RU2636049C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ IgG ПОСРЕДСТВОМ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ IgG ПОСРЕДСТВОМ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2636049C2 RU2636049C2 RU2013112276A RU2013112276A RU2636049C2 RU 2636049 C2 RU2636049 C2 RU 2636049C2 RU 2013112276 A RU2013112276 A RU 2013112276A RU 2013112276 A RU2013112276 A RU 2013112276A RU 2636049 C2 RU2636049 C2 RU 2636049C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- igg
- solution
- stage
- diafiltration
- concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 116
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 title claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 24
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 127
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 101
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 50
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 48
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 36
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 36
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 17
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 15
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 6
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 6
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 sulfopropyl groups Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 claims description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 claims description 2
- 239000012607 strong cation exchange resin Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 153
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 47
- 239000000047 product Substances 0.000 description 42
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 35
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 27
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 20
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 11
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 9
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 8
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 5
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 4
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 2
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000002391 anti-complement effect Effects 0.000 description 2
- 108010008730 anticomplement Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 2
- 229940117323 privigen Drugs 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000023706 Bruton agammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000025643 Congenital hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 description 1
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 1
- 102000010631 Kininogens Human genes 0.000 description 1
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 1
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010054979 Secondary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010043561 Thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004897 Triton X-45 Polymers 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 208000029192 congenital agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229940028757 flebogamma Drugs 0.000 description 1
- 229940009600 gammagard Drugs 0.000 description 1
- 229940069042 gamunex Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009177 immunoglobulin therapy Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940008228 intravenous immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091005763 multidomain proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940013982 octagam Drugs 0.000 description 1
- 125000005473 octanoic acid group Chemical class 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39516—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from serum, plasma
- A61K39/39525—Purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Confectionery (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения композиции IgG из раствора IgG, частично очищенного от человеческой плазмы и имеющего содержание IgG более чем 95% по отношению к сумме белков. Способ включает следующие стадии: (а) диафильтрации частично очищенного раствора IgG до достижения концентрации этанола менее чем 0,5% (масса/объем); b) стабилизации раствора, полученного на стадии а), с использованием сорбитола в качестве стабилизирующего агента при концентрации сорбитола между 30 мас.% и 35 мас.%; c) тепловой обработки раствора, полученного на стадии b), при температуре между 55ºС и 63ºС, в течение периода времени между 1 и 24 ч; d) избирательной адсорбции агрегатов и/или полимеров с высокой молекулярной массой из раствора, подвергнутого тепловой обработке на стадии с), посредством катионной хроматографии; и e) диафильтрации и получения в виде готовой формы раствора, полученного на стадии d). Изобретение обеспечивает стабильность конечного продукта. 26 з.п. ф-лы, 22 табл., 18 пр.
Description
Данное изобретение относится к новому способу получения композиции IgG из частично очищенного раствора IgG из человеческой плазмы, в котором за счет применения промежуточной стадии тепловой обработки и без использования реагентов для осаждения агрегатов/полимеров и/или белков с высокой молекулярной массой, достигается почти полное устранение полимеров IgG, создаваемых во время процесса. В дополнение к этому, способ предлагает высокую производительность, более низкие производственные затраты и более легкое осуществление по сравнению со способами предыдущего уровня техники. Также за счет использования данного способа конечному продукту в жидкости придается стабильность.
Иммуноглобулин G (IgG) представляет собой изотип наиболее распространенного иммуноглобулина в человеческой сыворотке (8-16 мг/мл), содержащей приблизительно 80% всех иммуноглобулинов. IgG показан для лечения различных заболеваний, таких как первичный иммунодефицит, в частности врожденная агаммаглобулинемия и гипогаммаглобулинемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, в качестве адъюванта при лечении болезни Кавасаки и при трансплантации костного мозга, гипогаммаглобулинемии, ассоциированной с хроническим лимфоцитарным лейкозом, в качестве компонента лечения ВИЧ-инфекции у пациентов-детей среди прочих.
В настоящее время имеется большая потребность в иммуноглобулине G (IgG), который является поливалентным с широким спектром человеческих антител и имеет общую функциональность (нейтрализующая способность, опсонизация, сохраненная средняя долговечность), с интактными молекулами (целостность кристаллизуемого Fc-фрагмента) и нормальным распределением подклассов IgG, идентичным или эквивалентным природной плазме, особенности для редких подклассов (IgG3 и IgG4).
Путями терапевтического введения IgG может быть внутривенный, подкожный и внутримышечный, а в дополнение к этому его можно вводить посредством других менее общепринятых путей, таких как пероральный, ингаляционный или топический пути.
Тем не менее, внутривенное введение предлагает наиболее используемые показания к применению, для лечения либо первичных иммунодефицитов или для общего вариабельного иммунодефицита (дефицита подклассов IgG и IgA) (Espanol, T. "Primary immunodeficiencies". Pharmaceutical Policy and Law 2009; 11(4): 277-283), либо вторичных или приобретенных иммунодефицитов (например, инфицирования вирусами, такими как цитомегаловирус, опоясывающий лишай, иммунодефицит человека) и заболеваний аутоиммунного происхождения (например, тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Кавасаки) (Koski, C. "Immunoglobulin use in management of inflammatory neuropathy". Pharmaceutical Policy and Law 2009; 11(4): 307-315).
В идеале IgG для внутривенного применения (IGIV) должен быть получен в виде готовой формы с высокой концентрацией в жидкости и предпочтительно должен допускать хранение приблизительно до 30°C для того, чтобы облегчить консервацию продукта и непосредственную инфузию.
Было описано, что для того, чтобы уменьшить возможные реакции непереносимости IgG, необходимо, чтобы иммуноглобулин A (IgA) и иммуноглобулин M (IgM), а также агглютинины групп крови, должны отсутствовать или находиться в невыявляемом количестве. Существенно также, что продукт фактически не должен обладать какой-либо ферментативной активностью, за счет наличия как плазмина, так и плазминогена, или прекалликреина, или его активаторов, кининов или кининогена или факторов свертывания крови, таких как среди прочего фактор XI/фактор XIa.
С другой стороны, человеческое происхождение первоначальной плазмы для получения поливалентного IgG делает необходимым снижение до минимума риска инфицирования через передачу вирусов или патогенов. Как описано у Fernandes et al. (ES 500121) и Hirao, Y. et al. (EP 196761 и EP 253313), тепловую обработку IgG в растворе (жидкости) или пастеризацию можно эффективно проводить в присутствии средств защиты от денатурации IgG (например, сахарозы, сорбитола, аминокислот). Для этой цели температуру раствора повышают приблизительно до 60°C в течение по меньшей мере примерно 10 часов, активируя или аттенуируя большинство опасных патогенов. Среди прочего, данные патогены могут иметь липидное покрытие, например, вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гепатита C (HCV) и вирус гепатита B (HBV) или быть незащищенными, например, полиовирус, вирус гепатита A (HAV) и парвовирус (Uemura Y. et al. "Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation". Vox Sang. 1989; 56: 155-161).
Тем не менее, пастеризация, даже в присутствии стабилизаторов и в наилучших условиях обработки, неминуемо приводит к образованию необратимых белковых агрегатов с высокой молекулярной массой, таких как полимеры IgG и/или полимеры других сопутствующих белков, в большей или меньшей пропорции в зависимости от чистоты первоначального IgG (Hirao, Y. et al. выше; and Ristol, P. et al. EP 1225180 and ES 2091161).
На протяжении десятилетия 1960-1970 наличие необратимых агрегатов с высокой молекулярной массой, известных как полимеры IgG, связывали с фиксацией комплемента для его активации (антикомплементная активность, ACA) в процессе внутривенного введения IgG, и данное явление связывали с наблюдаемой сильной непереносимостью или анафилактическими реакциями (Barandum, S. et al. Vox Sang. 7: 157-174, 1962). Вследствие этого, службы здравоохранения регламентировали максимальное содержание полимеров в IGIV, или молекулярных форм, выше, чем димеров, с лимитом, составляющим 3% (Eur. Ph. Monograph 6.3; and CMP Core SPC for normal immunoglobulin for intravenous administration: CPMP/BPWG/859/95 rev.2). Данное соображение является особенно важным для жидкой готовой формы, потому что 3% лимит также должен сохраняться до даты истечения срока годности продукта. Фактически полное отсутствие данных полимеров IgG, вследствие этого, должно достигаться, как после пастеризации, так и в полученном конечном продукте, для обеспечения, чтобы продукт не портился в течение долгого времени, и для обеспечения максимально возможной температуры хранения.
В настоящее время большая часть жидкого IgG, имеющегося на рынке и полученного в виде готовой формы с аминокислотами, должна сохранять кислый pH во избежание агрегации (Uemura, Y. "Dissociation of aggregated IgG and denaturation of monomeric IgG by acid treatment". Tohoku J. Exp. Med. 1983; 141: 337-349), предпочтительно c pH между 4,0-5,0 (Tenold, R. et al. US-4396608) и при температуре, равной 2-8°C, если они стабилизированы 0,2 M или 0,25 M глицином, например, известным под торговыми названиями Liquid Gamunex® (Grifols SA, Испания), Kiovig® или Gammagard® (и тот и другой от Baxter, Соединенные Штаты), или до 25°C, если стабилизированы 0,25 M пролином, таким как Privigen® (CSL Behring, Германия), для того, чтобы минимизировать молекулярную агрегацию в процессе хранения (Jolles, S. et al. "Clinical uses of intravenous immunoglobulin". Clin. Exp. Immunol. 2005 October; 142(1): 1-11; Hooper, J.A. "Intravenous immunoglobulins: evolution of commercial IVIG preparations". Immunol Allergy Clin. North Am. 2008; 28(4): 765-778).
Было продемонстрировано, что излишне кислый pH в течение длительного периода воздействия способствует фрагментированию IgG, например, при pH, равном 4,5 или ниже и при относительно высокой температуре, например, при 30°C (Vermeer, A. et al. "Thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein". Biophys. J. 2000; 78: 394-404; Shukla, A. et al. "Strategies to address aggregation during protein A chromatography". Bioprocess International, May 2005). Соответственно, например, в литературе сообщалось, что 10% IGIV композиции, полученные в виде готовой формы с L-пролином при pH, равном 4,8±0,2, являются достаточно стабильными в отношении молекулярной агрегации, но при продолжительности воздействия наблюдается тенденция к фрагментированию. Соответственно при температуре, равной 25°C, количество фрагментов составляет в среднем до 3,9% спустя 36 месяцев (Cramer, M. et al. "Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgProlO, Privigen®) stabilized with L-proline”, Vox Sang. 2009. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01143.x).
Было описано, что готовая форма IgG с полиолами или полиспиртами, например, с мальтозой и сорбитолом, предотвращает агрегацию (Katakam, M. et al.: Aggregation of proteins and its prevention by carbohydrate excipients: Albumins and globulin. J. Pharm. Pharmacol. 1995; 47: 103-107) и вследствие этого свойства растворы IgG, которые являются стабильными до 25°C (с 10% мальтозой, торговое название Octagam®) и до 30° (с 5% сорбитолом, торговое название Flebogamma® DIF) были получены в виде готовой формы в слабокислом диапазоне pH между 5,0 и 6,0 (Hirao, Y. et al. Патент EP-278422).
Однако, в последние годы наличие некоторых сахаров или производных в готовых формах IgG было поставлено под сомнение (Szenczi, A. et al.: The effect of solvent environment on formation and stability of human polyclonal in solution. Biologicals, 2006; 34(1): 5-14), так как некоторые случаи серьезной почечной недостаточности были связаны с инфузией препаратов IgG, имеющих в своем составе сахарозу. Другими недостатками, которые могут проявляться некоторыми иммуноглобулиновыми композициями с отдельными сахарами (сахарозой) и некоторыми высокими концентрациями полиолов (10% мальтозой), является относительная способность повышать вязкость крови при вливании растворов, причем это связано с некоторыми очень серьезными случаями внутрисосудистого тромбоза и острого инфаркта миокарда, когда имеется предшествующее заболевание, или пациент находится в зоне риска (Radosevich, M. and Burnouf, T. "Intravenous immunoglobulin G: Trends in production methods, quality control and quality assurance. Vox Sang. 2009; 1-17; Katz, U. and Shoenfeld, Y.: Review: Intravenous immunoglobulin therapy and thromboembolic complications. Lupus, 2005; 14(10): 802-808).
Было также установлено, что некоторые коммерческие IGIV продукты заключают в себе активные прокоагулирующие ферменты, остатки от процесса их очистки, которые имеют выраженный тромбоэмболический эффект (TEE), и была доказана связь между TEE и наличием факторов XI/XIa и/или других прокоагулирующих факторов (например, калликреина и тому подобное). Устранение тромбоэмболической способности является требованием, которое должно быть выполнено для инфузий IGIV с максимальными гарантиями иммунологической толерантности и безопасности.
Не связывая себя какой-либо конкретной теорией, авторы представленного изобретения полагают, что основные отличия между продаваемыми в настоящее время IGIV могут быть присущи не только готовой форме (аминокислоты, сахара и полиолы, и pH), но также способу получения IgG, который среди прочих характеристик будет влиять на итоговые условия консервации продукта в жидкости (температура-время), например, для предотвращения агрегации и фрагментирования в процессе хранения. Данная зависимость между стабильностью жидких готовых форм IgG и способом их очистки наблюдалась другими авторами (Cramer, M. et al. выше).
Вследствие этого, данное изобретение предоставляет способ получения препарата IgG, который решает упомянутые ранее проблемы состояния уровня техники. Способ, согласно данному изобретению, начинается с материала, имеющего в своем составе IgG, очищенный с помощью общепризнанных способов, который дополнительно очищают посредством тепловой обработки, также известной как пастеризация, в специальных условиях стабилизирующих агентов, концентрации белков, электропроводности, pH и остаточных концентраций реагентов из предшествующих стадий осаждения, что делает возможным уменьшение примесей белков и протеолитических ферментов. Данное уменьшение примесей и ферментов происходит в процессе данной обработки и/или в процессе последующей стадии избирательной адсорбции агрегированных белков, но в любом случае данные две стадии используют исключительно в качестве итоговой очистки без внедрения методов разделения, использующих осаждение.
Предыдущий уровень техники включает применение в промышленных масштабах комбинации осаждения и хроматографического отделения агрегатов/полимеров, например, как описано у Coval, L. (Патенты US-4093606 и US-4165370) и Uemura, Y. et al. (Патенты ES-506679 и EP-246579), которые описывают способы осаждения, использующие полиэтиленгликоль (PEG), недостаточно селективный метод, который вызывает сильные потери в извлечении мономеров/димеров IgG (совместное осаждение), которые сильно варьируют согласно используемому способу. Например, если тепловую обработку проводят в растворе IgG, который не был очищен в достаточной степени, извлечение IgG (мономеров/димеров), как правило, будет составлять между 70 и 80% (Uemura, Y. et al. выше). В случае очищенных растворов IgG могут быть получены более хорошие результаты извлечения, с 80-90%, но для этого необходимо использовать комплексные методы разделения, такие как микрофильтрация в тангенциальном потоке (TFF), которая описана в предыдущем уровне техники (Ristol, P. et al. выше). Однако способ TFF связан с высоким расходованием осаждающих реагентов (PEG), стабилизатора (сорбитола) и воды для инъекций, и ряда моющих и дезинфицирующих операций, которые необходимо принимать во внимание, когда необходимо повторно использовать оборудование. Кроме того, он связан с длительной продолжительностью процесса, может быть трудным для управления, высокими являются связанные с ним затраты на расходные материалы и/или энергию, и извлечение мономеров/димеров IgG составляет всегда менее чем 90%.
Авторы представленного изобретения разработали способ, с помощью которого обходятся без применения реагентов для осаждения агрегатов/полимеров и/или белков с высокой молекулярной массой, которое описано в предыдущем уровне техники, и неожиданно достигается фактически полное устранение создаваемых полимеров, с высокой производительностью, более низкими производственными затратами и легким осуществлением по сравнению со способами в предыдущем уровне техники. Кроме того, за счет применения данного способа достигается стабильность конечного продукта в жидкости, предпочтительно полученного в виде готовой формы в присутствии аминокислот или полиспиртов, и его можно хранить в жидкости в течение по меньшей мере 1 года при температуре между 2 и 30°C и pH, равным 4,6 или выше и до 5,8.
Вследствие этого, данное изобретение относится к способу получения композиции IgG из частично очищенного раствора IgG из человеческой плазмы, который включает стадии:
а) диафильтрации частично очищенного раствора IgG;
b) стабилизации раствора, полученного на стадии a);
c) тепловой обработки раствора, полученного на стадии b);
d) избирательной адсорбции агрегатов и/или полимеров с высокой молекулярной массой из подвергнутого тепловой обработке раствора на стадии c) посредством катионной хроматографии; и
e) диафильтрации и получения в виде готовой формы раствора, полученного на стадии d).
За счет применения данного способа достигается значительное уменьшение содержания агрегатов/полимеров с высокой молекулярной массой, иначе говоря, с молекулярной массой выше, чем у димера IgG и других нестабильных белков, приводя к раствору, который по существу имеет в своем составе мономеры/димеры IgG, которые могут быть получены в виде готовой формы в слабокислой среде, и могут сохраняться в жидкости при окружающей температуре без заметных признаков нестабильности, соответствуя спецификациям, установленным для его предпочтительно внутривенного или подкожного, или внутримышечного применения.
Предпочтительно способ согласно данному изобретению осуществляют, начиная с очищенного раствора IgG человеческой плазмы, имеющей содержание IgG более чем 95% относительно суммы белков, а более предпочтительно более чем 97%, что определяют с помощью электрофореза в ацетатцеллюлозе, черного окрашивания крахмала, и количественно оценивают денситометрически, в соответствии со способом, описанным в Европейской Фармакопее.
В качестве первоначальных материалов, для запуска способа согласно изобретению данный патент рассматривает применение богатых IgG фракций (выделенных при фракционировании человеческой плазмы для получения альбумина с помощью общепризнанных способов, известных в данной области), с последующей должной их очисткой.
До сих пор, продолжается использование главным образом и в промышленном масштабе холодного фракционирования плазмы с этанолом, на основании способа 6 по Cohn (Cohn, E.J. et al. Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components. J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475) для выделения богатой IgG фракции. Данную фракцию (Fr-II+III) или эквивалентную (Fr-I+II+III), которая имеет в своем составе большую часть (≥90%) IgG, и плазму, переменной чистоты (как правило, между 35 и 65% IgG по отношению к другим белкам), необходимо очищать более тщательно посредством осаждения этанолом, известным как метод 9 по Cohn-Oncley (Oncley, J.L. et al.: The Separation of the antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta-1 Lipoprotein into subfractions of human plasma. J. Am. Soc. 1949; 71: 541-550) до тех пор, пока не получат фракцию концентрированного иммуноглобулина (Fr-II, или супернатант концентрированного Fr-III). Еще одним практически осуществимым вариантом является применение способа по Kistler-Nistchmann (Kistler, P. and Nitschmann, Hs. Large Scale Production of Human Plasma Fractions. Vox Sang. 1962; 7: 414-424) до выпадения в осадок A (или эквивалентного выпадения в осадок A+I), а затем их очистки для получения преципитата GG или до концентрированного супернатанта (ультрафильтрата) преципитата B.
Применяя оба метода осаждения этанолом, возможно получить раствор IgG (из супернатанта Fr-III, Fr-I+III, Fr-II, осажденного GG или супернатанта преципитата B), который соответствует минимальным характеристикам чистоты ≥95% IgG (посредством электрофореза на ацетатцеллюлозе), а предпочтительно ≥97% IgG, что требуется для того, чтобы его можно было использовать в качестве первоначального материала в способе согласно изобретению. Это преобразует IgG, который подходит для внутримышечного или подкожного пути, в препарат, который является допустимым для внутривенного пути.
В любом случае, в настоящее время используются другие предпочтительные комбинации для повышения чистоты первоначального материала (например, Fr-II+III или преципитата A), например, за счет осаждения большей части загрязняющих примесей и/или их адсорбции на анионных смолах и/или неорганических адсорбентах (полиэтиленгликоле, октановой кислоте, ионообменной хроматографии, бентоните, перлите). Документы Ristol, P. et al. EP-1225180; Lebing, W. et al. EP-0893450; Teschner, W. et al.: A New liquid, intravenous immunoglobulib product (10% IGIV) highly purified by a state-of-the-art process. Vox sang. 2007; 92(1): 42-55 относятся к действующим способам очистки посредством осаждения этанолом, PEG или октановой кислотой, в сочетании с ионообменной хроматографией для повышения чистоты промежуточной фракции IgG (например, Fr-II+III) до ≥95% IgG, а предпочтительно ≥97% IgG, прежде чем перейти к очистительной обработке в патенте.
Диафильтрацию на стадии способа согласно данному изобретению, осуществляют с целью понижения концентрации нежелательных компонентов, получающихся в стандартном способе очистки IgG, ниже значений концентрации, которые могут воздействовать на способ согласно данному изобретению. Например, одним нежелательным компонентом является этанол, и посредством данной стадии (a) диафильтрации его необходимо уменьшить до концентрации меньше, чем 0,5% (масса/объем), предпочтительно меньше, чем 0,1%. Если присутствуют другие неденатурированные осаждающие реагенты, такие как PEG, октановые кислоты, совместимые неионные детергенты или любая их смесь, их концентрация также должна быть понижена до менее чем 2% (масса/объем), и в любом случае до того, чтобы они не приводили к более, чем 3% полимеров после стадии c).
Кроме того, на данной стадии диафильтрации первоначальный раствор IgG может быть отрегулирован до ионной силы, электропроводность которой составляет менее чем 1 мС/см, а pH отрегулирован до между 4,0 и 5,5, предпочтительно в обоих случаях. Диафильтрацию можно проводить с водой для инъекций или предпочтительно с буферным раствором низкой ионной силы, таким как раствор ≤5 мМ уксусной кислоты или раствор ацетата натрия, доведенный щелочью или разбавленной кислотой до pH 4,0-5,0.
Стадию (a) диафильтрации предпочтительно проводят в режиме тангенциального потока через ультрафильтрационные мембраны, например, из полиэфирсульфона или аналогов, с использованием отсечения по молекулярной массе между 10 кДа и 100 кДа. Предпочтительно в способе согласно данному изобретению, стадия (a) диафильтрации также служит для концентрирования белков до концентрации не более чем 5% (масса/объем), предпочтительно между 2% и 4% (масса/объем).
После того, как был получен раствор на стадии (a), его стабилизируют, например, посредством добавления сорбитола в качестве стабилизирующего агента до максимальной концентрации, составляющей 50% (масса/масса), предпочтительно между 30% и 35% по массе. В дополнение к этому pH доводят до между 4,2 и 6,0, предпочтительно между pH 4,6 и 5,2 посредством добавления кислоты (например, соляной кислоты или уксусной кислоты) или щелочи (например, гидроксида натрия) способом, который известен в данной области.
Тепловая обработка или нагревание раствора на стадии (c) способа согласно данному изобретению представляет собой специальную процедуру, также известную, как пастеризация, которая осуществляется при температуре между 55°C и 63°C в течение периода времени между 1 и 24 часами. Хотя раствор может быть подвергнут тепловой обработке при любой температуре и в течение любого времени в пределах диапазонов, упомянутых выше, тепловую обработку предпочтительно проводят при 60±1°C в течение 10-11 часов. В любом случае должны получаться не более чем 3% полимеров/агрегатов с высокой молекулярной массой, и предпочтительно между 1% и 2%. Также как протеолитическая активность вследствие возможного наличия прокоагулирующих факторов, например, фактора XI/XIa или других протеаз, измеренных хромогенно для различных субстратов (S-2302, S-2288 и S-2238), как описано в данной области (см. Пример 3), уменьшается по меньшей мере в 5 раз по сравнению с ее первоначальным содержанием.
Впоследствии раствор охлаждают, предпочтительно между 18°C-30°C, и разбавляют, предпочтительно по меньшей мере 33% (по массе) водой для инъекций или, более предпочтительно, буферным раствором, имеющим в своем составе совместимую соль (например, натрия ацетат, фосфат, цитрат и тому подобное) в концентрации, составляющей предпочтительно ≤20 мМ. После разбавления раствор содержит концентрацию сорбитола ≥5% масс., и концентрацию белков ≥5 мг/мл. Полностью ионизируемую совместимую соль, предпочтительно хлорид натрия, в виде твердого вещества или в концентрированном растворе, например, 3 M (моль/литр), добавляют к данному раствору до тех пор, пока не получают раствор хлорида натрия между 0,20 M (моль/литр) и 0,50 M (моль/литр), предпочтительно между 0,25 M (моль/литр) и 0,40 M (моль/литр). При необходимости pH можно снова довести до между 4,2 и 5,5, а предпочтительно между 4,5 и 5,0 посредством добавления предпочтительно разбавленной соляной или уксусной кислоты и/или гидроксида натрия.
Раствор, приведенный в надлежащее состояние способом, описанным выше, иначе говоря, после разбавления, регулирования концентрации соли и pH, который имеет в своем составе максимальное количество, равное 5%, димеров, инжектируют в хроматографическую колонку, содержащую сильные катионообменные перфузионные смолы, имеющие по меньшей мере одну из катионных сульфоновых групп (сульфониловую, сульфоновую или сульфопропиловую: S-, HS-, SP-группы), ковалентно соединенную с синтетической нерастворимой и фактически несжимаемой перфузионной матрицей, содержащей жесткие частицы полиметакрилата или полистирола и предпочтительно содержащей матрицу или подложку из частиц полистирола, поливинилбензена между 20-100 мкм. Смола может быть заложена в цилиндрическую колонку с осевым потоком подходящего диаметра для заполнения, предпочтительно занимая смолой приблизительно между 5-20 см высоты, или заложена в колонку с радиальным потоком с проходом, составляющим между предпочтительно 10-15 см. В обоих случаях по меньшей мере 1 литр, а предпочтительно между 1 и 10 литров данной смолы используют для каждого кг (сухого) IgG, который должен быть очищен, что эквивалентно загрузке между 100 и 1000 мг IgG/мл геля. Предпочтительно количество смолы, заложенной в используемую колонку, составляет между 2 и 5 литров на кг IgG (эквивалентно загрузке 200-500 мг IgG/мл геля). Перед инжектированием продукта колонку уравновешивают буферным раствором, имеющим в своем составе предпочтительно ацетат натрия между приблизительно 5 и 50 мМ (миллимолярным), а более предпочтительно 10 мМ (миллимоль/литр), и концентрацией хлорида натрия (если именно эту соль выбирают для добавления в продукт), которая приблизительно равна или эквивалентна концентрации продукта. Предпочтительный инжектируемый поток составляет не более чем 50 объемов колонки/час, а более предпочтительно между 5-30 объемов колонки/час, предпочтительная температура составляет 18°C-30°C. Мономеры/димеры IgG свободно проходят через колонку, при этом более чем 90% всех мономеров плюс применяемые димеры извлекаются в элюат (адсорбция составляет <10% мономеров/димеров), и предпочтительно достигается извлечение, составляющее ≥93%, причем данный элюат извлекают в пуле до надлежащего объема.
Одновременно агрегаты/полимеры улавливаются смолами в количестве, составляющем ≥85% от их первоначального содержания, что эквивалентно более чем 5-кратному уменьшению, предпочтительно уменьшению ≥95% (≥20 раз) первоначального содержания в материале, получаемом в результате тепловой обработки, при этом в пуле элюата колонки обнаруживается (неадсорбированными) ≤0,3% полимеров, а предпочтительно ≤0,1% или ≤0,06%. Также как за счет подходящего увеличения загрузки в колонку и применения последующего промывания, например, по меньшей мере двумя объемами колонки раствора, равными или эквивалентными объему, используемому для уравновешивания колонки, извлечение мономеров/димеров может быть даже увеличено наиболее предпочтительно до ≥95%. Соответственно при повторном инжектировании в ту же самую колонку регенерируемой фракции, должным образом разбавленной и отрегулированной до условий, используемых при первоначальной загрузке или с меньшей ионной силой, может быть достигнуто извлечение ≥95%. Инжектирование за счет уменьшающегося градиента, как уже показано, также стимулирует извлечение мономеров/димеров IgG, и таким образом или при использовании аналогичного способа квалифицированный специалист в данной области может легко добиться извлечения продукта ≥95%. Для осуществления этого загрузку начинают с максимальной концентрации соли в соответствии с pH для того, чтобы минимизировать эффекты суперадсорбции в первых применяемых объемах, постепенно увеличивая емкость смолы по мере уменьшения ионной силы до тех пор, пока не закончится объем загрузки. Например, предпочтительно может быть использован уменьшающийся градиент до 15% между концентрацией соли выбранного продукта в начале загрузки по сравнению с концентрацией соли в ее конце.
Необязательно, способ согласно данному изобретению может включать одну или более инактивирующих/уничтожающих вирусы обработок, дополняющих тепловую обработку раствора. Среди инактивирующих вирусы обработок, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению, имеется инкубирование при кислом рН (например, рН 3,8-4,2 при 37±2°C в течение между 4-24 часами в присутствии или отсутствии пепсина или нетоксичных детергентов, таких как Plironic, Triton, Tween и тому подобное); обработка алкилфосфатным органическим растворителем (0,3% три-n-бутил фосфатом или TNBP); детергентами (1% Triton X-100 или Triton X-45) (Neurath et al. Патент US-514375), предпочтительно за счет доведения рН раствора IgG до 4,2-6, а температуры до 4-30°C, инкубирования в течение 1-12 часов, а более предпочтительно приблизительно 6 часов при 25±2°C; и удерживающая вирусы наномембранная фильтрация (регенерированная целлюлоза, полиэфирсульфон, поливинилиденфторид) посредством либо тангенциального, либо терминального потока, в виде кассеты или многослойной конструкции (плоская поверхность), картриджа (складчатого, листового, с дисками) или полого волокна, предпочтительно сквозь поры с размером ≤50 нм, приблизительно между 10-50 нм и приблизительно между 15-35 нм и предпочтительно сквозь поры с размером 20±2 нм, с завершающей нанофильтрацией. Данные стадии инактивации/уничтожения можно проводить перед стадией тепловой обработки или после нее, за исключением применения нанофильтрации, когда предпочтительно, чтобы ее надо было применять перед тепловой обработкой.
После того, как стадию (d) способа согласно данному изобретению завершают, полученный раствор диафильтруют водой для инъекций или предпочтительно буферным раствором низкой ионной силы, который может, например, содержать ≤5 мМ уксусной кислоты при рН, составляющем 4,0-5,5, и необязательно стабилизаторами или эксципиентами для приготовления итоговой готовой формы. Итоговую диафильтрацию осуществляют посредством тангенциального потока через ультрафильтрационные мембраны полиэфирсульфона или эквивалента, используя отсечение по молекулярной массе предпочтительно между 10 кДа и 100 кДа, а более предпочтительно между 30 кДа и 50 кДа. После соответствующего количества объемов диафильтрации для уменьшения концентрации соли, предпочтительно до электропроводности, составляющей ≤2 мС/см, белок предпочтительно содержится в номинальных концентрациях, равных 5%, 10%, 16% или 20%, или в любой другой промежуточной концентрации между приблизительно 5% и 22% (м/о). Раствор предпочтительно стабилизируют посредством добавления полиспирта (полиола) или аминокислот. В любом случае осмоляльность полученного в результате раствора будет ≥240 мОсм/кг, и приблизительно изотонической. Предпочтительно pH доводят до 5,2±0,6 и проводят проверку, обеспечивая, чтобы он находился между 4,6 и 5,8, корректируя, при необходимости, разбавленной кислотой или щелочью.
Скорректированный раствор стерильно фильтруют через чистую мембрану с размером пор, равным 0,2 мкм, способом, известным в данной области. Полученный жидкий раствор стерильно дозируют в подходящие контейнеры и подвергают инкубированию (карантину) не меньше, чем 14 дней при 25±5°C, предпочтительно для того, чтобы наблюдать всякий признак нестабильности или заражения в каждом отдельном отмеренном объекте. Содержащийся продукт хранят в тех же самых условиях, что и для карантина (окружающая температура 25±5°C) или в холодной камере (5±3°C). Продукт, полученный посредством способа согласно данному изобретению, остается стабильным (по существу неизменным) в течение по меньшей мере 1 года при температуре между 2-30°C, не проявляя каких-либо признаков выявляемого ухудшения либо своих физических характеристик (внешний вид, цвет, мутность, отложения, частицы или волокна) или своих требуемых аналитических параметров согласно, например, Европейской Фармакопее (агрегаты с высокой молекулярной массой, фрагменты, антикомплементная активность или ACA, прекалликреиновый активатор или PKA, подклассы IgG и т.д.).
Данное изобретение описано более подробно ниже со ссылкой на примеры. Однако, данные примеры не предназначены для ограничения технических рамок данного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Начиная со смеси замороженной человеческой плазмы, подходящей для фракционирования, ее криопреципитировали при температуре между 0 и 4°C. Криопреципитат сепарировали с помощью центрифугирования в непрерывном потоке (центрифуга Westfalia) при одной и той же температуре криопреципитации. Супернатант подвергали обработке в соответствии со способом 6 фракционирования по Cohn (Cohn et al. выше) с использованием холодного этанола до тех пор, пока не получали Fr-II+III. Полученную или осажденную (Fr-II+III) массу сепарировали посредством фильтрации под давлением и замораживали при ≤20°C. Впоследствии Fr-II+III подвергали обработке посредством способа 9 фракционирования по Cohn-Oncley (Oncley, J. et al. выше) до тех пор, пока не получали Fr-II. Полученный Fr-II хранили при ≤20°C.
Fr-II суспендировали в изотоническом растворе глицина и натрия хлорида и доводили приблизительно до нейтрального pH. Раствор обрабатывали неорганическими адсорбентами, сепарировали посредством центрифугирования (центрифуга RINA), а затем очищали на фильтре с глубиной пор ≤0,5 мкм.
Фильтрат доводили до pH между 5,5 и 6,0, используя 0,5 M HCl и ультрафильтровали через полисульфоновые мембраны, имеющие номинальное отсечение по молекулярной массе 10 кДа. Объем сначала уменьшали, а затем запускали диафильтрацию с постоянным объемом водой для инъекций при 2-8°C. При завершении данной ультрафильтрации, оборудование дополнительно промывали, а раствор доводили до оптической плотности (при 280 нм), равной 60±5 оптических единиц белка. Добавляли твердый сорбитол в количестве 0,5 кг на каждый кг имеющегося раствора, а после растворения, pH раствора доводили до 5,5±0,5, используя 0,5 M HCl.
Затем проводили тепловую обработку раствора в термостатическом контейнере с рециркуляцией нагревающей текучей среды через кожух таким образом, чтобы температура продукта поднималась между 60 и 61°C и удерживалась там в течение 10-11 часов. Затем раствор охлаждали до 2-8°C.
Результаты, полученные для усреднения 3 отдельных партий, показаны в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| Стадия в способе | Общий белок (%) (оптическая плотность 280 нм) |
Чистота (% IgG электрофор.) | Полимеры (%) | Этанол (% о/о) | Электропроводность (мС/см) |
| Суспензия Fr-II | 6 | ≥97 | ~0,2 | 3,3 (3,2-3,4) | ~10 |
| Ультрафильтрованный раствор | 4 | ≥97 | 0,21 (0,19-0,23) | ≤0,1 | ≤0,5 |
| Нагретый раствор (10 час при 60-61°C) | 3 | ≥97 | 1,58 (1,30-1,86) | ≥0,1 | ≤0,5 |
Результаты выше показывают воздействие предшествующей очистки Fr-II+III (суспензия FrII ≥97% посредством электрофореза) и уменьшения денатурирующих агентов (этанола) на агрегацию в процессе тепловой обработки, только с 1,58% полимеров, делающих возможной последующую адсорбцию синтетическими катионными смолами.
Пример 2
Начиная с пула человеческой плазмы, процесс был таким же, как описано для Примера 1, до тех пор, пока не получали Fr-II+III (тест a) и продолжался до Fr-II (тест b). Для того, чтобы установить воздействие очистки, а также наличия денатурирующих агентов на полимеризацию в процессе тепловой обработки, процедуру проводили следующим образом:
а) Fr-II+III суспендировали в воде для инъекций при 2-8°C в пропорции, равной 1:3,5 по массе, а после того, как была получена гомогенная суспензия, pH поднимали до 5,25±0,25 с 0,5 M HCl. Впоследствии ее центрифугировали в декантаторе (центробежная сила между 200 g - 1000 g) с образованием очищенной суспензии.
b) Fr-II подвергали обработке, как в примере 1 до тех пор, пока не получали раствор, очищенный с помощью глубокого фильтра.
Каждый из растворов выше стабилизировали посредством добавления твердого сорбитола в количестве, равном 0,5 кг на кг первоначального супернатанта. После того, как сорбитол растворялся, pH, при необходимости, доводили до 5,5±0,5. Каждый раствор нагревали до 60-61°C в течение 10-11 часов. Затем его охлаждали до 2-8°C.
В Таблице 2 показаны результаты, полученные для пастеризованного продукта в тестах a) и b), по сравнению с Примером 1.
| Таблица 2 | |||||
| Тест или способ | Общий белок (%) (оптическая плотность 280 нм) |
Чистота IgG (%) |
Полимеры (%) | Этанол (% о/о) | Электропроводность (мС/см) |
| Тест а) | 4 | 75 | 15 | 2,5 | 2 |
| Тест b) | 4 | ≥97 | 5,03 | 2,5 | ≤0,5 |
| Пример 1 способа | 4 | ≥97 | 1,58 | ≤0,1 | ≤0,5 |
Результаты тестов a) и b) демонстрируют воздействие чистоты первоначального IgG и необходимость достижения значений ≥97%. С другой стороны, сравнивая тест b) со способом в примере 1, очевидно воздействие остаточного этанола, возникающего при фракционировании этанола и необходимость его устранения. Вследствие этого необходимо сделать вывод, что только условия в примере 1 будут приемлемы для способа согласно изобретению.
Пример 3
Плазму фракционировали таким же образом, как в примере 1 в отношении Fr-II+III, и данный материал очищали PEG или анионообменными смолами до тех пор, пока не получали достаточно чистый продукт.
Для данной первоначальной очистки Fr-II+III применяли такие же условия обработки, как описано в описании патента EP 1225180. Более подробно, в данном примере Fr-II+III суспендировали в водном растворе, имеющем в своем составе сорбитол, динатрийфосфат и уксусную кислоту, до тех пор, пока весь IgG эффективно не растворялся. Основные сопутствующие белки осаждали посредством добавления до 4% PEG. После этого добавляли неорганические адсорбенты и фильтрующий коадъювант. Перед отделением от преципитата посредством фильтрации под давлением (целлюлозные пресс фильтры) pH повторно доводили до 5,0±0,5. Массу сепарировали и собирали слой фильтрата. Проводили инжектирование в хроматографическую колонку, заключающую в себе анионообменные смолы типа DEAE-Sepharose® (Amersham Biosciences, Швеция) вслед за регулированием pH и очищающего градиента фильтрации до ≤0,5 мкм непосредственно перед поступлением в колонку. Собирали весь элюат, полученный в процессе загрузки продукта, имеющего в своем составе очищенный IgG. Элюат выше доводили до pH 4,4±0,2 с помощью 0,5 M HCl и ультрафильтровали через полисульфоновые мембраны, имеющие номинальное отсечение по молекулярной массе 100 кДа. Первоначально объем понижали приблизительно в 4 раза для получения концентрации, равной 2% белка, а затем при 2-8°C инициировали диафильтрацию при постоянном объеме 4 объемами воды для инъекций с 4 мМ уксусной кислоты (миллимоль/литр) и 5% сорбитола, доведенного до pH 4,2±0,2, с 0,5 M NaOH. При завершении этого, оборудование для ультрафильтрации дополнительно промывали с образованием раствора оптической плотности (при 280 нм), равной 55±5 оптических единиц белка. Впоследствии 0,5 M HCl добавляли до pH 4,0±0,1 с последующим инкубированием при 37±1°C в течение 4 часов.
Затем добавляли твердый сорбитол в количестве 0,43 кг на каждый кг имеющегося раствора (33% масса/масса), а после того, как он растворялся, pH раствора доводили до 4,9±0,1 с помощью 0,5 M NaOH.
Тепловую обработку проводили в термостатическом сосуде с рециркуляцией нагревающей текучей среды через кожух для того, чтобы поднять температуру продукта до 60-61°C и удерживать там в течение 10-11 часов. Затем раствор охлаждали до 2-8°C. В Таблице 3 показаны результаты анализа состава для мониторинга способа.
| Таблица 3 | ||||||
| Стадия в способе | Общий белок (%) | Чистота IgG (%) | Полимеры (%) | Этанол (% о/о) | PEG (%) |
Электропроводность (мС/см) |
| Суспензия Fr-II+III | n.d. | 70 | 12 | 1 | 0 | 1,5 |
| Очищенный раствор элюата в колонке | n.d. | ≥98 | ≤0,06 | 0,8 | 4 | 1,2 |
| Ультрафильтрованный раствор | 4,0 | ≥98 | ≤0,06 | ≤0,1 | 0,8 | ≤0,5 |
| Нагретый раствор (10 ч при 60°C) | 2,8 | 98 | 1,5 | ≤0,1 | 0,5 | ≤0,5 |
| n.d. Не определено | ||||||
Результаты в Таблице 3 показывают, что остаточное содержание PEG, равное 0,8%, не влияет на степень полимеризации в процессе тепловой обработки (1,5% полимеров). Также как на данную полимеризацию не влияет ранее использованный способ очистки, при использовании только ли этанола или этанола+PEG+анионной хроматографии (см. Примеры 1 и 2), при условии, что достигается чистота того же порядка (≥97% IgG).
Аналогичным образом определения аналитическим путем различных хромогенных субстратов проводили на других препаративных партиях, обработанных таким же образом, как описано ранее в данном Примере 3 для того, чтобы оценить стадии, имеющие способность инактивировать протеолитические ферменты, главным образом прокоагулянты. Субстраты S-2302, S-2288 и S-2238 (специфические для факторов свертывания крови для протромбинового комплекса, тромбина, плазминогена/плазмина, FXI/FXIa, FXII, PKA и т.д.) использовали на основе методики, описанной согласно состоянию уровня техники, рассчитывая градиент кинетики хромогенной реакции в оптической плотности (O.D.) единиц абсорбции в минуту (мин) по отношению к применяемой концентрации белков (г/мл). Соотношение (оптическая плотность/мин)/(г/мл) на стадиях перед пастеризацией и после нее показано в Таблице 4.
| Таблица 4 | |||
| Стадии способа | Протеолитическая активность (оптическая плотность/мин)/(г/мл) | ||
| S-2302 | S-2208 | S-2238 | |
| Очищенный раствор элюата в колонке | 1,69 | 2,03 | 0,23 |
| Ультрафильтрованный раствор | 0,87 | 1,1 | 0,14 |
| Нагретый раствор (10 ч при 60°C) | 0,12 | 0,14 | 0,017 |
Из результатов в Таблице 4 должно быть видно, что в специальных условиях способа пастеризации, протеолитическая активность (главным образом прокоагулирующие факторы) может быть понижена более чем в 5 раз по сравнению с первоначальным содержанием (ультрафильтрованный раствор) согласно значениям, полученным с тремя различными используемыми хромогенными субстратами.
Пример 4
Были доступны 3 различные партии продуктов, обработанных таким же образом, как в Примере 3, до тех пор, пока для каждой не получали пастеризованный раствор. Каждый раствор разбавляли приблизительно в 4 раза 10 мМ (миллимоль/литр) раствором ацетата натрия приблизительно при 20-25°C для достижения оптической плотности, равной приблизительно 10 оптических единиц (при 280 нм), и концентрации сорбитола, равной приблизительно 8% по массе, добавляя количество NaCl, необходимое для приведения продукта к итоговой концентрации, равной 0,4 M (моль/литр). Раствор доводили до pH 4,5 посредством добавления разбавленной HCl (0,1 M-0,5 M).
Раствор инжектировали в хроматографическую колонку с сильными полистироловыми катионитами (POROS HS® 50 µm, Applied Biosystems, Соединенные Штаты), c объемом приблизительно 8 мл (высота 10 см × поперечное сечение 0,8 см2). Колонку уравновешивали приблизительно 10 объемами колонки 10 мМ буферного раствора ацетата натрия с pH и концентрацией NaCl, равными pH и концентрации загружаемого продукта. Продукт инжектировали в потоке, равном приблизительно 20 объемов колонки/час, при этом собирали весь элюат из колонки с начала инжектирования. Получали образец элюата с фиксированным объемом, равным 16 объемам колонки, соответствующим загрузке приблизительно 155 мг IgG/мл геля, при этом определяли белок посредством оптической плотности (280 нм) и содержание полимеров посредством HPLC для того, чтобы рассчитать % извлечения IgG (мономеров/димеров) и достигнутый % уменьшения полимеров. Таблица 5 показывает полученные результаты.
| Таблица 5 | |||||
| Способ | Оптическая плотность (280 нм) разбавленный раствор (оптических единиц) | Извлечение белков (%) |
Первоначальные полимеры (%) |
Итоговые полимеры (%) | Уменьшение полимеров (%) |
| Партия А | 10 | n.d. | 1,90 | 0,11 | 94 |
| Партия В | 10 | n.d. | 1,82 | 0,09 | 95 |
| Партия С | 10 | 96 | 2,51 | 0,15 | 94 |
| n.d.: не определяли | |||||
В соответствии с предшествующими результатами, было получено очень значительное и достоверное уменьшение содержания полимеров между 94% и 95%, и было получено итоговое содержание между 0,09 и 0,15 для первоначального содержания полимеров между 1,8% и 2,5%. С другой стороны, необходимо отметить извлечение IgG (мономеров/димеров), составляющее 96%, вместе с емкостью загрузки, превышающей 100 мг IgG/мл геля, и продолжительностью процесса меньше, чем 2 часа (уравновешивание и загрузка).
Пример 5
Использованный способ был таким же, как в примере 4, но исследовали емкость загрузки с различными инжектируемыми объемами в условиях, установленных в примере 4. Брали образцы элюата для различных используемых объемов, определяя белок посредством оптической плотности (280 нм) и содержание полимеров посредством HPLC для расчета % извлечения IgG (мономеров/димеров) и % уменьшения полимеров, достигнутых для различных значений загрузки (мг IgG/мл геля). Результаты показаны в Таблице 6.
| Таблица 6 | ||||
| Используемый объем колонки (CV) | Инжектируемая загрузка (мг IgG/мл геля) | Полимеры (элюат) (%) | Уменьшение полимеров (%) | Извлечение белков (IgG) (%) |
| Первоначальный загружаемый раствор | 0 | 2,51 | 0 | 100 |
| 2 | 14 | ≤0,06 | ≥98 | 87 |
| 16 | 115 | 0,15 | 94 | 95 |
| 32 | 230 | 0,19 | 92 | 95 |
| 50 | 360 | 0,25 | 90 | 97 |
Результаты демонстрируют в очень значительной степени, что значения загрузки, равные 360 мг IgG/мл геля, могут быть достигнуты в условиях нормального потока до 20 объемов колонки в час с максимальным извлечением IgG, сохраняя способность к уменьшению полимеров ниже предела 0,3% до 50 используемых объемов колонки на постоянной основе. Продолжительность процесса для используемой загрузки не превышает 3 часов.
Пример 6
Для того, чтобы узнать рабочий диапазон концентрации NaCl в установленном pH, равном 4,5, и для оптимизации устранения полимеров за счет осуществления максимального извлечения IgG, процедуру проводили, как в примере 4, но изучали различные концентрации NaCl между 0,35 и 0,425 M, беря образец элюата колонки при 2 CV, 25 CV и 50 CV для определения белка посредством оптической плотности (280 нм) и полимеров посредством HPLC, для расчета % извлечения белка и уменьшения полимеров. Полученные результаты показаны в Таблице 7.
| Таблица 7 | |||||
| Используемый объем колонки (CV) | Инжектируемая загрузка (мг IgG/мл геля) | Полимер элюата при различных концентрациях NaCl (%) | |||
| 0,425 М | 0,40 М | 0,375 М | 0,35 М | ||
| Первоначальный загружаемый раствор | 0 | 1,88 | 2,12 | 2,13-2,14 | 1,99 |
| 2 | 14 | 0,10 | n.d. | ≤0,06 | ≤0,06 |
| 25 | 180 | 0,27 | 0,11 | ≤0,06 | ≤0,06 |
| 50 | 360 | 0,33 | 0,31 | ≤0,06 | ≤0,06 |
| Загружаемый пул элюата при 50 CV | 360 | n.d. | n.d. | ≤0,06 | ≤0,06 |
| n.d.: не определяли | |||||
Таблица 8 показывает результаты извлечения IgG и уменьшения полимеров в элюате для итогового максимального используемого значения загрузки (50 CV).
| Таблица 8 | ||
| Концентрация NaCl (М) при рН 4,5 | Извлечение IgG (%) | Уменьшение полимеров |
| 0,425 | 95,2 | n.d. |
| 0,40 | 93,0 | n.d. |
| 0,375 (n=2) | 94,2-93,2 | ≥97 |
| 0,35 | 90,8 | ≥97 |
| n.d.: не определяли | ||
Результаты выше демонстрируют, что в наилучших условиях концентрации NaCl снижение полимера не уменьшается за счет увеличения используемой загрузки до 50 CV (или 360 мг IgG/мл геля). Также как было установлено, что для получения максимальной емкости загрузки с минимальным содержанием полимеров (≤0,06%-0,31%) и извлечением IgG (мономеров/димеров) между 90,8% и 94,2% может быть использован диапазон от 0,40 M до 0,35 M NaCl.
Наилучшие результаты получаются при pH, равном 4,5, концентрации NaCl, равной 0,375 M, с концентрацией, равной 10 оптических единиц посредством оптической плотности (280 нм), и инжектируемым потоком, равным 20 CV/час. Было показано, что остаточный полимер составляет ≤0,06% (двойное повторение теста) при 50 CV (360 нм IgG/мл геля) с извлечением IgG, составляющим 93,2%-94,2%. Продолжительность процесса не превышала 3 часов.
Пример 7
Для того, чтобы узнать диапазон pH, в котором может быть использована стабильная концентрация NaCl, равная 0,35 M, и для оптимизации устранения полимеров посредством минимизации извлечения IgG, использовали процедуру, как в примере 4, изучая диапазон pH между 4,5 и 5,0, при этом для определения белка посредством оптической плотности (280 нм) и полимеров посредством HPLC и для расчета % извлечения белка и уменьшения полимеров образцы элюата колонки получали в конце 2 CV, 21-25 CV и 50 CV. Результаты показаны в Таблице 9.
| Таблица 9 | |||||
| Используемый объем колонки (CV) | Инжектируемая загрузка (мг IgG/мл геля) |
Полимер (%) в элюате при различных значениях рН | |||
| pH 4,96 | pH 4,88 | pH 4,76 | pH 4,50 | ||
| Первоначальный загружаемый раствор | 0 | 2,25 | 1,72 | 1,95 | 1,99 |
| 2 | 14 | 0,45 | 0,20 | 0,17 | ≤0,06 |
| 21-25 | 151-180 | 1,06 | 0,59 | 0,24 | ≤0,06 |
| 50 | 360 | 1,25 | 0,66 | n.d. | ≤0,06 |
| Общий загружаемый элюат до 50 CV | 360 | 1,13 | 0,63 | n.d. | ≤0,06 |
| n.d.: не определяли | |||||
Таблица 10 показывает результаты расчета извлечения IgG и уменьшения полимеров в элюате при итоговом максимальном используемом объеме загрузки (50 CV), и уменьшение полимеров в элюате при половине максимальной загрузки (приблизительно 25 CV).
| Таблица 10 | |||
| рН | Извлечение IgG (50 CV) (%) | Уменьшение полимеров (50 CV) (%) | Уменьшение полимеров (25 CV) (%) |
| 4,96 | 96,8 | 49,8 | 52,9 |
| 4,88 | 96,6 | 63,3 | 65,7 |
| 4,76 | 94,3 (*) | n.d. | 87,7 |
| 4,5 | 90,8 | ≥97 | ≥97 |
| (*) определяли в элюате при 21 CV; n.d.: не определяли | |||
Результаты выше демонстрируют сильную зависимость между pH и NaCl для эффективного уменьшения полимеров с минимальной потерей IgG. Было обнаружено, что при концентрации NaCl, равной 0,35 M, наиболее подходящий pH в пределах тестируемого диапазона составляет приблизительно между 4,76 и 4,50 так, что остаточный полимер находится между ≤0,06%-0,24% (при использовании 21-50 CV), а извлечение IgG находится между 90,8% и 94,3%. Продолжительность процесса составляла между 2 и 4 часами.
Пример 8
Процедура была такой же, как в примере 6, но для того, чтобы исследовать наилучшие условия концентрации NaCl между 0,1 M и 0,4 M, pH установили между 4,85 и 4,88. Результаты показаны в Таблице 11.
| Таблица 11 | ||||||||
| Объем колонки (CV) | Инжектируемая загрузка (мг IgG/мл геля) | Элюат при различных концентрациях NaCl | ||||||
| 0,4 М (n=2) | 0,375 М | 0,35 М | 0,325 М | 0,3 М (n=3) | 0,275 М | 0,1 М | ||
| Первоначальный загружаемый раствор | 0 | 1,55 2,19 | 1,71 | 1,72 | 1,28 | 1,94 1,33 1,57 | 2,11 | 1,51 |
| 2 | 14 | 0,52 0,56 | 0,25 | 0,20 | 0,06 | ≤0,06 ≤0,06 ≤0,06 | ≤0,06 | ≤0,06 |
| 25 | 180 | 0,98 1,18 | 0,84 | 0,59 | 0,25 | 0,10 0,13 0,12 | ≤0,06 | ≤0,06 |
| 50 | 360 | 1,23 1,34 | 0,94 | 0,66 | 0,25 | 0,13 0,16 0,15 | ≤0,06 | ≤0,06 |
| Загружаемый элюат при 50 CV | 360 | n.d. | 0,87 | 0,63 | 0,17 | ≤0,06 n.d. 0,13 | ≤0,06 | ≤0,06 |
| n.d.: не определяли | ||||||||
Таблица 12 показывает результаты расчета извлечения IgG и уменьшения полимеров в элюате при итоговом максимальном используемом значении загрузки (50 CV).
| Таблица 12 | ||
| Концентрация NaCl (моль/литр) при рН 4,85-4,88 | (%) извлечения IgG | (%) уменьшения полимеров |
| 0,4 М | 95-97 | n.d. |
| 0,375 М | 96,3 | 49,1 |
| 0,35 М | 96,6 | 63,4 |
| 0,325 М | 94,9 | 86,7 |
| 0,3 М | 93,7 93,6 93,7 |
≥97 n.d. 91,7 |
| 0,1 М | 76,0 | ≥96 |
| n.d.: не определяли | ||
Результаты выше показывают, что способ является целесообразным при pH 4,85-4,88 в пределах диапазона от 0,325 M до 0,275 M NaCl для максимальной емкости загрузки (50 CV, или 360 мг IgG/мл геля), с минимальным остаточным содержанием полимеров (≤0,06%-0,17%) и извлечением IgG (мономеров/димеров), составляющим между 92,5% и 94,9%. Наилучшие результаты были получены при концентрации NaCl, равной 0,3 M, при которой достигали извлечения, равного 93,7%, и максимального остаточного полимера в элюате, равного 0,13%. При более низкой концентрации NaCl, равной 0,1 M, полимеры исчезали полностью, но извлечение IgG составляло менее, чем 90%.
При сравнении результатов в данном примере 8 и результатов в примере 6 очевидна сильная зависимость между pH и NaCl, и данные параметры следует регулировать в пределах соответствующего диапазона для достижения оптимальных значений уменьшения полимеров и извлечения IgG. Примеры выше демонстрируют, что требуемые результаты в отношении остаточного полимера ≤0,3% и уменьшения ≥85%, и извлечения IgG (мономеров/димеров) ≥90% получаются между pH 4,5 и pH 4,9 с концентрацией NaCl от 0,275 M до 0,4 M.
Пример 9
Цель данного теста состояла в оценке емкости загрузки смол POROS HS® (Applied Biosystems, Соединенные Штаты) при использовании общепризнанного способа хроматографии, который предполагает адсорбцию всего IgG для последующего элюирования с последующим сравнением результатов, полученных в предшествующих вариантах осуществления изобретения. Общепризнанный способ хроматография осуществляли в условиях для полной адсорбции IgG для насыщения смол при различных инжектируемых потоках.
Начиная с партии продукта, обработанного таким же образом, как в примере 3, когда речь идет о получении пастеризованного раствора, раствор разбавляли приблизительно в 4 раза 10 мМ (миллимоль/литр) раствором ацетата натрия приблизительно при 20-25°C для того, чтобы обеспечить приблизительно 10 оптических единиц оптической плотности (при 280 нм) приблизительно с 8% (м/м) сорбитола. Раствор доводили до pH 4,5 посредством добавления разбавленной HCl (0,1 M-0,5 M).
Инжектирование проводили в катионную хроматографическую колонку с сильной полистироловой синтетической смолой (POROS HS® 50 мкм, Applied Biosystems, Соединенные Штаты) с объемом приблизительно 4 мл (высота 4 см и поперечное сечение 1 см2. Колонку уравновешивали приблизительно 10 объемами колонки 10 мМ буферным раствором натрия ацетата при pH, равном 4,5. Продукт инжектировали при различных потоках загрузки между 5 и 20 объемов колонки/час. Образцы элюата колонки брали из первоначального инжектирования в различные объемы колонки с определением белка посредством оптической плотности (280 нм) для того, чтобы рассчитать максимальную емкость загрузки в динамических условиях потока с приблизительным значением белка в инжектируемом растворе, равным 5%. Полученные результаты показаны в Таблице 13.
| Таблица 13 | |
| Инжектируемый поток (СМ/час) | Емкость загрузки (мг IgG/мл геля) |
| 5 | 63 |
| 10 | 58 |
| 20 | 55 |
Из результатов следует вывод, что максимальная емкость смолы, используемой для общей адсорбции IgG в наилучших условиях динамики потока в общепризнанном способе хроматографии, обнаруживается приблизительно при 60 мг IgG на мл смолы, и остается фактически неизменной в изучаемых инжектируемых потоках 5-20 CV/час. Принимая во внимание, что данный результат очень далек, приблизительно в 6 раз ниже, чем >360 мг IgG/мл геля, полученного в примерах 6 и 8 с применением условий процесса согласно данному изобретению, это демонстрирует, что производительность способа согласно данному изобретению очень сильно превосходит производительность общепризнанной хроматографии, описанной в предыдущем уровне техники.
Пример 10
В данном примере тест был разработан для того, чтобы определить хроматографическое разрешение (отделение полимеров) и извлечение IgG в условиях полного хроматографического цикла (загрузка, промывание и элюирование) с полной адсорбцией IgG (общепризнанная хроматография), и для сравнения результатов, полученных в предшествующих примерах способа согласно изобретению.
Процедура была такой же, как в примере 9, но в колонку инжектировали первоначальное количество раствора IgG, эквивалентное 80% ее максимальной емкости (приблизительно 50 мг IgG/мл геля) при потоке, равном приблизительно 5 CV/час. После того, как весь продукт загружали, проводили последующее промывание буферным раствором приблизительно в 8 CV, равным первоначальному уравновешенному раствору, содержащему 10 нм натрия ацетата при pH 4,5. IgG впоследствии элюировали, используя градиент концентрации NaCl от 0 до 1 M (моль/литр) с содержанием 0,5 M глицина при pH 4,5 всего приблизительно в 25 CV. Элюированный IgG собирали во фракции для последующего анализа белка (оптическая плотность при 280 нм) и анализа молекулярного распределения (HPLC). Результаты показаны в Таблице 14.
| Таблица 14 | |||
| Фракция | Объем (CV) |
Полимеры (%) |
Суммарное извлечение IgG (%) |
| Используемый раствор | 14 | 2 | 100 |
| Загрузка + последующее промывание элюата | 22 | n.d. | n.d. |
| 1-я текучая фракция | 16 | ≤0,06 | 64 |
| 2-я текучая фракция (хвостовая фракция) | 2,5 | 19 | 6 |
| 2-й пик | 4 | 57 | 16 |
| Регенерация | 5 | 50 | 4 |
| n.d.: не определяли | |||
В соответствии с результатами выше было продемонстрировано, что для загрузки 50 м IgG/мл геля получают максимальное извлечение, равное 64% IgG (мономеров/димеров) для содержания полимеров ≤0,06%, большая часть IgG, смешанного с неизвлекаемым полимером, обнаруживается в хвостовой фракции и 2-ом пике элюирования. Данное значение извлечения не сравнимо со значениями, полученными в предшествующих примерах, в которых применяется способ согласно данному изобретению, в которых демонстрируется удовлетворительное устранение полимера и извлечение более чем 90% IgG.
Пример 11
Дополнительный тест разработали для изучения пределов pH и ионной силы (NaCl), которые могут быть использованы, и чтобы узнать влияние концентрации IgG на загрузку.
Различные тесты проводили с пастеризованным IgG, происходящим из различных партий продуктов, обработанных таким же образом, как в примере 3. Тем не менее, в одном из тестов использовали 4-кратное разбавление (до оптической плотности 280 нм = 10 оптических единиц), а остальные с приблизительно 1,5-2 кратными разбавлениями (до оптической плотности 280 нм = 20-23 оптических единиц), используя 10 мМ раствор ацетата натрия, и в каждый из них добавляли NaCl, необходимый для достижения требуемой итоговой концентрации между 0,275 M и 0,45 M, доводя до итогового pH, равного 4,2 и 5,5, соответственно. Данные регулировки pH осуществляли, используя разбавленную уксусную кислоту. Отрегулированные растворы инжектировали в колонку POROS® HS 50 (Applied Biosystems, Соединенные Штаты) в независимых циклах, как описано в примере 4, но в данном случае используя между приблизительно 150 и 750 мг IgG/мл геля в проведенных тестах.
Содержание (%) полимера и димера определяли посредством HPLC, а извлечение IgG (%) определяли для различных значений загрузки. Полученные значения показаны в Таблице 15.
| рН | [NaCl] (М) | Первоначальная оптическая плотность 280 |
Использование (CV) | Загрузка (мг IgG/мл геля) | Первоначальный | Итоговый полимер (%) | Извлечение IgG (%) | Уменьшение полимера (%) | |
| Полимер (%) | Димер (%) | ||||||||
| 4,2 | 0,45 | 10 | 32 | 230 | 2,45 | ≤1 | ≤0,06 | 91,0 | ≥98 |
| 5,0 | 0,275 | 23 | 20 | 330 | 2,61 | n.d. | ≤0,06 | n.d. | ≥98 |
| 35 | 580 | 0,07 | 92,6 | 97 | |||||
| 4,85 | 0,275 | 20,6 | 10 | 147 | 1,76 | 2,5 | ≤0,06 | 92,5 | ≥96 |
| 25 | 369 | ≤0,06 | 99,5 | ≥96 | |||||
| 40 | 590 | 0,12 | 97,2 | 93 | |||||
| 50 | 737 | 0,61 | 96,0 | 65 | |||||
| 5,5 | 0,20 | 22,4 | 2 | 32 | 2,76 | 4,5 | ≥0,06 | 80,1 | ≥98 |
| 25 | 403 | 0,38 | 96,9 | 86 | |||||
| 50 | 806 | 1,34 | 94,5 | 51 | |||||
| n.d.: не определяли | |||||||||
На основе различных пастеризованных партий, имеющих первоначальное содержание полимеров, эквивалентное и менее, чем 3%, было продемонстрировано, что для любого отрегулированного значения в исследованных пределах в данном Примере (pH 4,2-5,5 и NaCl 0,20-0,45 M) имеется возможность избирательной адсорбции полимеров до значений между ≤0,06%-0,12%, эквивалентных уменьшению между 93% и ≥98%, и извлечению избытка IgG, равному 80% (91,0-99,5% достигалось между pH 4,2 и 5,0). Также как следует указать, что емкость загрузки и эффективность колонки не снижаются, когда концентрация белков в растворе продукта увеличивается до значения оптической плотности при 280 нм, равной 23 оптических единиц, эквивалентной 14,7-16,5 мг IgG/мл, при этом достигаются загрузки, равные 580-590 мг IgG/мл геля. Однако, на верхнем конце диапазона pH (pH 5,5) солевой раствор необходимо значительно уменьшить (с 0,45 M до 0,2 M) для того, чтобы добиться значительного уменьшения полимера. Также как наблюдается более низкая емкость загрузки, чем при более низких значениях pH, потому что когда используют 403 мг IgG/мл геля, определяют более большое содержание полимеров, причем их уменьшение составляет только 86%. Данный эффект может быть приписан наличию большего количества димерных молекул, имеющихся при pH 5,5, доля которых увеличивается с pH, по сравнению с pH 4,2.
Пример 12
Из предшествующих Примеров 6, 8 и 11 была определена эмпирическая формула (1) для полистироловой перфузионной смолы POROS®-HS 50, из которой возможно установить с большей точностью концентрацию NaCl, необходимую для того, чтобы получить желательные результаты для итогового полимера и извлечения в качестве функции используемого pH. Выражение: (1) [NaCl] = 0,24+(5,2-pH)/5=1,28=0,2 × pH обеспечивает приблизительно желательные значения в пределах диапазона pH, установленного (pH 4,2-5,5) для изучаемой смолы. На основе данных в примерах, в Таблице 16 показаны концентрации NaCl, необходимые при различных pH (наблюдаемое значение и значение, рассчитанное согласно формуле) для итогового полимера, предпочтительно ≤0,1%, и извлечения не меньше, чем 90%.
| Таблица 16 | ||
| рН | Наблюдаемое значение (М) | Расчетное значение (М) |
| 4,20 | 0,45 | 0,44 |
| 4,50 | 0,375 | 0,38 |
| 4,85-4,88 | 0,300-0,275 | 0,31 |
| 4,96 | 0,275 | 0,29 |
| 5,20 | n.d. | 0,24 |
| 5,50 | 0,20 | 0,18 |
Результаты в Таблице 16 показывают хорошую прямолинейную корреляцию между наблюдаемыми значениями и значениями, рассчитанными согласно формуле, включая крайние значения pH.
Пример 13
Плазму подвергали обработке таким же образом, как в примере 1, для получения очищенного раствора поливалентного IgG (чистота ≥97% IgG) посредством фракционирования этанола (согласно методу по Cohn-Oncley). Полученную Fr-II диафильтровали через 10 кДа мембраны до 60 оптических единиц и впоследствии пастеризовали (10-11 часов при 60-61°C) в присутствии 33% d-сорбитола (масса/масса) и при pH, равном 5,5±0,5. Пастеризованный раствор разбавляли приблизительно в 4 раза 10 мМ раствором ацетата натрия при pH 4,85 для того, чтобы оптическая плотность при 280 нм изменялась с 42,8 оптических единиц до 10,7 оптических единиц, и добавляли NaCl до тех пор, пока не получали итоговую концентрацию, равную 0,275 моль на литр раствора, доводя pH до 4,85 с использованием 0,1 M HCl. Доля полимера, определенного посредством HPLC, составляла 0,88%. Непосредственно после этого его инжектировали в колонку с полистироловыми катионообменными смолами (50 мкм POROS-HS®) и объемом, равным 8,0 мл (поперечное сечение 0,8 см2 × высота 10 см) с потоком, равным приблизительно 20 CV/час. Получали образцы элюата колонки при различных применяемых объемах загрузки (CV) и для итогового пула, определяя молекулярное распределение (полимеры с высокой молекулярной массой) посредством HPLC и полученное уменьшение. Найденные значения показаны в Таблице 17.
| Таблица 17 | |||
| Загрузка | Полимер | Уменьшение полимеров | |
| Объемы загрузки (CV) | мг IgG/мл геля | (%) | (%) |
| 2 | 15 | ≤0,06 | ≥93 |
| 25 | 192 | ≤0,06 | ≥93 |
| 50 | 385 | ≤0,06 | ≥93 |
| Пул | 385 | ≤0,06 | ≥93 |
Полученные результаты показывают, что с наилучшими условиями для процесса адсорбции возможно задерживать все полимеры (до ≤0,06%), образовавшиеся при пастеризации IgG, ранее очищенного посредством фракционирования этанола с высокой инжекционной загрузкой (385 мг IgG/мл смолы).
Пример 14
Данный тест разработали для определения целесообразности способа, когда различные стадии очистки включают в единственную стадию. Было решено определить, можно ли объединить адсорбцию полимера с предшествующей необязательной стадией обработки растворителем-детергентом и последующей адсорбцией этих реагентов.
Для того, чтобы это сделать, первоначальным материалом был Fr-II+III, который подвергали обработке таким же образом, как в примере 3 для получения основного объема пастеризованного раствора. Данный раствор разбавляли до оптической плотности при 280 нм, равной 28±1 оптических единиц (приблизительно 2% белка), и добавляли концентрированный раствор (x 10 раз) раствора растворителя-детергента, содержащего три-n-бутил фосфат и Triton X-100 для достижения итоговых концентраций 0,3±0,1% и 1,0±0,3%, соответственно. Температуру раствора повышали до 25±2°C и гомогенизировали в течение приблизительно 30 минут. Затем его переносили в еще один подходящий сосуд для того, чтобы инкубировать в течение приблизительно 6 часов при 25±2°C. После обработки раствор разбавляли приблизительно на 10% 100 мМ натрия ацетата и 2,75 M раствора NaCl для того, чтобы итоговые концентрации составляли 1/10 части добавленных, и концентрация белка составляла 16,5 мг/мл. pH раствора при необходимости доводили до 4,85±0,05 0,1 M HCl, с получением объема, равного 167 мл.
Перед этим кондиционировали колонку с объемом 17,5 мл и высотой 10 см с гидрофобными смолами (C8 углеводород) и матрицей с силаноловыми группами (SDR-HyperD® by Pall, Соединенные Штаты) и еще одну колонку POROS-HS® с катионными смолами (50 мкм, Applied Biosystems, Соединенные Штаты) объема 8,0 мл. Две колонки последовательно соединяли таким образом, чтобы первая (SDR-HyperD®) снабжала вторую (POROS-HS®), и их кондиционировали посредством пропускания через них уравновешивающего раствора, содержащего 10 мМ натрия ацетата, 0,275 M NaCl при pH, равном 4,85±0,05, в потоке, эквивалентном 6 CV/час и 13 CV/час для первой и второй колонки, соответственно.
В первую колонку SDR-HyperD® инжектировали предварительно приготовленный раствор IgG (167 мл), и элюат из последней подавали во вторую колонку POROS-HS®. Значения загрузки, рассчитанные для каждой колонки, составляли: 1) 167 мл/17,5 мл = 9,5 CV для колонки SDR-HyperD®; 2) 167 мл/8,0 мл = 21 CV для колонки POROS-HS®. Инжектируемый поток в течение всего способа составлял 6 и 13 CV/час для первой и второй колонок, соответственно. В конце загрузки проводили последующее промывание приблизительно 2 CV уравновешивающего раствора, собирая весь элюат из колонок в пул.
Результаты молекулярного распределения (HPLC) и белка (посредством 280 нм оптической плотности) для каждой стадии подытожены в Таблице 18.
| Таблица 18 | |||
| Стадия | Полимер (%) | Белок (%) | Извлечение (%) |
| Пастеризации | 2,22 | 2,75 | 100 |
| Обработки SD | 3,67 | 1,80 | 100 |
| Регулировки | 3,67 | 1,65 | 100 |
| SDR + POROS элюата | ≤0,06 | 1,58 | 95,7 |
Результаты выше показывают, что процесс адсорбции полимера мог быть полностью включен и проводиться одновременно с другими стадиями способа, в результате чего уменьшается общее время, вместе с расходованием реагентов в предшествующем кондиционировании и последующем промывании.
Пример 15
Тестировали способность удерживания полимера различных коммерчески доступных катионных смол для достижения наилучшего возможного отделения в отношении мономеров/димеров IgG. Для того, чтобы это сделать сравнивали матрицы смолы различного происхождения, особенно акриловые (Toyopearl®) против агарозной (Sepharose®). Смолы закладывали в колонки с поперечным сечением, равным 1,75 см2, с высотой закладки каждой, равной 100 мм (XK16® от GE-Healthcare) со смолами GigaCap Toyopearl-S 650® и SP-Sepharose XL®.
Первоначальным материалом была смесь различных партий пастеризованного раствора IgG, обработанного, как в примере 3, в который добавляли NaCl до 0,275 M и 0,20 M, доводя при необходимости pH до 4,85±0,05 с помощью 0,1 M HCl. Растворы имели концентрацию белков приблизительно 22 оптические единицы и до 50 CV инжектировали при потоке, равном приблизительно 15 CV/час в колонки, которые были приготовлены и кондиционированы теми же концентрациями NaCl и с pH, как раствор IgG в тесте.
Результаты извлечения полимера, полученные для различных используемых объемов колонки, по сравнению с первоначальным, показаны в Таблице 19.
| Таблица 19 | ||||
| Смола | Загрузка | Извлечение полимера (%) | ||
| CV | Мг белка/мл геля | NaCl (0,275 М) | NaCl (0,200 М) | |
| GigaCap Toyopearl-S 650 М | 0 | 0 | 100 | 100 |
| 10 | 158 | 97 | 15 | |
| 25 | 396 | 100 | 73 | |
| 40 | 633 | 104 | 97 | |
| 50 | 791 | 110 | 110 | |
| SP-Sepharose XL | 0 | 0 | 100 | 100 |
| 10 | 158 | 98 | 89 | |
| 25 | 396 | 100 | 95 | |
| 40 | 633 | 103 | 95 | |
| 50 | 791 | 95 | 91 | |
Общее извлечение белка, варьирующее от 98% до 100% для смолы SP-Sepharose XI, и от 90 до 100% для GigaCap-S 650M (приблизительно 98% при 10 CV и 0,2M NaCl).
Результаты выше показывают, что акриловые катионные смолы (типа GigaCap-S® 650M), как POROS-HS® (катионный полистирол), способны избирательно удерживать полимер, образованный посредством пастеризации IgG с возможностью уменьшения имеющегося полимера до 85% (15% извлечение) для загрузки белка, равной 158 мг/мл геля и извлечения общего белка, равного 98%. Очевидно, полученный результат может быть оптимизирован по отношению к pH (уменьшая его), улучшая емкость загрузки для достижения, например, приблизительно 25 CV (396 мг белка/мл геля).
Было обнаружено, что смолы из несинтетических матриц агарозного типа (Sepharose XI) не обладают достаточной разрешающей способностью для отделения полимеров от мономеров/димеров IgG в заданных условиях для избирательной адсорбции первых в загружаемом элюате.
Также как должно быть видно, что наиболее подходящие условия pH и концентрации NaCl являются специфичными для типа используемой синтетической перфузионной смолы. Соответственно для акриловой смолы типа GigaCap-S® 650M при pH 4,85 необходимо не более, чем 0,2 M NaCl, тогда как для POROS-HS® 50 мкм смолы будет необходимо 0,3 M NaCl.
Ясно, что квалифицированный специалист в данной области может найти наиболее подходящее соотношение между pH и концентрацией NaCl для каждого типа синтетической перфузионной смолы.
Пример 16
Затем проверяли масштабируемость способа в стадиях до конечного продукта, полученного в виде готовой формы и концентрированного в виде IGIV с 10% белка, исследуя композиционные характеристики продукта.
Пул плазмы более, чем 1000 литров фракционировали с этанолом для получения Fr-II+III, и очистку продолжали до тех пор, пока не получали основную массу пастеризованного раствора, как описано в примере 3.
6,34 кг пастеризованного ранее раствора (эквивалентно приблизительно 26,2 литрам первоначальной плазмы), брали после разбавления водой для инъекций до оптической плотности, равной 27,98 оптических единиц (при 280 нм), и электропроводности, равной 0,26 мС/см, проверяя, чтобы его pH составлял 4,65. Приблизительно 0,70 кг концентрированного раствора (x 10 раз) 3% три-n-бутилфосфата и 10% Triton X-100 добавляли в течение приблизительно 5-10 мин с жестким встряхиванием. pH доводили до 4,79 посредством добавления 0,1 M NaOH. 7,04 кг раствора получали и инкубировали при окружающей температуре (18-25°C) в течение до 6 часов. Содержание три-n-бутилфосфата определяли посредством газовой хроматографии, чтобы оно составляло 0,28% (2800 м.д.).
Впоследствии добавляли 1,5 M раствора NaCl, имеющего в своем составе 10 мм натрия ацетата при pH 4,85 для достижения итоговой концентрации NaCl, равной 0,275 M. Полученный в результате pH составлял 4,81. Впоследствии 6930,9 г раствора получали и инжектировали в колонку с диаметром 140 мм, заключающую в себе 770 мл смол SDR-HyperD® (от Pall), причем высота смолы составляла 50 мм. Инжектирование осуществляли при окружающей температуре и при эквивалентном потоке, равном 6,1 CV/час, таким образом, чтобы весь раствор был загружен менее, чем за 2 часа. Полученное в результате общее загрузочное соотношение составляло 9 CV (6,93 кг/0,770 л = 9,0 CV). Впоследствии осуществляли последующее промывание, используя 3 CV 0,275 M NaCl и 10 мм раствора ацетата натрия при pH 4,85. Получали 6,93 кг элюата колонки, извлеченного в процессе инжектирования раствора продукта, при этом pH составлял 4,82, а электропроводность 16,75 мС/см. Содержание три-n-бутилфосфата, определяемое аналитически посредством газовой хроматографии, составляло ≤5 м.д.
5,772 кг элюата выше брали и инжектировали в 222 мл колонку со смолами POROS HS® (50 мкм), диаметр колонки составляет 50 мм, а высота слоя 113 мм. Раствор инжектировали в колонку при окружающей температуре с потоком, равным приблизительно 10 CV/час, таким образом, чтобы процесс заканчивался приблизительно через 2,5 часа. Весь элюат колонки, полученный в процессе загрузки продукта, собирали и объединяли с 1 CV дополнительного промывания раствором 0,275 M NaCl, 10 мм натрия ацетата и 17% сорбитола (масса/масса) при pH 4,85. Получали 5,776 кг пула элюата из колонки, извлекаемого в процессе инжектирования раствора продукта, при этом оптическая плотность составляет 18,508 оптических единиц (280 нм), pH составляет 4,84 и электропроводность составляет 16,95 мС/см.
Пул элюата выше очищали посредством фильтрования через 0,1 мкм, а затем последовательного нанофильтрования с градиентом пористости, равным 35 нм (Planova® 35N) + 20 нм (Planova® 2ON). При завершении нанофильтрации продукта его дополнительно промывали объемом, эквивалентным 5% извлеченного объема того же самого раствора дополнительного промывания, используемого в колонке POROS HS®, при этом общая продолжительность процесса составляет приблизительно 18 часов. Количество полученного нанофильтрата составляло 6,797 кг, pH составлял 4,83, мутность 2,71 NTU (нефелометрическая единица мутности), а электропроводность 17,1 нС/см.
Нанофильтрованный раствор ультрафильтровали через полиэфирсульфоновую мембрану, имеющую номинальное отсечение по молекулярной массе 100 кДа. Сперва продукт концентрировали в 3,3 раза, от оптической плотности, равной 14,4 оптических единиц (280 нм) до приблизительно 50±10 оптических единиц (280 нм), а затем его диафильтровали при постоянном объеме приблизительно 7 объемами раствора для диализа, содержащего 2 мМ уксусной кислоты, доведенной до pH 4,2±0,2 с помощью NaOH. После проверки электропроводности (220 мкс/см), добавляли достаточное количество концентрированного 33% раствора сорбитола для приведения итоговой концентрации сорбитола приблизительно к 5% (масса/объем). В заключение его концентрировали приблизительно в 3,5 раза для достижения оптической плотности, равной 140±5 оптических единиц (280 нм), эквивалентной приблизительно 10% белку, а pH доводили до 5,25±0,25 с помощью 0,1 M NaOH. Получали 552,1 г раствора с итоговым pH, равным 5,26, с мутностью, равной 5,45 NTU, и электропроводностью, равной 1,18 мС/см. Данный раствор фильтровали через 0,22 мкм и расфасовывали в бутылки, при этом pH составлял 5,34, осмоляльность 330 мОсм/кг, мутность 4,62 NTU, а электропроводность 1,34 мС/см. Продолжительность процесса для данной стадии составляла 9,5 часов.
Дозированные бутылки выдерживали при 5±3°C и 25±2°C в течение более, чем 15 дней без проявления каких-либо признаков загустевания или мутности или осадкообразования, изменений цвета или появления видимых волокон или частиц.
Таблица 20 показывает результаты для полимеров, димера, мономера и фракций на различных стадиях всего способа получения.
| Таблица 20 | ||||
| Стадия способа | Полимер (%) | Димер (%) |
Мономер (%) | Фракции (%) |
| Пастеризации | 2,0 | 3,2 | 94,8 | 0 |
| Элюат SDR | 2,7 | 2,6 | 94,1 | 0,6 |
| Элюат POROS | ≤0,06 | 1,9 | 98,1 | 0 |
| Нанофильтрат | ≤0,06 | 3,0 | 96,5 | 0,5 |
| Итоговое концентрирование (0,2 мкм) | ≤0,06 | 4,3 | 95,6 | 0,1 |
Из результатов выше понятно, что регулирование содержания димеров (≤5%), которое достигается, как проиллюстрировано ранее в предшествующих примерах за счет регулирования pH и концентрации соли в продукте перед колонкой POROS (в Пастеризованном и SDR элюате), обеспечивает возможность превосходной адсорбции имеющегося полимера (≤0,06%), минимизируя потери димера IgG (2,6% в SDR элюате и 1,9% в POROS элюате).
Можно сделать заключение, что весь способ получения IGIV, за счет включения стадии устранения агрегатов/полимеров с помощью обработки SD и их отделения, вместе с нанофильтрацией, диафильтрацией и итоговым получением готовой формы является полностью жизнеспособным и масштабируемым, при этом получаются превосходные значения конечного продукта в отношении содержания полимеров (≤0,06%) и фракций (0,1%).
Пример 17
Полученный продукт (10% IGIV) в примере 16, расфасованный в 20 мл стеклянные бутылки по 10 мл в бутылку, герметично запечатанные 20 мм Ø бутилкаучуковыми пробками, хранили при окружающей температуре (25±5°C), без доступа света, в течение 12 месяцев.
Спустя некоторое время, которое было установлено длиной приблизительно в 1 год, их визуально обследовали (физический внешний вид), и аналитически определяли параметры, наиболее показательные для стабильности. Значения, полученные в начале (t=0) и конце хранения (t=1 год), показаны в Таблице 21. Аналогичным образом также включены нормальные значения, полученные в промышленном масштабе с использованием состояния уровня техники (Патент ES-200100101).
| Таблица 21 | |||
| Параметры | Время = 0 | Время = 1 год (Т:20-30°С) | Спецификации (Евр. Фарм.) |
| рН | 5,34 | 5,28 | 4,0-7,4 |
| Мутность (NTU) | 4,62 | 7,09 | n.e. |
| Электропроводность (мС/см) | 1,34 | 0,63 | n.e. |
| Осмоляльность (мОсм/кг) | 330 | 357 | ≥240 |
| Полимеры (% HPLC) | ≤0,06 | 0,27 | ≤3,0 |
| Фрагменты (% HPLC) | 0,09 | 0,92 | ≤5,0 |
| IgG1 (%) | 67,7 | 67,5 | Эквивалентно плазме |
| IgG2 (%) | 26,2 | 26,2 | Эквивалентно плазме |
| IgG3 (%) | 3,3 | 3,1 | Эквивалентно плазме |
| IgG4 (%) | 2,7 | 2,6 | Эквивалентно плазме |
| PKA (UI/мл) | <2 | <2 | ≤25 |
| ACA (СН20/мг) | 0,79 | 0,89 | ≤1 |
| n.e.: не установлены; Евр. Фарм.: Европейская Фармакопея | |||
Что касается внешнего вида, было обнаружено, что он не ухудшается в образцах ни в результате наличия частиц (волокон, сгустков или осадка) или мутности (прозрачности), или окрашивания (обесцвечивания). Можно сделать заключение, что полученный продукт сохранялся по существу неизменным (полимеры, ферменты, такие как PKA, ACA и т.д.) в течение 1 года при окружающей температуре, равной 25±5°C, при этом продукт соответствует значениям, утвержденным в Европейской Фармакопее (Eur.Ph.).
Пример 18
Одну партию подвергали обработке с подготовительным коэффициентом масштабирования, эквивалентным Примеру 16 только с одним изменением в порядке последовательности стадий инактивации вирусов таким образом, чтобы обработку SD осуществляли на первоначальном диафильтрованном материале, а затем данные реагенты адсорбировали смолами SDR-HyperD®, а затем остальные стадии способа, необходимые для получения продукта согласно изобретению, то есть пастеризацию в присутствии сорбитола и улавливание молекулярных агрегатов с использованием перфузионных смол POROS HS, проводили таким же образом, как в примере 16. В заключение, в полученном продукте, стабилизированном 5% сорбитолом, концентрацию белков IGIV поднимали до 10%, стерилизовали его посредством фильтрации и расфасовывали в 20 мл стеклянные бутылки. Бутылки, герметично запечатанные бутилкаучуковыми крышками, хранили в холодной камере при 5±3°C в течение приблизительно 1 года, а затем определяли наиболее существенные параметры для стабильности, включая визуальный осмотр. Полученные результаты в начале (t=0) и после хранение (t=приблизительно 1 год), вместе со спецификациями Eur.Ph. Показаны в Таблице 22.
| Таблица 22 | |||
| Параметры | Время = 0 | Время = 1 год (Т:2-8˚С) | Спецификации (Евр. Фарм.) |
| рН | 5,23 | 5,18 | 4,0-7,4 |
| Мутность (NTU) | 7,6 | 6,0 | n.e. |
| Электропроводность (мС/см) | 1,48 | 0,64 | n.e. |
| Осмоляльность (мОсм/кг) | 384 | 399 | ≥240 |
| Полимеры (% HPLC) | 0,30 | 0,40 | ≤3,0 |
| Фрагменты (% HPLC) | 0 | 0,32 | ≤5,0 |
| IgG1 (%) | 67,6 | 70,2 | Эквивалентно плазме |
| IgG2 (%) | 25,4 | 26,9 | Эквивалентно плазме |
| IgG3 (%) | 4,2 | 4,0 | Эквивалентно плазме |
| IgG4 (%) | 2,8 | 3,2 | Эквивалентно плазме |
| PKA (UI/мл) | <2 | <2 | ≤25 |
| ACA (СН20/мг) | 0,64 | 0,85 | ≤1 |
| n.e.: не установлены; Евр. Фарм.: Европейская Фармакопея | |||
Что касается внешнего вида, было обнаружено, что он не ухудшался в образцах за счет наличия частиц (волокон, сгустков или осадка) или мутности (прозрачности), или окрашивания (обесцвечивания). Полученный продукт сохранялся по существу неизменным (например, полимеры/фрагменты и протеолитические ферменты, такие как PKA) в течение более, чем приблизительно 1 года при температуре, равной 5±3°C, при этом продукт соответствует значениям, утвержденным в Европейской Фармакопее (Eur.Ph.).
Claims (32)
1. Способ получения композиции IgG из раствора IgG, частично очищенного от человеческой плазмы, где указанный раствор IgG имеет содержание IgG более чем 95% по отношению к сумме белков, способ включает стадии:
a) диафильтрации частично очищенного раствора IgG до достижения концентрации этанола менее чем 0,5% (масса/объем);
b) стабилизации раствора, полученного на стадии а), с использованием сорбитола в качестве стабилизирующего агента при концентрации сорбитола между 30 мас.% и 35 мас.%;
c) тепловой обработки раствора, полученного на стадии b), при температуре между 55ºС и 63ºС, в течение периода времени между 1 и 24 часами;
d) избирательной адсорбции агрегатов и/или полимеров с высокой молекулярной массой из раствора, подвергнутого тепловой обработке на стадии с), посредством катионной хроматографии; и
e) диафильтрации и получения в виде готовой формы раствора, полученного на стадии d).
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют, начиная с раствора IgG, очищенного от человеческой плазмы, имеющего содержание IgG более чем 97% по отношению к сумме белков.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (а) диафильтрации выполняют до тех пор, пока концентрация этанола не будет менее чем 0,1% (масса/объем).
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (а) диафильтрации выполняют до тех пор, пока концентрация неденатурированных осаждающих реагентов, таких как PEG, октановая кислота, совместимые неионные детергенты или любая их смесь, не составит меньше чем 2% (масса/объем) и в любом случае не будет подниматься до более чем 3% полимера после стадии с).
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (а) диафильтрации проводят до тех пор, пока ионная сила первоначального раствор IgG не составит менее чем 1 мС/см.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что значение рН в конце стадии (а) находится в пределах диапазона 4,2-6,0.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (а) диафильтрации выполняют с водой для инъекций или с буферным раствором низкой ионной силы.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что буферный раствор низкой ионной силы представляет собой ≤5 мМ раствор уксусной кислоты или ацетата натрия, имеющий рН между 4,0 и 5,0.
9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (а) диафильтрации проводят в режиме тангенциального потока через мембраны, имеющие отсечение по молекулярной массе между 10 кДа и 100 кДа.
10. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (a) диафильтрации белки концентрируют до концентрации, не превышающей приблизительно 5% (масса/объем), предпочтительно между 2% и 4% (масса/объем).
11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (b) стабилизации рН доводят до между 4,6 и 5,2.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тепловую обработку (стадия с) проводят при температуре, равной 60±1ºС, в течение 10-11 часов.
13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию избирательной адсорбции осуществляют в хроматографической колонке с сильным катионным обменом.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что сильная катионообменная смола включает по меньшей мере одну из катионных сульфоновых групп, таких как сульфониловую, сульфоновую или сульфопропиловую группы, ковалентно связанные с нерастворимой синтетической перфузионной матрицей, содержащей полиметакрилат или полистирол, размер частиц которого варьирует между 20 и 100 мкм.
15. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии избирательной адсорбции инжектируемый поток составляет 5-30 объемов колонки/час.
16. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что хлорид натрия добавляют к раствору, подвергнутому тепловой обработке на стадии с) до итоговой концентрации между 0,2 и 0,5 М (моль/литр).
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что после добавления хлорида натрия рН раствора на стадии с) доводят до между 4,2 и 5,5.
18. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии избирательной адсорбции используют между 1 и 10 литрами смолы на каждый кг IgG (сухой), требующий очистки, что эквивалентно загрузке между 100 и 1000 мг IgG/мл смолы.
19. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии избирательной адсорбции осуществляют элюирование, используя понижающийся солевой градиент.
20. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что способ включает по меньшей мере одну дополнительную стадию обработки для инактивации/удаления вирусов.
21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что дополнительную стадию обработки для инактивации/удаления вирусов проводят до или после стадии тепловой обработки.
22. Способ по п. 18, отличающийся тем, что дополнительную стадию обработки для инактивации/удаления вирусов проводят посредством инкубирования при кислом рН в присутствии или отсутствии пепсина, или посредством обработки неионными детергентами, ионными растворителями или посредством нанофильтрации.
23. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (е) диафильтрации проводят водой для инъекций или буферным раствором низкой ионной силы.
24. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (е) диафильтрации добавляют стабилизаторы для получения итоговой готовой формы.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что рН итоговой готовой формы находится между 4,6 и 5,8.
26. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадию (е) диафильтрации проводят в режиме тангенциального потока через мембраны, имеющие отсечение по молекулярной массе между 10 кДа и 100 кДа.
27. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что на стадии (е) диафильтрации белки концентрируют до значения между 5% и 22% (масса/объем).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201230413 | 2012-03-20 | ||
| ES201230413A ES2381828B1 (es) | 2012-03-20 | 2012-03-20 | PROCEDIMIENTO PARA OBTENER UNA COMPOSICION DE IgG MEDIANTE TRATAMIENTO TERMICO |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013112276A RU2013112276A (ru) | 2014-09-27 |
| RU2636049C2 true RU2636049C2 (ru) | 2017-11-17 |
Family
ID=46053016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013112276A RU2636049C2 (ru) | 2012-03-20 | 2013-03-19 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ IgG ПОСРЕДСТВОМ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9200032B2 (ru) |
| EP (1) | EP2641912B1 (ru) |
| JP (2) | JP6048936B2 (ru) |
| KR (1) | KR101840064B1 (ru) |
| CN (1) | CN103319592B (ru) |
| AR (1) | AR090337A1 (ru) |
| AU (1) | AU2013201853B2 (ru) |
| BR (1) | BR102013006411A2 (ru) |
| CA (1) | CA2809513C (ru) |
| CL (1) | CL2013000688A1 (ru) |
| ES (2) | ES2381828B1 (ru) |
| HK (1) | HK1185625A1 (ru) |
| HU (1) | HUE027915T2 (ru) |
| IL (1) | IL225197A (ru) |
| MX (1) | MX339268B (ru) |
| MY (1) | MY165024A (ru) |
| PL (1) | PL2641912T3 (ru) |
| PT (1) | PT2641912T (ru) |
| RU (1) | RU2636049C2 (ru) |
| SG (1) | SG193738A1 (ru) |
| TW (1) | TWI554283B (ru) |
| UY (1) | UY34679A (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2990033A1 (fr) * | 2014-08-26 | 2016-03-02 | Carlina Technologies | Procédé de préparation de nanoprécipites de peptide ou protéine de faible poids moléculaire |
| PT3135687T (pt) * | 2015-08-31 | 2019-05-21 | Inst Grifols S A | Método para preparação de imunoglobulinas |
| RU2708394C2 (ru) * | 2016-09-26 | 2019-12-06 | Институто Грифольс,С.А. | Способ получения иммуноглобулинов |
| AU2019250882A1 (en) * | 2018-04-12 | 2020-11-05 | Amgen Inc. | Methods for making stable protein compositions |
| CN112557643B (zh) * | 2019-09-26 | 2023-04-14 | 菲鹏生物股份有限公司 | 变性IgG和类风湿因子免疫抗原及制备方法 |
| CN112858671B (zh) * | 2019-11-27 | 2022-12-27 | 菲鹏生物股份有限公司 | 制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999064462A1 (en) * | 1998-06-09 | 1999-12-16 | Statens Serum Institut | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products |
| RU2198668C2 (ru) * | 1997-12-24 | 2003-02-20 | Алфа Терапьютик Корпорейшн | Способ получения раствора гамма-глобулина, предназначенного для внутривенного введения, и продукт, получаемый этим способом |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US514375A (en) | 1894-02-06 | miller | ||
| CA1064396A (en) | 1975-02-18 | 1979-10-16 | Myer L. Coval | Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol |
| US4165370A (en) | 1976-05-21 | 1979-08-21 | Coval M L | Injectable gamma globulin |
| DE3176491D1 (en) | 1980-03-05 | 1987-11-26 | Miles Lab | Pasteurized therapeutically active protein compositions |
| US4396608A (en) | 1981-08-24 | 1983-08-02 | Cutter Laboratories | Intravenously injectable immune serum globulin |
| ES8206184A1 (es) | 1981-10-29 | 1982-08-16 | Green Cross Corp | Un procedimiento para preparar una immunoglobulina adecuada para inyeccion intravenosa |
| US4540573A (en) | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
| JPH0825902B2 (ja) | 1985-02-21 | 1996-03-13 | 株式会社ミドリ十字 | γ−グロブリンの加熱処理方法 |
| JPH0662436B2 (ja) | 1986-05-19 | 1994-08-17 | 株式会社ミドリ十字 | 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 |
| CA1310267C (en) | 1986-07-09 | 1992-11-17 | Yutaka Hirao | Process for heat treating chemically unmodified _-globulin |
| JP2547556B2 (ja) | 1987-02-06 | 1996-10-23 | 株式会社 ミドリ十字 | ｒ−グロブリンの液状製剤 |
| US4876241A (en) * | 1987-05-22 | 1989-10-24 | Armour Pharmaceutical Company | Stabilization of biological and pharmaceutical products during thermal inactivation of viral and bacterial contaminants |
| ES2091161B1 (es) * | 1995-04-12 | 1997-05-16 | Grifols Grupo Sa | Procedimiento para la produccion de gammaglobulina intramuscular inactivada por pasteurizacion. |
| AT403989B (de) * | 1996-09-16 | 1998-07-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines plasmaprotein-hältigen arzneimittels |
| US5886154A (en) | 1997-06-20 | 1999-03-23 | Lebing; Wytold R. | Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies |
| ES2527915T3 (es) * | 1998-06-09 | 2015-02-02 | Csl Behring Ag | Producto de inmunoglobulina G (IgG) líquido |
| CN1137727C (zh) * | 1998-06-25 | 2004-02-11 | 四川远大蜀阳药业有限公司 | 无保护剂双重病毒灭活制备静注免疫球蛋白工艺 |
| ES2184594B1 (es) * | 2001-01-17 | 2004-01-01 | Probitas Pharma Sa | Procedimiento para la produccion de gammaglobulina g humana inactivada de virus. |
| DE602005021485D1 (de) * | 2004-05-07 | 2010-07-08 | Wisconsin Alumni Res Found | Verfahren und zusammensetzungen mit molkeproteinisolaten |
| ES2449148T5 (es) * | 2007-06-01 | 2023-06-14 | Hoffmann La Roche | Purificación de inmunoglobulinas |
| US8796430B2 (en) * | 2010-05-26 | 2014-08-05 | Baxter International Inc. | Method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield |
-
2012
- 2012-03-20 ES ES201230413A patent/ES2381828B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-03-11 HU HUE13158552A patent/HUE027915T2/en unknown
- 2013-03-11 PT PT131585523T patent/PT2641912T/pt unknown
- 2013-03-11 ES ES13158552.3T patent/ES2590045T3/es active Active
- 2013-03-11 EP EP13158552.3A patent/EP2641912B1/en active Active
- 2013-03-11 PL PL13158552.3T patent/PL2641912T3/pl unknown
- 2013-03-13 IL IL225197A patent/IL225197A/en active IP Right Grant
- 2013-03-13 CL CL2013000688A patent/CL2013000688A1/es unknown
- 2013-03-14 CA CA2809513A patent/CA2809513C/en active Active
- 2013-03-14 MX MX2013002910A patent/MX339268B/es active IP Right Grant
- 2013-03-14 AR ARP130100825A patent/AR090337A1/es unknown
- 2013-03-15 US US13/838,424 patent/US9200032B2/en active Active
- 2013-03-15 UY UY0001034679A patent/UY34679A/es not_active Application Discontinuation
- 2013-03-15 TW TW102109161A patent/TWI554283B/zh not_active IP Right Cessation
- 2013-03-18 MY MYPI2013700437A patent/MY165024A/en unknown
- 2013-03-18 BR BRBR102013006411-4A patent/BR102013006411A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-03-19 RU RU2013112276A patent/RU2636049C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-03-19 JP JP2013056191A patent/JP6048936B2/ja active Active
- 2013-03-19 SG SG2013020169A patent/SG193738A1/en unknown
- 2013-03-19 AU AU2013201853A patent/AU2013201853B2/en active Active
- 2013-03-20 CN CN201310090730.0A patent/CN103319592B/zh active Active
- 2013-03-20 KR KR1020130029551A patent/KR101840064B1/ko active IP Right Grant
- 2013-11-21 HK HK13113003.3A patent/HK1185625A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-08-18 JP JP2016160479A patent/JP2016199586A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198668C2 (ru) * | 1997-12-24 | 2003-02-20 | Алфа Терапьютик Корпорейшн | Способ получения раствора гамма-глобулина, предназначенного для внутривенного введения, и продукт, получаемый этим способом |
| WO1999064462A1 (en) * | 1998-06-09 | 1999-12-16 | Statens Serum Institut | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| AGHAIE А. et al. Preparation, purification and virus inactivation of intravenous immunoglobulin from human plasma // Human Antibodies, 19(2010), pp. 1-6. * |
| Биохимия. Под редакцией Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004, 784 с., см. с. 16, 28. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100501263B1 (ko) | 정맥 주사용 면역글로불린의 제조 방법 및 그 외의 면역글로불린 제품 | |
| RU2636049C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ IgG ПОСРЕДСТВОМ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ | |
| CA2941232C (en) | Method for purifying immunoglobulin | |
| SK582002A3 (en) | Process for the production of human gammaglobulin g and virus-inactivated human gammaglobulin g | |
| KR101917196B1 (ko) | 면역글로불린의 정제방법 | |
| KR20070009995A (ko) | 바이러스 안전성 면역글로불린을 제조하는 방법 | |
| JP6132839B2 (ja) | 多価免疫グロブリン濃縮物の製造方法 | |
| KR102372105B1 (ko) | 면역글로블린의 제조방법 | |
| JP6370853B2 (ja) | 免疫グロブリンの調製方法 | |
| KR20220161332A (ko) | C-1 억제제 고갈 혈장으로부터 면역글로불린 조제물을 제조하는 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210320 |