formulierung (wie beschrieben von Tenold, 1983) oder auf eine weitere entsprechende Endformulierung (z. B. eine gefriergetrocknete Formulierung) eingeengt bzw. aufkonzentriert. Für eine flüssige Formulierung wird das gereinigte IgG aufkonzentriert, um entweder 5 % oder 10 % IgG (G/V) im Anschluss an die Steril-Filtration zu ergeben. Vor der Filtration wird der pH-Wert auf 3,0 bis 4,25 eingestellt, und Maltose oder Glycin werden zugegeben, um Osmolarität einzustellen, um kompatibel zur intravenösen Injektion zu sein. Die sterile Hauptmasse wird dann nicht länger als 21 Tage lang gehalten, um die Anti-Komplement-Aktivität herabzusetzen und umhüllte Viren zu inaktivieren.
Wie hierin verwendet, sind die Prozentwerte für die Konzentrationen auf einer Gewicht/Volumen-Basis bestimmt.
Wie hierin verwendet, bedeutet die wesentliche Herabsetzung des Titers des aktiven Virus, dass der Titer des aktiven Virus um mindestens ca. 2 log-Einheiten, bevorzugter um mindestens ca. 3 log-Einheiten und am meisten bevorzugt um mindestens ca. 4 log-Einheiten herabgesetzt wird.
Wie hierin verwendet, bedeutet "im Wesentlichen alles an Protein" mindestens ca. 90 % des Proteins. "Im Wesentlichen keines an Protein" bedeutet weniger als ca. 5 % des Proteins.
Beispiel 1
Reinigung von IgG aus Cohn Fraktion II+III-Paste
Fraktion II+III-Paste wurde in 12 Volumina gereinigtem Wasser von 5°C solubilisiert. Der pH-Wert der Mischung wurde auf pH = 4,2 mit Essigsäure eingestellt, worauf das Ganze 1 h lang vermischt wurde. Diese Stufe brachte das IgG in Lösung.
Der pH-Wert der Mischung wurde dann auf pH = 5,2 mit NaOH und mit Natriumcaprylat eingestellt (der "pH-Schwung"). Proteine und Lipide wurden ausgefällt. Die Mischung wurde durch Filtration geklärt, um den Niederschlag zu entfernen, der die Virus-Inaktivierung stören würde. Die Caprylat-Konzentration wurde auf 20 mM bei pH = 5,1 eingestellt, und die Mischung wurde 1 h lang bei 25°C inkubiert, um die Inaktivierung umhüllter Viren durchzuführen.
Die Mischung wurde filtriert, um eine klare Lösung zur Chromatographie zu erzeugen. Die Leitfähigkeit der Lösung wurde auf 2,0 bis 3,0 mS/cm mit gereinigtem Wasser eingestellt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 5,0 bis 5,2 nach der Einstellung der Leitfähigkeit eingestellt.
Die Lösung wurde dann direkt auf zwei Anionaustausch-Säulen (einen starken Anionaustauscher und dann auf einen schwachen Anionaustauscher) gegeben. Die zwei Säulen waren in Serie geschaltet. Das IgG floss durch die Säule, während die Verunreinigungen (einschließlich des Caprylats) an die zwei Anion-Säulen gebunden wurden.
Der pH-Wert des gesammelten Durchflusses aus der Chromatographie wurde auf 3,8 bis 4,0 mit Essigsäure eingestellt. Er wurde mit 7 Austauschvolumina von Puffer (gereinigtes Wasser) diafiltriert. Er wurde dann eingeengt und endgültig bei pH = 4,2 formuliert.
Die Gesamtausbeute aus der Paste, die zu einem Endprodukt aufgelöst wurde, betrug 69 % (siehe die Tabelle). Dies stellte eine signifikante Verbesserung gegenüber der Ausbeute des Verfahrens des Standes der Technik dar, worin die Wäsche mit dem Alkohol-Verfahren angewandt wurde (48 %). (Siehe 2, worin das Verfahren des Standes der Technik dargestellt ist.)
Tabelle Ausbeutezusammenfassung
Beispiel 2
Reinigung von IgG aus Zellkulturmedium
Ein Zellinien-Wachstumsmedium, enthaltend sekretierte monoklonale Antikörper, wird zuerst auf den geeigneten pH-Wert und die entsprechende Leitfähigkeit eingestellt. Dies wird durch Diafiltration gegen gereinigtes Wasser bewerkstelligt, während der pH-Wert auf 4,2 mit Essigsäure eingestellt wird. Die Leitfähigkeit sollte nicht weniger als 1,0 mS betragen.
Die Reinigung des monoklonalen Antikörpers wird gemäß den obigen Stufen durchgeführt. Der gereinigte monoklonale Antikörper wird dann aufkonzentriert und auf einen pH-Wert von 4,2 mit Glycin, Maltose oder weiteren geeigneten Exzipienten endgültig formuliert. Durch die Formulierung bei pH = 4,2 wird eine flüssige Lösung hergestellt, die 2 Jahre lang bei 5°C stabil ist und bleibt. Dies ist vom kommerziellen Standpunkt aus hoch erwünscht.
Diskussion
Immunoglobuline fallen mit der II-III-Fraktion bei der Cohn-Alkohol-Fraktionierung aus. Die Ausfällung beruht auf der Gesamtladung der Proteinoberfläche und ihrer Wechselwirkung mit dem Lösungsmittel. Zu viel Salz, Alkohol und die pH-Bereiche können den Bereich etwas einschränken, bei dem die Proteine ausfallen. Allerdings fallen die meisten Proteine über einen weiten Bereich des pH-Wertes und der Alkohol-Konzentration aus (und zwar über einen so großen Bereich wie 1,5 pH-Einheiten und 10 % Alkohol). Somit weisen die Ausfällungsbereiche der Proteine eine Tendenz zur Überlappung auf. Alle drei Haupt-Immunoglobulin-Typen IgG, IgA und IgM werden wegen der Ähnlichkeit ihrer isoelektrischen Punkte mitgefällt. Eine weitergehende Auftrennung des Immunoglobulins gestaltet sich wegen dieser Ähnlichkeit kompliziert. Produktionsschemen, die sich der Ausfällung bedienen, bedingen daher, dass eine signifikante Menge des IgG mit dem IgA und IgM mitgefällt wird.
Zusätzlich zur Ausbeuteverringerung bedarf die klassische Fällung der Anwendung von Ethanol. Da Ethanol die Proteine destabilisiert, sind abgesenkte Temperaturen (in typischer Weise von –5°C) während der Verarbeitung zur Steigerung der Stabilität des Proteins erforderlich. Chromatographie vermag Probleme der Protein-Denaturierung zu vermeiden, die gewöhnlich bei Fällungsstrategien auftreten. Die Protein-Chromatographiestufen können ganz allgemein unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Stabilität der Proteine begünstigen. Ein weiterer Nachteil der Ethanol-Fraktionierung beruht auf der Tatsache, dass Alkohol wegen seiner chemischen Natur eine mögliche Explosionsgefahr darstellt, was explosionssichere Anlagen und Ausrüstungen sowie spezielle Handhabungsprotokolle erforderlich macht. Diese Tatsache erhöht die Kosten des Fraktionierungsverfahrens ganz deutlich, was einen Nachteil darstellt, den es bei herkömmlichen Chromatographieverfahren nicht gibt.
Die Ionenaustausch-Chromatographie nutzt die Oberflächenverteilung und Ladungsdichte auf sowohl den Protein- als auch den Ionenaustausch-Medien. Das Anionaustausch-Harz weist eine positiv geladene Oberfläche auf. Die Ladungsdichte ist spezifisch für das Harz und im Allgemeinen unabhängig vom pH-Wert (innerhalb des Arbeitsbereiches des Harzes). Ein typischer Anionaustauscher bindet Proteine, die eine negative Netto-Ladung aufweisen (d. h., wenn der pH-Wert der Lösung oberhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins liegt). In Wirklichkeit weist die Oberfläche des Proteins keine Einzelladung auf und ist vielmehr ein Mosaik positiver, negativer und neutraler Ladungen. Die Oberflächenstruktur ist spezifisch für ein gegebenes Protein und wird von Lösungsbedingungen wie Ionenstärke und pH-Wert beeinflusst. Diese Einzigartigkeit kann genutzt werden, um spezifische Bedingungen zu erstellen, bei denen individuelle Proteine an das Anionaustausch-Harz gebunden oder daraus freigesetzt werden. Durch Erstellung dieser Bedingungen können Proteine mit nur geringfügig sich unterscheidenden Oberflächen- oder Ladungseigenschaften in wirkungsvoller Weise mit hoher Ausbeute (>95 %) aufgetrennt werden.
Verbesserungen bei der Struktur der Chromatographie-Harzträger haben die in großem Maßstab durchgeführte Chromatographie zu einer Alternative in der Praxis gegenüber herkömmlicheren Reinigungsverfahren gemacht. Harte Harze ermöglichen die rasche (<5 h) Verarbeitung großer Volumina, und eine hohe Ligand-Dichte ergibt das gesteigerte Fassungsvermögen, das für die Verarbeitung großer Volumina benötigt wird. Diese Faktoren zusammen mit den hohen Ausbeuten, der Reinheit des Produkts und mit der Einfachheit des Verfahrens begünstigen die Anwendung der in großem Maßstab durchgeführten Chromatographie.
Schlussfolgerung
Das hier beschriebene Chromatographie-Verfahren nutzt die hohe Spezifität von Chromatographie-Harzen. Zwei Anionaustauscher werden angewandt, um Protein-Begleitstoffe und das virale Inaktivierungsmittel selektiv zu entfernen. Das entstandene Produkt weist eine Reinheit von >99 % auf, wenn es entweder mit Nephelometrie oder Größenausschluss-Chromatographie (SEC-HPLC) analysiert wird.
Das Verfahren ist auch so entworfen, dass der Verlust an IgG minimiert ist. Die Virus-Inaktivierung und die Beseitigungsstufen sind sorgfältig in die Auflösungs- und Chromatographiestufen integriert und eingebaut worden, weshalb der Wirkungsgrad des Verfahrens gesteigert ist. Die Gesamtausbeute aus der Paste an gelöstem Endprodukt beträgt 69 % (siehe die Tabelle). Dies stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber derzeitigen Verfahrensausbeuten unter Anwendung der Wäsche mit dem Alkohol-Verfahren dar (48 %).
Das Verfahren wurde an menschlicher Cohn Fraktion II+III-Paste in Beispiel 1 durchgeführt. Allerdings ist davon auszugehen, dass das Verfahren mit gleichwertigen Ergebnissen an Plasma-Fraktionen, die aus nichtmenschlichen Lebewesen isoliert sind, ebenso gut angewandt und durchgeführt werden kann.
Literaturverzeichnis

Bloom, James W., et al., Removal of protein A from antibody preparations, US 4,983,722 (Jan. 8, 1991).
Condie, Richard M., Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin, US 4,136,094 (1979).
Friesen, Albert D., Process for preparing purified immune globulin (IgG), CA 1,201,063 (1986).
Habeeb, A. F. S. A., et al., Preparation of human immunoglobulin by caprylic acid precipitation, Prep. Biochem. 14: 1–17 (1984).
Kimura, Tokosuke, et al., Method of preparing gamma globulin suitable for intravenous administration, US 4,476,109 (1984).
Kothe, Norbert et al., Manufacturing intravenous tolerable immunoglobulin-G preparation, US 5,164,487 (1992).
Lebing, Wytold R., et al., A highly purified antithrombin III concentrate prepared from human plasma fraction IV-1 by affinity chromatography, Vox Sang. 67: 117–24 (1994).
Lembach, Kenneth J., Protein compositions substantially free from infectious agents, US 4,534,972 (1985).
McKinney, Michella M., et al., A simple, non-chromatographic procedure to purify immunglobulins from serum and ascites fluid, J. Immunol. Meth 96: 271–78 (1987).
Neurath, Alexander R., et al. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives, US 4,540,573 (1985).
Pajaudier, L. et al., Preparation of human IgA as by-product of routine fractionation, Vox. Sang. 23: 165–75 (1972).
Plan, Robert A.M., et al., Process for the preparation of purified albumin by thermocoagulation and albumin obtained by said process. US 3,992,367 (1976).
Russo, C., et al., Immunol. Meth. 65: 269–71 (1983).
Schneider, et al., Process for isolating albumin from the blood, US 4,156,681 (1979).
Seng, Richard L., et al., Viral inactivation process, US 4,939,176 (1990).
Steinbuch, M., et al., The isolation of IgG from mammalian sera with the acid of caprylic acid. Arch. Biochem. Biophys 134 279–94 (1969).
Steinbuch, M., et al., Preparation of an IgM and IgA enriched fraction for clinical use, Prep. Biochem. 3 363–73 (1973).
Tenold, Robert, Intravenously injectable immune serum globuline, US 4,396,608 (1983).
Tenold, Robert, Low temperature albumin fractionating using sodium caprylate as a paritioning agent, US 5,561,115 (Oct. 1, 1996).

Claims

Verfahren zur Herstellung einer gereinigten, viral inaktivierten IgG-Zubereitung aus einer Ausgangs-Lösung, die IgG und Begleitstoffe umfasst, wobei das Verfahren die Stufen aufweist, in denen man: (a) den pH-Wert der Ausgangs-Lösung auf 3,8 bis 4,5 einstellt, um eine Zwischen-Lösung zu erzeugen, (b) Caprylat-Ionen zur Zwischen-Lösung gibt und den pH-Wert einstellt, um eine Überstands-Lösung zu bilden, die Antikörper und einen Niederschlag umfasst, (c) die Überstands-Lösung vom Niederschlag abtrennt, (d) die Überstands-Lösung unter Bedingungen der Caprylat-Ionenkonzentration, der Zeit, des pH-Wertes und der Temperatur so inkubiert, dass der Titer an aktivem umhüllten Virus um mindestens zwei log-Einheiten oder auf ein nicht mehr nachweisbares Niveau verringert wird, um eine viral inaktivierte Lösung zu erzeugen, und man (e) die viral inaktivierte Lösung mit mindestens einem Anionaustausch-Harz und gegebenenfalls mit zwei unterschiedlichen Anionaustausch-Harzen unter Bedingungen in Kontakt bringt, mit denen es ermöglicht ist, die Begleitstoffe an das Harz zu binden, während eine signifikante Bindung des IgG an das Harz nicht ermöglicht ist, und wobei eine gereinigte, viral inaktivierte IgG-Zubereitung erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Stufe (d) die Überstands-Lösung bei einem pH von 5,0 bis 5,2 inkubiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin in Stufe (b) der pH-Wert der Zwischen-Lösung auf 5,0 bis 5,2 eingestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, worin in Stufe (e) die viral inaktivierte Lösung mit mindestens einem Anionaustausch-Harz bei einem pH von 5,0 bis 5,2 in Kontakt gebracht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Ausgangs-Lösung Plasma-stämmige Antikörper umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Ausgangs-Lösung aus einem Säugetier-Zellkulturmedium erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin in Stufe (e) die viral inaktivierte Lösung mit zwei unterschiedlichen Anionaustausch-Harzen unter Bedingungen so in Kontakt gebracht wird, dass die Begleitstoffe an die Harze gebunden werden, während das IgG nicht signifikant an die Harze gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die zwei Anionaustausch-Harze in zwei unterschiedlichen Anionaustausch-Chromatographie-Säulen vorliegen und die viral inaktivierte Lösung durch die zwei Anionaustausch-Chromatographie-Säulen in Serie geleitet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, worin die viral inaktivierte Lösung mit den zwei Anionaustausch-Harzen bei einem pH von 5,0 bis 5,2 in Kontakt gebracht wird.