ES2596407T3

ES2596407T3 - Método para la producción de formulaciones inyectables de productos proteicos hemoderivados y productos obtenidos utilizando dicho método

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Publication number: ES2596407T3
Application number: ES11863087.0T
Authority: ES
Inventors: Alvaro SEGURA RUIZ; Mariángela VARGAS ARROYO; Guillermo LEON MONTERO; Mauren VILLALTA ARRIETA; María HERRERA VEGA; Yamileth ANGULO UGALDE
Original assignee: Universidad de Costa Rica
Current assignee: Universidad de Costa Rica
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2017-01-09
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: CA2832665A1; CN103476786B; AU2011364724A1; AU2011364724B2; CA2832665C; MX2013011743A; MX340349B; WO2012136172A1; US20140121357A1; US10562958B2; EP2719704B1; EP2719704A4; CN103476786A; HUE029232T2; EP2719704A1

Abstract

Un método para producir formulaciones farmacéuticas de calidad inyectable de productos proteicos hemoderivados, que comprende los pasos de fraccionamiento del material de partida en un sistema de dos fases acuosas polímero-sal en presencia de fenol, purificación de la fase superior del sistema, mediante precipitación con ácido caprílico y la purificación de la fase inferior mediante termocoagulación, incremento de la pureza de los productos en ambas fases mediante cromatografía, remoción de partículas virales por nanofiltración de ambas preparaciones, y la formulación, estabilización y envase de los productos así obtenidos.

Description

Método para la producción de formulaciones inyectables de productos proteicos hemoderivados y productos obtenidos utilizando dicho método

Campo técnico

La presente invención se relaciona con el campo de la purificación de proteínas terapéuticas, particularmente con un método para la producción de formulaciones inyectables de productos proteicos hemoderivados, tales como inmunoglobulinas y/o albúmina.

Antecedentes de la invención

Los productos derivados de plasma sanguíneo tales como albúmina humana, inmunoglobulinas humanas y antivenenos heterólogos, son medicamentos importantes en el tratamiento de diversas enfermedades, accidentes y lesiones. Debido al aumento de la demanda actual de estos productos, es importante mejorar la eficiencia de los métodos de producción de los mismos, para poder abastecer adecuadamente dicha demanda, y de esta manera prevenir que a corto plazo se presente una escasez global de estos medicamentos.

Para la obtención de productos proteicos derivados de la sangre, y particularmente del plasma, existen vanos métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Entre ellos se encuentran:

1. Fraccionamiento de plasma

El fraccionamiento de plasma por la técnica de Cohn (fraccionamiento alcohólico en frío) es el método más extendido y utilizado por la industria de los productos biológicos derivados del plasma (ver Cohn E.J., Strong L.E., Hughes W.L., Mulford D.J., Ashworth J.N., Melin M., Taylor H.L. 1946. "Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissue and fluids", Journal of the American Chemical Society, 68: 459-475). Para mejorar los aspectos relacionados con el costo de producción y el rendimiento de la técnica original, varios investigadores han propuesto modificaciones que emplean menos reactivos o suprimen etapas en el proceso (ver Hink J., Hidalgo J., Seeberg V., Johnson F.F. 1957. "Preparation and properties of aheat-treated human plasma protein fraction". Vox Sanguinis 2: 174-186; Kistler, P, Nitschmann, H. 1962. "Large Scale Production of Human Plasma Fractions", Vox Sanguinis 7: 414-424; Schneider, W., Wolter, D., McCarty, L. 1976. "Alternatives for Plasma Fractionation". Vox Sanguinis, (31) 2: 141-151). Por otra parte, otras modificaciones sugieren la incorporación de técnicas de purificación basadas en el uso de agentes precipitantes, uno o más pasos cromatográficos

o una combinación de los mismos. Dentro de los agentes precipitantes comúnmente empleados se encuentran el sulfato de amonio, el polietilenglicol y el ácido caprílico.

2. Fraccionamiento de plasma mediante sistemas de dos fases acuosas (SDFA).

Se ha reportado el uso de los sistemas de dos fases acuosas (SDFA) para la recuperación primaria y fraccionamiento de compuestos de interés con alto valor comercial. Los SDFA se componen por mezclas de polímero-polímero, polímero-sal

o alcohol-sal, y se han empleado en la recuperación primaria y purificación parcial de productos biológicos tales como proteínas, material genético, células u organelos de las mismas, compuestos orgánicos como aromas y colorantes, metales pesados y algunos fármacos (ver Benavides, J., Rito-Palomares, . 2008. "Review: Practical experiences from the development of aqueous two-phase processes for the recovery of high value biological producís". J Chem Technol Biotechnol 3:133-142; Huddleston, J., A. Veide, K. Kóhler, J. Flanagan, S-0. Enfors and A. Lyddiat. 991. "The molecular basis of partitioning in aqueous two-phase systems". Tibtech 9:381-388).

La patente US 4,684,723 presenta un método para separar el inhibidor de la alfa-1-proteinasa de otras proteínas y ácidos nucléicos presentes en el plasma o en medio de cultivo mediante el uso de SDFA. Asimismo, existe una solicitud de patente, publicación WO 2010/062244A1 , que propone la recuperación y purificación parcial de proteínas terapéuticas, específicamente anticuerpos monoclonales, en dos etapas de extracción en SDFA. En la primera etapa, los anticuerpos se particionan hacia la fase superior, y en la segunda se precipitan en dicha fase. Posteriormente, son recuperados y re-disueltos para su posterior purificación mediante cromatografía. En otra invención (solicitud número US 2010/0179252) se propone el uso de un sistema multifásico compuesto por dos tipos de polímeros, uno ácido y el otro etérico, y al menos una sal, para la separación de biomoléculas, células o partículas. Adicionalmente, en la solicitud de patente WO 2010/080062 se presenta un método para aislar biomoléculas en SDFA polímero-sal, donde la molécula de interés, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, se particiona hacia la fase que no es rica en el polímero. Adicionalmente, existen estudios sobre las condiciones de partición, extracción y purificación de anticuerpos en SDFA (ver Andrews, B.A., Nielsen, S., Asenjo, J.A. 2007, "Partinioning and purification of monoclonal antibodies in aqueous two-phase systems",

Bioseparation 6 (5): 303-313; Azevedo, A., Rosa, P., Ferreira, F. Aires-Barros, M. 2007, "Optimisation of aqueous twophase extraction of human antibodies", J. Biotechnology 132(2): 209-217; y Rosa, P., Azevedo, A., Sommerfeld, S., Mutter, M, Aires-Barros, M., Bácker, W. 2009, "Application of aqueous two-phase systems to antibody purification: A multi-phase approach", J. Biotechnology 139 (4):306-313).

Por otra parte, se han publicado trabajos sobre la partición de albúmina en este tipo de sistemas, con respecto a variables como pH, temperatura, y tipo y concentración del polímero y las sales, (ver Gündüz, U. 2000. "Partitioning of bovine serum albumin in an aqueous two-phase system: optimization of partition coefficient", Journal of Chromatography

B: Biomedical Sciences and Applications, 743 (1-2): 259-262.; Farruggia, B., Nerli, B., Picó, G. 2003. "Study of the serum albumin-polyethyleneglycol interaction to predict the protein partitioning in aqueous two-phase systems". Journal of Chromatography B, 798 (1): 25-33; Lu,Y., Yang, Y., Zhao.X., Xia, C. 2010 "Bovine serum albumin partitioning in polyethylene glycol (PEG)/potassium citrate aqueous two-phase systems". Food and Bioproducts Processing. 88(1): 4046; Garza, M., Rito, M., Serna, S., Benavides, J. 2010. "Potential of Aqueous Two-Phase Systems constructed on flexible devices: Human serum albumin as proof of concept". Process Biochemistry 45 (7): 1082-1087).

3. Purificación de inmunoglobulinas mediante precipitación con ácido caprílico

La técnica de purificación de inmunoglobulinas por precipitación con ácido caprílico fue introducida por primera vez porSteinbuch, M., Audran, R., 1969. "The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid". Arch. Biochem. Biophysics 134, 279-284. Posteriormente, surgieron varias metodologías basadas en este principio. Por ejemplo, la patente US 4,164,495 (Hansen, 1979) emplea la precipitación de proteínas con 1-8% v/v de PEG y 0.1-5% v/v de ácido caprílico. En la patente US 5,075,425 (Kotitschke ef al., 1991) se precipitan proteínas contaminantes con ácido caprílico al 2.5%, seguido por una adsorción en DEAE-Sephadex. De manera similar, la solicitud de patente WO2006064373 (Bloy et al., 2006) propone el uso de ácido caprílico al 2.5% para precipitar proteínas contaminantes. Asimismo, la patente US6955917 (Alred, et al., 2003) propone el uso de una solución de caprilato al 40% (15-50 mM, preferiblemente 20 mM) para la eliminación de proteínas contaminantes e inactivación viral del producto, seguido por una cromatografía de intercambio iónico. Dicho proceso, es similar al presentado por la solicitud de patente WO200508293 (Romisch, et al., 2005), en la que una solución de caprilato o de heptanoato se aplica con el mismo fin.

Finalmente, existen patentes que proponen el uso del ácido caprílico con otras finalidades. La patente US 5,164,487 (Kothe, et al., 1992), en la cual el ácido caprílico, a una concentración entre 0.4 y 1.5%, se emplea para eliminar sustancias vasoactivas y enzimas proteolíticas, seguido por una cromatografía de intercambio iónico; y la patente US 20070244305 (Parkinnen, 2007) que presenta la precipitación de proteínas contaminantes con PEG, y utiliza el ácido caprílico como un paso para la inactivación de los virus.

La mayoría de las metodologías propuestas en dichas patentes poseen rendimientos alrededor del 60%, y parten de una etapa inicial de fraccionamiento alcohólico en frío.

4. Purificación de Albúmina

En el caso de la albúmina, la desnaturalización térmica diferencial o termocoagulación selectiva es un método empleado para su purificación a partir del plasma o una mezcla de proteínas que la contenga. La patente US 4,156,681 propone el calentamiento del plasma a 68 °C en presencia de etanol y caprilato de sodio, seguido por la adición de PEG para recuperar la albúmina precipitada. De manera similar, en la patente US 3,992,367 se calienta el plasma a 60 °C, y posteriormente se precipita la albúmina con etanol. En otra invención (US 4,222, 934) el plasma se calienta a 60 °C, se adiciona PEG para eliminar el precipitado de proteínas desnaturalizadas, y la albúmina se recupera mediante precipitación isoeléctrica. Por otra parte, en la patente US 4,177,188 las inmunoglobulinas se recuperan previo al tratamiento térmico.

Por lo tanto, existen procesos que parten de plasma, suero, alguna fracción del método de Cohn u otro material de partida que contenga albúmina y/o inmunoglobulinas para la recuperación de las mismas, y que posteriormente emplean la termocoagulación selectiva y la precipitación con ácido caprílico para purificar albúmina e inmunoglobulinas, respectivamente. Sin embargo, hasta la fecha no se ha reportado el empleo de estas técnicas de purificación a partir de fracciones provenientes de un sistema de dos fases acuosas (SDFA).

La presente invención supera las limitaciones del estado de la técnica, ya que presenta una línea de producción para obtener formulaciones inyectables de productos proteicos hemoderivados con carga viral reducida para uso humano, un aspecto de suma trascendencia que no ha sido descrito en el estado de la técnica con respecto a la obtención de inmunoglobulinas y albúmina empleando los SDFA.

Sumario de la Invención

Un objeto de la presente invención es un método para la producción de formulaciones inyectables de productos proteicos hemoderivados con carga viral reducida, cuyo método comprende los pasos de (Figuras 1 y 4):

a.: fraccionamiento del material de partida en un sistema de dos fases acuosas mediante la adición de un polímero y al menos una sal;

b.: adición de fenol al sistema de dos fases acuosas como primer paso de inactivación viral;

c.: separación de las fases superior e inferior del sistema de dos fases acuosas;

d.: purificación de los productos contenidos en la fase superior del sistema mediante precipitación con un ácido graso;

e.: purificación de los productos contenidos en la fase inferior del sistema mediante termocoagulación;

f.: remoción del precipitado de proteínas desnaturalizadas formado durante los pasos de purificación de las fase superior e inferior del sistema de dos fases;

g.: aumento de la pureza de los productos purificados a partir de la fase superior e inferior mediante cromatografía;

h.: nanofiltración de los productos obtenidos en el paso anterior para remover partículas virales;

i.: formulación, estabilización y esterilización de los productos obtenidos.

El método de la invención puede llevarse a cabo partiendo de un material que puede seleccionarse a partir del grupo que consiste de plasma sanguíneo, suero sanguíneo, una fracción obtenida por el método de Cohn u otro material cualquiera que contenga productos proteicos hemoderivados, particularmente albúmina y/o inmunoglobulinas.

Inicialmente, se lleva a cabo el fraccionamiento del material de partida en un sistema compuesto de dos fases acuosas. Para ello, se procede a la adición de un polímero y una sal, siendo el polímero de elección el polietilenglicol con peso molecular entre 1000-6000 Da, y preferiblemente polietilenglicol de 3350 Da, el cual se emplea a una concentración en el rango entre el 6 y el 15 % p/v, y preferiblemente entre el 6 y 9 % p/v.

La sal que se utiliza en el fraccionamiento puede ser fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, sulfato de amonio y citrato de sodio, siendo utilizados de preferencia el fosfato de potasio monobásico y dibásico, a concentraciones entre el 10 y el 20% p/v, y preferiblemente entre 15 y 20% p/v.

Adicionalmente, se emplea una sal que no participa en la formación de las dos fases, pero que influye en la partición de los solutos en el sistema, preferiblemente se utiliza el cloruro de sodio, a una concentración entre el 5 y el 20% p/v, de forma preferida entre el 12 y 15% p/v.

Este paso de fraccionamiento se realiza a un pH entre 5.5 y 7.5, y de forma preferida a un pH de 6, y se realiza a temperatura ambiente (entre 20-25°C).

Como primer paso de inactivación viral, el método de la invención emplea fenol entre el 0.05 y 0.3% v/v, en una realización preferida utiliza el fenol al 0.25% v/v.

Luego de la inactivación viral, se procede a la separación de las fases superior e inferior del sistema de dos fases acuosas mediante una combinación de procesos seleccionada que puede ser: reposo y separación, reposo y filtración, reposo y decantación o simplemente centrifugación.

El siguiente paso es la purificación de los productos contenidos en la fase superior del SDFA obtenido. Esta fase es rica en inmunoglobulinas, y para su purificación se lleva a cabo una precipitación con ácido caprílico, este último a una concentración entre el 1 y 6% v/v, y de forma preferida a una concentración entre el 1.5 y el 2% v/v.

Asimismo, se realiza una termocoagulacion para la purificación de los productos que se encuentran en la fase inferior del sistema, la cual es rica en albúmina. Este proceso se lleva a cabo a una temperatura entre 60 y 70°C, y preferiblemente a 65 °C. Esta operación se lleva a cabo en presencia de caprilato de sodio al 0.012 M y etanol al 9% v/v.

Para aumentar la pureza de los productos obtenidos en la fase superior del sistema, se emplea un paso cromatografía) que puede comprender una cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio hidrofóbico. Por su parte, la etapa final de purificación de los productos obtenidos en la fase inferior del sistema, se lleva a cabo empleando cromatografía de intercambio iónico.

La remoción de las partículas virales de los productos obtenidos como resultado del proceso de la invención, se lleva a cabo mediante nanofiltración, empleando para ello un filtro con exclusión para 20 nm. Los productos se pueden estabilizar con agentes como sacarosa y caprilato de sodio para la solución de inmunoglobulinas y albúmina,

respectivamente. La formulación de inmunoglobulinas puede mantenerse en solución o liofilizarse. En el caso de la albúmina se incluye un paso final de pasteurización durante 10 horas a 60 °C. Finalmente, los productos obtenidos se esterilizan a través de una membrana con exclusión para 0.22 mm.

Otros objetos de la presente invención son los productos obtenidos mediante el método previamente descrito. Tanto las inmunoglobulinas como la albúmina obtenidas en realizaciones preferidas de la invención, son productos que muestran calidad de solución inyectable, y poseen la carga viral reducida acorde con las especificaciones establecidas (WHO, 2010. Guidelines for the Production, Control and Regulation of Snake Antivenom Immunoglobulins; WHO, 2004. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products).

Breve descripción de las figuras

FIG. 1. Diagrama de flujo que representa el método de la invención para obtener productos proteicos derivados de plasma equino hiperinmune, libres de virus. Se presenta el valor de rendimiento y pureza de los productos obtenidos en cada etapa del proceso. Las operaciones con asterisco muestran pasos de inactivación o remoción viral. Clave: Igs = Inmunoglobulinas, AV = antiveneno.

FIG. 2. Filtración en gel de muestras del método propuesto en la invención para la obtención de antiveneno a partir de plasma equino hiperinmune. Se empleó una columna Superdex 200 10/300 GL, la elución se realizó con un amortiguador de NaCI 150 mM, Tris-HCI 20 mM, pH 7.5. A. Plasma equino hiperinmune. B. Fase superior del SDFA resuspendida. C. Filtrado obtenido a partir de precipitación con ácido caprílico.

FIG 3. Filtración en gel de muestras del método propuesto en la invención para la obtención de albúmina equina. Se empleó una columna Superdex 200 10/300 GL, la elución se realizó con un amortiguador de NaCI 150 mM, Tris-HCI 20 mM, pH 7.5. A. Plasma equino hiperinmune. B. Fase inferior del SDFA. C. Cromatografía de intercambio catiónico de filtrado obtenido luego de la termocoagulación.

FIG. 4. Diagrama de flujo que representa el método de la invención para obtener productos proteicos derivados de plasma humano para uso intravenoso, libres de virus. Se presenta el valor de rendimiento y pureza obtenido de los productos en cada etapa del proceso. Las operaciones con asterisco muestran pasos de inactivación o remoción viral. Clave: Igs = Inmunoglobulinas.

FIG. 5. Filtración en gel de muestras del método propuesto en la invención para la obtención de gammaglobulinas a partir de plasma humano. Se empleó una columna Superdex 200 10/300 GL, la elución se realizó con un amortiguador de NaCI 150 mM, Tris-HCI 20 mM, pH 7.5. A. Plasma humano. B. Fase superior del SDFA resuspendida. C. Cromatografía de intercambio aniónico de filtrado obtenido luego de la precipitación con ácido caprílico.

FIG 6. Filtración en gel de muestras del método propuesto en la invención para la obtención de albúmina humana. Se empleó una columna Superdex 200 10/300 GL, la elución se realizó con un amortiguador de NaCI 150 mM, Tris-HCI 20 mM, pH 7.5. A. Plasma humano. B. Fase inferior del SDFA. C. Cromatografía de intercambio catiónico de fase inferior.

Descripción detallada de la invención

La presente invención trata de un método para la purificación de productos proteicos hemoderivados, y es particularmente útil para la obtención simultánea de inmunoglobulinas y albúmina con calidad inyectable, a partir de mezclas que pueden contener estas y otras proteínas. Este método se caracteriza por ser práctico y económico, ya que emplea reactivos de costo accesible, y a diferencia del método de Cohn, no necesita equipamiento específico para satisfacer requerimientos de temperatura estrictos. Los productos obtenidos (inmunoglobulinas y albúmina), presentan altos niveles de pureza (>90%) y rendimiento. El método se puede emplear para la recuperación de otros hemoderivados diferentes de las inmunoglobulinas y la albúmina, por ejemplo los factores de coagulación. Asimismo, puede emplearse para la purificación de fragmentos de inmunoglobulinas (F(ab')2 o Fab) obtenidos por digestión enzimática del plasma o de las inmunoglobulinas purificadas. Además, el proceso de obtención de cada producto incluye 2 pasos de inactivación y 1 de remoción viral, los cuales generan una reducción de la carga viral del producto que garantiza su seguridad, según lo establecido en la normativa. Por otra parte, esta metodología puede ser empleada para la purificación de anticuerpos a partir de plasma hiperinmune, por ejemplo, para la producción de antivenenos o antitoxinas.

El material de partida puede consistir en plasma o suero, digerido o no con enzimas proteolíticas, alguna fracción del plasma o suero, o alguna mezcla que contenga inmunoglobulinas y albúmina de origen humano o de cualquier otro animal.

El fraccionamiento del material de partida se realiza en un SDFA (Figuras 1 y 4). En este tipo de separación, el producto de interés posee afinidad hacia una de las dos fases acuosas que componen el sistema, diferente a la del resto de componentes de la mezcla en que se encuentra. Las fases se forman al mezclar dos o más sustancias hidrofílicas que en ciertas concentraciones se vuelven inmiscibles en agua, con base en fuerzas termodinámicas relacionadas con su hidratación. El agua del sistema corresponde al agua presente en el material de partida. El sistema comprende el uso de un polímero soluble en agua, una sal soluble en agua y una sal soluble en agua que está involucrada en la partición de los solutos, pero que no es parte de la formación de las dos fases. El polímero es polietilenglicol (PEG), con un rango de peso molecular de 1000-6000 Da, que se separa en su mayoría en la fase superior; la sal es fosfato de potasio, di y monobásico, la cual se separa en su mayoría en la fase inferior, y la sal que no participa en la formación de las fases es cloruro de sodio. La relación entre el fosfato de potasio monobásico y dibásico determina el pH del sistema, a medida que aumenta el fosfato de potasio monobásico, disminuye el pH. La partición deseada de las proteínas se lleva a cabo en un rango de pH de 5.5-7.5 y a temperatura ambiente (20-25 °C). Por otra parte, la adición de fenol se realiza con el objetivo de inactivar partículas virales presentes en el material de partida durante el fraccionamiento. La capacidad antiviral del fenol radica en su habilidad para producir disrupción física de proteínas y estructuras lipídicas de los virus.

Los componentes del sistema se añaden al material de partida bajo condiciones de agitación constante en las siguientes concentraciones: fenol entre 0.05-0.3% v/v, PEG entre 6-15 p/v%, fosfato de potasio entre 10-20 p/v% y cloruro de sodio entre 5-20 %p/v; preferiblemente, 0.25% v/v de fenol, entre 6 y 9 % p/v de PEG, entre 15 y 20% p/v de fosfato de potasio y 15% p/v de NaCI. El orden de adición de los componentes puede variar, sin embargo, es recomendable añadir el siguiente componente cuando el previo esté disuelto. Una vez adicionados los componentes, la mezcla se agita durante una hora. Posteriormente, se deja en reposo para favorecer la formación de las fases. Cabe mencionar que las concentraciones de los diferentes componentes se expresan en términos de p/v (peso/volumen), ya que como el material de partida aporta el agua que compone el SDFA, la adición de los mismos se realiza en su forma sólida y no en solución. Este hecho resulta en una ventaja al escalar el método, pues elimina la necesidad de manejar varios contenedores con las soluciones de los componentes.

Una vez que se forman las fases, diversas características del medio y de las proteínas determinan la partición de las mismas, tales como peso molecular y concentración de las proteínas, pH, fuerza iónica y concentración de los componentes del sistema. Bajo estas condiciones, la albúmina y otras proteínas contaminantes se particionan hacia la fase inferior rica en sales, y las inmunoglobulinas y otras proteínas contaminantes, se particionan hacia la fase superior.

Las inmunoglobulinas, a diferencia de la albúmina que queda en suspensión, se precipitan en la fase superior, lo que permite su concentración en dicha fase en un solo paso. Esto representa una ventaja al integrar dos operaciones unitarias como lo son la purificación primaria y la concentración de estas proteínas.

La separación de las fases se realiza por filtración, centrifugación o decantación. A partir de este punto, cada fase se convierte en una línea paralela de purificación. Ambas líneas serán descritas por separado a continuación (Figuras 1 y 4):

Purificación de inmunoglobulinas a partir de la fase superior de SDFA.

El precipitado recuperado de la fase superior al separar las fases, se resuspende en un volumen de agua que permita la redisolución total del precipitado; de preferencia en un volumen igual o menor al volumen de partida, para favorecer la concentración del producto. La suspensión se agita hasta lograr la total disolución de la pasta. Posteriormente, se adiciona un ácido graso, el cual precipita y desnaturaliza a las proteínas contaminantes, y deja las inmunoglobulinas en suspensión. El ácido graso funciona en un rango de 1-6% v/v, preferiblemente entre 1.5 y 2 % v/v. El ácido graso puede ser de 6 a 8 carbonos, preferiblemente de 8 carbonos (ácido caprílico u octanoico). La precipitación puede llevarse a cabo en un rango de pH de 5 a 8 sin afectar el resultado obtenido. La agitación durante la precipitación debe ser vigorosa y se realiza en un rango de 30 a 60 minutos. El precipitado es eliminado mediante microfiltración o centrifugación. Además, este método funciona como un paso de inactivación de virus con envoltura lipídica. La forma no ionizada del ácido caprílico es lipofílica, y tiene la capacidad de penetrar y romper la bicapa lipídica del virus y las proteínas asociadas a ella.

Posteriormente, el filtrado o sobrenadante en el cual se encuentran las inmunoglobulinas, se pasa a través de una columna cromatográfica para incrementar su pureza, que puede seleccionarse del grupo que consiste en cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio hidrofóbico.

Purificación de albúmina a partir de fase inferior de SDFA.

La fase inferior enriquecida en albúmina (Figuras 1 y 4), se dializa o diafiltra para eliminar las sales provenientes del SDFA. Este proceso se lleva a cabo con una membrana de corte molecular menor o igual a 30 KDa. Posteriormente, la 6

solución se somete al proceso de termocoagulación selectiva, en el cual esta se calienta en un rango de temperatura de 60-70 °C, preferiblemente 65 °C, durante 0.5-2 horas. Este paso precipita el resto de proteínas y deja en solución a la albúmina, ya que a esta temperatura las demás proteínas del plasma se desnaturalizan. Se emplean agentes como el caprilato de sodio y el N-acetil triptofanato de sodio para mantener la estabilidad de la albúmina a dichas temperaturas, preferentemente caprilato de sodio en un rango de 0.02-0.1 M, preferiblemente 0.012 M. Este calentamiento se realiza en presencia de etanol en un rango de 5-15% v/v, preferiblemente 9% v/v con el fin de propiciar la precipitación del resto de proteínas. Luego de que la solución se calienta, se lleva a temperatura ambiente, y se baja el pH a 5. Seguidamente, el precipitado se separa por microfiltración o centrifugación, y se recupera la albúmina en suspensión. Como paso final de purificación del producto, esta solución se pasa a través de una columna cromatográfica, en una realización particular, a través de una resina de intercambio catiónico (ácido sulfónico o carboximetil).

Nanofíltracion, formulación, estabilización y envase de las dos formulaciones farmacéuticas.

De manera paralela ambas soluciones, de albúmina y de inmunoglobulinas, se nanofiltran, formulan, estabilizan y envasan (Figuras 1 y 4). La nanofíltracion es un paso de remoción viral basado en exclusión por tamaño, emplea un filtro de 20 nm. Las partículas virales pueden ser removidas como complejos anticuerpo-virus, debido a la presencia de anticuerpos antivirales en las soluciones de inmunoglobulinas, o como partículas virales en el caso de la formulación de albúmina. Después de nanofiltrar ambas soluciones, se formula cada medicamento. La formulación de inmunoglobulinas comprende la concentración del producto a 1.0 a 10.0 g/dL de proteína mediante ultrafiltración con una membrana con exclusión para 30 KD; el ajuste del pH en un rango de 5 a 7, preferiblemente 5; la adición de sacarosa al 5% como estabilizante y NaCI al 0.9%. El producto se esteriliza mediante filtración a través de una membrana con exclusión para

0.22 mm, y se envasa. El producto podría liofilizarse o mantenerse líquido.

En el caso de la albúmina, luego de la nanofíltracion , la formulación del producto comprende la concentración a 20 g/dL de proteína mediante ultrafiltración con una membrana con exclusión para 10 KDa; el ajuste del pH en un rango de 6.5 a 7.5, preferiblemente 7; la adición de caprilato de sodio como estabilizante y NaCI al 0.9%. El medicamento se esteriliza, se envasa, y finalmente se pasteuriza a 60 °C por 10 horas. La pasteurización inactiva virus envueltos y sin envoltura por exposición a alta temperatura. Según Kempf, C, Stucki, M., Boschetti, N. 2007. "Pathogen inactivation and removal procedures used in the production of intravenous immunoglobulins", Biologicals 35: 35-42, la pasteurización actúa sobre la bicapa lipídica de virus envueltos, e inestabiliza al virión al transformar los lípidos del estado sólido al líquido.

El método objeto de la invención será mejor comprendido a partir de los siguientes ejemplos de realización, los cuales se proporcionan con el único fin de ilustrar la invención, y en modo alguno se deben considerar para restringir su alcance.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Ejemplo 1. Producción de antivenenos v albúmina a partir de plasma equino hiperinmune

Con el fin de obtener inmunoglobulinas y albúmina a partir del mismo lote de plasma, 1 L de plasma equino hiperinmune, es decir de plasma rico en anticuerpos antiveneno de serpiente, fue fraccionado en un sistema de dos fases acuosas polímero-sal. El plasma se obtuvo a partir de caballos inmunizados con veneno de Bothrops asper, Lachesis stenophrys y Crotalus simus. El material de partida contenía 63% de inmunoglobulinas y 27% de albúmina (Figuras 1 y 2). Para formar el sistema de dos fases, se adicionó 150 g cloruro de sodio (15% p/v), 106 g de fosfato de potasio dibásico, 74 g de fosfato de potasio monobásico (18% p/v), 90 g de polietilenglicol (9% p/v) y como agente antiviral 2.5 ml_ de fenol(0.25% v/v). Se empleó una proporción de fosfato de potasio monobásico/dibásico de 0.7 para que el pH del sistema fuera de 6.1. Se agitó luego de la adición de cada componente para favorecer la disolución antes de añadir el siguiente. El sistema se agitó vigorosamente durante 1 hora, y se dejó reposar por 1 hora para favorecer la formación de las fases, una superior en la cual se encuentran las inmunoglobulinas precipitadas, y una inferior en la que se encuentra la albúmina en suspensión. Posteriormente, se microlfiltró la mezcla por gravedad; este paso también puede llevarse a cabo mediante centrifugación o decantación. Luego de la filtración, se continuó procesando el precipitado (inmunoglobulinas) y el filtrado (albúmina) por separado. Tal como lo muestra la figura 1 , una vez separadas ambas fases, se recuperó el 68% de las inmunoglobulinas antiveneno del plasma en la fase superior (Figura 2.B), y el 100% de la albúmina del plasma en la fase inferior (Figura 3B). El valor de pureza de cada uno fue estimado por filtración en gel, y corresponde al 92% y 62% de pureza, respectivamente. El rendimiento proteico global entre las dos fases fue del 88%, el otro 12% corresponde a fibrina que se particiona hacia la fase superior (Figura 1).

Para la preparación del antiveneno, el precipitado se resuspendió en 1400 ml_ de agua desionizada con agitación constante durante 1 hora. Una vez que las inmunoglobulinas y resto de proteínas remanentes se disolvieron, se adicionó ácido caprílico. Normalmente, la cantidad de ácido caprílico que se utiliza para la producción de antivenenos es de 5-7% v/v. Sin embargo, debido a que en este caso la fracción de inmunoglobulinas proviene del SDFA, esta contiene menor cantidad de contaminantes. En consecuencia, se requiere menor cantidad de ácido caprílico (1.75 % v/v). Luego de la

adición de ácido caprílico, la mezcla se agitó vigorosamente por 30 minutos para favorecer la precipitación. Este paso tiene doble propósito, ya que por una parte precipita las proteínas contaminantes y por otra, inactiva los virus envueltos. Posteriormente, las inmunoglobulinas en solución se recuperaron por microfiltración por gravedad. En este punto, se recuperó el 60% de las inmunoglobulinas antiveneno presentes originalmente en el plasma, con una pureza del 99% (Figuras 1 y 2). Debido a que el producto cumple con un nivel de pureza muy elevado, no se realizó un paso cromatográfico adicional y se pasó a la etapa de formulación del producto.

Seguidamente, el filtrado se dializó contra agua desionizada con una membrana de exclusión de 15 KDa. La diálisis puede substituirse por diafiltración en un ultrafiltrador. Como tercer paso antiviral, el antiveneno se nanofiltró a través de un filtro con exclusión de 20 nm. Se concentró el producto mediante ultrafiltración con una membrana de exclusión de 30 KDa a la concentración de proteína requerida para alcanzar la especificación de actividad neutralizante (por ejemplo, 3 mg veneno/mL antiveneno para Bothrops asper, 3 mg veneno/mL antiveneno para Lachesis stenophrys, 2 mg veneno/ml_ antiveneno para Crotalus simus ó 0.5 mg veneno/mL antiveneno para Micrurus nigrocinctus). El producto fue formulado a pH 7 con NaCI 0.9 % p/v y fenol 0.25% v/v, y esterilizado mediante filtración con una membrana con exclusión para 0.22 pm (Figura 1). Se dispensó en frascos estériles con 10 mL cada uno.

Por otra parte, la fase inferior del SDFA rica en albúmina, se dializó contra agua con una membrana de exclusión de 15 KDa para eliminar sales provenientes del sistema. La diálisis puede substituirse por diafiltración en un ultrafiltrador. Para precipitar las proteínas contaminantes, la suspensión de albúmina se sometió a termocoagulación, para lo cual se le adicionó 2.4 g (0.012 M) de caprilato de sodio como estabilizante y 126 mL de etanol al 95% v/v (9% v/v). Luego, se calentó durante 1 h a 65 °C en un baño maría con temperatura regulada. Posteriormente, se llevó a temperatura ambiente y se ajustó el pH a 5 con HCI 0.5 M. las proteínas precipitadas fueron removidas por microfiltración por gravedad. Como se muestra en las Figuras 1 y 3C, en esta etapa del proceso, se obtuvo un rendimiento del 94%, con una pureza del 91%.

Para pulir la pureza del filtrado rico en albúmina purificada, se le adicionó NaCI al 0.1 % y se le ajustó el pH a 8 con NaOH 0.5 M. Después, se pasó a través de una membrana de intercambio catiónico con una resina ácido sulfónico. Se recuperó la fracción no unida y se ajustó su pH a 7 con HCI 0.5 M. Como segundo paso antiviral la solución fue nanofiltrada a través de un filtro con exclusión de 20 nm. Se concentró el producto mediante ultrafiltración con una membrana de exclusión de 10 KDa a 20 g/dL, y se adicionó caprilato de sodio como estabilizante y el pH se ajustó a 7. Se esterilizó el producto mediante filtración con una membrana con exclusión para 0.22 pm y se dispensó en frascos estériles. El producto se pasteurizó durante 10 horas a 60 °C para garantizar su seguridad viral (Figura 1).

Ejemplo 2. Producción de inmunoglobulina y albúmina de calidad inyectable libre de virus a partir de plasma humano.

Se fraccionó 1 L de plasma humano en un SDFA acuosas polímero-sal para la obtención de inmunoglobulinas y albúmina. Cabe mencionar que el plasma humano contiene una mayor proporción de albúmina (52%) con respecto a la de inmunoglobulinas (16%). Para formar el sistema de dos fases, se adicionó 150 g cloruro de sodio (15% p/v), 106 g de fosfato de potasio dibásico, 74 g de fosfato de potasio monobásico (18% p/v), 60 g de polietilenglicol (6% p/v) y como agente antiviral 2.5 ml_ de fenol (0.25% v/v). En este caso, se empleó una concentración menor de PEG que en el ejemplo 1, puesto que, a diferencia del material de partida de dicho ejemplo, el plasma humano posee un porcentaje menor de inmunoglobulinas, por lo que se requiere una fase superior menor en la cual se particionan estas proteínas. El resto de operaciones relacionadas con esta etapa de fraccionamiento se llevaron a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1. Tal como se muestra en la Figuras 4 y 5B, la recuperación de IgG en la fase superior fue de 85%, con una pureza del 42%; por su parte el rendimiento proteico de albúmina en la fase inferior fue de 91 %, con una pureza del 80% (Figuras 4 y 6B). El rendimiento proteico global del sistema fue del 91 %, el porcentaje restante corresponde a fibrina.

Una vez separadas las dos fases, la fase superior rica en inmunoglobulinas precipitadas, se resuspendió en 1400 ml_ de agua desionizada con agitación constante durante 1 hora. Una vez que las inmunoglobulinas y resto de proteínas remanentes se disolvieron, se adicionó ácido caprílico al 2% v/v. El filtrado recuperado presentó un rendimiento de IgG del 70%, con una pureza del 82% (Figura 4).

A diferencia del ejemplo 1, luego de recuperar el filtrado proveniente de la precipitación con el ácido caprílico, se realizó una cromatografía de intercambio aniónico para retinar la pureza de la solución de inmunoglobulinas (Figura 4), Para esto, a la solución se le adicionó NaCI al 0.1 % y se ajustó el pH a 5 con HCI 0.5 M, y se pasó a través de una membrana de intercambio aniónico con una resina de amonio cuaternario. Se recuperó la fracción no unida y se ajustó su pH a 7 con NaOH 0.5 M. En esta fracción se recuperó el 70% de las IgG presentes originalmente en el material de partida, con una pureza del 92% determinada por filtración en gel (Figuras 4 y 5C). Cabe mencionar que la precipitación con ácido caprílico y la cromatografía son procesos efectivos en la remoción de IgA e IgM. El producto obtenido se formuló, estabilizó y esterilizó de la manera descrita en el ejemplo 1 para la solución de antiveneno.

Con respecto a la fase inferior del SDFA rica en albúmina, la misma presentó un nivel de pureza del 80%, con un rendimiento de recuperación del 91% (Figura 6B), por lo que luego de la diálisis, no se realizó termocoagulación selectiva de la solución. Por lo tanto, se incrementó la pureza de la albúmina mediante cromatografía de intercambio catiónico, la cual se realizó bajo las mismas condiciones descritas en el ejemplo 1 para la albúmina equina. Asimismo, el resto de operaciones se llevaron a cabo de la misma manera en la que se describió anteriormente en el caso de la albúmina equina. Finalmente se obtuvo un producto con un 90% de pureza y con un rendimiento de recuperación del 91% (Figuras 4 y 6C).

Ejemplo 3. Determinación de pureza y rendimiento de inmunoglobulinas antiveneno

Se realizó un análisis de la pureza del material de partida y de las muestras provenientes de cada etapa de purificación mediante filtración en gel en FPLC (Figuras 2 y 3). Se empleó una columna Superdex 200 10/300 GL, y la elución se realizó con un amortiguador de NaCI 150 mM, Tris-HCI 20 mM, pH 7.5. Se calculó el porcentaje de pureza de inmunoglobulinas totales como la relación entre el área bajo la curva del pico con tiempo de retención de 25 ± 0.3 min (correspondiente al peso molecular de las inmunoglobulinas), y la suma del área bajo la curva de todos los picos del cromatograma.

Para la determinación del rendimiento proteico, se cuantificó la concentración de proteína total del material de partida y de las muestras provenientes de cada etapa de purificación, haciendo uso de una modificación del método de Biuret (ver Parvin, R., Pande, S.V., Venkitasubramanian, A. 1965. "On the colorimetric Biuret Method of Protein Determination". Analytical Biochemistry 12: 219-229). Con los datos obtenidos de la determinación proteica, de los porcentajes de pureza por FPLC y del volumen de cada muestra, se expresó la cantidad obtenida de ¡inmunoglobulinas totales en término de gramos. Finalmente, se calculó el rendimiento proteico a partir de la relación de ¡inmunoglobulinas totales en la muestra

(g) y las inmunoglobulinas totales en el material de partida (g).

Asimismo, se realizó un ELISA del material de partida y de las muestras provenientes de cada etapa de purificación para la cuantificación de anticuerpos específicos antiveneno de Bothrops asper. Para esto, se recubrieron placas de 96 hoyos con 100 pL/hoyo de una solución de veneno de B. asper en solución de fosfatos (3 pg/hoyo), seguido por una incubación durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, se adicionaron por triplicado 100 pL/hoyo de varias diluciones de las muestras, y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Luego de realizar el lavado de la placa, se adicionaron 100 pL/hoyo de una dilución de un conjugado anti-lgG de caballo unido a peroxidasa, y se realizó una incubación de una hora. Finalmente, luego de lavar la placa, se adicionó el sustrato (peróxido de hidrógeno y o-fenilendiamina) para desarrollar color. La absorbancia se leyó en un lector de microplacas a 492 nm. La concentración de IgG equina antiveneno se expresó en términos de g/L, utilizando una curva de calibración estándar preparada con concentraciones conocidas de IgG antiveneno. Dicho estándar se obtuvo mediante cromatografía de afinidad, al pasar una muestra de plasma equino hiperinmune parcialmente purificado, a través de una columna de Sepharose unida a veneno de B. asper.

Posteriormente, con base en la concentración de inmunoglobulinas antiveneno obtenida en las muestras por ELISA y el volumen de cada una, se expresó la cantidad de inmunoglobulinas antiveneno en términos de gramos. Finalmente, se calculó el rendimiento proteico a partir de la relación de inmunoglobulinas antiveneno en la muestra (g) y las inmunoglobulinas antiveneno en el material de partida (g).

Ejemplo 4. Determinación de pureza v rendimiento de inmunoglobulinas humanas

La determinación del rendimiento proteico del material de partida y de las muestras provenientes de cada etapa de purificación se realizó de la manera descrita en el ejemplo 3.

Para la cuantificación de IgG, IgA e IgM se empleó un kit de inmunodifusión radial (IDR) (Cromatest; Linear Chemicals SL, Barcelona, España). Las muestras se aplicaron en pozos en un gel de agarosa y se dejaron difundir durante 48 horas. Con base en la concentración obtenida y el volumen de cada muestra, se expresó la cantidad de cada tipo de anticuerpo en gramos. A partir de los datos anteriores, se determinó la pureza de gammaglobulinas (IgG) en cada muestra, con base en la relación de la cantidad de gammaglobulinas obtenida por IDR y la proteína total de la muestra en cuestión. Asimismo, el rendimiento de gammaglobulinas se calculó a partir de la relación de gammaglobulinas en la muestra (g) y las gammaglobulinas en el material de partida (g).

Ejemplo 5. Determinación de pureza v rendimiento de albúmina

Esta determinación se llevó cabo de manera similar tanto para la albúmina equina, como para la humana. Con respecto a la pureza de la albúmina, esta se determinó mediante filtración en gel en FPLC (Figuras 3 y 6), tal como se describió para las inmunoglobulinas. La pureza se definió con base en la relación entre el área bajo la curva del pico con tiempo

de retención de 28 ± 0.3 min (correspondiente al peso molecular de la albúmina), y la suma del área bajo la curva de todos los picos del cromatograma.

Por su parte, el rendimiento proteico se determinó tal como se especificó en el caso de las inmunoglobulinas, es decir, con base en la relación de albúmina en la muestra (g) y la albúmina en el material de partida (g).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de formulaciones inyectables de productos proteicos hemoderivados con carga viral reducida, caracterizado porque comprende los pasos de:

a.

fraccionamiento del material de partida en un sistema de dos fases acuosas mediante la adición de un polímero y al menos una sal;

b.

adición de fenol al sistema de dos fases como primer paso de inactivación viral;

c.

separación de las fases superior e inferior del sistema de dos fases acuosas; 10 d. purificación de los productos de la fase superior del sistema mediante precipitación con un ácido graso;

e.

purificación de la fase inferior de los productos del sistema mediante termocoagulación;

f.

remoción del precipitado de proteínas desnaturalizadas formado durante los pasos de purificación de las fase superior e inferior del sistema de dos fases;

g.

aumento de la pureza de los productos obtenidos a partir de la fase superior e inferior mediante cromatografía; 15 h. nanofiltración de los productos obtenidos en el paso anterior para remover partículas virales;

i. formulación, estabilización y esterilización de los productos obtenidos.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el material de partida se selecciona a partir del grupo que consiste de

plasma sanguíneo, suero sanguíneo, una fracción obtenida por el método de Cohn u otro material cualquiera que 20 contenga productos proteicos hemoderivados.
3. El método según la reivindicación 1, en donde el polímero que se utiliza en el fraccionamiento del material de partida es polietilenglicol con peso molecular entre 1000-6000 Da.

25 4. El método según la reivindicación 3, en donde el polímero es polietilenglicol con un peso molecular de 3350 Da.
5. El método según las reivindicaciones 3 y 4, en donde el polietilenglicol se emplea a una concentración entre el 6 y el 15 % p/v,

30 6. El método según la reivindicación 5, en donde el polietilenglicol se emplea entre el 6 y el 9% p/v.
7. El método según la reivindicación 1, en donde la sal es seleccionada del grupo que consiste de fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, sulfato de amonio y citrato de sodio.
8.

El método según la reivindicación 7, en donde la sal es fosfato de potasio monobásico y dibásico.
9.

El método según la reivindicación 8, en donde el fosfato de potasio monobásico y dibásico se emplean a una concentración entre el 10 y el 20% p/v.
10. El método según la reivindicación 9, en donde el fosfato de potasio monobásico y dibásico se emplean entre el 15 y el 20% p/v.
11. El método según las reivindicaciones de la 8 a la 10, en donde el fosfato de potasio monobásico o dibásico se 45 emplean en una proporción dependiente del pH deseado.
12. El método según la reivindicación 1, en donde se adiciona una sal que influye en la partición de los solutos, pero no en la formación de las dos fases.

50 13. El método según la reivindicación 12 en donde la sal es cloruro de sodio.
14. El método según la reivindicación 13, en donde el cloruro de sodio se emplea a una concentración entre el 5 y el 20% p/v.

55 15. El método según la reivindicación 14, en donde el cloruro de sodio se emplea a una concentración entre el 12 y el 15% p/v.
16. El método según la reivindicación 1, en donde la etapa de fraccionamiento se realiza a un pH entre 5.5 y 7.5.

60 17. El método según la reivindicación 16, en donde la etapa fraccionamiento se realiza a un pH de 6.
18.

El método según la reivindicación 1, en donde en la primera inactivación viral se emplea fenol entre el 0.05 y 0.3% v/v.
19.

El método según la reivindicación 18, en donde se emplea fenol al 0.25% v/v.
20.

El método según la reivindicación 1, en donde la separación de las fases superior e inferior del sistema de dos fases acuosas se realiza mediante una combinación de procesos seleccionada del grupo que consiste de reposo y separación, reposo y filtración, reposo y decantación, o centrifugación.

10 21. El método según la reivindicación 1, en donde la purificación de los productos contenidos en la fase superior del sistema de dos fases acuosas se realiza mediante precipitación con ácido octanoico.
22.

El método según la reivindicación 21, en donde el ácido octanoico se emplea a una concentración de entre el 1 y el 6% v/v.
23.

El método según la reivindicación 22, en donde el ácido octanoico se emplea a una concentración entre el 1.5 y el 2% v/v.
24.

El método según la reivindicación 1, en donde la termocoagulación se lleva a cabo a una temperatura entre 60 y 20 70°C.
25. El método según la reivindicación 24, en donde la termocoagulación se lleva a cabo a 65 °C.
26.

El método según la reivindicación 1, en donde la termocoagulación selectiva de la fase inferior de las fases se lleva a 25 cabo en presencia de caprilato de sodio y etanol.
27. El método según la reivindicación 26, en donde se emplea una mezcla de caprilato de sodio al 0.012 M y etanol al 9% v/v.

30 28. El método según la reivindicación 1, en donde en la etapa final de la purificación de los productos obtenidos en la fase superior del sistema acuoso de dos fases, se emplea un paso cromatográfico, seleccionado a partir del grupo que consiste de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio hidrofóbico.
29. El método según la reivindicación 1, en donde en la etapa final de la purificación de los productos obtenidos en la 35 fase inferior del sistema acuoso de dos fases, se emplea cromatografía de intercambio iónico.
30. El método según la reivindicación 1, en donde la etapa de nanofiltración se realiza a través de un filtro con exclusión para 20 nm.

40 31. El método según la reivindicación 1, en donde la esterilización de los productos se realiza a través de una membrana con exclusión para 0.22 pm.
32. El método según la reivindicación 1, en donde en la formulación las inmunoglobulinas se liofilizan o se mantienen líquidas.
33. El método según la reivindicación 1, en donde las inmunoglobulinas se pasterizan por 10 horas a 60 °C como paso de inactivación viral luego del envasamiento.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6