KR102372105B1 - 면역글로블린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역글로블린의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다음 단계를 포함하는 글리콜의 폴리에테르 또는 폴리머(중합체) 존재 하 96% 동등 또는 그 이상의 순도를 갖는 면역글로블린의 개시용액에 근거한 면역글로블린의 제조방법이다.
(다음)
a) 개시용액에 카프릴릭산(caprylic acid) 또는 그의 염을 첨가하고;
b) a)단계에서 얻어진 용액의 pH를 조절한 다음;
c) b)단계에서의 얻어진 용액을 봉입된 바이러스의 불활성에 필요한 시간과 온도로 인큐베이션시키고;
d) c)단계에서 얻어진 용액을 한외여과(ultrafiltration)/다이아여과(diafiltration)를 실행하는 단계이다.

Description

면역글로블린의 제조방법{METHOD FOR THE PREPARATION OF IMMUNOGLOBULINS}

본 발명은 면역글로블린의 제조를 위한 새로운 방법에 관한 것이다. 얻어지는 면역글로블린 조성물은 예를 들어 비경구 투여를 위해 적합하다.

면역글로블린은 척추동물의 혈액 및 기타 체액에서 적당한 형태로 존재할 수 있는 당단백질로서, 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 이물질을 확인 및 중화하기 위해 면역계에 의해 사용된다. 면역글로블린은 질병 진단, 치료적 처치 및 태아 치료와 같은 다양한 의료 용도를 갖는다. 면역글로블린의 가장 일반적인 치료 용도는 다음과 같은 세 개의 일반적인 병리 그룹에서의 용도로 분류될 수 있다: 일차 면역결핍증(체액성 면역결핍증), 이차 면역결핍증 또는 후천성 면역결핍증(예를 들어, 바이러스 감염증의 예방 및 치료), 및 자가면역성 면역결핍증(항체의 발생).

면역글로블린은 특히 근육내, 정맥내 및 피하 경로와 같은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 이들 경로 중에서, 정맥내 경로를 사용하는 것이 바람직한데, 이러한 경로가 다수의 이점, 특히 더욱 큰 치료 효능을 나타내기 때문이다.

일반적으로, 면역글로블린은 콘(Cohn) 분획화 방법(Cohn EJ. 등, J Am Chem Soc, 1946, 62, 459-475), 콘-온클레이 (Cohn-Oncley) 방법(Oncley JL. 등, J Am Chem Soc, 1949, 71, 541-550) 또는 차가운 에탄올 분획화에 기반한 다른 방법들, 예를 들어 키슬러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 방법(Kistler P, Nitschmann H, 1962, 7, 414-424)에 기반한 과정들을 이용하여 인간 혈장으로부터 정제된다. 따라서, 위의 방법들 중 임의의 방법을 통해 면역글로블린이 풍부한 분획(예를 들어, II+III 분획, 또는 II 분획, 또는 A 분획, 또는 감마 글로블린 GG 침전물)이 얻어진다. 면역글로블린(IgG)을 더욱 철저하게 정제하고 이들 면역글로블린이 투여, 바람직하게는 정맥내 투여에 허용될 수 있도록 하기 위하여 변형법(modification)들이 소개되어 왔다. 상기 변형법들은, 예를 들어 응집체 및 다른 불순물들을 제거하고 그 제품의 안전성을 확보하기 위하여 소개되어 왔다. 그러나, 면역글로블린의 제조 과정에 다수의 단계들을 추가하면, 그 과정의 수율이 감소하고 제조 비용이 증가한다. 주로 정맥내 투여를 위한 면역글로블린 제품에 대한 증가하는 수요로 인해, 수율은 공업적 규모로 면역글로블린을 제조하는 공정에서 중요한 측면이 되어왔다.

종래 기술에서 기재된 방법들 중에서, 정맥내 경로를 통해 투여될 수 있는 면역글로블린 조성물을 얻는 과정으로는 하기의 단계들을 사용하는 것들이 있다: 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용한 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 불활성화 능력을 갖는 물리적/화학적 방법, 또는 효소를 이용한 처리 및 면역글로블린 분자의 부분적 화학적 변형.

따라서, 병원성 생물학적 제제를 제거하는 능력을 갖는 확고한 단계들을 실시함으로써 제품의 안전성을 확보하는 것이 필요하다. 일반적으로 사용되는 방법은 용매/세제를 사용하여 지질 봉입된 바이러스를 불활성화하는 것을 포함하는데, 이는 단백질들의 생물학적 활성을 심하게 감소시키지 않기 때문이다. 그러나, 용매/세제 혼합물의 독성을 고려하면, 이러한 시약은 최종 제품을 얻기 전에 광범위하게 제거되어야 하므로, 그 공정에 필요한 시간이 증가하고 수율이 감소한다. 상기 용매/세제의 제거를 위해 기재된 과정은 간단하지 않고, 소수성 상호작용을 통해 직접적으로 또는 이온 교환 수지에서 면역글로블린의 간접적인 포착 및 포착되지 않은 용매/세제의 분리를 통한 크로마토그래피 흡착 기법의 사용을 일반적으로 필요로 한다. 모든 경우에 있어서, 그 공정들은 값비싸고 어려워서 단백질의 상당한 손실을 초래한다.

그러나, 바이러스를 불활성화하는 능력을 갖는 더욱 간단하고 더욱 효율적인 대안의 처리법들이 현재 기술 수준에서 알려져 있다. 예를 들어, 카프릴릭 지방산(옥탄산이라고도 알려져 있음) 또는 이의 염이 사용되어 왔다.

미국특허 US 4446134 호에서는, VIII 인자(factor)의 제조 방법에서 카프릴산 나트륨이 아미노산과 함께 사용되고 바이러스 불활성화 과정으로서 열처리가 사용된다. 지질막을 분해할 수 있는 살바이러스제(virucidal agent)는 해리되지 않은 카프릴산인 것으로 판단되긴 하지만, 이러한 살바이러스제를 사용하는 과정은 카프릴레이트(caprylate)의 명칭을 갖는 산 및 이의 이온화 형태의 용액을 표시하는 생화학적 협약(biochemical convention)에 따라 카프릴레이트에 의한 불활성화로서 일반적으로 알려져 있다.

또한, 카프릴산은 면역글로블린을 정제하기 위한 침전제로 사용되어 왔다(Steinbuch, M. 등, Arch. Biochem. Biophys., 1969, 134(2), 279-284). 면역글로블린의 순도 및 수율은 첨가된 카프릴산의 농도 및 pH에 주로 의존한다. 또한, Steinbuch, M. 등은 두 개의 상이한 단계들에서 유효량의 카프릴레이트를 첨가하면서 그 두 단계들의 사이에서 침전물을 제거하는 것이 유리하다고 언급하고 있다. 이렇게 하면, 그 침전물에서 비면역글로블린 단백질의 분포 때문에, 봉입되거나 되지 않은 바이러스를 제거하는 능력이 그 과정에 부여된다.

또한, 침전과 카프릴레이트의 병용 후 면역글로블린의 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피의 기재가 현재의 기술 상태에서 확인된다(상기 Steinbuch, M. 등).

유럽 특허 EP 0893450 호는 II+III 분획(위에서 언급한 콘 방법에 근거한 과정을 통해 얻음)을 이용하여 IgG를 정제하는 방법으로서, 이중 침전 단계에서 15 내지 25 mM의 농도로 카프릴레이트를 첨가하고 그 카프릴레이트의 두 효과, 즉, 침전에 의한 비면역글로블린 단백질의 감소와 인큐베이션에 의한 바이러스 불활성화 능력을 합치는 단계 후 두 개의 일련의 음이온 교환 칼럼들을 포함하는 방법을 개시하고 있다. 다른 불순물(IgM, IgA, 알부민 등)을 제거하는 것 외에도, 후속 음이온 교환 단계를 이용하여 카프릴레이트를 제거하기 때문에, 비교적 많은 양의 음이온 수지를 이용한 이중 흡착이 요구된다.

또한, 특허 출원 PCT WO 2005/082937 호는 면역글로블린을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서, 면역글로블린을 포함하는 용액 또는 조성물에 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트를 첨가한 다음, 상기 용액을 음이온 교환 수지를 갖는 칼럼에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다.
특허출원 PCT WO 2005/082937 호는 카프릴레이트를 이용하는 면역글로블린의 제조 방법을 개시한다. 그러나, 출발 물질에 있어서의 폴리에테르나 글리콜의 중합체의 존재는 언급되지 않고 조(crude)면역글로블린에 있어서의 방법에 첨가된다.

그러나, 본 발명자들은 종래 기술에서 기재된 바와 같이 바이러스 불활성화 능력을 갖는 처리를 제공하기 위하여 적절한 농도 및 pH (예를 들어, pH 5.0 내지 5.2)의 카프릴레이트(caprylate)를 사용하면, 희석 및/또는 pH의 변화를 통해 부분적으로 비가역성이 되는 고분자량의 단백질 응집체가 형성된다는 것을 확인했다. 그러나, 이들 응집체는 여과를 통해서 부분적으로만 분리될 수 있고, 따라서 예를 들어 크로마토그래피 또는 침전을 통해 분리하는 특정의 후속 단계를 필요로 한다. 이들 응집체를 분리하면, 단백질이 상당히 손실되고 면역글로블린 제조의 공업적 공정의 수율이 감소한다.

또한, 본 발명자들은 카프릴레이트를 이용한 처리 동안에 형성된 응집체는 매우 낮은 수준으로 존재하는 경우에도, 최적 공정 조건하에서 한외여과막(ultrafiltration membrane)을 이용한 분리 단계의 직접 적용을 통해 카프릴레이트를 정확하게 제거하는 것을 방해한다는 것을 확인했다. 이들 응집체는 액체 형태의 콜로이드(탁도) 또는 불안정성의 존재로 인해 치료적 농도(예를 들어, 5 % 내지 20 %)의 면역글로블린의 용액의 제조를 저해 또는 방해함으로써, 나노여과 또는 살균 여과와 같은, 면역글로블린 제조 방법의 후속 단계들을 저해 또는 방해한다.

위의 사항 때문에, 본 발명자들은, 놀랍게도 종래 기술에서 기재된 것보다 더욱 낮은 카프릴레이트 농도에서 바이러스를 불활성화하는 능력을 갖는 카프릴레이트 처리를 포함하는 방법으로서, 초기 용액이 적당히 정제 및 희석되면서 글리콜의 적어도 한 종의 폴리에테르 또는 중합체의 존재하에서 응집체의 출현을 억제하고, 방지하고, 외피하고 촉진하지 않는, 면역글로블린 용액의 제조 방법을 개발했다.

또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법에서 글리콜의 적어도 한 종의 폴리에테르 또는 중합체의 존재는 봉입된 바이러스를 불활성화하기 위한 그의 능력의 측면에서 카프릴레이트의 활성 및 효능을 방해하지 않는다는 것을 발견했다.

추가의 측면에서, 본 발명자들은 면역글로블린을 얻는 방법을 최초로 기재하는데, 그 방법은 최적 조건하에서 불활성화 능력을 갖는 처리를 포함하는 외에도, 한외여과 기법을 사용함으로써 카프릴레이트 및 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체 시약(상기 처리 동안에 미리 존재하는)을 제거 또는 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 한외여과 단계는 최종 생성물 내에 면역글로블린 단백질 응집체를 생성하지 않고, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로를 통한 그의 투여에 허용되는 수준까지 그 생성물을 정제 및 농축하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 예를 들어 크로마토그래피와 같은, 카프릴레이트를 이용한 처리 후의 추가의 분리 단계를 도입하기 위한 필요성이 제거된다. 또한, 한외여과 후 잔여 수준의 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체 및 카프릴레이트는, 정확히 제제화(formulation)되는 경우 액체 형태로서의 보존 동안 불안정화되지 않는 20 ± 2 %까지의 면역글로블린(예를 들어, IgG) 농도를 달성하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 방법의 단순화를 고려하면, 생성물의 안전성 및 순도 수준을 손상시키지 않고, 종래 기술에서 기재된 이전의 방법들과 비교하여 수율을 실질적으로 개선하고 제조 비용을 매우 유의하게 감소시키는 것이 가능하다.

따라서, 제 1 측면에서, 본 발명은 글리콜의 적어도 한 종의 폴리에테르 또는 중합체의 존재하에서 카프릴산 또는 이의 염을 면역글로블린의 정제된 용액에 첨가한 다음, 한외여과(ultrafiltration) 및 다이아여과(diafiltration)를 통해 상기 시약을 제거 또는 감소시키는 것을 포함하는, 면역글로블린 용액의 제조 방법에 관한 것이다.

삭제

추가의 측면에서, 본 발명은 단백질 제조 공정에서 바이러스 불활성화를 위해 사용된 카프릴산 또는 이의 염 및/또는 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체를 제거 또는 그 수준을 감소시키기 위해 한외여과 및 다이아여과의 단일 단계를 실시하는 것에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 존재하에 96 % 이상의 순도를 갖는 면역글로블린의 초기 용액에 기초하여 면역글로블린 용액을 제조하는 방법으로서,

a) 상기 초기 용액에 카프릴산 또는 이의 염을 첨가하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 얻은 용액의 pH를 조절하는 단계;

c) 상기 b)단계에서 얻은 용액을 봉입된 바이러스의 불활성화에 필요한 시간 동안 및 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계에서 얻은 용액에 대하여 한외여과 및 다이아여과 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 개시한다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 d) 단계에서 얻은 용액을 최종 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 면역글로블린의 초기 용액은, 콘(Cohn) 또는 콘-온클레이(Cohn-Oncley) 방법에 따라 얻은 I+II+III 분획, II+III 분획 또는 II 분획에서 유래한 것이거나, 키슬러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 방법 또는 이에 대한 변형법(variation)에 따라 얻은 A 또는 I+A 또는 GG 침전물에서 유래한 것이고, 상기 분획 및 침전물은 96 % 이상의 IgG의 순도가 얻어지도록 추가로 정제된 것이다. 바람직하게, 상기 면역글로블린의 초기 용액은, 콘 방법 또는 이에 대한 변형법에 따라 얻어진 분획으로서, 특허문헌 EP 1225180 B1호에 기재된 바와 같이 PEG를 이용한 침전 또는 음이온 크로마토그래피를 통해 나중에 정제된 II+III분획에서 유래한 것이다. 본 특허에 따르면, 상기 분획들 중 임의의 것이 PEG를 이용한 침전 과정을 받은 다음, 그 침전물을 제거하기 위해 여과되고 이온 교환 칼럼(예를 들어, DEAE Sepharose를 갖는 칼럼)을 이용한 추가의 정제 단계를 받을 수 있었다. 이들 경우 모두에 있어서, 상기 면역글로블린의 초기 용액은 인간 혈장에서 유래한 것이다.

가장 바람직한 실시예에서, 상기 면역글로블린의 초기 용액은 알부민 함량이 전체 단백질을 기준으로 바람직하게는 1 % (w/v) 이하이면서, 본 발명의 비침전 조건하에서 카프릴레이트를 이용한 처리를 받기에 충분한 수준의 정제, 즉, 아세트산 셀룰로오스에서 전기영동에 의해 측정된 96 % (w/v) 이상의 IgG 순도 값을 달성하기 위하여 종래 기술에서 기재된 방법들 중 어느 하나의 방법에 의해 추가로 정제되는 분획으로서, 콘 방법에 기반한 과정을 통해 얻은 II + III 분획에서 유래한 것이다. 따라서, 본 발명의 바이러스 불활성화 능력을 갖는 단계 이후에 추가의 정제가 요구되지 않도록 하기 위하여 상기 면역글로블린의 초기 용액은 이것이 예정되는 치료적 투여 경로를 위해 카프릴레이트를 이용한 처리 전 및 후에 충분히 정제된다.

또한, 본 발명에 따른 방법의 초기 용액의 면역글로블린은 유전자 재조합 기법, 예를 들어, 세포 배양물에서의 발현, 화학적 합성 기법, 또는 형질전환 단백질 생성 기법을 통해 얻어질 수 있다.

가장 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법에서 언급된 면역글로블린은 IgG 이다. 상기 IgG는 단클론성 또는 다클론성일 수 있는 것으로 생각된다. 가장 바람직한 실시예에서, 상기 IgG는 다클론성이다.

본 발명의 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체는 폴리글리콜로서도 알려져 있는, 알칸의 폴리에테르 또는 폴리알칸의 산화물일 수 있고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)로서 더욱 잘 알려져 있는, 에틸 또는 에틸렌 및 프로필 또는 프로필렌의 유도체, 또는 이의 균등물을 의미한다. 또한, 상기 시약들은 이들이 이들의 안정성 또는 용해도를 손상시키지 않고 이들의 크기로 인해 한외여과 기법을 통해 순조롭게 제거될 수 있거나 이들의 더욱 낮은 독성으로 인해 면역글로블린의 치료적 사용과 양립할 수 있다는 의미에서 면역글로블린과 양립할 수 있어야 한다.

바람직한 실시예에서, 상기 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체는 PEG이고, 더욱 바람직하게는 3350 Da 내지 4000 Da의 공칭 분자량을 갖는 PEG이고, 가장 바람직하게는 4000 Da의 공칭 분자량을 갖는 PEG 이다.

상기 면역글로블린의 초기 용액에서 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 함량은 바람직하게는 2 % 내지 6 % (w/v) 이고, 더욱 바람직하게는 3 % 내지 5 % (w/v) 이다.

상기 면역글로블린의 초기 용액에서 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 농도를 조절하는 것이 어쩌면 필수적일 수 있는 것으로 생각된다. 상기 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 조절은 면역글로블린의 초기 정제 용액을 희석하고/하거나 이를 첨가함으로써 달성될 수 있다.

면역글로블린의 초기 용액의 조성에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 a) 단계 이전에, 일련의 정제 또는 농도 조절 단계가 수행되는 것으로 생각되는데, 예를 들어 다음과 같다:

1 내지 10 mg/ml, 더욱 바람직하게는 3 내지 7 mg/ml로 면역글로블린 농도의 조절. 이러한 조절은 경우에 따라 예를 들어 단백질을 소정 범위(예를 들어, 280 nm E(1 %) = 13.8 - 14.0 UA에서의 광학 밀도, 뷰렛(Biuret) 방법, 브래포드(Bradford) 방법, 또는 특히 면역비탁법에 의해 전체 단백질에 따라 측정됨)로 희석 또는 농축함으로써 현재 기술 수준에서 알려진 과정들 중 임의의 과정을 통해 달성될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 면역글로블린의 초기 용액은 1 내지 10 mg/ml, 더욱 바람직하게는 3 내지 7 mg/ml의 면역글로블린 농도를 갖는다; 및/또는

전체 단백질을 기준으로 바람직하게는 적어도 96 %의 IgG에 도달하여야 하는 면역글로블린 용액 순도의 조절. 이러한 정제는, 예를 들어 PEG를 이용한 침전, 여과 및 그 이후의 음이온 교환 크로마토그래피(DEAE Sepharose)와 같은, 당업자에게 충분히 알려진 기법들을 통해 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 a) 단계에서, 카프릴산 또는 이의 염이 바람직하게는 이의 농축 용액(예를 들어, 1.5 M 내지 2.5 M)을 이용하여 첨가되어, 바람직하게는 9 mM 내지 15 mM의 최종 농도를 달성한다.

바람직한 실시예에서, b) 단계에서는, 얻어지는 용액은 5.0 내지 5.2, 더욱 바람직하게는 5.1 의 pH로 조절된다.

바람직한 실시예에서, c) 단계에서는, 얻어지는 용액은 적어도 10 분, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 시간, 더 더욱 바람직하게는 2 시간 동안 인큐베이션된다. 또한, 상기 인큐베이션이 수행되는 온도는 2 ℃ 내지 37 ℃, 더욱 바람직하게는 20 ℃ 내지 30 ℃이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법의 d) 단계에서는, c) 단계에서 얻은 용액에서 고분자량 중합체 또는 응집체의 함량은 0.2 % 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 % 이하이다. 전체 단백질을 기준으로 한 면역글로블린의 중합체 또는 분자 응집체의 이러한 비율은 280 nm에서의 광학 밀도에 따라 배제 HPLC 겔 칼럼을 통해 결정된다. 상기 면역글로블린의 중합체 또는 분자 응집체의 비율은, 예를 들어 유럽 약전의 정맥내 감마글로블린의 모노그래프에 기재된 분석 방법을 이용하여 평가될 수 있다.

바람직하게, 상기 면역글로블린의 용액은 한외여과 및 다이아여과 단계 d)를 수행하기 전에 심층여과 필터(depth filter)를 이용하여 정화될 수 있다.

d) 단계에서, 본 발명에 따른 방법에서의 한외여과 및 다이아여과는 부피의 감소를 통한 다이아여과 및 농축의 초기 단계 및 그 이후의 일정한 부피에서의 다이아여과의 적용 단계를 갖는 것이 바람직한 것으로 생각된다.

상기 한외여과 및 다이아여과는, 단백질의 농도가 최적이고 바람직하게는 30 mg/ml 이라는 사실을 고려하여, 시약의 소비가 어느 정도 더욱 낮아지고 공정이 더욱 효율적이도록 하기 위하여, 바람직하게는 생성물의 부피을 감소시키고 다시 다이아여과하면서 투석 및 농축을 동시에 수행하는 방법을 통해 공업적 규모로 수행될 수 있다. 어느 경우에도, 당업자는 현재 기술 수준에서 알려진 다양한 조작 과정들(예를 들어, 희석/농축 또는 다이아여과/농축, 일정한 부피에서의 다이아여과, 또는 이들의 변형 또는 조합)중에서 선택되는 것으로, 상기 한외여과 및 다이아여과 단계를 수행하는 가장 적절하고 실용적인 방법을 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 d) 단계에서 사용된 한외여과 및 다이아여과 막은, 예를 들어, Biomax® (Millipore사, 미국), Omega® (Pall사, 미국), Kvik-flow® (General Electric사, 미국)의 상표명으로 시판되는 막들과 같이, 폴리설폰, 재생 셀룰로오스 또는 이의 균등물로 구성되는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 막에 대하여 선택된 분자량 컷오프(cutoff)는 여러 가지 요인, 예를 들어 선택된 제조사에 따라 변화할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 처리하고자 하는 용액에서 카프릴레이트의 농도 또는 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 농도에 따라 각각의 경우의 요건으로 조절되는 막을 용이하게 선택할 수 있다.

바람직하게, 한외여과 및 다이아여과의 d) 단계는 100 kDa 이하, 더욱 바람직하게는 100 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하여 달성될 수 있다.

가장 바람직한 실시예에서, d) 단계의 상기 한외여과 및 다이아여과는 하기의 두 단계(phase)로 수행된다:

카프릴레이트를 감소시키거나 대부분을 제거하기 위하여 pH 가 5.0 내지 6.0으로 조절되는 제 1 단계(phase), 및 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체를 감소시키거나 대부분을 제거하기 위하여 pH가 5.0 미만, 바람직하게는 4.0 내지 5.0으로 조절되는 제 2 단계.

바람직한 실시예에서, 상기 한외여과 및 다이아여과 단계의 제 1 단계에서는, 그 다이아여과는 카르복실산, 예를 들어 아세트산의 알칼리 염을 약 5 mM의 농도로 포함하는 다이아여과 매질을 이용하여 수행된다. 가장 바람직한 실시예에서, 상기 다이아여과는 상기 언급한 pH, 즉 5.0 내지 6.0의 pH로 조절되는 5 mM 이상의 농도에서 아세트산나트륨의 용액을 이용하여 수행된다.

한외여과 및 다이아여과의 d) 단계의 제 1 단계에서 수행될 다이아여과 부피 배수는 초기에 사용된 카프릴레이트의 양 및 허용가능한 최종 품질에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 3 배 부피의 다이아여과 매질이 사용되는데, 상기 다이아여과 매질은 위에서 언급한 바와 같이, pH 5.0 내지 6.0의 아세트산 나트륨의 5 mM 용액인 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 한외여과 및 다이아여과의 제 1 단계에서, 상기 초기 카프릴레이트의 약 90 % 이상이 제거됨으로써, 이러한 제 1 단계에서 카프릴레이트의 농도는 약 1 mM 이하로 감소된다.

상기 한외여과 및 다이아여과 단계 d)의 제 2 단계에서, 면역글로블린 용액이 바람직하게는 일정한 부피에서 다이아여과된다.

바람직하게, 상기 한외여과 및 다이아여과의 제 2 단계는 위에서 나타낸 pH 값에서 아세테이트, 포스페이트 또는 이의 균등물, 또는 아미노산 및/또는 폴리올, 예를 들어 글리신 및/또는 폴리올로 형성된 알칼리 금속염을 함유하는 완충 용액을 이용하여 수행된다.

상기 다이아여과의 제 1 단계의 경우에서와 같이, 제 2 단계에서 본 발명에 따른 방법에서 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체를 적당히 감소시키기 위하여 사용되는 투석 부피의 배수는 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 필요한 감소 또는 제거를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 한외여과 및 다이아여과 단계 d)의 다이아여과에서 교환될 완충액의 양은 6배 부피 이하이다. 가장 바람직한 실시예에서, 상기 제 2 단계에서는, 그 교환은 한외여과 및 다이아여과 단계 d)를 개시하기 전에 상기 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 초기 함량의 100 배 이상으로 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체의 감소를 얻는데 필요한 완충액의 부피 배수에 따라 수행된다.

상기 카프릴레이트 및 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체가 한외여과 및 다이아여과 단계 d)에서 감소되면, 상기 언급한 최종 제제화 단계에서 그 용액은 그 생성물을 농축하여 최종 제형을 달성하는데 필요한 부형제 및/또는 안정화제를 첨가하여 원하는 최종 조성으로 조절될 수 있다. 최종 제제화 후에 수행될 부형제 및/또는 안정화제의 첨가는 고체 형태 또는 농축 용액 형태의 부형제 및/또는 안정화제를 첨가하거나, 더욱 바람직하게는 최종 생성물의 적절한 조성을 확보하는데 필요한 제제화 용액 교환 부피 배수를 이용한 다이아여과를 통해 직접 달성될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 상기 부형제 및/또는 안정화제의 첨가는 d) 단계의 제 2 단계에서 사용된 아세트산 나트륨의 투석 완충 용액을, 최종 농축 후 면역글로블린이 제제화되도록 4.0 내지 5.0 의 동일한 pH로 바람직하게 조절되는, 부형제 및/또는 안정화제를 포함하는 용액으로 완전히 또는 부분적으로 교체함으로써 수행된다.

당업자는 원하는 용해도를 달성하기 위하여 무슨 유형의 부형제 및/또는 안정화제가 첨가되어야 하는지를 알고 있다. 예를 들어, 상기 부형제 및/또는 안정화제는, 바람직하게는 0.2 내지 0.3 M의 농도의 한 종 이상의 아미노산, 예를 들어 글리신, 한 종 이상의 탄수화물 또는 폴리올, 예를 들어 소르비톨, 또는 이들의 조합일 수 있는 것으로 생각된다.

끝으로, 면역글로블린, 바람직하게는 IgG의 최종 농도는 당업자에게 알려져 있는, 이의 정맥내, 근육내 또는 피하 사용에 적당한 농도로 조절되고, 예를 들어, 5 % 내지 22 % (w/v)일 수 있다. 상기 농도는 당업자에게 알려진 임의의 과정, 예를 들어 한외여과를 통한 농축을 통해 달성된다. 상기 면역글로블린의 농축이 한외여과를 통해 달성되는 경우, 상기 농축은 이전의 다이아여과에서와 동일한 막을 이용하여 수행될 수 있는 것으로 생각된다. 명백히, 위에서 언급한 세 번의 다이아여과뿐 아니라 농축은 상이한 막들을 이용하여 수행될 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 생성물의 안정성 마진(margin)을 증가시키기 위하여 나노여과 단계를 도입할 수 있는 것으로 생각된다. 생성물이 20 nm 이하 내지 50 nm까지의 공극 크기, 바람직하게는 20 nm 이하 또는 심지어는 15 nm의 공극 크기를 갖는 상업적으로 이용가능한 필터(예를 들어, Asahi-Kasei사에 의해 제조된 Planova® 및 Bioex®, Pall사에 의해 제조된 DV® 및 SV4®, Sartorius사에 의해 제조된 Virosart®, Millipore사에 의해 제조된 Vpro®, 또는 이들의 균등물)를 이용하여 나노여과될 수 있는 과정에는 다수의 단계들이 있다. 나노여과 단계가 수행될 수 있는 중간 단계들은 예를 들어, 면역글로블린의 초기 용액, 또는 한외여과 및 다이아여과 단계 후(카프릴레이트 및 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체가 감소된 후) 카프릴레이트로 처리된 물질, 또는 면역글로블린, 바람직하게는 IgG의 용액을 농축 및 제제화한 후의 물질(최종 생성물)에 대한 것이다. 당업자는, 특히 막의 공극 크기, 과정의 시간에 따라 요구된 여과 면적, 나노여과하고자 하는 생성물의 부피, 및 단백질 회수율에 따라 최상의 옵션을 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 의해 얻어지는 최종 생성물은 혈구응집소의 함량에 관한 유럽 약전의 기준을 완전히 만족시킨다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 그의 감소를 최대화하기 위하여 항-A 및/또는 항-B 혈액 항체를 선택적이고 특이적으로 포착하는 단계를 포함하는 옵션을 생각하기도 한다. 이러한 단계는 현재 기술 수준에서 기재된 바와 같이 이중특이성(biospecific) 친화성 수지를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 삼당류로 형성된 리간드를 갖는 이중특이성 친화성 수지를 이용함으로써, 동종혈구응집소 수준의 유의한 감소가 달성될 수 있다(Spalter 등, Blood, 1999, 93, 4418-4424). 이러한 추가의 포착은 본 발명의 방법의 임의의 단계에서 당업자의 재량으로 선택적으로 포함될 수 있거나, 본 발명의 방법을 수행하기 전 또는 후에 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 면역글로블린 용액의 제조 방법에서, 가장 바람직한 실시예에서는 96 % 이상의 IgG 순도를 갖는 면역글로블린의 초기 용액이 사용된다. 이러한 용액은 1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 3 mg/ml 내지 7 mg/ml의 IgG 농도로 조절되고, 4 ± 1 % (w/v)의 농도로 PEG를 함유(이전의 단계에서의 첨가를 통해)하거나 PEG가 첨가되는 것이다. 다음에, 상기 용액의 pH는 아세트산을 이용하여 5.0 내지 5.2 로 조절되고, 카프릴산 나트륨이 첨가된다(예를 들어, 상기 카프릴산 나트륨의 농축 용액을 이용하여). 바람직한 실시예에서, 상기 카프릴레이트의 농축 용액은 IgG의 정제 용액에 교반하면서 서서히 첨가된다. 그 생성물이 9 내지 15 mM의 카프릴레이트가 되게 하도록 계산된 모든 카프릴레이트가 첨가된 후, 최종 pH가 필요한 경우 5.0 내지 5.2로 조절되고, 그 용액은 바람직하게는 2 내지 37 ℃의 온도, 더욱 바람직하게는 25 ± 5 ℃의 온도에서 적어도 10분, 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션된다.

다음에, 심층여과 필터(예를 들어, Cuno 90LA, 50LA, Seitz EK, EK-1, EKS, 또는 이의 균등물)을 이용하여 정화(clarification)가 수행된다.

다음에, 이와 같이 얻어지는 용액은, 바람직하게는 적층가능한 카세트 형태의 폴리설폰을 포함하는 막, 예를 들어 Millipore사의 Biomax® 또는 Pall사의 Omega®로 형성된 한외여과 및 다이아여과 장치를 이용하여 처리된다. 다음에, 그 용액은 바람직하게는 약 100 내지 500 L/h의 부피 및 5 ± 3 ℃의 온도에서 각각의 각각의 한외여과 및 다이아여과 유닛(unit)을 통해 재순환된다. 입구 압력과 출구 압력(대기압) 사이의 압력 강하는 1 내지 3 bar인 것이 바람직하다. 다음에, 5 mM 이상의 농도 및 5.0 내지 6.0의 pH에서 바람직하게는 아세트산 나트륨의 용액으로 형성된 적어도 3배 부피의 완충액을 적용하면서, 카프릴레이트를 제거하기 위하여 한외여과 및 다이아여과 단계의 제 1 다이아여과 단계가 시작된다. 바람직하게는, 각각의 부피의 완충액이 첨가 또는 소비되면서, 생성물의 용액의 부피이 마지막 첨가를 제외하곤 초기 부피의 절반으로 감소된다.

다이아여과의 제 1 단계(희석 및 농축 또는 이의 균등 방법에 의해)후, 얻어지는 용액의 pH는, 예를 들어 아세트산을 이용하여 4.0 내지 5.0으로 조절된다. 다음에, 바람직하게는 5 mM 이상의 농도 및 4.0 내지 5.0의 pH에서 아세트산 나트륨으로 형성된 6 배 부피 이상의 완충 용액을 이용하여 일정한 부피에서의 다이아여과가 시작된다.

선택적으로, 상기 언급된 아세트산 나트륨으로 형성된 투석 완충 용액은, 최종 농축 후 면역글로블린이 이미 제제화되도록 하기 위하여, 탄수화물 또는 폴리올, 예를 들어 폴리올이 선택적으로 결합된 0.2-0.3 M 농도의 아미노산, 예를 들어 글리신의 용액으로 부분적으로 또는 완전히 대체될 수 있다.

4.0 내지 5.0의 pH에서 바람직하게는 적어도 6 배 부피(더욱 바람직하게는 6 내지 10 배 부피)의 상기 언급된 투석 용액을 적용한 후, 그 생성물은 이미 제제화되어 있지 않은 경우, 얻어지는 용액에 부형제(들) 및/또는 안정화제(들), 예를 들어 글리신 또는 다른 아미노산 외에도, 탄수화물, 예를 들어 소르비톨, 또는 이들의 조합을 고체 상태 또는 농축 용액 형태로 직접 첨가함으로써 제제화될 수 있다. 다음에, 부피 감소를 통해 얻어지는 IgG 용액은 정맥내, 근육내 또는 피하 사용에 적절한 IgG 농도를 달성하기 위해 농축된다.

부형제(들) 및/또는 안정화제(들)의 농도 및 pH가 적당히 조절된 사익 농축 용액은 0.2 ㎛의 공극 크기를 갖는 필터를 이용한 절대 여과(absolute filtration)를 통해 적용되고, 선택적으로 나노여과된다. 끝으로, 그 IgG 용액은 주사용 제제, 앰풀, 바이알, 병 또는 다른 유리 용기에 무균적으로 분배된 후 밀봉된다. 또 다른 선택적인 방법은 양립할 수 있는 단단하거나 유연한 플라스틱 용기, 예를 들어 백 또는 병에 용량분배(dosification)하는 것이다.

그 분배된 생성물은 검역 및 시각적 검사를 받은 후 적어도 2 년의 보존 기간 동안 2 내지 30 ℃의 온도에서 저장된다.

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이하, 본 발명을 여러 실시예들을 참조하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라, 본 발명의 설명을 예시하기 위한 것이다.

실시예

실시예 1. 바이러스에 대하여 안전하고, 응집체가 없고 산업적으로 적용하기에 충분한 수율을 갖는 면역글로블린 용액을 혈장으로부터 얻기 위한 본 발명에 따른 방법.

출발 물질은 유럽특허 EP 1225180B1 호에 기재된 방법을 통해 얻어진 것으로, IgG를 주요 단백질 성분으로서 함유하는 16 리터의 면역글로블린 용액이었다. 요약하면, 상기 용액은 콘 방법을 이용하여 II+III 분획으로부터 감마글로블린을 추출함으로써 얻어졌다. II+III 분획으로부터 감마글로블린의 이러한 추출을 수행하기 위하여, 상기 분획은 에탄올을 이용한 인간 혈장의 분획화를 통해 미리 분리했다. 다음에, 이를 탄수화물의 존재하에서 현탁하고, 동반되는 주요 단백질의 함량을 PEG-4000을 이용한 침전을 통해 감소시켰다. 끝으로, 그 분획의 최종 정제를 이온 교환 수지 칼럼(DEAE Sepharose)에서의 흡착을 통해 수행했다. 이와 같이 얻어지는 칼럼 유출물(effluent)(수지, 즉 DEAE에 흡착되지 않은 분획)은 아세트산 셀룰로오스(ACE)에서 98 ± 2 %의 면역글로블린의 전기영동 순도, 6.0의 pH, 2.6 네펠로법 탁도 단위(Nephelometric Turbidity Units (NTU))의 탁도, 및 약 5 mg/ml의 IgG 농도를 가졌다.

얻어진 용액은 아세트산을 첨가하여 5.1 의 pH로 조절했고, 2 내지 8 ℃의 온도로 조절했다. 다음에, 이러한 면역글로블린 용액은 카프릴산 나트륨의 농축 용액을 첨가하여 13 mM의 최종 농도로 조절했다.

상기 카프릴레이트를 갖는 면역글로블린 용액을 25 ℃까지 가열하고 이러한 온도에서 느린 교반하에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 과정 동안에, pH는 5.10 ± 0.05 에서 유지했다. 얻어지는 용액의 탁도는 17.3 NTU 였다.

상기 카프릴레이트를 이용하여 처리한 용액을 약 8 ℃의 온도까지 냉각한 다음, 심층여과 필터(CUNO®, Ultrafilter사, 덴마크)를 이용하여 정화했다. 상기 정화(세정 포함)로부터 약 20 리터의 여액을 얻었는데, 이는 약 4 mg/ml의 IgG 농도 및 3 NTU 미만의 탁도를 가졌다.

상기 정화된 용액을 100 kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 막(Biomax®, Millipore사, 미국)을 이용한 한외여과를 통해 투석했다. 상기 한외여과는 다음과 같이 두 개의 상이한 단계로 수행했다. 제 1 단계에서는, 5.1 의 pH를 갖는 물질은, pH 5.1 로 조절된 아세테이트의 5 mM 용액을 이용한 다이아여과 및 약 30 UA로의 농축을 통해 3 개의 순차적인 투석 및 농축 단계를 받았다. 제 2 단계에서는, 충분한 농도의 단백질, 카프릴레이트 및 PEG를 갖는 용액을 pH 4.5 ± 0.1로 조절한 다음, pH 4.5 에서 8 배 부피의 아세테이트의 5 mM 용액을 이용하여 투석을 시작했다. 다음에, 그 생성물을 pH 4.2 에서 약 20 리터의 200 mM 글리신 용액을 이용한 투석을 통해 제제화하고, 10 % (w/v)의 농도를 갖는 IgG 용액을 얻는 목적으로 동일한 한외여과 유닛에서 140.5 UA의 값으로 농축했다.

끝으로, 상기 용액을 심층여과 필터(CUNO®, Ultrafilter사, 덴마크) 및 0.22 ㎛의 공극 크기를 갖는 절대(absolute) 필터 또는 막(CVGL®, Millipore사, 미국; 또는 DFL®, PALL사, 미국)을 이용하여 여과했다.

하기 표 1은 전술한 방법에 따른 출발 물질, 다수의 중간 생성물 및 최종 생성물의 특성규명 결과를 보여준다. 상기 표에 포함된 결과에 있어서, 탁도는 네펠로법(nephelometry)에 의해 측정되었고, 검출된 전체 단백질에 대한 면역글로블린의 중합체 또는 분자 응집체의 비율(%)은 280 nm에서의 광학 밀도에 따라 배제 HPLC 겔 칼럼을 통해 결정되었고, 카프릴레이트의 농도는 비색 기질(colorimetric substrate)의 정량을 통해 효소적 방법을 이용하여 결정되었고, PEG의 농도는 굴절률 검출기를 이용한 HPLC 여과 겔 칼럼을 통해 결정되었고, 공정의 회수율(%)은 네펠로법에 의해 정량된 IgG 농도에 따라 계산되었다.

본 실시예의 결과는 상기 언급한 정제된 용액의 카프릴레이트를 이용한 처리는 면역글로블린 응집체 또는 다른 침전물의 형성을 전혀 유발하지 않으면서, 생성물의 분자 분포를 변화되지 않은 상태로 유지한다는 것을 나타낸다. 따라서, 카프릴레이트를 이용한 처리 후, 응집체 및/또는 침전물을 제거하기 위한 정제 단계가 필요하지 않았다. 이러한 사실은 제조 공정을 크게 촉진했고 한외여과 막에의 물질의 직접적인 적용을 가능하게 했다.

실시예 1의 방법에서 출발 물질, 다수의 중간 생성물 및 최종 생성물에 대하여 얻은 결과

시료	IgG 농도(mg/ml)	탁도(NTU)	응집체(중합체/이합체)(%)	카프릴레이트 농도(mM)	PEG 농도(mg/ml)	회수율(%)
출발 물질(pH 5.1로 이미 조절된 이온 교환 칼럼 유출물)	4.6	2.6	<0.1/3.0	0	38.4	100
카프릴레이트를 이용하여 처리된 물질	4.3	17.3	<0.1/3.0	12.1	38.2	97.8
정화된 물질	3.7	2.2	<0.1/2.8	11.1	38.0	95.2
최종 생성물	99.1	3.5	<0.1/2.7	0.1	0.1	89.4

따라서, 나중의 한외여과 공정은 제조 공정의 화학적 시약(즉, PEG 및 카프릴레이트)를 효율적으로 감소시키는 외에도, 그의 치료적 사용에 적절한 조성을 얻기 위하여 면역글로블린의 정제 용액을 나중에 제제화 및 농축하는 것을 가능하게 하는 목적을 만족스럽게 달성했다.

상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 출발 유출물로부터 10 % 농축 생성물까지, 이러한 경우에 얻어진 단백질 회수율은 89.4 % 이므로, 공업적 규모로 이러한 공정의 실행가능성을 알 수 있다. 이러한 회수율은 특허 출원 PCT WO 2005/073252호에서 기재된 바와 같은 현재 기술 수준에 따른 방법에 의해 얻어진 값(초기의 6.8 g/l와 비교하여 4.8 g/l의 수율에 근거한 70 % 수율)보다 컸다.

실시예 2. 카프릴레이트를 이용한 처리에 있어서 면역글로블린의 초기 용액의 순도의 영향

본 실시예에서는, 본 발명의 방법을 받은 출발 물질에서 동반(accompanying) 단백질의 존재 및 면역글로블린의 초기 용액의 순도의 영향을 평가했다.

다음과 같은 두 개의 독립적인 실험 그룹을 만들었다:

A 그룹의 경우, 출발 물질은 98 ± 2 % IgG의 전기영동 순도(ACE)를 갖는 DEAE Sepharose 칼럼 유출물, 즉 실시예 1에서 사용된 출발 물질이었다.

B 그룹의 경우, 4 % PEG 여액(filtrate)으로 지명된 출발물질을, DEAE Sepharosa 크로마토그래피 이전의 단계까지 실시예 1에서 기재된 바와 동일한 공정을 통해 얻었다. 따라서, B 물질은 II+III 분획의 추출 현탁액의 PEG를 이용한 침전 후에 얻었고, 약 90 % IgG의 전기영동 순도를 가졌다.

약 4 %의 동등한 PEG 함량을 갖는 출발 물질(A 그룹 및 B 그룹)은 13 mM의 농도 및 5.0 내지 5.2 의 pH에서 카프릴레이트를 이용하여 처리했고, 실시예 1에서 나타낸 바와 같이 정제했다.

하기 표 2는 두 시험 그룹(각각 A 및 B)에서 사용된 출발 물질들의 주요 특성 및 카프릴레이트를 이용한 처리 이후의 단계들에서 제조된 물질의 특성을 나타내고 있다.

실시예 2에서 기재된 A 및 B 그룹에 대하여 본 발명의 방법의 다수 단계들에서 얻은 탁도 및 응집 비율(%) 결과

출발 물질(그룹)	순도(%)	알부민 함량 (mg Alb/g IgG)	카프릴레이트릴 이용한 처리 전의 용액			카프릴레이트릴 이용한 처리 후의 용액		인큐베이션(25 ℃에서 2 시간)후의 용액
			O.D. 280 nm(UA)	탁도 (NTU)	응집체, 중합체 (%)	탁도 (NTU)	응집체, 중합체 (%)	탁도 (NTU)	응집체, 중합체 (%)
칼럼 유출물(A)	97.9 ± 1.5	<0.4	6.7	2.9	<0.1	15.1	<0.1	17	<0.1
PEG를 이용한 처리후의 여액	90.2 ± 2.9	36	8.3	8	1.9	517	0.9	591	1.0

얻어지고 표 2에서 나타낸 결과들은 불활성화에 효과적인 농도(13 mM)의 카프릴레이트를 더욱 낮은 순도(약 90 % IgG, B 그룹 참조)의 물질에 첨가하면, 그 용액의 성분들의 침전이 발생하여, 탁도가 크게 증가(500 NTU 이상)한다는 것을 나타냈다. 따라서, 그 용액에 대한 분자 분포 결과들은 고분자량을 갖는 동반 단백질들의 일부의 침전을 나타냈다.

저순도의 물질에 위에서 기재한 양으로 및 조건(13 mM의 카프릴레이트, 5.0 내지 5.2 의 pH)하에서 카프릴레이트를 첨가하면, 침전된 현탁액이 얻어졌으므로, 고분자량 단백질 및 침전된 응집체를 분리하기 위하여 추가의 분리 및 정제 단계를 포함시킬 필요가 있었다. 그러므로, 1 %를 초과하는 응집체 함량을 갖는 것으로, 카프릴레이트를 이용하여 처리한 A 그룹의 생성물의 분자 조성은, PEG를 이용한 침전 단계, 크로마토그래피 또는 이의 균등 방법들과 같은 추가의 정제 또는 분리 단계들이 포함되지 않는 경우, 이러한 생성물을 정제된 최종 생성물로 전환하는 것이 실현될 수 없다는 것을 나타낸다. 끝으로, 이러한 사실은 카프릴레이트가 충분한 순도의 물질에 첨가되는 경우에만, 비침전 조건하에서, 바이러스 불활성화 능력을 갖는 작용제로서 카프릴레이트를 사용하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.

실시예 3. 응집물의 발생에 대한 출발 물질의 조성의 영향

본 실험의 목적은 카프릴레이트를 이용한 처리가 적용되는 면역글로블린의 초기 용액의 조성의 영향을 평가함에 있다.

순도가 동등(97.9 ± 1.5 %)하지만 조성이 상이한 두 개의 독립적인 실험 그룹(A 및 B)을 만들었다.

A 그룹의 경우, 출발 물질은 5 ± 2 mg/ml의 단백질 농도 및 4 ± 1 %의 PEG-4000 농도를 갖는 칼럼 유출물(실시예 1에서 기재한 초기 방법에 따라 얻음)이었다.

B 그룹의 경우, 농축 및 투석된 유출물로 지명된 출발 물질은 A 그룹에 대하여 언급된 것과 동일한 칼럼 유출물이지만, 농축 및 투석된 후의 것이었다. 따라서, DEAE 칼럼 유출물(실시예 1에서 언급되고 본 실시예의 A 그룹에 해당하는 것)은, PEG 함량이 약 6배 정도 감소되고 단백질이 약 4 %, 즉 40 mg/ml의 값으로 농축되도록 한외여과를 통한 추가의 투석 및 농축 단계를 받았다.

두 실험 그룹(A 및 B)에서 얻은 물질은 13 mM의 농도 및 5.0 내지 5.2의 pH에서 카프릴레이트를 이용하여 처리하고, 10 %의 IgG 농도를 갖는 생성물을 얻기 위하여 실시예 1에서 기재된 조건하에서 한외여과했다.

하기 표 3은 상기 언급된 실험 그룹 A 및 B에서 처리된 물질의 주요 특성 및 각각의 실험 그룹에 대하여 카프릴레이트를 이용한 처리 이후의 단계에서 발생된 물질 및 다이아여과 및 농축된 최종 생성물에서 발생된 물질의 특성을 나타내고 있다.

실시예 3의 A 및 B 그룹에서 본 발명의 방법의 다수 단계들에 대하여 얻은 결과

출발 물질(그룹)	출발 물질			공칭 카프릴레이트(mM)	카프릴레이트 첨가후의 용액		농축된 최종 생성물
	IgG (mg/ml)	PEG (mg/ml)	순도(%)		탁도(NTU)	응집체, 중합체 (%)	카프릴레이트(mM)	응집체, 중합체 (%)
칼럼 유출물 (A)	5 ± 2	40 ± 10	97.9 ± 1.5	13	7.0	<0.1	<0.1	<0.1
					9.8	<0.1	0.1	<0.1
					11.9	<0.1	0.1	<0.1
농축 및 투석된 유출물(B)	~40	~6	98 ± 2	13	11.9	0.5	0.3	0.3
					13.4	0.4	0.5	0.5
					10.0	0.3	0.5	0.4

상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 그 결과는 5 ± 2 mg/ml의 농도에서 및 40 ± 10 mg/ml (4 ± 1 %)의 PEG 농도의 존재하에서 면역글로블린의 정제 용액을 상기 특정한 조건하에서 카프릴레이트를 이용하여 처리하면(A 그룹, 칼럼 유출물), 면역글로블린의 용액이 전혀 변경되거나 응집되지 않아서, 0.1 %의 검출불가능한 비율의 응집체를 가지면서 카프릴레이트의 첨가 동안 및 후에 생성물의 분자 분포가 변화되지 않고 유지된다는 것을 입증한다.

그러나, 카프릴레이트를 이용한 처리를 위한 이러한 동일한 조건이 낮은 PEG 함량(<1 %)을 갖는 물질에 적용된 때(B 그룹), 카프릴레이트의 첨가 후 면역글로블린 응집체의 실질적인 증가가 관찰되었다. 또한, 사용된 조건하에서 한외여과를 통해 이러한 응집체 함량을 제거하는 것이 불가능했고, 최종 생성물에서 유사한 수준의 중합체가 측정되었다.

실험 그룹 A 및 B에서 사용된 출발 물질들 사이의 주요한 차별적인 특성이 단백질 농도 및 PEG 농도라는 것을 감안하여, 카프릴레이트를 이용한 나중의 처리에 대한 이들 파라미터의 각각의 영향을 확인하는 목적으로 추가의 실험을 수행했다.

이러한 실험에서는, 출발점은 네 개의 별개의 실험 그룹(B1, B2, B3 및 B4 그룹)으로 분리되는, 농축 및 투석된 유출물(이전의 그룹 B의 초기 물질)의 단일 배치(single batch)였다.

B1 그룹의 물질은 약 4 %의 단백질 농도 및 약 0.6 %의 PEG 농도에서 처리하였다.

B2 그룹의 물질은 약 4 %의 동일한 단백질 농도에서 처리하였으나, PEG 함량은 4 ± 1 % (w/w)의 값으로 다시 조절하였다.

B3 및 B4 그룹의 경우, 그 물질은 0.5 ± 0.2 %의 단백질까지 희석하였다. PEG 함량은 B3 그룹의 경우 약 0.6 % (w/w)로 조절된 반면, B4 그룹의 경우 그 PEG 함량은 4 ± 1 % (w/w)로 다시 조절하였다.

네 개의 실험 그룹에서 얻은 물질은 5.10 ± 0.05의 pH 및 15 mM의 카프릴레이트 농도로 조절한 다음, 25 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 얻어진 결과는 하기 표 4에서 나타낸다.

초기물질에 대하여 얻은 결과 및 실시예 3의 B1, B2, B3 및 B4 그룹에 대한 카프릴레이트와의 인큐베이션 후에 얻은 결과

실험 그룹	출발 물질				25 ℃에서 2 시간 동안 15 mM 카프릴레이트를 이용하여 처리한 용액
	IgG(mg/ml)	PEG(mg/ml)	탁도(NTU)	응집체, 중합체(%)	응집체, 중합체(%)
B1	~40	~6	1.5	<0.1	0.5
B2	~40	40 ± 6	2.5	<0.1	0.3
B3	5 ± 2	~6	1.3	<0.1	0.5
B4	5 ± 2	40 ± 6	1.3	<0.1	<0.1

상기 표 4에서 나타낸 결과는 확립된 조건하에서 카프릴레이트를 이용한 처리 동안, PEG 보호 효과가 충분한 단백질 희석액과의 병용시 관찰되었다는 것을 나타낸다. 출발 물질이 약 5 ± 2 mg/ml의 단백질 농도 및 4 %의 PEG 농도를 갖는 경우, 검출불가능한 값(<0.1 %)의 응집체가 카프릴레이트를 이용한 처리 후에 얻어졌다는 것은 주목할 만하다.

실시예 4. 카프릴레이트를 이용하여 처리한 면역글로블린 용액의 용해도에 대한 pH의 영향

면역글로블린 용액에서 PEG를 제거하고 상기 면역글로블린을 이의 치료적 사용에 적절한 농도로 농축하는 것은 바람직하게는 약 4.5 의 pH 값에서 일어난다는 알려져 있다.

또한, 그의 pKa(4.89) 미만의 pH 값에서 카프릴산의 비용해성을 고려하여, 본 실험에서는 그의 한외여과를 시작하기에 적절한 pH 값을 확립하는 목적으로, 카프릴레이트를 이용하여 처리한 면역글로블린 용액의 용해도에 대한 pH의 영향을 평가했다.

이를 위하여, 실시예 1에서 기재한 초기 방법에 따라 얻은 칼럼 유출물의 배치(batch)를 처리하여, 13 mM 카프릴레이트가 처리된 면역글로블린 용액을 얻고 정화했다.

한외여과 단계 전의 물질을 구성하는 이러한 중간체를 아세트산의 첨가를 통해 산성화하여, 카프릴레이트를 이용한 처리의 pH (5.1)를 약 4.5의 pH로 조절했다. 다음에, 그 용액의 외관 및 용해도를 각각의 평가된 pH 값에 대하여 평가하고, 콜로이드 입자의 발생을 탁도의 네펠로법 측정(nephelometric measurement)을 통해 정량했다.

하기 표 5는 각각의 평가된 pH 값에 대하여 얻은 외관 및 탁도 결과를 나타낸다.

실시예 4에서 분석된 여러 pH 값에 대하여 얻은 탁도 및 시각적 외관 결과

pH	탁도(NTU)	시각적 외관
5.1	5.6	투명함
5.0	10.0	투명하고 작은 결정
4.8	32.5	백색의 침전된 결정
4.6	53.0	백색의 침전된 결정
4.4	57.1	백색의 침전된 결정

표 5에서 나타낸 바와 같이, 얻어진 결과는 13 mM 카프릴레이트를 이용하여 처리한 면역글로블린 용액이 pH 5.0 미만의 pH 값으로 산성화되는 때, 백색을 띤 침전물의 외관이 관찰되면서 탁도가 뚜렷하게 증가하였다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는, 5.0 미만의 pH 값에서 한외여과 공정을 시작하는 것을 불가능하게 하는, 콜로이드 형태의 불용성 카프릴산의 형성에 기인하는 가능성이 매우 높았다.

얻어진 결과는, 정제된 용액이 바이러스 불활성화에 효과적인 농도 범위(9 내지 15 mM의 카프릴레이트)에서 상기 기재된 조건하에서 카프릴레이트를 이용하여 처리되는 경우, 카프릴레이트의 이온화 및 가용성 형태의 농도를 증가시켜서 한외여과막을 통한 이의 투과를 촉진하는 목적으로, 바이러스 불활성화 처리의 pH(즉, 5.1) 이상의 pH에서 나중의 한외여과 단계를 시작하는 것이 바람직하다는 것을 입증한다.

실시예 5. 한외여과 및 다이아여과에 의한 카프릴레이트의 감소에 대한 투석 용액내 아세테이트 함량의 영향

생성물의 투석을 위해 사용된 완충 용액에서 여러 농도의 아세테이트의 존재하에 일련의 독립적인 한외여과 및 다이아여과 공정을 수행했다.

농축 및 투석된 유출물이라고 지명된 사용된 출발 물질은 실시예 3의 B 그룹의 것과 동일하였다. 98 ± 2 %의 IgG 순도, 약 40 mg/ml의 단백질 농도 및 약 0.6 %의 PEG 함량을 갖는 상기 출발 물질은 카프릴레이트로 처리한 다음, 약 100 kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하여 한외여과 및 다이아여과했다.

적용된 한외여과 및 다이아여과 단계는 약 4 % (w/v)의 IgG로 농축하는 제 1 단계, 8배 부피의 투석 용액을 이용하여 투석하는 제 2 단계, 및 최종적으로 약 9 내지 10 % (w/v)의 IgG로 농축하는 것을 포함했다.

상기 한외여과 및 다이아여과 시험들 중 첫 번째 것은 주사용 증류수를 이용하여 수행한 반면, 그 이후의 시험들은 아세테이트의 농도를 더욱 구체적으로는 각각 2, 5, 20 또는 50 mM로 증가시키고 pH를 모든 경우에 5.0 내지 5.5로 조절하면서 완충 용액을 이용하여 수행했다.

투석 완충액에서 여러 농도의 아세테이트를 이용한 한외여과 및 다이아여과 단계에 대하여 얻은 결과

투석 용액에 존재하는 아세테이트의 농도(mM)	카프릴레이트의 공칭 첨가(mM)	투석된 생성물
		투석된 생성물 내의 카프릴레이트(mM)(1)	카프릴레이트의 투과율(2)
0	20	2.3	13.2
2	13	0.6	19.3
5	13	<0.2	32.8
20	13	<0.2	43.3
50	13	0.2	45.3

(1) 8 배 투석 부피을 이용하여 투석한 후에 결정된 값

(2) 하기의 식을 통해 계산된 투과율

투과 부피 배수 = ln (Cf/Co)/(R-1); 여기서 Cf는 문제의 투석 부피 배수를 이용하여 투석한 후의 농도이고, Co는 투석 전의 농도이고, R은 머무름 계수(retention coefficient)이다.

상기 표 6의 결과는, 5.0 내지 5.5의 pH 및 약 5 mM 내지 적어도 50 mM의 최소 아세테이트 농도에서 8 배 투석 부피의 아세테이트 완충 용액을 적용하면서 약 100 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하는 한외여과 및 다이아여과 과정이 최종 농축 생성물 내의 카프릴레이트를 적절한 수준으로 효율적으로 감소시키는 목적을 성공적으로 달성한다는 것을 나타낸다.

반대로, 투석을 위해 사용된 용액이 주사용수 또는 2 mM의 아세테이트 농도를 갖는 완충 용액인 경우, 카프릴레이트는 여액에서 효과적으로 제거되지 않았다.

이는 정확한 수준의 상기 시약이 최종 농축 생성물에서 검출되었다는 것을 고려하면, 위에서 기재한 조건하에서 약 100 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용한 한외여과 및 다이아여과 방법이 이전의 처리로부터 유래하는 카프릴레이트를 감소시키는데 있어서 효과적이라는 것을 입증한다.

실시예 6. 단일 한외여과 단계에 의한 화학적 시약(PEG 및 카프릴레이트)의 동시 제거

IgG의 배치(batch)를 실시예 1에서 기재된 방법에 따라 처리하여, 카프릴레이트로 불활성화된 용액을 얻고 정화했다. 약 0.5 %의 단백질 농도 및 5.0의 pH를 갖는 상기 용액을, 100 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 Biomax® 타입의 폴리설폰 막(Millipore사, 미국)으로 형성된 한외여과 및 다이아여과 설비를 이용하여 처리했다. 상기 한외여과 및 다이아여과는 실시예 5에서 기재한 바와 같이 2개의 차별화된 단계로 수행했다.

pH 5.1, 5.6 또는 5.8에서 수행된 제 1 단계의 경우, 그 물질은 pH 5.1, 5.6 또는 5.8로 조절한 3배 이상의 부피의 5 mM 아세테이트의 완충 용액을 이용한 다이아여과를 통한 순차적인 투석 및 농축 단계를 받았고, 그 단백질을 약 2 %의 값으로 농축했다.

제 2 단계의 경우, 카프릴레이트의 함량이 약 1/10로 감소된 후, 그 용액을 4.5 ± 0.1 또는 5.1의 pH로 조절했다. 다음에, 그 생성물을 충분한 단백질 및 PEG 농도로 조절하여 투석을 시작하였고, 그 투석은 4.5 또는 5,1의 pH에서 8배 부피의 5 mM 아세테이트의 완충 용액을 이용하여 시작했다.

끝으로, 그 생성물을 200 mM의 농도 및 4.2의 pH에서 6배 부피의 글리신 용액을 이용한 투석을 통해 제제화한 다음, 농축하여 IgG의 10 % 용액을 얻었다.

하기 표 7은 한외여과 및 다이아여과 단계들의 각각의 출발 시 및 여러 pH 값에서 얻은 PEG 및 카프릴레이트의 통과의 비율(%)을 나타낸다.

분석된 여러 pH 값에서 한외여과 및 다이아여과 단계의 두 개의 단계에서 PEG 및 카프릴레이트의 통과율

단계(카프릴레이트 농도)	pH	PEG 통과율(%)	카프릴레이트 통과율(%)
단계 I의 시작(13 mM)	5.1	17	74
	5.6	15	98
	5.8	15	100
단계 II의 시작(1 mM)	5.1	40	100
	4.5	82	97

상기 표 7의 결과는 단계 I에서 한외여과 및 다이아여과의 시작시, 카프릴레이트는 pH 5.1 내지 pH 5.8 사이에서 매우 높은 통과율 값을 나타내었다는 것을 보여주었다. 이들 값은 한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 I 동안 카프릴레이트의 매우 높은 감소를 결과했다(초기 함량과 비교하여 10 배 이상의 카프릴레이트 감소가 얻어졌다). 반대로, 상기 단계 I에서 PEG의 통과율은 매우 낮았고(<20 %), 이의 전체 제거는 카프릴레이트의 존재하에서 pH >5에서는 실질적으로 실행될 수 없었다.

다른 한편으로, 단계 II에서는, 상기 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, PEG의 통과율은 pH 4.5 에서 82 %의 값으로 매우 높았다. 또한, 그 단계의 시작 시 카프릴레이트가 1 mM의 잔류 수준으로 존재하여 실질적으로 100 % 통과될 수 있다는 사실을 고려하면, 단계 II 동안 카프릴레이트가 또한 감소되는 것으로 확인되었다.

하기 표 8은 한외여과 및 다이아여과 단계(step)의 각각의 단계(phase) 및 최종 제제화(formulation) 단계에서 단백질, PEG 및 카프릴레이트의 농도의 전개(evolution)를 나타낸다.

바이러스 불활성화 단계, 한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 I 및 II, pH 4.2 에서의 제제화 후의 용액 및 최종 용액에서 PEG 및 카프릴레이트의 품질(농도 및 광학 밀도에 의해 측정됨)

단계(phase)/단계(phase)	PEG(mg/ml)	PEG(O.D. 280 nm)	카프릴레이트(mM)	카프릴레이트(O.D. 280 nm)
불활성화 및 정화된 용액	38	6.9	12	2.2
한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 I의 종료시의 용액	45	1.8	0.9	0.04
한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 II의 종료시의 용액	0.7	0.02	0.1	0.003
pH 4.2에서의 제제화된 용액	0.1	0.003	<0.1	<0.003
최종 농축 용액	0.1	0.001	<0.1	<0.001

각각의 단계(step 및 phase)에서 기록된 PEG 및 카프릴레이트 값에 따르고 각각의 단계에서의 단백질 농도를 고려하면, PEG 감소 계수(factor)는 한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 I(pH 5.1)에서는 4였고, 한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 II(pH 4.5)에서는 90 이면서, 약 350 배의 전체 감소 계수(단계 I 및 단계 II)가 얻어졌다(한외여과 및 다이아여과 단계의 종료 시에 얻은 0.02 의 흡광도와 비교하여 6.9의 초기 흡광도).

카프릴레이트의 경우, 감소 계수는 한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 I(pH 5.1)에서는 55 였고, 한외여과 및 다이아여과 단계의 단계 II(pH 4.5)에서는 13 이면서, 약 700 배의 전체 감소 계수(단계 I 및 단계 II)가 얻어졌다(한외여과 및 다이아여과 단계의 종료 시에 얻은 0.003 의 흡광도와 비교하여 2.2 의 초기 흡광도).

그 결과들은 불활성화 능력을 갖는 시약(카프릴산 또는 카프릴레이트)뿐 만 아니라 침전 시약(PEG)이 약 100 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용한 한외여과의 단일 단계를 통해 효율적으로 감소되면서, 한외여과 및 다이아여과 단계의 각각의 단계에서 적용될 물리적 및 화학적 조건(특히 pH, 단백질 농도, 투석 칼럼의 수, 투석 완충액)이 선택되고, 두 시약의 일부 잔류 농도가 정맥내 사용에 적당하면서 10 %로 농축된 IgG의 최종 생성물이 얻어졌다는 것을 나타냈다.

실시예 7. PEG의 존재하에서 카프릴레이트를 이용한 바이러스 불활성화 능력의 평가

칼럼 유출물 및 투석 및 농축된 유출물(각각 실시예 1 및 3에 따라 얻어짐)을 출발 물질로 이용하여 여러 독립적인 실험을 수행하여, 지질 봉입된 바이러스를 제거 또는 불활성화하기 위한 PEG의 존재하에 카프릴산 또는 카프릴레이트의 능력을 평가했다.

두 물질은 98 ± 2 %의 면역글로블린 순도 및 5 내지 10 mg/ml의 단백질 농도를 가졌지만, 이들의 PEG 함량은 각각 40 mg/ml 및 1.5 mg/ml로서 서로 달랐다.

지질 봉입이 있고 물리적 및 화학적 제제(agent)에 대하여 평균 내성이 있는 40 내지 60 nm의 플라비리데과(Flaviviridae family)의 소 바이러스성 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhoea virus (BVDV))를 이용하여 바이러스 불활성화 시험을 수행했다.

각각의 시험에서, 해당하는 시험 물질은 0.5 % 이하의 값까지 바이러스를 접종하였고, 9 mM 또는 13 mM의 카프릴레이트 농도를 적용하면서 15 ℃ 또는 25 ℃의 온도에서 2 시간 동안 바이러스 불활성화 처리했다.

MBDK 세포주를 이용한 TCID50 시험 (50 % 세포반수 감염 용량)을 통해 상이한 시료들에서 BVDV의 바이러스 수치(viral load)의 정량을 수행했다. 처리의 종료 시 최종 시료에서 검출된 바이러스의 양으로 나눈 접종 출발 물질에서 검출된 바이러스 수치의 지수(log 10으로 나타냄)로서 바이러스 불활성화 단계의 바이러스 감소 인수(RF)를 결정했다.

하기 표 9는 각각의 시험의 출발 물질 및 얻어진 RF의 특성을 나타낸다.

PEG의 존재 또는 부재하에서 바이러스 접종물을 이용한 카프릴레이트 처리 시험에서 관찰된 바이러스 불활성화 결과

실험 그룹	출발 물질		처리 온도	카프릴레이트 농도(mM)	바이러스 감소 인수(RF)
	IgG(mg/ml)	PEG(mg/ml)	(℃)
투석 및 농축된 유출물	10	1.5	25	9	≥4.19
					≥4.36
				13 9	≥3.95
					≥4.13
칼럼 유출물	5	40	25	13	≥4.62
					≥5.10
				13	≥4.71
					≥4.57
			15	13	≥4.32
					≥4.27

모든 시험에서 얻은 바이러스 감소 시험 결과(표 9 참조)는 상이한 온도(15 및 25 ℃)에서의 처리 후 최소 9 mM의 카프릴레이트 농도의 경우에도 두 출발 물질에서 높은 BVDV 불활성화 능력을 나타낸다. 또한, 이들 실험은 두 개의 평가된 물질의 경우에 동등한 결과가 얻어졌다는 사실을 고려하면, 분석된 각각의 PEG 농도에서는, 카프릴레이트의 바이러스 불활성화 능력에서 PEG에 의한 방해가 관찰되지 않았다는 것을 나타냈다.

실시예 8. 본 발명의 제조 방법에 따라 얻어진 정맥내 투여용 면역글로블린 용액의 특성규명

이 실시예는 본 발명의 방법에 의해 얻은 10 % (w/v) 단백질을 갖는 면역글로블린 용액의 생화학적 및 기능적 특성을 확인하기 위한 것이다.

DEAE 칼럼 유출물의 두 개의 배치를 실시예 1에서 기재한 방법에 따라 처리하여, 약 200 리터의 혈장 규모에서 카프릴레이트를 갖는 불활성화된 바이러스 용액을 얻었다.

상기 카프릴레이트를 갖는 용액을 정화한 후, 주요 공정 잔존물(PEG 및 카프릴레이트)의 제거를 달성하는 목적으로, 실시예 6에서 기재한 바와 같이 차별화된 단계에서 한외여과를 통해 투석 및 농축했다. 다음에, 약 2.5 %의 단백질 농도를 갖는 상기 정제된 용액을 pH 4.5 ± 0.1로 조절된, 소르비톨 1 % 및 글리신 240 mM로 구성되는 약 6배 부피의 완충 용액에 대하여 일정 부피에서 투석을 통해 제제화했다. 끝으로, 상기 용액을 한외여과를 통해 농축하고, 10 % (w/v) 단백질에 해당하는 140 ± 5 UA (280 nm)의 광학 밀도로 조절하고, 5.25 ± 0.25의 최종 pH로 조절했다.

소르비톨 및 글리신을 이용하여 안정화되고 살균 등급 막(0.22 ㎛)을 이용하여 정화 및 여과된 얻어진 생성물(IGIV 10 % (w/v))을, 정맥내 투여를 위한 면역글로블린 용액의 품질, 불변성(unalterability) 및 안정성의 가장 관련 있는 분석 파라미터들을 결정함으로써 클로로부틸 마개를 갖는 유리병에 분배했다. 상기 두 배치에 대하여 얻은 평균 분석값 및 유럽 약전의 명세 값들은 하기 표 10에서 나타낸다.

10 % (w/v)의 정맥내 투여용 면역글로블린 용액의 특성 규명

파라미터	본 발명의 방법에 의해 얻은 생성물	명세 값(Eur. Ph.)
pH	5.26	4.0-7.4
삼투질농도(mOsm/kg)	306	≥240
나트륨(mM)	<3.2	n.e.
탁도(NTU)	4.4	n.e.
분자 분포(%) 중합체 이합체 단량체 분획	<0.1 7.6 92.5 <0.3	<3.0 단량체 + 이합체 > 90
IgG 아류(%) IgG1 IgG2 IgG3 IgG4	66.7 27.6 3 2.7	혈장과 동등
Fc 단편의 완전성 순도 프로필: Ig 순도 (ACE)(%) IgM (mg/ml) NAPTT (Dil. 1/10((s) 활성화된 인자(ng/ml) TGT FXI(nM 트롬빈) 동종응집소 역가 항-A 항-B	93 99.6 <0.002 308 검출되지 않음 <53 응집 1:16 응집 1:16	≥95 응집 ≤1:64
단백질분해 활성 PKA (UI/ml) ACA (CH50/mg)	<2 0.06 ± 0.07	<35 ≤1

Eur. Ph.: 유럽 약전; n.e.: 확인되지 않음; TGT FXI: 트롬빈 발생 시험(인자 IX가 결핍된 혈장을 이용); NAPTT PKA: 프리칼리크레인 활성인자(Prekallikrein Activator); ACA: 항보체 활성.

상기 결과로부터, 얻어진 생성물은 중합체의 부재, PKA 또는 ACA 활성과 같은 바람직하지 않은 생물학적 활성의 부재 등과 같은 파라미터가 본 발명의 정제 공정의 결과로서 본질적으로 변화되지 않으면서, IgG 아류 및 Fc 단편 완전성과 같은 몇몇 기능적 특성이 혈장에 대하여 그대로 유지되는 동시에, 우수한 순도 프로필(항-A/항-B 동종혈구응집소의 낮은 역가, IgM의 농도, 전응고 활성 등)을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

PEG의 존재하에서 카프릴레이트를 이용한 바이러스 불화성화 단계, 그 이후 카프릴레이트의 제거 및 최종 제제화를 포함하는 방법으로서, IGIV 10 % (w/v)를 얻기 위한 본 발명의 전체 방법은 IGIV 10 % (w/v) 단백질 용액으로 제제화 및 농축된 최종 생성물의 제조를 위해 아주 실행가능하고 적합하면서, 유럽 약전에 기재된 값들을 완전히 만족시키는 최종 생성물을 제공하는 것으로 판단된다.

그 생성물의 상업성을 위해 필수적인 수행된 안정성 연구는 4.2 내지 6.0의 pH 범위에 있고 소르비톨(5 % 까지), 글리신(등장성(isotonia)까지) 또는 이들의 조합을 갖는 제제는 상온(25 ℃ 내지 30 ℃)에서 2년간 정맥내 투여용 면역글로블린의 10 % (w/v) 용액을 안정화하는데 적당하다는 것을 나타냈다.

실시예 9. 대안의 방법에 의해 얻은 IgG 풍부 분획에 대한 카프릴레이트 처리의 적용성

대안의 정제 방법을 이용하여 얻은 다른 공정 중간체를 이용하여, 본 발명에 기재된 조건하에서 카프릴레이트를 이용한 적용의 타당성을 평가했다.

콘-온클레이 에탄올 분획화로부터 얻어지고 II 분획의 현탁액으로 지명된 IgG 풍부 혈장 중간체를 출발 물질로 이용하여 두 개의 독립적인 실험을 수행했다.

이러한 중간체는 II+III 분획까지 본 발명에 기재된 동일한 혈장 분획화 방법을 수행하여 얻었다. 다음에, II+III 분획의 추출 현탁액의 재침전을 수행한 다음, III 분획을 분리하여, 96 % 초과의 순도를 갖는 II 분획을 최종적으로 얻었다. 상기 II 분획의 현탁액은 벤토나이트를 이용하여 정제하고 물로 투석하여 알코올 성분을 제거한 후, 이들 실험을 위한 출발 물질로 이용되었다.

수행된 두 개의 실험에 있어서, 두 개의 혈장 배치 유래의 물질을 PEG 함량에 따라 두 개의 상이한 그룹(A 및 B)으로 분리했다. B 그룹의 경우, 출발 물질은 PEG-4000의 농축 용액을 첨가하여 40 mg/ml의 공칭 PEG 농도로 조절했다.

다음에, 두 그룹(A 및 B)에서 유래한 두 물질을 약 5 mg/ml의 단백질 농도로 조절하고, 5.1의 pH 값으로 조절하고, 본 발명의 방법에서 기재한 바와 같이 13 mM의 공칭 농도 및 5.0 내지 5.2 의 pH에 도달할 때까지 카프릴레이트를 이용하여 처리했다.

하기 표 11은 두 실험 그룹(각각 A 및 B)에서 사용된 출발 물질의 주요 특성 및 카프릴레이트를 이용한 처리 후에 발생된 물질의 특성을 나타낸다.

A 및 B 그룹에서 사용된 출발 물질의 주요 특성 및 그 출발물질에서 얻어진 최종 생성물의 주요 특성. 면역글로블린의 초기 용액의 순도는 99.6 ± 0.6 %이다(n=5 개 배치)

실험 그룹	카프릴레이트를 이용한 처리 전의 용액				카프릴레이트를 이용하여 처리한 용액(25℃에서 2 시간)
	PEG (mg/ml) (1)	O.D. 280 nm (UA)	탁도 (NTU)	응집체, 중합체 (%)	O.D. 280 nm (UA)	탁도 (NTU)	응집체, 중합체 (%)	카프릴레이트 (mM) (1)
A	<0.01	6.9	3.3	<0.1	7.0	10.1	0.5	11.2
	<0.01	6.9	3.0	<0.1	7.1	16.5	1.2	11.2
B	34.1	7.1	2.5	<0.1	7.2	14.5	0.1	11.9
	33.6	6.9	3.0	<0.1	7.2	14.4	<0.1	12.4

(1) PEG 및 카프릴레이트 값들은 분석 측정을 통해 얻은 값이다.

상기의 결과들은 특정된 조건하에서 카프릴레이트를 이용한 불활성화 처리의 실행가능성을 나타내고, 상이한 방법들에 의해 충분히 정제된 면역글로블린 용액을 사용하면, 면역글로블린 응집체 또는 다른 비가역적인 침전물의 형성이 유도되지 않으므로, 나중의 정제 공정이 매우 용이하게 된다는 것을 나타낸다.

상기의 결과는 단백질의 충분한 희석 및 충분한 정도의 순도와 함께, 면역글로블린 중합체의 발생에 대한 PEG의 보호 효과가 명백하다는 것을 나타낸다.

이러한 실험적 실시예는 충분한 순도를 갖고 단백질 및 PEG 농도에 관한 특정 조건들을 만족시키는 물질에 첨가되는 경우, 카프릴레이트가 비침전 조건 및/또는 응집 촉진 조건하에서 바이러스 불활성화 능력을 갖는 시약으로서 단독으로 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

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1. 3 % 내지 5 %(w/v)의 농도를 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 존재하에 96 % 이상의 순도와 3 내지 7 mg/ml 농도를 갖는 면역글로블린의 초기 용액에 기초하여 면역글로블린(immunoglobulins)의 용액을 제조하는 방법으로서,
   a) 상기 초기 용액에 카프릴산 또는 이의 염을 9 mM 내지 15 mM 농도로 첨가하는 단계;
   b) 상기 a)단계에서 얻은 용액의 pH를 pH가 5.0 내지 5.2가 되도록 조절하는 단계;
   c) 상기 b)단계에서 얻은 용액을 봉입된 바이러스의 불활성화를 위하여 2 ℃ 내지 37 ℃의 온도에서 적어도 10 분간 인큐베이션하는 단계; 및
   d) 상기 c) 단계에서 얻은 용액에 대하여 한외여과 및 다이아여과 단계를 수행하는 단계로, 한외여과 및 다이아여과를 100 kDa의 막으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 d) 단계에서 얻은 면역글로블린의 용액을 최종 제제화하는 단계를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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10. 제 1 항에 있어서, 상기 PEG가 4000 Da의 공칭 분자량을 갖는 PEG인 것을 특징으로 하는 방법.
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13. 제 1 항에 있어서, b) 단계에서, 상기 얻은 용액이 5.1 의 pH로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
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15. 제 1 항에 있어서, c) 단계에서, 상기 용액이 20 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 2 시간 동안 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로블린의 초기 용액이 전체 단백질을 기준으로 1 % (w/v) 이하의 알부민 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로블린의 초기 용액이 인간 혈장에서 유래한 것임을 특징으로 하는 방법.
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20. 제 1 항에 있어서, 상기 한외여과 및 다이아여과의 d) 단계는 하기의 두 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    - 상기 카프릴레이트를 감소 또는 제거하기 위하여 pH가 5.0 내지 6.0 으로 조절되는 제 1 단계; 및
    - 상기 글리콜의 폴리에테르 또는 중합체를 감소 또는 제거하기 위하여 pH가 5.0 이하의 값으로 조절되는 제 2 단계.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 한외여과 및 다이아여과의 d) 단계의 제 2 단계에서, pH가 4.0 내지 5.0 으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 2 항에 있어서, 상기 최종 제제화의 단계에서, 한 종 이상의 아미노산, 한 종 이상의 탄수화물 또는 폴리올, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 부형제 및/또는 안정화제가 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 2 항에 있어서, 상기 면역글로블린의 최종 농도는 이의 정맥내, 근육내 또는 피하 사용에 적용할 수 있는 농도로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
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