TW201811815A - 製備免疫球蛋白溶液的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種用於製備免疫球蛋白溶液的方法，該方法是在聚醚或二醇聚合物的存在下基於具有大於或等於96%純度的免疫球蛋白的初始溶液進行，該方法包括以下步驟：a)向該初始溶液加入辛酸或其鹽；b)調整在步驟a)中獲得的溶液的pH；c)在去活包膜病毒必需的溫度培養在步驟b)中獲得的溶液持續去活包膜病毒必需的時間；和d)對在步驟c)中獲得的溶液進行超濾/滲濾的步驟。

Description

製備免疫球蛋白溶液的方法及其用途

本發明關於一種用於製備免疫球蛋白的新方法。獲得的免疫球蛋白組合物適合於例如腸胃外施用。

免疫球蛋白是可以可溶形式見於脊椎動物的血液和其他體液中的糖蛋白，並被免疫系統使用以識別和中和異物諸如細菌、病毒或寄生蟲。免疫球蛋白具有多種醫學應用，諸如診斷疾病、治療性處理(therapeutic treatment)和產前治療。免疫球蛋白的最常見治療性應用可以分為三個大組的病理學：原發性免疫缺陷(體液免疫缺陷)、繼發性免疫缺陷或獲得性免疫缺陷(例如，在預防和治療病毒感染中)和自體免疫缺陷(抗體的發育)。

免疫球蛋白可通過多種途徑施用，諸如肌內、靜脈內和皮下途徑等等。在其中，較佳地使用靜脈內途徑，因為該途徑提供許多益處，特別是更大的治療效力。

免疫球蛋白通常通過使用基於以下的程序從人類血漿純化：科恩(Cohn)分級方法(Cohn EJ.等，J Am Chem Soc,1946,62,459-475)、科恩-昂科利(Cohn-Oncley)方法(Oncley JL.等，J Am Chem Soc,1949,71,541-550)或其他 基於冷乙醇分級的等同方法，例如奇石樂/尼赤曼(Kistler-Nitschmann)方法(Kistler P,Nitschmann H,1962,7,414-424)。如此，使用通過以上任一方法獲得的富含免疫球蛋白的級分(諸如級分II+III、或級分II、或沉澱A、或γ球蛋白GG沉澱)。已引入修飾以更徹底地純化免疫球蛋白(IgG)並使它們對於施用，較佳地靜脈內施用是可耐受的。該修飾已被引入，例如，以去除聚集體和其他雜質，以及確保產物的安全性。然而，向用於製備免疫球蛋白的程序加入多個步驟減少了程序的產率並增加製造成本。對於免疫球蛋白產品，主要是用於靜脈內施用的免疫球蛋白產品日益增加的需求已經使得產率在工業規模生產它們的方法中成為關鍵方面。

在先前技術描述的方法之中，用於獲得經由靜脈內途徑可耐受的免疫球蛋白組合物的程序包括使用以下步驟的那些：用聚乙二醇(PEG)沉澱、離子交換色譜、具有病毒去活(inactivation)能力的物理/化學方法、或用酶處理和免疫球蛋白分子的部分化學修飾。

如此，必需通過實施具有消除病原性生物藥劑/生物因子(pathogenic biological agent)的能力的穩健步驟來確保產物的安全性。通常使用的方法包括使用溶劑/去垢劑以去活具有脂質包膜的病毒，因為這不會嚴重地減少蛋白的生物活性。然而，考慮到溶劑/去垢劑混合物的毒性，該試劑必須在獲得最終產物之前被徹底地消除，且這增加了方法所需的時間並減少產率。對於消除該溶劑/去垢劑描述的程 序並不簡單且通常要求使用色譜吸附技術，直接通過疏水相互作用或通過在離子交換樹脂中間接捕獲免疫球蛋白和分離未捕獲的溶劑/去垢劑。在所有情形中，該方法是昂貴和費力的，涉及蛋白的顯著損失。

然而，具有去活病毒的能力的更簡單高效的替代處理是本領域已知的。例如，已經使用辛脂肪酸(caprylic fatty acid)(還稱為辛酸(octanoic acid))或其鹽。

在專利US4446134中，辛酸鈉聯合氨基酸和熱處理用作用於製備因子VIII的方法中的病毒去活程序。儘管認為能夠分解脂質膜的殺病毒劑是未解離的辛酸(undissociated caprylic acid)，但根據酸及其離子形式的溶液以後者的名字即辛酸鹽(caprylate)表示的生化命名法，使用該劑的程序通常稱為辛酸鹽去活。

辛酸也已被用作純化免疫球蛋白的沉澱劑(Steinbuch,M.等，Arch.Biochem.Biophys.,1969,134(2),279-284)。免疫球蛋白的純度和產率主要取決於加入的辛酸的濃度和pH。Steinbuch,M.等還陳述，以兩個不同步驟加入有效量的辛酸鹽，在兩個步驟之間去除沉澱是有利的。歸因於非免疫球蛋白的蛋白分配在沉澱中，這將為程序提供消除帶包膜和不帶包膜的病毒二者的能力。

先前技術中還發現了用辛酸鹽沉澱、隨後離子交換色譜的組合用於純化免疫球蛋白的描述(Steinbuch,M.等，v.同上)。

歐洲專利EP0893450公開了使用級分II+III(通過以上 提到的基於Cohn方法的程序獲得)純化IgG的方法，包括以雙重沉澱步驟加入15mM-25mM濃度的辛酸鹽的步驟後的兩個連續陰離子交換柱，並組合了辛酸鹽的兩種作用：通過沉澱減少非免疫球蛋白的蛋白，和通過培養去活病毒的能力。隨後的陰離子交換步驟，除了去除其他雜質(IgM、IgA、白蛋白等等)，還用於消除辛酸鹽，且因此要求使用相對大量陰離子樹脂的雙重吸附。

專利申請PCT WO2005/082937還公開了製備包含免疫球蛋白的組合物的方法，該方法包括以下步驟：向包含免疫球蛋白的溶液或組合物加入辛酸鹽及/或庚酸鹽(heptanoate)，和隨後在帶有陰離子交換樹脂的柱中施加該溶液。

然而，本發明的發明人已經認識到，使用適當濃度的辛酸鹽和pH(例如，pH 5.0-5.2)以提供具有病毒去活能力的處理(如先前技術中已經描述的)，導致形成具有高分子量的蛋白聚集體，這是通過稀釋及/或改變pH部分地不可逆的。而且，這些聚集體通過過濾僅部分地可分離，且因此要求特殊的隨後分離步驟，例如通過色譜或沉澱。這些聚集體的分離導致蛋白的顯著損失和免疫球蛋白生產的工業方法的產率的減少。

此外，本發明的發明人已經認識到，辛酸鹽處理期間形成的聚集體的存在，即使是以非常低的水平，阻礙在最佳製程條件下通過直接施加使用超濾膜的分離步驟正確消 除辛酸鹽。這些聚集體由於膠體(濁度)的存在或液體形式的不穩定性，阻礙或阻止製備治療濃度(例如，5%至20%之間)的免疫球蛋白的溶液，從而阻礙或阻止方法用於製備免疫球蛋白的隨後的步驟，諸如奈米過濾和滅菌過濾。

由於以上的結果，本發明的發明人開發了用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其令人驚訝地，包括以比先前技術中描述的更低濃度的辛酸鹽的具有病毒去活能力的辛酸鹽處理，且初始溶液被適合地純化和稀釋，且在至少一種聚醚或二醇聚合物的存在下，抑制、阻止、避免或不促進聚集體的出現。

此外，本發明的發明人已經發現，根據本發明的方法中至少一種聚醚或二醇聚合物的存在不干擾辛酸鹽在其去活帶包膜的病毒的能力方面的活性和效力。

在另外的方面，本發明的發明人首次描述了獲得免疫球蛋白的方法，其也包括在最佳條件下用去活能力的處理，涵蓋了通過僅使用超濾技術消除或減少辛酸鹽和聚醚或二醇聚合物試劑(該處理期間預先存在的)的可能性。這一超濾步驟使得可能純化和濃縮產物到對其施用，例如經由靜脈內、肌內或皮下途徑施用可耐受的水平，而在最終產物中不產生免疫球蛋白蛋白聚集體。這消除了在辛酸鹽處理後引入另外的分離步驟，諸如例如色譜的需求。而且，超濾後聚醚或二醇聚合物和辛酸鹽的剩餘水平使得可能實現免疫球蛋白例如IgG的濃度高達20±2%，其如果正確地配製，在其以液體形式保存期間不會不穩定。

考慮到根據本發明的方法的簡化，這使得可能與先前技術中描述的先前方法相比顯著地改進產率且非常顯著地減少生產成本，而不因此損害產物的安全性或純度水平。

因此，在第一方面，本發明關於一種用於製備免疫球蛋白溶液的方法，該方法包括在至少一種聚醚或二醇聚合物的存在下向免疫球蛋白的純化溶液加入辛酸或其鹽，和隨後通過超濾/滲濾消除或減少該試劑。

在另外的方面，本發明關於在至少一種聚醚或二醇聚合物的存在下使用辛酸或其鹽，用於蛋白生產方法中的病毒去活，和隨後通過超濾/滲濾消除或減少該試劑。

在另外的方面，本發明關於實施超濾/滲濾的單個步驟用於消除或減少在蛋白生產方法中用於病毒去活的辛酸或其鹽及/或聚醚或二醇聚合物的水平。

因此，本發明揭露用於在聚醚或二醇聚合物的存在下，基於純度大於或等於96%的免疫球蛋白的初始溶液製備免疫球蛋白溶液的方法，該方法的特徵在於其包括以下步驟：a)向初始溶液加入辛酸或其鹽；b)調整步驟a)中獲得的溶液的pH；c)在去活包膜病毒必需的溫度，培養步驟b)中獲得的溶液持續去活包膜病毒必需的時間；以及d)對步驟c)中獲得的溶液進行超濾及/或滲濾步驟。

根據本發明的方法還可包括最終配製步驟d)中獲得的溶液的步驟。

在根據本發明的方法中，免疫球蛋白的初始溶液來源於根據Cohn或Cohn-Oncley方法獲得的級分I+II+III、級分II+III或級分II，或來源於根據Kistler-Nitschmann方法獲得的沉澱A或I+A或GG，或其變化形式，該級分I+II+III、級分II+III或級分II、沉澱A或I+A或GG，或其變化形式已被另外純化以獲得大於或等於96%的IgG純度。較佳地，免疫球蛋白的初始溶液來源於根據Cohn方法獲得的級分II+III或其變化形式，該級分II+III或其變化形式已被通過以聚乙二醇(PEG)沉澱和陰離子色譜隨後純化，如專利文獻EP1225180B1中描述的。根據本專利，上述任何級分可經受使用PEG的沉澱程序、隨後過濾以消除沉澱和利用離子交換柱(例如，帶有DEAE Sepharose的柱)的另外的純化步驟。在所有這些情形中，免疫球蛋白的初始溶液來源於人類血漿。

在最較佳的實施方案中，免疫球蛋白的初始溶液來源於通過基於Cohn方法的程序獲得的級分II+III，該級分II+III另外通過先前技術中描述的任一種方法純化以實現足夠的純化水平以經受在本發明的非沉澱條件下用辛酸鹽處理，亦即，通過在乙酸纖維素中電泳確定的IgG的大於或等於96%(w/v)的純度值，具有相對於總蛋白較佳地小於或等於1%(w/v)的白蛋白含量。如此，在辛酸鹽處理之前和之後，該免疫球蛋白的初始溶液是對於其預期的治療施用途徑足夠地純化的，從而在本發明的具有病毒去活能力的步驟之後不需要另外的純化。

根據本發明的方法的初始溶液的免疫球蛋白還可通過以下獲得：遺傳重組技術，例如通過在細胞培養物中表達；化學合成技術；或轉基因蛋白產生技術。

在最較佳的實施方案中，根據本發明的方法中提到的免疫球蛋白是IgG。設想，該IgG可以是單株或多株的。在最佳的實施方案中，IgG是多株的。

設想，本發明的聚醚或二醇聚合物可以是鏈烷的聚醚或聚鏈烷的氧化物，也稱為聚二醇，並指例如乙基或乙烯和丙基或丙烯的衍生物，更好地稱為聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)、或其等同物。此外，該試劑必須與免疫球蛋白相容，在這種意義上，它們不危害免疫球蛋白的穩定性或溶解度，且由於其尺寸，它們可有利地通過超濾技術消除，或由於其低毒性，它們與免疫球蛋白的治療用途相容。

在較佳的實施方案中，聚醚或二醇聚合物選自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、或其組合。較佳地，聚醚或二醇聚合物是PEG，更佳地是具有3350Da(Dalton)與4000Da之間的標稱分子量(nominal molecular weight)的PEG，且最佳地是具有4000Da的標稱分子量的PEG。

上述聚醚或二醇聚合物在免疫球蛋白的初始溶液中的含量較佳地在2%至6%(w/v)之間，且更佳地在3%至5%(w/v)之間。

設想，可能有必要調整該聚醚或二醇聚合物在免疫球蛋白的初始溶液中的濃度。該聚醚或二醇聚合物的該調整可通過稀釋免疫球蛋白的初始純化溶液及/或通過加入該 聚醚或二醇聚合物來實現。

根據免疫球蛋白的初始溶液的組成，設想，在根據本發明的方法的步驟a)之前，進行一系列純化或濃度調整步驟，諸如，例如：- 調整免疫球蛋白的濃度到1mg/ml至10mg/ml之間，更佳地3mg/ml至7mg/ml之間。這一調整可通過先前技術已知的任何程序來實現，例如通過根據具體情況稀釋或濃縮蛋白濃度到確立的範圍(例如通過在280nm E(1%)的光密度=13.8-14.0UA，通過Biuret方法、通過Bradford方法、或特別地通過免疫濁度測定法根據總蛋白確定的)。因此，在較佳的實施方案中，免疫球蛋白的初始溶液具有較佳地在1mg/ml至10mg/ml之間，和更佳地在3mg/ml至7mg/ml之間的免疫球蛋白濃度；及/或- 調整免疫球蛋白溶液的純度，其應較佳地達到相對於總蛋白至少96%的IgG。這一純化可通過本領域技術人員充分已知的技術來實現，諸如，例如，通過用PEG沉澱、和過濾和隨後陰離子交換色譜(DEAE Sepharose)。

在根據本發明的方法的步驟a)中，加入辛酸或其鹽，較佳地利用其濃溶液，例如在1.5M至2.5M之間的，以實現較佳地在9mM至15mM之間的終濃度。

在較佳的實施方案中，在步驟b)中，將獲得的溶液調整到5.0至5.2之間、更佳地5.1的pH。

在較佳的實施方案中，在步驟c)中，培養獲得的溶液持續至少10分鐘，更佳地1至2小時，又更佳地2小時。 此外，進行該培養的溫度在2℃至37℃之間，更佳地在20℃至30℃之間。

在較佳的實施方案中，在根據本發明的方法的步驟d)之前，在該步驟c)中獲得的溶液中具有高分子量的聚合物或聚集體的含量小於或等於0.2%，且更佳地小於0.1%。聚合物或免疫球蛋白的分子聚集體相對於總蛋白的這一百分比通過尺寸排阻HPLC凝膠柱根據在280nm的光密度值確定。聚合物或免疫球蛋白的分子聚集體的所述百分比可例如使用歐洲藥典的關於靜脈內γ球蛋白的專著中描述的分析方法來評價。

較佳地，免疫球蛋白的溶液在進行超濾/滲濾的步驟d)之前使用深度濾器來澄清。

關於步驟d)，設想，較佳地，根據本發明的方法中的超濾/滲濾具有通過減少體積滲濾和濃縮的初始步驟，隨後是在恒定體積應用滲濾。

考慮到以下事實：蛋白的濃度是最佳且較佳地小於或等於30mg/ml，超濾/滲濾可在工業規模較佳地通過同時透析和濃縮、減少產物體積並轉而滲濾的方法進行，從而試劑的消耗略微較低且方法更有效。在任何情形，本領域技術人員能夠容易地確定進行超濾/滲濾的這一步驟的最適合和實用的方式，從先前技術中已知的各種操作程序(例如，稀釋/濃縮或滲濾/濃縮、在恒定體積滲濾、或以上的修改和組合)中選擇。

根據本發明的方法的步驟d)中使用的超濾/滲濾膜較 佳地由聚碸、再生纖維素或其等同物組成，諸如，例如，以商標Biomax®(Millipore,USA)、Omega®(Pall,USA)、Kvik-flow®(General Electric,USA)銷售的膜。然而，為膜選擇的分子量截留可根據多種因素例如選擇的製造商而不同。本領域技術人員可容易地確定選擇的膜，其將由每種情形的需要來調整，依賴於例如將要加工的溶液中辛酸鹽和聚醚或二醇聚合物的濃度。

較佳地，步驟d)的超濾/滲濾通過具有小於或等於100kDa、更佳地100kDa的分子量截留的膜來實現。

在最佳的實施方案中，步驟d)的超濾/滲濾以以下兩個階段進行。

第一階段，其中pH調整到5.0至6.0之間以減少或消除大部分辛酸鹽；以及第二階段，其中pH調整到小於5.0，較佳地到4.0至5.0之間的pH以減少或消除大部分聚醚或二醇聚合物。

在較佳的實施方案中，在超濾/滲濾的步驟的第一階段中，滲濾使用包含在大於或等於大約5mM濃度的羧酸例如乙酸的鹼性鹽的滲濾介質進行。在最佳的實施方案中，上述滲濾使用調整到上述pH，亦即5.0至6.0之間的在大於或等於5mM濃度的乙酸鈉溶液進行。

在步驟d)的超濾/滲濾的第一階段中將進行的滲濾體積的倍數可由本領域技術人員根據最初使用的辛酸鹽的量和可接受的最終量容易地確定。較佳地，使用至少三倍體積的滲濾介質，該滲濾介質較佳地為，如以上提到的，在 pH 5.0至6.0的5mM乙酸鈉溶液。較佳地，在超濾/滲濾的該第一階段中，大約90%或更多的初始辛酸鹽被消除，從而在該第一階段中，辛酸鹽的濃度減少到大約1mM或更少。

在步驟d)的超濾/滲濾的第二階段中，免疫球蛋白溶液被滲濾，較佳地以恒定體積。

較佳地，在超濾/滲濾的該第二階段中的滲濾使用在以上指出的pH值的緩衝溶液進行，該緩衝溶液包含由乙酸鹽(acetate)、磷酸鹽(phosphate)或等同物形成的鹼性金屬鹽、或氨基酸及/或多元醇，例如甘氨酸及/或山梨糖醇。

如在滲濾的第一階段的情形一樣，在第二階段中用於適當地減少根據本發明的方法中使用的聚醚或二醇聚合物的透析體積的倍數可由本領域技術人員考慮到聚醚或二醇聚合物的需要的減少或消除容易地確定。在較佳的實施方案中，在步驟d)的超濾/滲濾的第二階段的滲濾中將要交換的緩衝液的量是等於或大於六倍體積。在最較佳的實施方案中，在該第二階段中，交換根據獲得聚醚或二醇聚合物的在開始步驟d)的超濾/滲濾之前該聚醚或二醇聚合物的初始含量的等於或大於100倍的減少必需的緩衝液體積倍數進行。

辛酸鹽和聚醚或二醇聚合物在步驟d)的超濾/滲濾中已被減少後，在以上提到的最終配製步驟中，通過加入必需的賦形劑和/或穩定劑，溶液可被調整到期望的最終組成，從而濃縮產物以實現最終配製。在最終配製之後將進 行的賦形劑籍/或穩定劑的加入可如下實現：直接地通過加入以固體形式或以濃溶液的該賦形劑及/或穩定劑，或仍更佳地，通過利用配製溶液的交換體積的必需倍數滲濾以確保最終產物的適當組成。

在另一實施方案中，賦形劑及/或穩定劑的加入通過用被調整到較佳地4.0至5.0之間的相同pH值的包含賦形劑及/或穩定劑的溶液完全或部分地代替在步驟d)的第二階段中使用的乙酸鈉透析緩衝溶液來進行，從而在最終濃縮後，免疫球蛋白已被配製。

本領域技術人員知曉為了實現期望的穩定性，必須加入哪些類型的賦形劑及/或穩定劑。設想，例如，該賦形劑及/或穩定劑可以是一種或複數種氨基酸，例如甘氨酸，較佳地以0.2至0.3M之間的濃度；一種或複數種碳水化合物或多元醇，例如山梨糖醇；或其組合。

最後，免疫球蛋白(較佳地IgG)的最終濃度被調整到適合其靜脈內、肌內或皮下使用的濃度，該濃度將是本領域技術人員已知的，並可以是例如5%至22%(w/v)之間。該濃度通過先前技術已知的任何程序來實現，例如通過超濾濃縮。設想，如果免疫球蛋白的濃度通過超濾實現，該濃縮可使用如在前面的滲濾中使用的相同的膜進行。明顯地，提到的三種滲濾以及濃縮可使用不同的膜進行。

根據本發明的方法還設想引入奈米過濾以增加產物的安全界限的可能性。程序中存在產物可用商購可得的濾器(例如，由Asahi-Kasei製造的Planova®和Bioex®、由Pall 製造的DV®和SV4®、由Sartorius製造的Virosart®、由Millipore製造的Vpro®、或其等同物)奈米過濾的多個階段，該濾器具有20nm或更小和高達50nm的孔徑，較佳地具有20nm或更小的孔徑，或可使用甚至15nm的奈米濾器。可在其中進行奈米過濾步驟的中間步驟是，例如，在免疫球蛋白的初始溶液中；或在超濾/滲濾步驟後用辛酸鹽處理的材料中(辛酸鹽和聚醚或二醇聚合物已被減少後)；或在濃縮和配製免疫球蛋白(較佳地IgG)溶液後的材料(最終產物)中。本領域技術人員將依據膜的孔徑、根據程序時間所需的過濾面積、將被奈米過濾的產物體積、和蛋白回收率等等選擇最佳選項。

根據本發明的方法獲得的最終產物完全符合歐洲藥典關於同種血凝素含量的標準。然而，根據本發明的方法還設想包括選擇性和特異性捕獲抗-A及/或抗-B血液抗體以使其減少最大化的步驟的選項。這一步驟較佳地使用生物特異親和性樹脂進行，如在先前技術中已描述的。例如，通過使用具有由三糖形成的配體的生物特異親和性樹脂，可實現同種血凝素水平的顯著減少(Spalter等，Blood,1999,93,4418-4424)。這一另外的捕獲可由本領域技術人員判斷，在本發明的方法的任何步驟中任選地被併入，或可在進行本發明的方法之前或之後進行。

因此，關於用於製備根據本發明的免疫球蛋白溶液的方法，在最佳的實施方案中，使用具有大於或等於96% IgG的純度的免疫球蛋白的初始溶液。該溶液被調整到較佳地 在1mg/ml至10mg/ml之間，且較佳地在3mg/ml至7mg/ml之間的IgG濃度，其包含(通過在前面的步驟中加入)4±1%(w/v)的濃度的PEG或向其加入PEG至4±1%(w/v)的濃度。然後通過乙酸調整該溶液的pH到5.0至5.2之間，並加入辛酸鈉(例如，利用該辛酸鈉的濃溶液)。在較佳的實施方案中，辛酸鹽的濃溶液被緩慢地伴隨攪拌加入到IgG的純化溶液。加入計算為使產物達到9mM至15mM之間的辛酸鹽終濃度的辛酸鹽後，然後如有必要，調整最終pH到5.0至5.2之間，並較佳地在2℃至37℃的溫度，更佳地在25±5℃的溫度培養溶液持續至少10分鐘，且較佳地持續1至2小時。

然後使用深度濾器(例如，Cuno 90LA、50LA、Seitz EK、EK-1、EKS、或等同物)進行澄清。

如此獲得的溶液然後通過由包含聚碸的膜形成的超濾/滲濾設備處理，該包含聚碸的膜例如由Millipore製造的Biomax®或來自Pall的Omega®，該超濾/滲濾設備較佳地呈可堆疊盒的形式。將溶液再循環通過每個超濾/滲濾單元，較佳地以大約100L/h至500L/h的體積和在5℃±3℃的溫度。在入口壓力和出口壓力(大氣壓)之間的壓力降較佳地在1至3巴之間。然後，開始超濾/滲濾步驟的第一超濾階段以消除辛酸鹽，較佳地施加至少三倍體積的緩衝液的交換，該緩衝液較佳地由在等於或大於5mM的濃度和在5.0至6.0之間的pH的乙酸鈉溶液形成。較佳地，對於加入的或消耗的每個體積的緩衝液，產物溶液的體積減 少至初始體積的一半，最後一次加入除外。

在滲濾的第一階段(通過稀釋和濃縮或等同處理)後，利用例如乙酸調整獲得的溶液的pH到4.0至5.0之間。然後開始以恒定體積的滲濾，較佳地利用六倍或更多體積的緩衝溶液，該緩衝溶液由在等於或大於5mM的濃度和在4.0至5.0之間的pH的乙酸鈉形成。

由乙酸鈉形成的上述透析緩衝溶液可任選地完全或部分地被在0.2M至0.3M濃度的氨基酸例如甘氨酸溶液代替，該氨基酸溶液任選地與碳水化合物和多元醇例如山梨糖醇組合，較佳地被調整到4.0至5.0之間的相同pH值，從而在最終濃縮後，免疫球蛋白已被配製。

在施加較佳地至少六倍體積(更佳地在六倍和十倍體積之間)的在4.0至5.0之間的pH的上述透析溶液後，如果產物尚未配製，則可如下配製產物：通過以一種或複數種賦形劑及/或一種或複數種穩定劑的固體狀態或濃溶液形式向獲得的溶液直接加入該一種或複數種賦形劑及/或一種或複數種穩定劑，諸如，例如，甘氨酸或其他氨基酸、以及碳水化合物例如山梨糖醇或其組合。然後，通過體積減少獲得的IgG溶液被濃縮以實現用於靜脈內、肌內或皮下使用的適當的IgG濃度。

關於一種或複數種賦形劑及/或一種或複數種穩定劑的濃度和pH被適當地調整的該濃溶液通過使用具有0.2μm孔徑的濾器絕對過濾來施加，並任選地被奈米過濾。最後，IgG溶液被無菌地在可注射製品、安瓿、小瓶、瓶 或其他玻璃容器中劑量化(dosified)，其隨後被密封(hermetically sealed)。另一選項是在相容的剛性或柔性塑膠容器例如包或瓶中劑量化(dosification)。

經劑量化的產物通過檢疫和外觀檢驗，隨後被放置在2℃至30℃之間的溫度儲存，用於儲存多達至少2年。

而且，如以上提到的，本發明還首次揭露一種在至少一種聚醚或二醇聚合物存在下，辛酸或其鹽用於在蛋白生產過程中病毒去活的用途，其中該聚醚或二醇聚合物和辛酸或其鹽隨後通過超濾被消除。

較佳地，該蛋白選自包括以下的蛋白組：免疫球蛋白；白蛋白；凝血因子諸如因子VII、因子VIII和因子IX；和血管性血友病因子。仍更佳地，該蛋白是免疫球蛋白。在最佳的實施方案中，該蛋白是IgG。

現在將參考實施方案的多種實施例來更詳細地描述本發明。然而，這些實施例並非意圖限制本發明的範圍，而僅示例其描述。

實施例

實施例1. 用於從血漿獲得病毒學上安全(virally safe)、不含聚集體且具有用於工業應用的足夠產率的免疫球蛋白溶液的根據本發明的方法

起始材料是16升的免疫球蛋白溶液，其包含IgG作為主要蛋白組分，通過在歐洲專利EP1225180B1中描述的方法獲得。簡要地說，該溶液通過使用Cohn方法從級分 II+III提取γ球蛋白來獲得。為了進行γ球蛋白從級分II+III的這一提取，該級分此前通過使用乙醇分級人類血漿來分離。然後將其在碳水化合物的存在下懸浮，且伴隨的大多數蛋白的含量通過以PEG-4000沉澱來減少。最後，級分的最終純化通過在離子交換樹脂柱(DEAE Sepharose)中吸附來進行。如此獲得的柱流出液(樹脂即DEAE中未吸附的級分)具有免疫球蛋白98±2%的乙酸纖維素(ACE)中電泳純度、6.0的pH2.6比濁濁度單位(NTU)的濁度和大約5mg/ml的IgG濃度。

獲得的溶液通過加入乙酸被調整到5.1的pH和調整到2℃至8℃的溫度。然後通過加入辛酸鈉的濃溶液，使免疫球蛋白的這一溶液達到13mM的終濃度。

將帶有辛酸鹽的免疫球蛋白溶液加熱到25℃並在這一溫度在緩慢攪拌下培養2小時。在培養程序期間，保持pH在5.10±0.05。所得溶液的濁度是17.3NTU。

將經辛酸鹽處理的溶液冷卻到8℃的近似溫度用於隨後使用深度濾器(CUNO®,Ultrafilter,Denmark)的澄清。從該澄清(包括漂洗)獲得大約20升的過濾液體，具有大約4mg/ml的IgG濃度和小於3NTU的濁度。

上述澄清的溶液通過使用具有100kDa的標稱分子量截留的膜(Biomax®,Millipore,USA)超濾來透析。超濾以兩個有區別的階段進行：在第一階段中，具有5.1的pH的材料通過使用被調整到pH 5.1的5mM乙酸鹽溶液透析和通過濃縮到大約30UA經受三個步驟的順序透析和濃縮。 在第二階段中，具有足夠濃度的蛋白、辛酸鹽和PEG的溶液被調到pH 4.5±0.1，且然後使用8倍體積的在pH 4.5的5mM乙酸鹽溶液開始透析。然後，如下配製產物：通過使用大約20升的在pH 4.2的200mM甘氨酸溶液透析，並在同一超濾單元中濃縮到140.5UA的值，目標是獲得具有10%(w/v)濃度的IgG溶液。

最後，該溶液使用深度濾器(CUNO®,Ultrafilter,Denmark)和具有0.22μm孔徑的絕對濾器或膜(CVGL®,Millipore,USA；或DFL®,PALL,USA)過濾。

表1顯示了根據以上描述的方法的起始材料、多種中間產物和最終產物的表徵。關於該表中包括的結果，應注意的是，濁度是通過比濁法測量的；檢測的聚合物或免疫球蛋白的分子聚集體相對於總蛋白的百分比，是通過尺寸排阻HPLC凝膠柱根據在280nm的光密度值確定的；辛酸鹽的濃度使用通過比色底物定量的酶方法確定；PEG的濃度通過HPLC過濾凝膠柱使用折射率檢測器確定；且方法的回收百分比根據由比濁法定量的IgG的濃度來計算。

這一實施例的結果顯示，用辛酸鹽處理上述純化的溶液不引起免疫球蛋白聚集體或其他沉澱的任何形成，保持產物的分子分佈不變。因此，在以辛酸鹽處理後，不需要純化步驟來消除聚集體及/或沉澱。這一事實大大地促進了生產過程並允許直接施用材料到超濾膜。

表1對於實施例1的方法中的起始材料、多種中間產物和最終產物獲得的結果

如此，隨後的超濾過程令人滿意地實現了有效減少製造過程的化學試劑(即PEG和辛酸鹽)，以及允許免疫球蛋白的純化溶液的隨後配製和濃縮以獲得用於其治療用途的適當組成的目的。

如表1中可見的，在該例子中獲得的從起始流出液到10%濃縮產物的蛋白回收率是89.4%，顯示這一方法在工 業規模上的可行性。這一回收率大於通過根據先前技術的常規方法獲得的和如專利申請PCT WO2005/073252中描述的值(70%回收率，基於4.8g/l的產率相比於初始6.8g/l)。

實施例2. 在用辛酸鹽處理中免疫球蛋白的初始溶液的純度的影響

在這一實施例中，對經受本發明的方法的起始材料中免疫球蛋白的初始溶液的純度和伴隨蛋白的存在的影響進行了評價。

創建兩個獨立的實驗測試組：

- 在組A中，起始材料是DEAE Sepharose柱流出液，具有98±2% IgG的電泳純度(ACE)，亦即，實施例1中描述的起始材料。

- 在組B中，起始材料稱為4%PEG濾液，由實施例1中描述的相同過程，直到DEAE Sepharosa色譜之前的步驟獲得。如此，材料B在用PEG沉澱級分II+III的提取懸液後獲得，並具有90% IgG的大致電泳純度(ACE)。

兩種起始材料(組A和組B)，具有大約4%的等同PEG含量，經受在13mM濃度的辛酸鹽和5.0至5.2之間的pH處理，並如實施例1所示的純化。

表2詳述了兩個測試組(分別是組A和組B)中使用的起始材料的主要特徵以及用辛酸鹽處理後的步驟中產生的材料的主要特徵。

在表2中獲得和收集的結果顯示，以用於去活的有效濃度(13mM)加入辛酸鹽到較低純度(大約90% IgG，見組B)的材料，導致溶液的組分沉澱，產生濁度的激烈增加(高於500NTU)。如此，溶液的分子分佈結果顯示具有高分子量的部分伴隨蛋白的沉澱。

以此前描述的量和在此前描述的條件下(13mM辛酸鹽、pH在5.0至5.2之間)加入辛酸鹽到低純度材料產生沉澱的懸液，其使得必須包括另外的分離和純化步驟以分離具有高分子量的蛋白和沉澱的聚集體。因此，用辛酸鹽處理的組A的產物的分子組成，亦即，具有超過1%的聚集體含量，顯示加工此產物為純化的最終產物的不可行性，除非包括另外的純化或分離步驟，諸如用PEG沉澱、色譜或等同方法的步驟。最後，這一事實顯示僅當辛酸鹽被加入到具有足夠純度的材料時，在非沉澱條件下使用辛酸鹽作為具有病毒去活能力的劑的可行性。

實施例3. 起始材料的組成對聚集體的生成的影響

這一實驗的目的是評價向其施加辛酸鹽處理的免疫球蛋白的初始溶液的組成的影響。

從具有同等的純度(97.9±1.5%)但具有不同組成的材料開始創建兩個獨立的實驗測試組A和組B。

在組A中，起始材料是柱流出液(根據實施例1中描述的初始方法獲得的)，具有5±2mg/ml的蛋白濃度和4±1%的PEG-4000濃度。

在組B中，起始材料稱為濃縮和透析的流出液，是對組A提到的相同柱流出液，但是在濃縮和透析後的。因此，DEAE柱流出液(以上實施例1中提到的並對應於本實施例的組A)經受透析和通過超濾濃縮的另外步驟，從而PEG含量減少大約6倍的級且蛋白濃縮到4%的近似值，亦即40mg/ml。

兩個實驗組A和組B中獲得的材料經受在13mM的濃度和5.0至5.2之間的pH的辛酸鹽的處理，並在實施例1中描述的條件下超濾，以獲得具有10%的IgG濃度的產物。

表3詳述了以上提到的實驗組A和組B中加工的材料的主要特徵、以及對於每個實驗組，在用辛酸鹽處理後的步驟中生成的材料和滲濾和濃縮的最終產物的特徵。

如在表3中可見的，結果證明：在指定的條件下，對 在5±2mg/ml濃度和在40±10mg/ml(4±1%)的PEG濃度存在下的免疫球蛋白的純化溶液(組A，柱流出液)用辛酸鹽處理，不引起免疫球蛋白溶液的任何改變或聚集，保持產物的分子分佈在加入辛酸鹽期間和之後不變，具有小於0.1%的聚集體的不可檢測的比例。

然而，當用辛酸鹽處理的這些相同條件施加於具有低PEG含量(<1%)的材料(組B)時，在加入辛酸鹽後觀察到免疫球蛋白聚集體的實質增加。而且，在使用的條件下通過超濾消除這一聚集體含量是不可能的，且在最終產物中測量到相當的聚合物水平。

考慮到實驗組A和組B中使用的起始材料之間的主要差異特徵是蛋白濃度和PEG濃度，進行另外的測試，目的是確定這些參數的每一個對隨後用辛酸鹽處理的影響。

在這一實驗中，起始點是單批次的濃縮和透析的流出液(以上組B的最初材料)，將其分成四個不同的實驗組：組B1、組B2、組B3和組B4。

組B1的材料在4%的近似蛋白濃度和0.6%的近似PEG濃度加工。

組B2的材料在大約4%的相同蛋白濃度加工，但PEG含量被重新調整到4±1%(w/w)的值。

在組B3和組B4中，材料被稀釋到0.5±0.2%蛋白。關於PEG含量，在組B3中其被調到大約0.6%(w/w)的濃度，而在組B4中PEG含量被重新調整到4±1%(w/w)。

在四個實驗組中獲得的所得材料被調到5.10±0.05的 pH和15mM的辛酸鹽濃度，且然後在25℃培養2小時。獲得的結果在表4示出。

表4中顯示的結果表示，在確立的條件下用辛酸鹽處理期間，PEG保護作用連同足夠的蛋白稀釋被觀察到。值得注意的是，當起始材料在5±2mg/ml的近似蛋白濃度和4%的PEG濃度時，在用辛酸鹽處理後獲得不可檢測水平的聚集體(<0.1%)。

實施例4. pH對用辛酸鹽處理的免疫球蛋白溶液的溶解度的影響

已知，消除免疫球蛋白溶液中的PEG，以及濃縮該免疫球蛋白到對其靜脈內使用適合的濃度，必須較佳地在大約4.5的pH值發生。

而且，考慮到辛酸在低於其pKa(4.89)的pH值的不溶性，在本實驗中評價了pH對用辛酸鹽處理的免疫球蛋白溶液的溶解度的影響，目的是確立用於開始其超濾的適合pH值。

為此目的，根據實施例1中詳述的初始方法獲得的一批柱流出液被加工以獲得用13mM辛酸鹽處理的免疫球蛋白溶液和澄清。

構成在超濾步驟之前的材料的這一中間產物，通過加入乙酸來酸化，使其從用辛酸鹽處理的pH(5.1)到約4.5的pH值。隨後，針對每一個評價的pH值評價溶液的外觀和溶解度，且通過濁度的比濁測量定量膠體顆粒的生成。

表5顯示針對每一個評價的pH值獲得的外觀和濁度結果。

如表5中所見的，獲得的結果顯示，當用13mM辛酸鹽處理的免疫球蛋白溶液被酸化到低於pH5.0的pH時，觀察到發白的沉澱的出現，伴隨濁度的明顯增加。這 一作用非常可能是由於膠體形式的不溶性辛酸的形成，其使得在低於5.0的pH值開始超濾過程不可行。

獲得的結果證明：當純化的溶液以用於病毒去活的有效濃度範圍(9mM至15mM的辛酸鹽)和在以上描述的條件下經受辛酸鹽處理時，較佳地在大於或等於病毒去活處理的pH即5.1的pH開始隨後的超濾步驟，目的是增加離子型和可溶形式的辛酸鹽的濃度，並因此促進其穿過超濾膜的滲透性。

實施例5. 透析溶液中的乙酸鹽含量對通過超濾/滲濾減少辛酸鹽的影響。

在用於透析產物的緩衝溶液中不同濃度的乙酸鹽的存在下進行一系列獨立的超濾/滲濾過程。

使用的起始材料稱為濃縮和透析的流出液，與實施例3的組B的相同。該起始材料具有98±2%的IgG純度、40mg/ml的近似蛋白濃度和0.6%的近似PEG含量，經受辛酸鹽處理和隨後經受使用具有大約100kDa的標稱分子量截留的膜的超濾/滲濾。

施加的超濾/滲濾步驟包括濃縮到大約4%(w/v)IgG的第一階段、使用八倍體積透析溶液的透析的第二階段、和最後濃縮到9-10%(w/v)IgG的近似值。

超濾/滲濾測試的第一個使用注射用水進行，而隨後的測試使用具有遞增濃度的乙酸鹽，更具體地分別2mM、5mM、20mM或50mM乙酸鹽的緩衝溶液進行，以及在所有情形中具有5.0至5.5之間的調整的pH。

(1)用8倍透析體積透析後確定的值

(2)通過以下公式計算的滲透性：透析體積的倍數=ln(Cf/Co)/(R-1)；其中Cf是用所討論的透析體積的倍數透析後的濃度，Co是透析前的濃度，且R是滯留係數。

表6的結果顯示，使用具有大約100kDa的分子量截留的膜、施加8倍透析體積的具有乙酸鹽的緩衝溶液、在5.0至5.5之間的pH和以大約5mM的最小濃度和最多50mM的乙酸鹽的超濾/滲濾程序，令人滿意地實現了在最終濃縮產物中有效減少辛酸鹽到適當水平的目的。

相反，當用於透析的溶液是注射用水或具有2mM乙酸鹽水平的緩衝溶液時，濾液中的辛酸鹽未被有效消除。

這證明：考慮到在最終濃縮產物中檢測到辛酸鹽的正確水平，在以上描述的條件下使用具有大約100kDa的分子量截留的膜超濾/滲濾的方法，有效地減少源於此前的處理的辛酸鹽。

實施例6. 通過超濾的單個步驟同時消除化學試劑(PEG和辛酸鹽)。

根據實施例1中所述的方法加工一批IgG以獲得用辛酸鹽去活的溶液並澄清。具有0.5%的近似蛋白濃度和5.1的pH的所述溶液使用由具有100kDa的分子量截留的Biomax®型聚碸膜(Millipore,USA)形成的超濾/滲濾設備加工。超濾/滲濾以兩個有區別的階段進行，如實施例5中所述的：

- 在第一階段中，在pH 5.1、5.6或5.8進行，材料經受順序的透析和通過用不少於三倍體積的調整到pH 5.1、5.6或5.8的5mM乙酸鹽緩衝溶液滲濾濃縮的步驟，並濃縮蛋白到2%的近似值。

- 在第二階段中，辛酸鹽含量已被減少到大約十分之一後，將溶液調到4.5±0.1或5.1的pH。然後將產物調到蛋白和PEG的足夠濃度以開始透析，且透析以8倍體積的在4.5或5.1的pH的5mM乙酸鹽緩衝溶液開始。

最後，通過用六倍體積的在200mM濃度和pH 4.2的甘氨酸溶液透析來配製產物，並濃縮以獲得10%的IgG溶液。

表7顯示在超濾/滲濾的每個階段開始時和在不同pH 值獲得的PEG和辛酸鹽的穿過(passage)百分比：

表7的結果顯示，在階段I中，在超濾/滲濾步驟開始時，辛酸鹽在pH 5.1至pH 5.8之間顯示非常高的穿過值。這些值導致在超濾/滲濾步驟的該階段I期間辛酸鹽的非常高的減少(相對於初始含量，獲得多於10倍的辛酸鹽減少)。相反，該階段I中PEG的穿過非常低(<20%)，且在pH>5在辛酸鹽的存在下其總體消除實際上不可行。

另一方面，如表7中可見的，在階段II中，在pH 4.5時PEG的穿過非常高，具有82%的值。此外發現，在這一階段II期間，辛酸鹽也被減少，考慮到在該階段開始時其以1mM的殘留水平存在，這允許穿過實際上是100%。

表8詳述了在超濾/滲濾步驟的每個階段中和在最終配製步驟中蛋白、PEG和辛酸鹽的濃度的演化。

表8. 病毒去活步驟、超濾/滲濾步驟的階段I和II、 在pH 4.2配製後的溶液、和在最終溶液中PEG和辛酸鹽的量(通過濃度和光密度測量)

根據在每個步驟和階段記錄的PEG和辛酸鹽值，並考慮在每個步驟的蛋白濃度，在超濾/滲濾步驟的階段I(pH 5.1)中PEG減少倍數是4且在超濾/滲濾步驟的階段II(pH 4.5)中是90，給出總減少倍數(階段I和階段II)為大約350倍(最初吸光度為6.9，與之相比在超濾/滲濾步驟結束時獲得的吸光度為0.02)。

在辛酸鹽的情況，在超濾/滲濾步驟的階段I(pH5.1)中減少倍數是55且在超濾/滲濾步驟的階段II(pH4.5)中是13，給出總減少倍數(階段I和階段II)為大約700倍(最初吸光度為2.2，與之相比在超濾/滲濾步驟結束時獲得的吸光度為0.003)。

結果顯示，具有病毒去活能力的試劑(辛酸或辛酸鹽)以及沉澱試劑(PEG)，可通過使用具有大約100kDa的分子 量截留的膜、選擇在超濾/滲濾步驟的每個階段中將施加的物理和化學條件(pH、蛋白濃度、透析體積的倍數、透析緩衝液等等)的單個超濾步驟有效地減少，並產生具有適合於靜脈內使用的以上兩種試劑的某些剩餘濃度、濃縮至10%的IgG的最終產物。

實施例7. 在PEG存在下，對辛酸鹽的病毒去活能力的評價。

取柱流出液或透析和濃縮的流出液(分別根據實施例1和3獲得)作為起始材料進行各個獨立實驗，以評價在PEG的存在下，辛酸或辛酸鹽用於消除或去活帶有脂質包膜的病毒的能力。

兩種材料具有98±2%的免疫球蛋白純度和5至10mg/ml之間的蛋白濃度，而其PEG含量不同，分別為40mg/ml和1.5mg/ml。

病毒去活測試使用40-60nm的黃病毒(Flaviviridae)科的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)進行，該病毒具有脂質包膜和對物理和化學劑的一般耐受(average resistance)。

在每個測試中，將對應的起始材料接種病毒到小於或等於0.5%的值並經受在15ºC或25ºC、施加9mM或13mM的辛酸鹽濃度的病毒去活處理持續2小時。

在產生的不同樣品中BVDV的病毒載量的定量通過使用MBDK細胞系的TCID50測試(50%組織培養物感染劑量)進行。病毒去活步驟的病毒減少倍數(RF)按照以下確定：在接種的起始材料中檢測到的病毒載量除以處理結束時所 得樣品中檢測到的病毒的量的係數，以log₁₀表示。

表9詳述了每種測試的起始材料的特徵、以及獲得的RF。

在所有測試中獲得的病毒減少結果(見表9)顯示在不同溫度(15℃和25℃)處理後，即使對於辛酸鹽的最小9mM濃度，去活兩種起始材料中的BVDV9的高能力。而且，這些測試顯示，在分析的每種PEG濃度，考慮到對兩種評價的材料獲得等同的結果，不存在觀察到的PEG在辛酸鹽的病毒去活能力中的干擾。

實施例8. 根據本發明的生產方法獲得的靜脈內免疫球蛋白溶液的表徵。

意圖確立由本發明的方法獲得的具有10%(w/v)蛋白的免疫球蛋白溶液的生化和功能特徵。

在200升血漿的近似規模，根據實施例1中詳述的方法加工兩批DEAE柱流出液，以獲得用辛酸鹽去活的病毒溶液。

帶有辛酸鹽的該溶液，在被澄清後，如實施例6所述的，通過以有區別的階段的超濾透析和濃縮，目標是實現主要製程殘留物(PEG和辛酸鹽)的消除。隨後，在2.5%的近似蛋白濃度的所述純化的溶液，通過對大約6倍體積的由山梨糖醇1%和甘氨酸240mM組成的、被調整到pH 4.5±0.1的緩衝溶液以恒定體積透析來配製。最後，該溶液通過超濾濃縮並調整到140±5UA(280nm)的光密度，等同於10%(w/v)蛋白，並調整到5.25±0.25的最終pH。

獲得的產物(IGIV10%(w/v))用山梨糖醇和甘氨酸穩定，在澄清和使用滅菌級的膜(0.22μm)過濾後，通過確定品質的最相關分析參數，即用於靜脈內施用的免疫球蛋白溶液的不變性和穩定性，在帶有氯丁基塞子的玻璃瓶中劑量化。對兩個批次獲得的平均分析值、以及歐洲藥典的規格值顯示在表10中。

Eur.Ph.：歐洲藥典；n.e.；未確立；TGT FXI：凝血酶生成測試(使用缺乏因子IX的血漿)；NAPTT PKA：前激肽釋放酶活化物；ACA：抗互補活性。

以上結果增強了，獲得的產物基本上未因為本發明的純化過程在諸如聚合物的不存在、不期望的生物活性諸如PKA或ACA活性等等參數方面改變，保留關於血漿的一些功能特徵諸如IgG亞類和Fc片段完整度未受損傷(intact)，並同時顯示極佳的純度譜(抗-A/抗-B同種血凝素的低滴度、IgM的濃度、促凝血活性等)。

總結，用於獲得IGIV 10%(w/v)，併入在PEG的存在下用辛酸鹽病毒去活和其隨後分離的步驟，以及最後配製的本發明的總方法，是完全可行的，並可放大規模到配製和濃縮為IGIV 10%(w/v)蛋白溶液的最終產物，提供完 全符合歐洲藥典中確立的值的最終產物。

進行的對於產物的商業可行性是必需的穩定性研究，顯示用山梨糖醇(到5%)、甘氨酸(到等滲性)或二者的組合配製，在4.2和6.0之間的pH範圍，對於在環境溫度(25℃-30℃)穩定靜脈內免疫球蛋白的10%(w/v)溶液持續兩年的適合性。

實施例9. 用辛酸鹽處理對通過替代方法獲得的富含IgG的級分的適用性

利用使用替代的純化方法獲得的其他製程中間產物，對在本發明中描述的條件下應用辛酸鹽的有效性進行了評價。

使用來自Cohn-Oncley乙醇分級的稱為級分II懸液的富含IgG的血漿中間產物作為起始材料，進行兩個獨立實驗。

這一中間產物通過本發明中描述的相同血漿分級方法、直到級分II+III獲得。該程序然後以級分II+III的提取懸液的乙醇再沉澱繼續，隨後分離III，最後獲得具有大於96%的純度的級分II。該級分II的懸液，在用膨潤土純化和用水透析以去除乙醇成分後，用作這些實驗的起始材料。

在進行的兩個實驗中，源自兩個血漿批次的材料根據其PEG含量被分為兩個不同組A和組B。在組B中，通過加入PEG-4000的濃溶液，將起始材料調到40mg/ml的標稱PEG濃度。

隨後，來源於兩個組(A和B)的兩種材料被稀釋到5mg/ml的近似蛋白濃度，調整到5.1的pH值，並經受用辛酸鹽處理直到達到13mM的標稱濃度和5.0和5.2之間的pH，如在本發明的方法中描述的。

表11詳述了在兩個測試組(分別是A和B)中使用的起始材料的主要特徵、以及在用辛酸鹽處理後生成的材料的特徵。

(1)PEG和辛酸鹽值對應通過分析確定獲得的值。

結果顯示使用由不同方法足夠地純化的免疫球蛋白溶液，在指定條件下用辛酸鹽去活處理的可行性，不存在引起的免疫球蛋白聚集體或其他不可逆沉澱物的形成，這大大地促進了隨後的純化過程。

結果顯示，與蛋白的足夠稀釋和純度的足夠程度組合，PEG對免疫球蛋白聚合物的生成的保護作用是明顯的。

這一實驗實施例證明，當辛酸鹽被加入到具有足夠純度的材料並遵從關於蛋白和PEG濃度的指定條件時，在非沉澱條件、及/或聚集促進條件下使用辛酸鹽僅作為具有病毒去活能力的試劑的可行性。

儘管已經參照本發明的實施方案呈現和描述了本發明，將理解，這些實施方案不是本發明的限制，因為可存在在製造或其他細節方面的許多變數，在解釋本說明書和申請專利範圍中揭露的主題後，其將對本領域技術人員是明顯的。因此，如果所有變體或等同物可被認為落入以下申請專利範圍的最寬範圍，則它們將被包括在本發明的範圍中。

Claims (24)

1. 一種用於製備免疫球蛋白溶液的方法，該用於製備免疫球蛋白溶液的方法是在聚醚或二醇聚合物的存在下基於具有大於或等於96%純度的免疫球蛋白的初始溶液進行，包括以下步驟：a)向該初始溶液加入辛酸或其鹽；b)調整在步驟a)中獲得的溶液的pH；c)在去活包膜病毒必需的溫度培養在步驟b)中獲得的溶液持續去活包膜病毒必需的時間；以及d)對在步驟c)中獲得的溶液進行超濾及/或滲濾的步驟。
2. 如請求項1所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其進一步包括最終配製步驟d)中獲得的免疫球蛋白溶液的步驟。
3. 如請求項1或2所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的初始溶液來源於根據科恩(Cohn)或科恩-昂科利(Cohn-Oncley)方法獲得的級分I+II+III、級分II+III或級分II，或來源於根據奇石樂/尼赤曼(Kistler-Nitschmann)方法獲得的沉澱A或I+A或GG，或它們的變化形式，該級分I+II+III、該級分II+III或該級分II、該沉澱A或I+A或GG，或它們的變化形式已被另外純化以獲得大於或等於96%的IgG純度。
4. 如請求項3所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方 法，其中該免疫球蛋白的初始溶液來源於根據科恩(Cohn)方法獲得的級分II+III或它的變化形式，該級分II+III或它的變化形式已被通過以聚乙二醇(PEG)沉澱和陰離子色譜隨後純化。
5. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的初始溶液具有1mg/ml至10mg/ml之間的免疫球蛋白濃度。
6. 如請求項4所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的初始溶液具有3mg/ml至7mg/ml之間的免疫球蛋白濃度。
7. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該聚醚或二醇聚合物選自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、或其組合。
8. 如請求項7所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該聚乙二醇(PEG)在該初始溶液中的濃度在2%至6%(w/v)之間。
9. 如請求項7所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該聚乙二醇(PEG)在該初始溶液中的濃度在3%至5%(w/v)之間。
10. 如請求項7至9中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該聚乙二醇(PEG)是具有4000Da的標稱分子量的聚乙二醇(PEG)。
11. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在步驟a)中，加入辛酸或其鹽以實 現在9mM至15mM之間的濃度。
12. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在步驟b)中，將獲得的溶液調整到5.0至5.2之間的pH。
13. 如請求項12所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在步驟b)中，將獲得的溶液調整到5.1的pH。
14. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在步驟c)中，在2℃至37℃之間的溫度培養該溶液持續至少10分鐘。
15. 如請求項13所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在步驟c)中，在20℃至30℃之間的溫度培養該溶液持續2小時。
16. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的初始溶液具有相對於總蛋白小於或等於1%(w/v)的白蛋白含量。
17. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的初始溶液來源於人類血漿。
18. 如請求項1至17中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的初始溶液的免疫球蛋白通過遺傳重組技術、化學合成技術或轉基因蛋白產生技術、或在細胞培養物中獲得。
19. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中步驟d)的超濾及/或滲濾使用100kDa 的膜來進行。
20. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中步驟d)的超濾及/或滲濾以兩個階段進行：第一階段，pH調整到5.0至6.0之間以減少或消除大部分辛酸鹽；以及第二階段，pH調整到小於或等於5.0的值以減少或消除大部分該聚醚或二醇聚合物。
21. 如請求項20所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在步驟d)的超濾及/或滲濾的第二階段中，pH調整到4.0至5.0之間。
22. 如請求項2所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中在最終配製的步驟中，加入賦形劑及/或穩定劑，該賦形劑及/或穩定劑選自一種或複數種氨基酸、一種或複數種碳水化合物或多元醇、或其組合。
23. 如前述請求項中任一項所記載之用於製備免疫球蛋白溶液的方法，其中該免疫球蛋白的最終濃度被調整到適合其靜脈內、肌內或皮下使用的濃度。
24. 一種辛酸或其鹽在至少一種聚醚或二醇聚合物的存在下在免疫球蛋白生產方法中用於病毒去活的用途，其中該聚醚或二醇聚合物和該辛酸或其鹽隨後通過超濾被消除。