PT1718675E

PT1718675E - Método de proporcionar uma preparação purificada de anticorpos livre de vírus

Info

Publication number: PT1718675E
Application number: PT57168049T
Authority: PT
Inventors: Juergen Roemisch; Andrea Buchacher; Guenther Iberer
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2013-05-21
Also published as: EP1718675B2; UA87836C2; KR101206788B1; CA2557229A1; EP2277915A1; AU2005217148A1; RU2006134285A; CN1922207B; IL177541A; CA2557229C; PL1718675T3; BRPI0508096A; EP1718675A2; IL177541A0; WO2005082937A2; EP1718675B1; KR20060131920A; NO20063784L; US20070173638A1; CN1922207A

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE PROPORCIONAR UMA PREPARAÇÃO PURIFICADA DE ANTICORPOS LIVRE DE VÍRUS" A presente invenção refere-se a um método de preparar uma preparação purificada de anticorpos livre de vírus a partir de uma solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes. Descreve-se um processo de purificação de globulinas gama de plasma humano e de outras fontes. Os passos de inactivação e remoção de vírus estão incluídos no processo de preparação aqui descrito.

Precipitação e remoçao/inactivação de vírus resultante

Nos anos 1940, Cohn et al. introduziram o fraccionamento de etanol a frio de plasma humano. Muitas variações deste esquema vieram aumentar a pureza e/ou rendimento dos diferentes intermediários. No fraccionamento de Cohn foram identificados alguns passos para contribuir eficazmente para inactivação e remoção de vírus. No processo de IgG, especialmente a separação da fracção de Cohn I + III é mais eficaz a este respeito. Alguns vírus sensíveis (principalmente vírus de envelope) são destruídos por pH baixo e presença de EtOH e uma grande parte de vírus de envelope e de não-envelope é removida por partição no precipitado I+III que é normalmente rejeitado. 1

Nos anos 1960, mostrou-se que ácidos gordos curtos (C6-C12) formam complexos insolúveis com globulinas α e β enquanto as globulinas γ não são tão rapidamente precipitadas (Chanutin et al., 1960). Steinbruch et al. (1996) descreveram um processo de purificação para IgG com caprilato (i. e. octanoato, um ácido gordo saturado C8) como agente de precipitação. As não imunoglobulinas foram precipitadas de plasma humano após diluição com um tampão acetato para atingir um pH final de 4,8. Após adição de caprilato sob agitação vigorosa, obteve-se uma solução enriquecida de IgG. A pureza e rendimento dependeram da quantidade de ácido caprílico, do pH, da molaridade do tampão e do factor de diluição. Steinbruch et al. também afirmaram que é vantajoso adicionar a quantidade eficaz de caprilato em dois passos com a remoção dos precipitados entre si. Os vírus de não-envelope e de envelope são removidos por partição no precipitado das proteínas não IgG como é o caso para a separação da fracção I+III.

Cromatografia Várias patentes descrevem a purificação da solução de IgG no assim designado modo negativo; a IgG atravessa sem ligação (apenas em quantidades vestigiais) enquanto a maioria das proteínas de fracção não IgG se liga aos ligandos aniónicos (Bertolini et al. 1998, documento WO-A-98/05686; Lebing 1999, documento US-A-5,886,154; Friesen et al., 1986, documento CA 1201063) . A combinação de precipitação de caprilato seguida por cromatograf ia de troca iónica para a purificação de IgG foi descrita em muitas publicações. Uma das primeiras foi escrita por Steinbuch et al. (1969). Este descreveu a purificação adicional de IgG após precipitação de caprilato com celulose 2 DEAE. A publicação recente por Lebing et al. (2003) descreve duas colunas de troca aniónica utilizadas em série para a remoção de IgM, IgA, albumina e outras impurezas. Lebing et al. combinaram efeitos mediados por caprilato, nomeadamente a redução essencial de proteínas não IgG por precipitação, utilizando desse modo a partição de vírus e as propriedades de inactivação de vírus de envelope do ácido gordo num passo de incubação separado. A importância da assim designada "oscilação de pH", Lebing et al. (2003), começando da reconstituição de uma pasta/precipitado contendo IgG a pH 4,2 e a subsequente adição de caprilato mediante ajuste de pH 5,2 é salientada ser essencial para o processo de enriquecimento de IgG, deste modo necessário para reduzir eficazmente as proteínas não IgG. Como algumas outras impurezas, tipo IgA e IgM, assim como o caprilato, foram subsequentemente reduzidos pelos passos de cromatografia de troca iónica mencionados.

De um modo surpreendente, verificou-se que tal desvio de pH, como indicado acima e descrito por Lebing et al., não é necessário para atingir um efeito de purificação significativa mediante adição de caprilato e remoção do precipitado resultante. Em vez disso, mediante manutenção do pH constante a pH 4,6 a 4,95 durante o processo completo de reconstituição de pasta e incubação de caprilato e remoção de precipitado, atinge-se um enriquecimento de IgG eficaz. Igualmente, a quantidade de impurezas, especialmente albumina, é mais eficazmente reduzida mantendo o pH constante na gama de 4,8 a 4,95. Ao mesmo tempo, os vírus são removidos. Mais tarde, as impurezas residuais e o caprilato são separados por passos de troca iónica. 3

Inactivação de vírus clássica

Os tratamentos com detergente solvente e a pH 4 são métodos bem conhecidos e vastamente utilizados para imunoglobulinas. 0 tratamento com SD é normalmente introduzido nestes processos devido à sua superioridade em termos de inactivação de vírus de envelope (Biesert L. Clinicai and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47). Os vírus de envelope e de não-envelope são afectados pela exposição a baixo pH, embora os vírus de envelope sejam mais afectados do que os de não-envelope (Biesert. Clinicai and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47, Bos et al. Biologicals 1998; 26: 267, Em Seop et al. J Microbiol Biotechnol 2001; 11: 619).

No documento EP-A-0525502 são descritas a combinação de detergente solvente e incubação a pH 4 como passos de inactivação de vírus.

Filtração de vírus

As soluções de IgG são filtradas através de membranas de tamanho de poro muito pequeno (tipicamente 15 a 50 nm) sob condições que retêm vírus por um mecanismo largamente baseado na exclusão por tamanho (Burnouf e Radosevich. Haemophilia 2003; 9: 24) para aumentar a segurança de vírus. Igualmente, são utilizados filtros de profundidade desenhados para reter vírus por adsorção de troca iónica para filtração de imunoglobulinas. 4

Sumário da Invenção A invenção descreve um processo de purificação de IgG com um rendimento aumentado e tempo de processo mais curto comparado com o processo de fraccionamento clássico de Cohn-Oncly. A IgG é reconstituída em tampão numa gama de pH acídico de 4,60 a 4,95, de um modo preferido, 4,9. As proteínas não IgG são separadas por dois passos de incubação com caprilato numa gama de concentração de 10 a 30 mM de caprilato, de um modo preferido, 20 mM.

Para inactivação eficaz de vírus de envelope, uma incubação conhecida como tratamento de detergente solvente com Triton X-100, Tween 80, etc., e TNBP, pode ser adicionada para aumentar a capacidade de inactivação de vírus do processo completo. Uma remoção de vírus por filtração, i. p. pela assim designada nanofiltração ou filtros de profundidade carregados, pode ser adicionada aos processos de remoção de vírus. Além disso, pode ser realizado o tratamento com UVC também em combinação com os tratamentos mencionados anteriormente. Esses tratamentos são descritos e. g., nos documentos EP-A-0840624 ou EP-A-042200 7.

Além disso, o caprilato/ácido caprílico pode ser combinado ou substituído por heptanoato/ácido heptanóico para realizar os passos do processo de precipitação e incubação acima mencionados. 0 produto passível de obter pelo método da invenção é vírus inactivado. Os priões são inactivados/removidos também devido ao tratamento com caprilato. 5

As Figuras 1 e 2 representam organigramas de formas de realização particulares do processo da invenção.

Descrição detalhada da invenção A invenção refere-se a um método de preparar uma preparação purificada de anticorpos livre de vírus e inactivada contra vírus, a partir de uma solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes, o método compreendendo os passos de: (a) ajustar o pH da solução de partida para 4,6 a 4,95, em particular, para 4,8 a 4,95 para produzir uma solução intermediária; (b) adicionar iões caprilato e/ou heptanoato à solução intermediária e manter o pH a 4,8 a 4,95 pelo qual se forma um precipitado e os anticorpos estão essencialmente presentes no sobrenadante; (c) incubar a solução sobrenadante após uma segunda adição de iões caprilato e/ou heptanoato à mesma condição como no passo b) , filtração da solução resultante e, de um modo opcional, concentrar e diafiltrar a solução filtrada antes do ajuste de pH; (d) aplicar a solução filtrada a pelo menos uma resina de troca aniónica a um pH de 5,0 a 5,2 e, de um modo opcional, com duas resinas de troca aniónica diferentes sob condições que permitem a ligação de contaminantes à resina embora não permitam ligação significativa dos anticorpos à resina, em que é produzida uma preparação purificada de anticorpos livre de vírus e inactivada contra vírus. 6

Se forem realizadas duas cromatografias de troca aniónica, a segunda cromatograf ia pode ser realizada numa gama de pH de 6,7 a 6,9. De um modo opcional, os passos (b) e (c) podem ser repetidos, pelo menos, uma vez. 0 tratamento com caprilato a um pH 4,9 conduz a uma redução significativa de proteínas não desejadas.

Tipicamente, a solução de partida compreende anticorpos derivados de plasma.

Pode ser vantajoso contactar, no passo (d), a solução inactivada com duas resinas de troca aniónica diferentes sob condições tais que os contaminantes se ligam selectivamente às resinas enquanto os anticorpos não se ligam significativamente às resinas.

De um modo preferido, os anticorpos são do tipo imunoglobulina G.

Entre os dois passos de cromatografia de troca aniónica (AEX) o pH pode ser alterado, em particular, para 6,8 ± 0,1. O eluato de AEX pode ser concentrado a 60 a 90 mg/mL e diafiltrado contra e. g., tampão fosfato. Noutra forma de realização do método da invenção o eluato do primeiro AEX é tratado com detergente solvente, de um modo preferido, por Triton X-100 e TnBP, de um modo preferido, a concentrações de 1% de

Triton X-100 e 0,3% de TnBP durante 4,5 a 8 horas para inactivar vírus revestidos de lípidos. O método é conhecido como tratamento com detergente solvente e divulgado no documento EP-A-0131740 (incorporado por referência). De acordo com a invenção, os detergentes da mistura de incubação são, em particular, removidos por extracção de fase sólida e líquida. 7

Após extracção de fase sólida, o valor de pH da solução é ajustado para 6,7 a 6,9. A combinação do tratamento de S/D e inactivação de vírus com caprilato conduz a um produto mais seguro. A solução ajustada deste modo pode ser aplicada à segunda coluna de AEX em que o eluato de AEX pode ter pH ajustado para e. g., 3,5 a 4,5, em particular para 4,0 ± 0,1. De acordo com a invenção, a solução de IgG de pH ajustado é contactada por um filtro de vírus. Este passo opcional conduz, em combinação com o tratamento com caprilato, a maior segurança contra vírus. A solução de IgG pode também ser incubada a 37 °C ± 1 durante, pelo menos, 24 horas. De modo a melhorar a segurança contra vírus do produto de anticorpo, o tratamento com UV-C pode ser combinado com o tratamento de caprilato da fracção contendo anticorpo. Os métodos de inactivação, isolados ou em combinação, tais como tratamento com TnBP, tratamento com UV-C, filtração de virus ou aquecimento, podem ser combinados com o processo da invenção.

O método de acordo com a invenção pode ser combinado com métodos para remoção ou inactivação de priões e. g., métodos de filtração ou adsorção ou métodos cromatográficos como divulgados na técnica anterior e. g., documentos EP-A-0954528, Trejo, S.R. et al., Vox Sanguinis, (2003) 84, 176 - 187. A solução de IgG obtida de acordo com a invenção é concentrada devido à utilização terapêutica pretendida, tipicamente a concentrações de 5 ou 10% e a osmolaridade do concentrado é ajustada para 200 a 400 mOsmol/kg por um aditivo apropriado. No entanto, é possível qualquer outro valor desde que farmaceuticamente aceitável. Esses aditivos são bem conhecidos dos especialistas e incluem, mas não são limitados a açúcares, álcoois de açúcar e aminoácidos. A solução de IgG pode ter o pH ajustado para 3,5 a 6,0, em particular 4,0 a 5,5. Finalmente, a solução de IgG é filtrada estéril e cheia em garrafas de vidro ou recipientes plásticos. Em alternativa, o eluato após o primeiro ou segundo passo de AEX é aplicado a nanofiltros para atingir um produto ainda mais seguro. O processo da invenção é descrito em mais detalhe, de um modo preferido, realizado como indicado:

Como material de partida utilizou-se fracção de plasma humano I+II+III ou fracção II+III. Estas fracções foram produzidas como descrito por Cohn et al. (1946). O ajuste do pH durante o processo foi feito com ácido acético 1 M, NaOH 0,1 M ou HC1 0,3 M. Adicionou-se caprilato como uma solução mãe de caprilato de sódio 1 M. Esta solução mãe foi preparada dissolvendo 166 g de caprilato de sódio em 1 litro de água para injecções (WFI) e agitando até dissolução total de caprilato de sódio. A titulo exemplificativo, utilizou-se Triton X-100 e TnBP para o tratamento de SD. Para a remoção dos reagentes de SD utilizou-se óleos vegetais, tais como óleo de semente de soja ou óleo de rícino.

Todos os reagentes eram de grau USP ou melhor.

Utilizaram-se cromatografia de exclusão por tamanho quantitativa e ELISA para determinar a concentração de IgG. Fez-se HPLC analítica com um Sistema de HPLC Agilent com coluna TosoHaas G3000SW. 9 É mostrado um desenho esquemático do processo na figura 1. 0 processo inicia-se com a dissolução do precipitado de IgG, designado pasta, em água purificada. Normalmente, quanto maior o volume de água para reconstituir a pasta, maior é o rendimento de IgG. 0 pH da solução é ajustado para 4,60 a 4,95, de um modo preferido, para 4,90 com ácido acético 1 Μ. A solução é agitada durante várias horas para obter tanto IgG quanto possivel em solução. Depois disso, adiciona-se caprilato como uma solução mãe 1 M até concentrações entre 10 e 30 mM, de um modo preferido, caprilato 20 mM. O pH durante a adição de caprilato é mantido constante entre 4,80 e 4,95, de um modo preferido, a 4,90. Durante a incubação da solução de IgG com caprilato precipitam proteínas não IgG e lípidos. O precipitado formado é removido por filtração da solução de IgG. Após o primeiro passo de precipitação algumas impurezas permanecem na solução de IgG. Portanto, é necessário um segundo tratamento com caprilato. Tal como no primeiro passo, o caprilato é adicionado como uma solução mãe 1 M até uma concentração de, aproximadamente, caprilato 20 mM em solução a um pH constante entre 4,80 e 4,95, de um modo preferido, a 4,9. Após a incubação, o precipitado é removido por filtração ou centrifugação. Para um melhor desempenho durante a filtração, utiliza-se um auxiliar de filtro. A solução filtrada é ajustada para um pH entre 5,0 e 5,2, de um modo preferido, para 5,1 e aplicada a uma coluna de troca aniónica. Como uma coluna de troca aniónica, de um modo preferido, escolheram-se permutadores aniónicos fortes, tais como Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source Q 15 ou 30 (Amersham Biosience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q e Macro Prep High Q (Bio-Rad) , Q Hyper D (BioSepra) e Poros HQ (PerSeptive Biosystems). 10 A IgG escoa através da coluna sob as condições escolhidas, enquanto alguns aditivos/impurezas, tais como caprilato e IgA, se ligam à resina. A solução de proteína é carregada sobre a coluna numa razão de 40 para 120 mg, em particular de 40 a 90 mg de proteína por mL de resina. O eluato obtido é concentrado a uma concentração de proteína de 60 a 90 mg/mL, de um modo preferido, 70 mg/mL e diafiltrado contra 5 volumes de tampão fosfato com uma concentração de 5 a 20 mM, de um modo preferido, fosfato de sódio 10 mM. Como um passo de inactivação de vírus opcional, o tratamento de SD pode ser escolhido após a diafiltração. A solução diafiltrada é então inactivada por vírus utilizando o tratamento de SD descrito por Horowitz e. g., no documento EP-A-0131740. Como reagentes de SD utilizaram-se TnBP e Triton X-100. Após agitação, a solução é incubada até 8 horas a uma temperatura entre 4 e 10 °C. Em seguida, um óleo vegetal, tais como óleo de semente de soja ou óleo de ricino, de um modo preferido, óleo de ricino, adiciona-se à solução até uma concentração de 3 a 5 % (p/p) . Após a separação da fase oleosa da fase aquosa, a fase aquosa é filtrada. Portanto, utiliza-se um filtro de profundidade apropriado. Os exemplos para estes filtros são Polysep II (Millipore), Sartofine PP e Sartobran P (Sartorius). A subsequente extracção de fase sólida é realizada, num modo preferido, utilizando meios de suporte hidrófobo que são também utilizados em cromatografia de fase inversa com uma matriz de gel feita de sílica, estireno-co-divinilbenzeno (SDVB), glicidilo metacrilato-co-etileno dimetacrilato ou poliaromático. Os exemplos para estes meios são pBondapak (Waters), Amberchrom CG-161 M e S, Amberchrom CG-070 (Tosoh Biosep), PLRP-S (Polymer Laboratories), RPC-1 e Toyopearl Hexyl 650C (Tosoh Biosep), Source 15 RPC (Amersham Biosiences), LiChroprep Si60 (Merck), Chromabond Sorbent HR-P e EASY (Machery-Nagel), ProntoSORB SPE (Bischoff Chrom.). A solução de 11 proteína é carregada sobre a coluna numa razão de 0,5 para 1,5 mg/mL de resina seca. O eluato da extracção de fase sólida (ou passo de cromatografia, respectivamente) é tratado com UVC e, em seguida, ajustado para um pH entre 6,7 e 6,9, de um modo preferido, 6,8 pela adição de NaOH 0,1 M a uma temperatura entre 4 e 10 °C. Depois disso, a solução de IgG é aplicada a uma segunda coluna de troca aniónica. A IgG escoa não retida através da coluna, enquanto as impurezas e polímeros se ligam à coluna. Como uma coluna de troca aniónica, de um modo preferido, escolheram-se permutadores aniónicos fortes, tais como Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source Q 15 ou 30 (Amersham Biosience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q e Macro Prep High Q (Bio-Rad), Q Hyper D (BioSepra) e Poros HQ (PerSeptive Biosystems). A coluna é equilibrada com um tampão de fosfato de sódio 10 mM. Após a aplicação da solução de IgG, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio para obter toda a IgG não ligada da coluna. A solução de proteína é carregada sobre a coluna numa razão de 120 para 300 mg de proteína/mL de resina. A solução de IgG recolhida é ajustada para um pH entre 3,9 e 4,1, de um modo preferido, 4,0 com HC1 0,3 M a uma temperatura entre 4 e 10 °C. Em seguida, a solução é filtrada estéril e armazenada a 37 °C durante, pelo menos, 24 horas. A seguir ao tratamento a pH baixo, o pH da solução é ajustado para 4,7 com NaOH 0,1 M a uma temperatura entre 4 e 10 °C. Como um passo de redução de vírus adicional podem ser utilizados filtros de vírus apropriados. Para filtração de vírus a solução de IgG foi filtrada através de um filtro de 0,1 pm seguida por filtros de vírus com um tamanho de poro entre 200 e 15 nm. Os exemplos para estes filtros são DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore) , Planova 75, 35, 20, 15N (Asahi Kasei Pharma). Igualmente, pode ser utilizado um filtro de profundidade carregado, tipo Zeta Plus VR (Cuno) . 12

Este passo de filtração pode ser também aplicado após incubação a pH 4. De um modo preferido, este passo será implementado no processo antes do tratamento a pH baixo. A solução de IgG altamente purificada é diafiltrada e concentrada para os valores de formulação final. Como concentrações finais para uma proteína de formulação líquida escolheram-se concentrações de 5 ou 10% (p/v). Após a concentração, a osmolaridade é ajustada para ser compatível para injecção intravenosa por um aditivo apropriado. Podem ser utilizados açúcares, álcoois de açúcar e aminoácidos. O pH é novamente verificado e ajustado para 4,5 a 5,0, de um modo preferido para 4,7. Subsequentemente, realiza-se outra filtração estéril e a solução é cheia para garrafas de infusão.

Os exemplos seguintes explicam o processo da invenção em maior detalhe:

Exemplo 1:

Dissolveu-se a fracção de Cohn I+II+III ou II+III em 12 volumes de água, ajustou-se o pH para 4,9 com ácido acético 1 M e agitou-se a solução durante 5 horas até a maioria da IgG estar dissolvida a uma temperatura de 2 a 8 °C. Depois disso, adicionou-se caprilato como uma solução mãe caprilato de sódio 1 M à solução de IgG até uma concentração de caprilato 20 mM enquanto se mantém o pH constante a 4,9 adicionando ácido acético 1 M. Esta solução foi agitada durante uma hora. Os lípidos e impurezas precipitaram sob estas condições e foram removidos por filtração. Depois disso, adicionou-se novamente caprilato à solução até uma concentração de 20 mM em solução mediante manutenção de pH constante a 4,9. Gerou-se novamente um 13 precipitado e removeu-se por filtração. Obteve-se uma solução límpida após a filtração. A solução foi ajustada para um pH de 5,1 com NaOH 0,1 Ma uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada à coluna Source Q 30. A solução de IgG escoou através da coluna enquanto as impurezas e caprilato se ligaram à coluna. A solução de IgG recolhida foi concentrada para uma concentração de proteína de 70 mg/mL e diafiltrada contra 5 volumes de um tampão fosfato pH 5,1. Subsequentemente, adicionaram-se 0,3% (p/p) de

TnBP e 1% (p/p) de Triton X-100 à solução, seguida por agitação vigorosa. Após, pelo menos, 4,5 horas de agitação a 7 ± 3 °C, adiciona-se 5% (p/p) de óleo de rícino. A extracção de óleo realizou-se à temperatura ambiente. As fases oleosa e aquosa foram separadas e a fase aquosa foi filtrada com um filtro

Millipore Opticap Polysep. A solução filtrada foi aplicada a uma coluna cheia com uma matriz de fase inversa designada pBondapak (Waters) . Em seguida, a solução foi ajustada para pH de 6,8 com NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C e aplicada a um permutador aniónico forte, nomeadamente Q-Sepharose-XL. A IgG atravessou a coluna enquanto as impurezas se ligaram à coluna. O pH da solução de IgG recolhida foi ajustado para 4,7 com

NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C. Realizou-se novamente uma ultrafiltração para ajustar a concentração de proteína à concentração final de 50 ou 100 mg/mL, seguida pela adição de maltose a uma gama de concentração de 2 a 10% (peso), de um modo preferido, 8% ou glicina numa gama de concentração de 0,1 a 0,5 M, em particular, 0,1 a 0,3, de um modo preferido, 0,3 M, em particular 0,2. Subsequentemente à seguinte filtração estéril, a solução foi cheia em garrafas de infusão esterilizadas e siliconizadas com diferentes volumes (50, 100, 200 mL). As garrafas foram vedadas por rolhas. 14

Exemplo 2:

Este exemplo, em particular, difere do exemplo 1 pela implementação de um passo de incubação a pH 4. Dissolveu-se a fracção de Cohn I+II+III ou II+III em 12 volumes de água, ajustou-se o pH para 4,9 com ácido acético 1 M e agitou-se a solução durante 5 horas até a maioria da IgG estar dissolvida a uma temperatura de 2 a 8 °C. Depois disso, adicionou-se caprilato como uma solução mãe de caprilato de sódio 1 M à solução de IgG até uma concentração de caprilato 20 mM em solução e manteve-se o pH constante a 4,9 adicionando ácido acético 1 M. Esta solução foi agitada durante uma hora. Os lipidos e impurezas precipitaram sob estas circunstâncias e foram removidos por filtração. Depois disso, adicionou-se novamente caprilato à solução até uma concentração de 20 mM mediante manutenção do pH constante a 4,9. Novamente, o precipitado formado foi removido por filtração. Obteve-se uma solução límpida após a filtração. A solução de IgG recolhida foi concentrada a uma concentração de proteína de 70 mg/mL e diafiltrada contra 5 volumes de um tampão fosfato pH 5, 1. A solução foi ajustada para um PH de 5, 1 com NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C e aplicada ao permutador aniónico forte Q-Sepharose-XL. A IgG escoou através da coluna enquanto as impurezas e caprilato se ligaram à coluna. Subsequentemente, adicionaram-se 0,3% (p/p) de TnBP e 1% (p/p) de Triton X-100 à solução, seguida por agitação vigorosa. Após, pelo menos, 4,5 horas de agitação a 4 a 10 °C, adicionou-se 5% (p/p) de óleo de rícino. A extracção de óleo realizou-se à temperatura ambiente. As fases oleosa e aquosa foram separadas e a fase aquosa foi filtrada com um filtro Millipore Opticap Polysep. A solução filtrada foi aplicada a uma coluna cheia com Amberchrom CG-161M. Em seguida, a solução foi ajustada para pH de 6,8 com 15

NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C e aplicada ao permutador aniónico forte Q-Hyper D. A IgG escoou através da coluna enquanto as impurezas se ligaram à coluna. O pH da solução de IgG recolhida foi ajustado para 4,0 com HC1 0,3 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C. A solução foi filtrada estéril e armazenada a 37 ± 3 °C durante, pelo menos, 24 horas. Depois disso, o pH da solução foi ajustado para 4,7 com NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C. Realizou-se novamente uma ultrafiltração para ajustar a concentração de proteína à concentração final de 50 ou 100 mg/mL a ser obtida após formulação com maltose ou glicina. Subsequentemente à seguinte filtração estéril, a solução foi cheia em garrafas de infusão esterilizadas e siliconizadas com diferentes volumes (50, 100, 200 mL). As garrafas foram vedadas por rolhas.

Exemplo 3:

Este exemplo, em particular, difere das amostras anteriores por concentração da solução de IgG a concentração de proteína de 70 mg/mL antes do primeiro passo de AEX e por implementação de um passo de nanofiltração.

Dissolveu-se a fracção de Cohn I+II+III ou II+III em 12 volumes de água, ajustou-se o pH para 4,9 com ácido acético 1 M e agitou-se a solução durante 5 horas até a maioria da IgG estar dissolvida a uma temperatura de 2 a 8 °C. Depois disso, adicionou-se caprilato como uma solução mãe de caprilato de sódio 1 M à solução até uma concentração de caprilato 20 mM em solução e manteve-se o pH constante a 4,9 adicionando ácido acético 1 M. Esta solução foi agitada durante uma hora. Os lípidos e impurezas precipitaram sob estas condições e foram 16 removidos por filtração. Depois disso, adicionou-se novamente caprilato à solução até uma concentração de 20 mM mediante manutenção do pH constante a 4,9. Gerou-se novamente um precipitado e removeu-se por filtração. Obteve-se uma solução limpida após a filtração. A solução de IgG recolhida foi concentrada para uma concentração de proteína de 70 mg/mL e diafiltrada contra 5 volumes de um tampão fosfato pH 5,1. A solução foi ajustada para um pH de 5,1 com NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C e aplicada a um permutador aniónico forte. A IgG escoou através da coluna enquanto as impurezas e caprilato se ligaram à coluna. Em seguida, a solução foi ajustada para pH de 6,8 com NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C e aplicada a um segundo permutador aniónico forte. A IgG passou através da coluna enquanto as impurezas se ligaram à coluna. O pH da solução de IgG recolhida foi ajustado para 4,0 com HC1 0,3 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C. A solução foi filtrada através de um filtro de 0,1 pm, depois disso utilizaram-se uma cascata de filtros PALL para nanofiltração, nomeadamente PALL DVD, DV 50 e DV 20 com um tamanho de poro a iniciar abaixo de 20 nm. A solução nanofiltrada é armazenada a 37 ± 3 °C durante, pelo menos, 24 horas. Depois disso, o pH da solução foi ajustado para 4,7 com NaOH 0,1 M a uma temperatura de 7 ± 3 °C. Realizou-se novamente uma ultraf iltração para ajustar a concentração de proteína à concentração final de 50 ou 100 mg/mL a ser obtida após formulação com maltose ou glicina pela adição de maltose ou glicina. Subsequentemente à seguinte filtração estéril, a solução foi cheia em garrafas de infusão esterilizadas e siliconizadas com diferentes volumes (50, 100, 200 mL). As garrafas foram vedadas por rolhas. 17

Exemplos Comparativos Método da invenção

Reconstituíram-se aprox. 310 g de Fracção I+II+III (incluindo auxiliares de filtro) em 12 volumes de WFI calculados do peso teórico da fracção I+II+III sem auxiliares de filtro. A solução é agitada durante 1 hora a 5 °C. Em seguida, o pH é ajustado para 4,9 ± 0,1 (ca. 950 g). A reconstituição é continuada durante 2 horas a 5 °C. Em seguida, a amostra "Fracção I+II+III reconstituída" é extraída. Adiciona-se uma solução de caprilato 1 molar para atingir uma concentração de 20 mM. O pH é mantido constante a 4,9. A solução é incubada durante 1 hora a 5 °C. A solução é filtrada sobre um filtro de profundidade e uma folha de papel a 5 °C (ca. 1050 g) . O filtro é depois lavado com uma solução de cloreto de sódio 10 mM. O filtrado é aquecido até 25 °C, adiciona-se o caprilato 1 molar para atingir uma concentração adicional 10 mM. A solução é incubada durante 1 hora a 25 °C. A solução é centrifugada e o sobrenadante é filtrado sobre um filtro (1110 g) possuindo um tamanho de poro de 1 pm e 0,5 pm. A amostra "após caprilato" é extraída.

De acordo com o documento EP 0893450

Reconstituíram-se aprox. 310 g de Fracção I+II+III (incluindo auxiliares de filtro) em 7 volumes de WFI calculados do peso teórico da fracção I+II+III sem auxiliares de filtro. A solução é agitada durante 1 hora a 5 °C. O pH é ajustado para 4,1 ± 0,1. A reconstituição é continuada durante 2 horas a 5 °C. Em seguida, a amostra "Fr. I+II+III rec." é extraída. 18

Adiciona-se uma solução de caprilato 1 molar para atingir uma concentração de 20 mM. O pH altera-se para 4,9 mediante adição de caprilato e é ajustado para 5,1. A solução é incubada durante 1 hora a 5 °C. A solução é filtrada sobre um filtro de profundidade e uma folha de papel a 5 °C. O filtro é depois lavado com uma solução de cloreto de sódio 10 mM (ca. 1050 g). O filtrado é aguecido até 25 °C, adiciona-se o caprilato 1 molar para atingir uma concentração adicional 10 mMolar. A solução é incubada durante 1 hora a 25 °C. A solução é centrifugada e o sobrenadante é filtrado sobre um filtro de 0,45 pm (ca. 1110 g). A amostra "após caprilato" é extraída.

Diminuição de albumina e IgA pH 4, 9 Invenção 5,1 Documento EP 0893450 Experiência Amostras Albumina Albumina [pg/mg IgG] [pg/mg IgG] 1 Fr. I+II+III rec. 27,1 32,9 após caprilato 0,2 10,2 2 Fr. I+II+III rec. 44,2 32,6 após caprilato 0,2 2,2 3 Fr. I+II+III rec. 30,2 31,2 após caprilato 0,8 9,9 4 Fr. I+II+III rec. 22, 7 33,1 após caprilato 0,9 10, 7 média de Fr. I+II+III rec. 31,1 32,5 desv. pad. de Fr. I+II+III rec. 9,3 0,9 média de após caprilato 0,5 8,3 desv. pad. de após caprilato 0,4 4,0 19 pH 4,9 Invenção 5,1 Documento EP 0893450 Experiência Amostras IgA IgA [pg/mg IgG] [pg/mg IgG] 1 Fr. I+II+III rec. 86 106 após caprilato 40, 9 49,3 2 Fr. I+II+III rec. 74,3 120, 7 após caprilato 23, 7 60,5 3 Fr. I+II+III rec. 88,5 114 após caprilato 30,8 56,9 4 Fr. I+II+III rec. 115,5 113,6 após caprilato 34, 4 51,3 média de Fr. I+II+III rec. 91, 1 113,6 desv. pad. de Fr. I+II+III rec. 17,4 6,0 média de após caprilato 32,5 54,5 desv. pad. de após caprilato 7,2 5, 1

Lisboa, 14 de Maio de 2013 20

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparar uma preparação purificada de anticorpos livre de vírus e inactivada contra vírus, a partir de uma solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes, compreendendo o método os passos de: (a) ajustar o pH da solução de partida para 4,6 a 4,95, em particular para 4,8 a 4,95 para produzir uma solução intermediária; (b) adicionar iões caprilato e/ou heptanoato à solução intermediária e manter o pH a 4,8 a 4,95, pelo qual se forma um precipitado e os anticorpos estão presentes no sobrenadante; (c) incubar a solução sobrenadante após uma segunda adição de iões caprilato e/ou heptanoato nas mesmas condições como no passo b), filtração da solução resultante e, de um modo opcional, concentrar e diafiltrar a solução filtrada antes do ajuste de pH; (d) aplicar a solução filtrada a pelo menos uma resina de troca aniónica a um pH de 5,0 a 5,2 e, de um modo opcional, com duas resinas de troca aniónica diferentes, ligação de contaminantes à resina enquanto não é possível a ligação dos anticorpos à resina, em que é produzida uma preparação purificada de anticorpos livre de vírus e inactivada contra vírus. 1
2. Método da reivindicação 1, em que é realizada uma segunda cromatograf ia de troca aniónica numa gama de pH de 6,7 a 6,9.
3. Método das reivindicações 1 e/ou 2, em que os passos (b) e (c) são repetidos, pelo menos, uma vez.
4. Método das reivindicações 1 a 3, em que a solução de partida compreende anticorpos derivados de plasma.
5. Método das reivindicações 1 a 4, em que, no passo (d), a solução inactivada é contactada com duas resinas de troca aniónica diferentes, de modo que os contaminantes se ligam selectivamente às resinas enquanto os anticorpos não se ligam às resinas.
6. Método das reivindicações 1 a 5, em que os anticorpos são imunoglobulina G.
7. Método da reivindicação 5, em que o pH é ajustado para pH 6,8 ± 0,1 antes da segunda cromatografia de troca aniónica.
8. Método das reivindicações 1 a 7, em que o eluato de cromatografia de troca aniónica é concentrado a 60 a 90 mg/mL e diafiltrado contra uma solução tampão, de um modo preferido, um tampão fosfato.
9. Método das reivindicações 1 a 8, em que o eluato da primeira cromatografia de troca aniónica é tratado com detergente solvente, de um modo preferido, por Triton X-100 e TnBP, de um modo muito preferido por concentrações de 2 Triton X—10 0 a 1% e TnBP a 0,3% durante 4,5 a 8 horas para inactivar vírus revestidos por lípidos.
10. Método da reivindicação 9, do qual os detergentes da mistura de incubação são removidos por extracção de fase sólida e líquida.
11. Método de, pelo menos, qualquer das reivindicações 1 a 10, em que pelo menos um dos métodos seleccionados do grupo consistindo de tratamento com UV-C, tratamento por calor, filtração de vírus e remoção ou inactivação de prião é combinado com um tratamento de caprilato da reivindicação 1.
12. Método da reivindicação 10, em que o valor de pH mediante extracção de fase sólida é ajustado para 6,7 a 6,9.
13. Método da reivindicação 12, em que a solução é submetida à segunda cromatografia de troca aniónica.
14. Método da reivindicação 13, em que o valor de pH do eluato de troca aniónico é ajustado para 3,5 a 4,5, de um modo preferido, para pH 4,0 ± 0,1.
15. Método da reivindicação i—1 em que a solução de IgG é contactada por um filtro de vírus.
16. Método da reivindicação i—1 em que a solução de IgG é contactada por um nanofiltro.
17. Método da reivindicação 14, em que a solução de IgG é incubada durante, pelo menos, 24 horas, de um modo 3 preferido, a 37 °C ± 1.
18. Método da reivindicação 14, em que a solução de IgG é concentrada a 5 ou 10%.
19. Método da reivindicação 18, em que a osmolaridade do concentrado é ajustada para 200 a 400 mOsmol/kg.
20. Método da reivindicação 19, em que o pH da solução de IgG é ajustado para 3,5 a 6,0, preferido para um valor de pH de 4,0 a 5,5.
21. Método da reivindicação 20 em que a solução de IgG é filtrada estéril e cheia em garrafas de vidro ou recipientes de plástico. Lisboa, 14 de Maio de 2013 4