CN103319592B

CN103319592B - 通过热处理获得IgG组合物的方法

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Publication number: CN103319592B
Application number: CN201310090730.0A
Authority: CN
Inventors: 佩雷·里斯托尔德巴尔特; 萨尔瓦多尔·格兰沙加蒙
Original assignee: Grifols SA
Current assignee: Grifols SA
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2033-03-20
Also published as: TW201343179A; CL2013000688A1; MY165024A; MX2013002910A; MX339268B; RU2636049C2; HUE027915T2; CA2809513C; JP6048936B2; HK1185625A1; TWI554283B; IL225197A; US9200032B2; ES2590045T3; CN103319592A; PL2641912T3; US20140113355A1; ES2381828B1; IL225197A0; JP2013194054A

Abstract

本发明涉及用于从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的新方法，其中通过采用中间热处理并且不使用试剂来沉淀高分子量聚集体/聚合物和/或蛋白质，实现了在该方法过程中产生的IgG聚合物的几乎完全消除。此外，与现有技术的方法相比，该方法提供了高生产率、较低的生产成本并且易于实施。除此之外，通过使用该方法赋予了最终产物在液体中的稳定性。

Description

通过热处理获得IgG组合物的方法

技术领域

本发明涉及从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的新方法，其中通过采用中间热处理步骤并且不使用试剂以沉淀高分子量聚集体/聚合物和/或蛋白质，实现了在该方法过程中产生的IgG聚合物的几乎完全消除。除此之外，与现有技术的方法相比，该方法提供了高生产率、较低的生产成本并且更易于实施。通过使用该方法还赋予了最终产物在液体中的稳定性。

背景技术

免疫球蛋白G(IgG)是人血清中最丰富的免疫球蛋白的亚类(8-16 mg/ml)，其构成所有免疫球蛋白的约80％。IgG适用于治疗多种疾病，例如原发性免疫缺陷(特别是先天性丙种球蛋白缺乏症和低丙种球蛋白血症)、特发性血小板减少性紫癜，作为治疗川崎病(Kawasaki’s disease) 和移植骨髓的佐剂，与慢性淋巴细胞白血病相关的低丙种球蛋白血症，作为儿科患者HIV感染治疗的一部分，等等。

目前对免疫球蛋白G(IgG)的要求很高——与广谱人抗体一样是多价的并且具有总体功能性(中和能力、促进调理、平均保存寿命)，具有完整分子(可结晶Fc片段的完整性)和与天然血浆相同或相当的IgG亚类的正常分布，尤其是对于少数亚类(IgG3和IgG4)。

用于治疗性施用IgG的途径可以是静脉内、皮下和肌内，并且除此之外，其还可通过其他较不常规的途径施用，例如口服、吸入或表面 (topical)途径。

虽然如此，无论是用于治疗原发性免疫缺陷还是用于常见变异性免疫缺陷(IgG和IgA亚类不足)(Espanol，T.″Primary immunodeficiencies″. Pharmaceutical Policyand Law 2009；11(4)：277-283)、继发性或获得性免疫缺陷(例如感染病毒(如巨细胞病毒)、带状疱疹、人类免疫缺陷)和自身免疫来源的疾病(例如血小板减少性紫癜、川崎病)(Koski，C. ″Immunoglobulin use in management of inflammatory neuropathy″.Pharmaceutical Policy and Law2009；11(4)：307-315)，静脉内施用都提供了最有用的治疗指征。

理想地，供静脉内使用的IgG(IGIV)应以高浓度配制到液体中，并且优选应该能够在高至约30℃下储存，从而有助于产物保存和直接输注。

已描述了为了减少可能的IgG不耐受反应，有必要应当使免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)以及血型凝集素不存在，或者是以检测不到的量存在。还必不可少的是，产品应基本上不含任何酶活性，这两者都通过纤溶酶或纤溶酶原、或者激肽释放酶原、或其活化物、激肽或激肽原、或凝血因子(如因子XI/因子XIa)等的存在来实现。

另一方面，用于得到多价IgG的人源初始血浆使得必须将通过病毒或病原体传播的感染的风险减至最小。如Fernandes等(ES 500121)和 Hirao，Y.等(EP 196761和EP253313)所述，在抵抗IgG变性的保护剂 (例如，蔗糖、山梨醇、氨基酸)存在下可有效地进行溶液(液体)中 IgG的热处理或巴氏灭菌。为此目的，将溶液升温至约60℃的温度维持至少约10小时，使最危险的病原体灭活或减弱。这些病原体可具有脂质包膜，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)；或者是裸露的，例如骨髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒 (HAV)和细小病毒等(Uemura Y.等.″Inactivation and eliminationof viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulinpreparation″.Vox Sang.1989；56：155-161)。

虽然如此，但是即使在稳定剂存在并且在最佳工艺条件下，巴氏灭菌也必然导致形成不可逆的高分子量蛋白质聚集体，例如IgG聚合物和/或其他伴随蛋白质的聚合物，这或多或少地取决于初始IgG的纯度(Hirao， Y.等，见上和Ristol，P.等.EP 1225180和ES2091161)。

在1960至1970年的十年中，不可逆的高分子量聚集体(称为IgG 聚合物)的存在与静脉内施用IgG期间用于活化所述聚集体的补体的消耗(抗补体活性，ACA)有关，并且该现象与所观察到的严重不耐受性或过敏反应有关(Barandum，S.等.Vox Sang.7：157-174，1962)。因为这个原因，卫生当局将IGIV中聚合物或高于二聚体之分子形式的最大含量限度规定为3％(欧洲药典专论6.3和CMP Core SPC for normal immunoglobulin forintravenous administration：CPMP/BPWG/859/95 rev.2)。这种考虑对于液体制剂尤其重要，因为3％的限度还必须维持到产品的到期日。因此，在巴氏灭菌之后和在获得最终产物中都必须实现这些IgG聚合物的几乎完全不存在，从而确保产品在长期内不变质并且确保最高的可能储存温度。

目前，市场上可得的并且与氨基酸一起配制的大多数液体IgG必须维持酸性pH以避免聚集(Uemura，Y.″Dissociation of aggregated IgG and denaturation ofmonomeric IgG by acid treatment″.Tohoku J.Exp.Med.， 1983；141：337-349)，优选pH4.0至5.0(Tenold，R.等US-4396608)；并且如果它们用0.2M或0.25M甘氨酸(例如已知商标名称为

(Grifols SA，Spain)、

或液体的那些(两种都来自于Baxter，United States))稳定则必须稳定在2至8℃的温度下，或者如果用0.25M脯氨酸(例如

(CSL Behring，Germany))稳定则高至25℃，以使储存期间分子聚集最小(Jolles，S.等″Clinical uses of intravenous immunoglobulin″.Clin.Exp.Immunol.2005 October；142(1)： 1-11；Hooper，J.A.″Intravenousimmunoglobulins：evolution of commercial IVIG preparations″.Immunol AllergyClin.North Am.2008； 28(4)：765-778)。

已证实，经长期暴露于过度酸性pH有助于IgG断裂，例如在4.5或以下的pH和相对高的温度下(例如30℃)(Vermeer，A.等″Thermal stability of immunoglobulin：Unfolding and aggregation of a multi-domain protein″.Biophys.J.2000；78：394-404；Shukla，A.等″Strategies to address aggregation during protein Achromatography″. Bioprocess International，May2005)。因此，例如，有文献报道称，虽然在pH4.8±0.2下与L-脯氨酸一起配制的10％IGIV组合物对于分子聚集足够稳定，但是观察到有随暴露时间而断裂的趋势。因此，在25℃的温度下，36周后平均的片段量为3.9％(Cramer，M.等″Stability over 36 months of a new liquid 10％ polyclonalimmunoglobulin product(IgPro10，

)stabilised with L-proline″，VoxSang.2009.DOI： 10.1111/j.1423-0410.2008.01143.x)。

已描述了IgG与多元醇(例如，与麦芽糖和山梨醇)的制剂防止聚集(Katakam，M.等：Aggregation of proteins and its prevention by carbohydrate excipients：Albumins and globulin.J.Pharm.Pharmacol. 1995；47：103-107)，并且因为这个特性，在5.0至6.0之间的微酸性pH 范围中配制了在高达25℃稳定的IgG溶液(含有10％麦芽糖，商品名

)和在高达30℃稳定的IgG溶液(含有5％山梨醇，商品名

DIF)(Hirao，Y.等，专利EP-278422)。

但是，近年来IgG制剂中一些糖或衍生物的存在受到了质疑(Szenczi， A.等：Theeffect of solvent environment on formation and stability of human polyclonalin solution.Biologicals，2006；34(1)：5-14)，因为一些严重肾衰竭的病例与输注包含蔗糖的IgG制剂有关。含有特定糖(蔗糖) 和一些高浓度多元醇(10％麦芽糖)的一些免疫球蛋白组合物可具有的另一些缺点是当输注溶液时增加血液粘度的相对能力，这与血管内血栓形成和急性心肌梗塞的一些非常严重的病例(其中之前就有疾病或者患者具有风险)有关(Radosevich，M.和Burnouf，T.″Intravenous immunoglobulin G：Trends in productionmethods，quality control and quality assurance. Vox Sang.，2009；1-17；Katz，U.和Shoenfeld，Y.：Review：intravenous immunoglobulin therapy and thromboemboliccomplications.Lupus，2005； 14(10)：802-808)。

还检测到一些商业化IGIV产品包含活性促凝血酶——来自所述产品纯化过程并且具有显著血栓栓塞作用(TEE)的残余物，并且已证明了 TEE与因子XI/XIa和/或其他促凝血因子(例如激肽释放酶等)的存在之间的关联。消除血栓栓塞能力是势在必行的，其对于IGIV灌注必须实现，并且最大程度地保证耐受性和安全性。

与任何具体理论都无关，本发明人认为目前市售的IGIV之间的主要差异可不仅归因于制剂(氨基酸、糖和多元醇，以及pH)，还归因于用于获得IgG的方法，其将影响液体中产物的最终保存条件(温度-时间)，例如以在储存期间防止聚集和断裂等特征。其他作者已观察到了液体IgG 制剂的稳定性与其纯化方法之间的这种依赖关系(Cramer，M.等，同上)。

因此，本发明提供了一种用于获得IgG制剂的方法，其克服了先前提到的现有技术中的问题。本发明的方法开始于包含经常规方法纯化的 IgG的材料，其在稳定剂、蛋白质浓度、电导率、pH和来自先前沉淀步骤的残余试剂浓度的特定条件下又通过热处理(也称为巴氏灭菌)纯化，从而可减少蛋白质和蛋白水解酶杂质。杂质和酶的这种减少在该处理期间和/或在选择性吸附聚集蛋白质之后的步骤期间发生，但是无论如何，这两个步骤都被专门地用作最终纯化而不引入使用沉淀的分离技术。

现有技术包括工业规模使用聚集体/聚合物沉淀与色谱分离的组合，例如如Coval，L.(专利US-4093606和US-4165370)和Uemura，Y.等(专利ES-506679和EP-246579)所述，其描述了使用聚乙二醇(PEG)的沉淀方法--一种造成IgG单体/二聚体高回收率损失的选择性差的方法 (共沉淀)，其根据使用的方法变化很大。例如，如果在未经充分纯化的IgG溶液中进行热处理，则IgG回收率(单体/二聚体)将通常在70％至 80％之间(Uemura，Y.等，同上)。在经纯化的IgG溶液的情况下可获得更好的回收率结果(80％至90％)，但是为此必须使用复杂的分离技术，例如切向流微滤(TFF)，如现有技术中所述(Ristol，P.等，同上)。但是， TFF方法涉及沉淀剂(PEG)、稳定剂(山梨醇)和注射用水的高消耗，并且当有必要再使用设备时必须要考虑多次清洗-消毒操作。此外，它还涉及长的工艺时间，可能难以操作，消耗品和/或能量的附带成本高并且 IgG单体/二聚体回收率总是小于90％。

发明内容

本作者开发了这样的方法，通过其已无需使用试剂来沉淀现有技术中所述的高分子量聚集体/聚合物和/或蛋白质，并且与现有技术的方法相比，出乎意料地实现了所产生聚合物的几乎完全消除，具有高生产率、较低的生产成本并且易于操作。此外，通过使用该方法，实现了液体中最终产物 (优选在氨基酸或多元醇存在下配制)的稳定性，并且其可在2至30℃的温度和4.6或以上并高至5.8的pH下在液体中维持至少1年。

因此，本发明涉及一种从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG 组合物的方法，其包括以下步骤：

a)渗滤所述部分纯化的IgG溶液；

b)稳定步骤a)中得到的溶液；

c)将步骤b)中得到的溶液热处理；

d)通过阳离子色谱从步骤c)中的热处理溶液中选择性吸附高分子量聚集体和/或聚合物；以及

e)渗滤并配制步骤d)中得到的溶液。

通过使用该方法，实现了高分子量聚集体/聚合物含量(即高于IgG 二聚体的那些和其他的不稳定蛋白质)的显著减少，从而产生了基本上包含IgG单体/二聚体的溶液，其可在微酸介质中配制并且可在环境温度下在液体中保存而没有不稳定性的明显信号，这符合供其优选的静脉内或皮下或肌内使用所制定的规范。

优选地，本发明的方法从人血浆的纯化的IgG溶液开始进行，根据欧洲药典所述方法，如通过乙酸纤维素中的电泳、淀粉黑染色和光密度计定量所测定的，所述溶液中IgG相对于总蛋白质的含量大于95％并更优选大于97％。

本专利考虑使用富含IgG的级分(通过本领域已知常规方法分离自人血浆分级以得到白蛋白)作为初始材料，然后对其进行适当纯化以开始本发明的方法。

迄今为止，用乙醇对血浆进行冷分级仍被普遍使用，并且是以工业规模使用，该方法基于Cohn的方法6(Cohn，E.J.等.Separation into Fractions of the Protein andLipoprotein Components.J.Am.Chem.Soc. 1946；68：459-475)以分离出富含IgG的级分。包含大部分(≥90％)IgG 和血浆并且纯度可变(相对于其他蛋白质，IgG通常在35％与65％之间) 的这种级分(Fr-II+III)或等同物(Fr-I+II+III)必须通过乙醇沉淀(称为Cohn-Oncley方法9)(Oncley，J.L.等：The separation of the antibodies， isoagglutinins，prothrombin，plasminogen and beta-1 lipoprotein into subfractions of humanplasma.J.Am.Soc.1949；71：541-550)更彻底地纯化直至得到浓缩的免疫球蛋白级分(Fr-II、或浓缩Fr-III的上清液)。另一种可变的替代方法是使用Kistler-Nistchmann方法(Kistler，P.和 Nitschmann，Hs.Large Scale Production of Human PlasmaFractions.Vox Sang.1962；7：414-424)直至产生沉淀物A(或等同沉淀物A+I)，然后对其纯化以得到GG沉淀，或沉淀物B的浓缩上清液(超滤)。

使用两种乙醇沉淀方法都可(从Fr-III上清液、Fr-I+III、Fr-II、沉淀GG或沉淀物B的上清液中)得到符合IgG≥95％(通过乙酸纤维素上的电泳)并优选IgG≥97％之最小纯度特征的IgG溶液，需要这种溶液使得它可在本发明方法中用作初始材料。这将肌内或皮下途径可接受的IgG 转化为对静脉内途径耐受的制剂。

无论如何，目前还使用其他优选的组合以增加初始材料(例如，Fr-II +III或沉淀物A)的纯度，例如通过多数污染物的沉淀和/或将其吸附到阴离子树脂和/或无机吸附剂(聚乙二醇、辛酸、离子交换色谱、膨润土、珍珠岩)上。文件Ristol，P.等.EP-1225180；Lebing，W.等.EP-0893450； Teschner，W.等：A new liquid，intravenous immunoglobulinproduct(10％ IGIV)highly purified by a state-of-the-art process.Voxsang.2007；92(1)：42-55涉及用于纯化的有效方法，其通过用乙醇、PEG或油酸进行沉淀并结合离子交换色谱，从而使中间IgG级分(例如Fr-II+III)的纯度增加高至IgG≥95％，优选IgG≥97％，然后进行本专利的纯化处理。

进行本发明方法步骤a中的渗滤的目的是将来源于标准IgG纯化方法的不期望组分的浓度降低至可影响本发明方法的浓度值以下。例如，一种不期望的组分是乙醇，并且通过该渗滤步骤(a)，其应减少至浓度小于 0.5％(重量/体积)，优选小于0.1％。如果存在其他非变性沉淀剂，例如 PEG、辛酸、相容性非离子型去污剂或其任意混合物，则在步骤c)之后这些物质的浓度也必须减少至小于2％(重量/体积)并且无论如何都必须减少至它们不产生多于3％的聚合物。

此外，在该渗滤步骤中，可将初始IgG溶液调节至电导率小于1 mS/cm的离子强度，以及将pH调节至4.0至5.5，优选这两种情况兼具。可用注射用水或优选用低离子强度的缓冲溶液(例如，乙酸≤5mM的溶液或用碱或稀酸调节至pH4.0至5.0的乙酸钠溶液)进行渗滤。

渗滤步骤(a)优选地以切向流模式穿过使用截留分子量为10kDa至 100kDa之间的超滤膜(例如，聚醚砜或等同物)进行。在本发明方法中有益的是，渗滤步骤(a)还起到将蛋白质浓缩至浓度不大于5％(重量/体积)，优选2％至4％(重量/体积)的作用。

一旦得到了步骤(a)的溶液，就使其稳定，例如通过添加山梨醇作为稳定剂至最大浓度为50％(重量/体积)，优选按重量计30％与35％。除此之外，以本领域已知方式通过添加酸(例如盐酸或乙酸)或碱(例如氢氧化钠)将pH调节至4.2至6.0，优选pH4.6至5.2。

本发明方法步骤(c)中的热处理或对溶液的加热是一个特殊步骤(也称为巴氏灭菌)，并且在55℃至63℃的温度下进行1至24小时。虽然溶液可以在上述范围内的任何温度下进行热处理并且可进行任何时间，但是热处理优选在60±1℃下进行10至11小时。无论如何所产生的高分子量聚合物/聚集体都应不多于3％，并优选1％至2％。同样地，因为可能存在促凝血因子，例如因子XI/XIa或其他蛋白酶，通过如本领域所述的对不同底物(S-2302、S-2288和S-2238)进行通过发色法(参见实施例3) 而测量的蛋白水解活性与其初始含量相比降低了至少5倍。

然后将溶液冷却(优选18℃至30℃)并稀释，优选用至少33％(按重量计)的注射用水或更优选用包含浓度优选≤20mM的相容性盐(例如，乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠等)的缓冲溶液稀释。稀释后溶液包含浓度按重量计≥5％的山梨醇和浓度≥5mg/ml的蛋白质。将作为固体或在浓缩溶液(例如3M(mol/升))中的完全可离子化的相容性盐(优选氯化钠) 添加到该溶液中直至得到0.20M(mol/升)至0.50M(mol/升)，优选0.25 M(mol/升)至0.40M(mol/升)的氯化钠溶液。如果需要，则可通过优选地添加稀盐酸或乙酸和/或氢氧化钠将pH再次调节至4.2至5.5，优选 4.5至5.0。

将以上述方法处理(即，稀释后调节盐浓度和pH)的包含最大5％二聚体的溶液注射到包含强阳离子交换灌注树脂的色谱柱中，所述树脂具有至少一种与合成的不溶性并且基本不可压缩的灌注基质共价连接的阳离子磺基(磺酰基、磺基或磺丙基：S、HS、SP基)，所述基质包含聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯的刚性颗粒，并且优选包含20至100μm的聚苯乙烯、聚乙烯苯颗粒的基质或载体。可将树脂填充到直径适合于填充的圆柱形轴流柱中，占据优选约5至20cm高的树脂；或者填充到径流柱中，路径10至15cm。在两种情况下，对于每kg必须纯化的(干燥)IgG，使用至少1升，优选1至10升的所述树脂，这相当于每ml凝胶负载100 至1000mg IgG。优选地，填充到所用柱中的树脂的量为2至5升/kg IgG (相当于每ml凝胶负载200至500mg IgG)。在注射产物之前，用缓冲溶液平衡柱子，所述缓冲溶液包含优选约5至50mM(毫摩尔每升)、更优选10mM(毫摩尔/升)的乙酸钠，并且氯化钠浓度(如果它是所选择的添加到产物中的盐)约等于或相当于产物的浓度。优选注射流速不大于 50柱体积/小时，更优选5至30柱体积/小时；优选温度是18℃至30℃。 IgG单体/二聚体自由地通过柱，大于90％的总单体和实用的二聚体在流出液中被回收(吸附＜10％的单体/二聚体)，并且优选实现≥93％的回收率，在达到合适体积的合并物中回收该流出液。

同时，聚集体/聚合物被树脂捕获，量为其初始含量的≥85％，这相当于将来自热处理材料中的初始含量减少多于5倍，优选减少≥95％(≥20 倍)，并且在柱流出合并物中发现≤0.3％并优选≤0.1％或≤0.06％的聚合物 (未吸附)。同样地，通过适当增加柱的负载并采用后清洗(post-washing)，例如用等于或相当于用于平衡柱的溶液的至少两个柱体积的溶液进行，单体/二聚体回收率可甚至最优选地增加至≥95％。因此，可实现≥95％的回收率，将再生级分再注射到相同柱中，适当稀释并调节至用于初始负载或较小离子强度的条件。如已指出的，通过降低梯度的注射也促进IgG单体/二聚体的回收，并且以这种方法或使用类似方法，本领域技术人员可容易地实现产物回收率≥95％。为此，负载的开始是根据pH的最大盐浓度以使所采用的第一体积中超吸附现象最小，随着离子强度减小逐渐增加树脂的容量，直至负载体积完成。例如，可优选使用多至15％的降低梯度(在负载开始时所选择产物的盐浓度与其结束时的盐浓度之间)。

任选地，本发明的方法可包括补充溶液热处理的一种或更多种病毒灭活/消除处理。其中，可用于本发明方法的病毒灭活处理是：在酸性pH下孵育(例如在胃蛋白酶或非离子型去污剂(如Pluronic、Triton、Tween 等)存在或不存在下，在pH3.8至4.2和37±2℃下维持4至24小时)；用磷酸烷基酯有机溶剂(0.3％磷酸三正丁酯或TNBP)处理；去污剂(1％Triton X-100和Triton X-45)(Neurath等，专利US-514375)，优选通过将IgG溶液调节至pH4.2至6.0，温度4至30℃，孵育1至12小时，更优选在25±2℃约6小时；以及通过切向流或末端流(terminal flow)的病毒滞留膜纳滤(再生纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯)，其形式为盒或夹层(平面)、柱体(折叠、片、圆盘)或中空纤维，优选通过孔径≤50nm，对于末端纳滤，孔径为约10至50nm，优选约15至35nm，优选20±2nm。这些灭活/消除步骤可在热处理步骤之前或之后进行，在使用纳滤时除外，其优选应在热处理之前使用。

本发明方法的步骤(d)一旦完成，就将得到的溶液用注射用水或优选低离子强度的缓冲溶液进行渗滤，所述缓冲溶液可例如包含pH4.0至5.5 的≤5mM乙酸和任选的稳定剂或赋形剂用于最终制剂。通过穿过聚醚砜或等同物的超滤膜的切向流进行最终的渗滤，所述膜使用的截留分子量优选在10kDa与100kDa之间，更优选在30kDa与50kDa之间。在适当的渗滤体积使盐浓度降低，优选使电导率≤2mS/cm之后，优选地将蛋白质浓缩为以下标称浓度：5％、10％、16％或20％、或约5％至22％(w/v) 之间的任何其他中间浓度。所述溶液优选通过添加多元醇或氨基酸来稳定。无论如何，所得溶液的摩尔渗透压浓度(osmolality)都将≥240 mOsm/kg，并且近似为等渗的。优选地，将pH调节至5.2±0.6并且进行检查以确保其在4.6与5.8之间，如果需要则用稀酸或碱再调节。

所述经调节的溶液以本领域已知的方法通过0.2μm孔径的完全膜无菌过滤。将得到的液体溶液无菌地计量到适当容器中并在25±5℃进行孵育(检疫)不少于14天，优选使得在每个分开的计量单位中观察不稳定性或污染物的任何信号。在与用于检疫相同的条件(环境温度25±5℃) 下或冷室(5±3℃)中储存所包含的产物。在2至30℃的温度下，通过本发明方法得到的产物在至少1年中仍然稳定(基本上不变)，并且没有显示出表明变质的任何信号：其物理特征(外观、颜色、浊度、沉积物、颗粒或纤维)或例如根据欧洲药典的其质量要求的分析参数(高分子量聚集体、片段、抗补体活性或ACA、前激肽释放酶活化物或PKA、IgG的亚类等)。

参照以下实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例并非旨在限制本发明的技术范围。

具体实施方式

实施例1.

以适用于分级的冷冻人血浆的混合物开始，使其在0至4℃的温度下低温沉淀。将低温沉淀物在相同的低温沉淀温度下通过连续流离心 (Westfalia离心机)分离。根据Cohn分级方法6(Cohn等，同上)使用冷乙醇加工上清液直至得到Fr-II+III。将得到的或沉淀的糊状物 (Fr-II+III)通过压滤分离并在≤20℃冷冻。然后通过Cohn-Oncley分级方法9(Oncley，J.等，同上)加工Fr-II+III直至得到Fr-II。将得到的Fr-II 在≤20℃储存。

将Fr-II悬于甘氨酸和氯化钠的等渗溶液中并调节至约中性pH。将溶液用无机吸附剂处理，离心分离(RINA离心机)，然后在孔深≤0.5μm 的过滤器中使其澄清。

使用0.5M HCl将滤液调节至pH5.5至6.0并通过标称截留分子量为 10kDa的聚砜膜超滤。先减少体积，然后在2至8℃用注射用水开始以恒定体积渗滤。完成这之后，对超滤设备进行后清洗，并且将溶液调节至蛋白质的光密度(280nm)为60±5AU。相对于每kg存在的溶液以0.5kg 的量添加固体山梨醇，并且在溶解之后使用0.5M HCl将溶液的pH调节至5.5±0.5。

然后将溶液在通过夹套再循环加热流体的恒温容器中进行热处理，以这种方式使产物升温至60至61℃并保持在此温度10至11小时。然后将溶液冷却至2至8℃。

针对3个单独批次的平均值得到的结果示于表1中。

表1

以上结果示出了Fr-II+III(通过电泳，FrII悬液≥97％)的较早纯化和减少变性剂(乙醇)对热处理期间聚集的作用，仅有1.58％的聚合物，使得可通过合成阳离子树脂进行后续吸附。

实施例2

以人血浆的合并物开始，方法与实施例1所述的相同，直至得到 Fr-II+III(测试a)并继续得到Fr-II(测试b)。为了确立纯化以及变性剂存在对热处理期间聚合的作用，步骤如下：

a)在2至8℃以按重量计1∶3.5的比例将Fr-II+III悬于注射用水中，在得到均匀悬液之后，用0.5M HCl将pH升高至5.25±0.25。随后在倾析器(离心力在200g至1000g之间)对其进行离心，产生澄清的悬液。

b)如实施例1加工Fr-II直至得到经深度过滤器澄清的溶液。

通过以0.5kg/kg初始上清液的量添加固体山梨醇来稳定以上溶液中的每一种。在山梨醇溶解之后，如果需要则将pH调节至5.5±0.5。每种溶液加热至60至61℃维持10至11小时。然后将其冷却至2至8℃。

与实施例1相比的由测试a)和b)中的巴氏消毒产物得到的结果示于表2中。

表2

测试或方法

总蛋白质(％)

IgG纯度

聚合物

乙醇

电导率

	(O.D.280nm)	(％)	(％)	(％v/v)	(mS/cm)
						测试a)	4	75	15	2.5	2
测试b)	4	≥97	5.03	2.5	≤0.5
						方法实施例1	4	≥97	1.58	≤0.1	≤0.5

测试a)和b)的结果证明了初始IgG纯度的作用和实现值≥97％的要求。另一方面，比较测试b)与实施例1中的方法，很明显看出来源于乙醇分级的残余乙醇的作用和消除乙醇的要求。因此，推断只有实施例1 的条件可被本发明方法接受。

实施例3

以与实施例1相同的方法对血浆进行分级直至得到Fr-II+III，并用 PEG或阴离子交换树脂纯化该材料直至得到足够纯的产物。

将与专利EP 1225180的说明书所述的相同工艺条件用于Fr-II+III的该初始纯化。更详细地，在该实施例中，将Fr-II+III悬于含有山梨醇、磷酸氢二钠和乙酸的水溶液中直至所有的IgG被有效溶解。通过添加多达4％的PEG使主要的伴随蛋白质沉淀出来。在此之后，添加无机吸附剂和过滤协同助剂(coadjuvant)。在通过压滤(纤维素压滤器)分离出沉淀物之前，将pH再调节至5.0±0.5。分离糊状物并收集滤液合并物。在进入柱之前调节pH并梯度过滤澄清直至≤0.5μm，然后注入包含

(AmershamBiosciences，Sweden)型阴离子交换树脂的色谱柱中。收集在负载包含纯化IgG的产物期间得到的所有流出液。

用0.5M HCl将以上流出液调节至pH4.4±0.2并通过标称截留分子量 100kDa的聚砜膜超滤。最初，使体积减少约4倍以产生浓度2％的蛋白质，然后在2-8℃以恒定体积用经0.5M NaOH调节至pH4.2±0.2的含有 4mM乙酸(毫摩尔/升)和5％山梨醇的4体积注射用水渗滤。此步骤完成后，对超滤设备进行后清洗，产生蛋白质光密度(280nm)55±5AU的溶液。随后，添加0.5M HCl直至pH4.0±0.1，然后在37±1℃孵育4小时。

然后以每kg该溶液0.43kg(33％重量/重量)的量添加固体山梨醇，在其溶解之后，用0.5M NaOH将溶液的pH调节至4.9±0.1。

在通过夹套再循环加热流体的恒温容器中进行热处理，使得产物升温至60至61℃，并在此温度下维持10至11小时。然后将溶液冷却至2至8℃。监测该方法的分析组成结果示于表3中。

表3

n.d.：未测定

表3的结果表明，0.8％的残余PEG含量不影响热处理期间的聚合度 (1.5％的聚合物)。同样地，先前所用的纯化方法，无论是单独使用乙醇还是使用乙醇+PEG+阴离子色谱(参见实施例1和2)都不影响该聚合，前体是实现的纯度数量级相同(IgG≥97％)。

同样地，对以与之前该实施例3描述的相同方法加工的制备规模的其他批次进行不同发色底物的分析测定，以评价能够使蛋白水解酶(主要是促凝血剂)失活的步骤。基于现有技术水平描述的技术，使用底物S-2302、 S-2288和S-2238(对凝血酶原复合物的促凝血因子、凝血酶、纤溶酶原/ 纤溶酶、FXI/FXIa、FXII、PKA等具有特异性)，以相对于所用蛋白质浓度(g/ml)的光密度(O.D.)每分钟吸收单位来计算显色反应的动力学梯度。巴氏灭菌之前和之后的步骤中的比例(O.D./分钟)/(g/ml)示于表4 中。

表4

从表4的结果将看出，根据用所用的三种不同发色底物得到的值，与初始含量(超滤溶液)相比，在巴氏灭菌方法的具体条件下蛋白水解活性 (主要是促凝血因子)可减少多于5倍。

实施例4

可使用3种不同的生产批次，其通过与实施例3相同的方法进行加工直至得到每一种的巴氏灭菌溶液。在约20至25℃用10mM(毫摩尔/升) 乙酸钠将每种溶液稀释约4倍，以实现约10AU的光密度(280nm)和按重量计约8％的山梨醇浓度，添加所需量的NaCl以使产物的最终浓度为0.4M(mol/升)。通过添加稀HCl(0.1M至0.5M)将溶液调节至pH 4.5。

将溶液注射到体积约8ml(高10cm×0.8cm²横截面)的强聚苯乙烯阳离子色谱柱(

50μm，Applied Biosystems，United States) 中。用约10柱体积的乙酸钠溶液的10mM缓冲溶液(pH和NaCl浓度等于负载产物的pH和NaCl浓度)平衡柱。将产物以约20柱体积/小时的流速注射，收集开始注射时柱的所有流出液。得到16柱体积的固定体积(相当于约155mg IgG/ml凝胶的负载)的流出液样品，通过O.D.(280 nm)测定蛋白质并且通过HPLC测定聚合物含量，以计算IgG(单体/ 二聚体)的％回收率和实现的聚合物的％减少。表5示出得到的结果。

表5

n.d.：未测定

与之前结果一致，得到了聚合物含量的非常显著且一致的减少(94％至95％)，并且对于1.8％至2.5％的初始聚合物含量，得到了0.09至0.15％的最终含量。另一方面，应注意到，IgG回收率(单体/二聚体)为96％，负载容量超过100mg IgG/ml凝胶并且加工时间小于2小时(平衡和负载)。

实施例5

使用的方法与实施例4相同，但是研究了在实施例4建立的条件下不同注射体积下的负载容量。获得了不同使用体积下的流出液样品，通过 O.D.(280nm)测定蛋白质并通过HPLV测定聚合物含量，以计算不同负载值(mg IgG/ml凝胶)下IgG(单体/二聚体)的％回收率和所实现的聚合物的％减少。结果示于表6中。

表6

结果非常明显地证明，在多至20柱体积/小时的常规流速条件下可实现360mgIgG/ml凝胶的负载值以及最大的IgG回收率，以持续方式维持着能够使聚合物降低至低于0.3％限度直至采用50个柱体积。使用的负载加工时间不超过3小时。

实施例6

为了知道在确定的pH4.5下NaCl浓度的操作范围并且为了通过使 IgG回收率最大优化聚合物的消除，步骤如实施例4，但是研究了0.35至 0.425M的不同NaCl浓度，在2CV、25CV和50CV下对柱流出液取样，以通过O.D.(280nm)测定蛋白质并通过HPLC测定聚合物，从而计算蛋白质的％回收率和聚合物减少。得到的结果示于表7中。

表7

n.d.：未测定

表8示出针对最终采用的最大负载值(50CV)的流出液中IgG回收率和聚合物减少的结果。

表8

在pH4.5下的NaCl浓度(M)	IgG回收率(％)	聚合物的减少
			0.425	95.2	n.d.
0.40	93.0	n.d.
			0.375(n＝2)	94.2-93.2	≥97
0.35	90.8	≥97

n.d.：未测定

以上结果证明，在最佳NaCl浓度条件下，将采用的负载增加多至50 CV(或360mgIgG/ml凝胶)不减弱聚合物的减少。同样地，已确定0.40M 至0.35M的NaCl范围可用于得到最小聚合物含量(≤0.06％至0.31％) 下的最大负载容量，以及90.8％至94.2％的IgG回收率(单体/二聚体)。

在pH4.5，NaCl浓度0.375M，浓度10AU(O.D.(280nm))和注射流速为20CV/h下得到最佳结果。已表明50CV(360mg IgG/ml凝胶) 下残余聚合物≤0.06％(重复测试)，并且IgG回收率为93.2％-94.2％。该方法时间不超过3小时。

实施例7

为了知道可使用0.35M的稳定NaCl浓度的pH范围，并且为了通过使IgG回收率最小优化聚合物的消除，使用了如实施例4的步骤，研究 4.5至5.0的pH范围，并且在2CV、21-25CV和50CV结束时获得柱流出液样品，以通过O.D.(280nm)测定蛋白质并通过HPLC测定聚合物，并且计算蛋白质的％回收率和聚合物减少。结果示于表9中。

表9

n.d.：未测定

表10示出在最终采用的最大负载值(50CV)下计算流出液中的IgG 回收率和聚合物减少的结果，以及在半数最大负载(约25CV)下流出液中的聚合物减少。

表10

(＊)在21CV下在流出液中测定；n.d.：未测定。

以上结果证明对于最小IgG损失下的有效聚合物减少而言，pH与 NaCl之间的强依赖关系。在0.35M NaCl的浓度下，发现测试范围内的最适当pH约为4.76至4.50，使得残余聚合物为≤0.06％-0.24％(采用21 至50CV)，并且IgG回收率为90.8％至94.3％。加工时间为2至4小时。

实施例8

步骤与实施例6相同，但是建立了4.85至4.88的pH以研究在0.1M 与0.4M之间的最佳NaCl浓度条件。结果示于表11中。

表11

n.d.：未测定

表12示出在最终采用的最大负载值(50CV)下计算流出液中的IgG 回收率和聚合物减少的结果。

表12

n.d.：未测定

以上结果说明，对于最大负载容量(50CV或360mg IgG/ml凝胶)，在0.325M至0.275M NaCl的范围内，在pH4.85至4.88下该方法是可可行的，并且具有最小残余聚合物含量(≤0.06％-0.17％)和92.5％至 94.9％的IgG回收率(单体/二聚体)。用0.3M的NaCl浓度得到了最佳结果，通过其实现了93.7％的回收率和0.13％的最大残余聚合物。在0.1M 的较低NaCl浓度下，聚合物完全减少，但是IgG回收率小于90％。

比较该实施例8的结果和实施例6的结果，pH与NaCl之间的强依赖关系非常明显，并且必须将这些参数调节至适当范围内以实现最优的聚合物减少和IgG回收率值。以上实施例证明，在pH4.5至pH4.9下并且在0.275M至0.4M的NaCl浓度下得到了关于残余聚合物≤0.3％、聚合物减少≥85％和IgG回收率(单体/二聚体)≥90％的期望结果。

实施例9

该测试的目的是评价使用常规色谱方法时

树脂 (AppliedBiosystems，United States)的负载容量，其意味着吸附所有IgG 用于后续洗脱，然后将得到的结果与本发明之前的实施方案进行比较。在不同注射流速下，在用于将IgG完全吸附至树脂饱和的条件下进行常规色谱方法。

由以与实施例3相同的方法加工直至得到巴氏灭菌溶液的生产批次开始，在约20至25℃用约4倍的10mM(毫摩尔/升)乙酸钠溶液稀释溶液，以提供约10AU的光密度(280nm)和约8％(w/w)的山梨醇。通过添加稀HCl(0.1M至0.5M)将溶液调节至pH4.5。

注射到约4ml体积(高4cm，横截面1cm²)的强聚苯乙烯合成树脂阳离子色谱柱(50μm，Applied Biosystems，United States) 中。用约10倍柱体积的pH4.5的10mM乙酸钠缓冲溶液平衡柱。以5 至20柱体积/小时的不同负载流速注射产物。从初始注射到不同柱体积，获得柱流出液的样品，通过O.D.(280nm)测定蛋白质，以计算注射溶液中蛋白质值约为5％的动力流条件下的最大负载容量。得到的结果示于表13中。

表13

注射流速(CV/小时)	负载容量(mg IgG/ml凝胶)
		5	63
10	58
		20	55

从结果推断出，在常规色谱方法中，在最佳流速动力条件下，用于 IgG完全吸附的树脂的最大容量发现为约60mg IgG/ml树脂，并且在5 至20CV/小时的注射流速中基本保持不变。鉴于该结果远远(低约6倍) 低于采用本发明方法条件的实施例6和8中获得的＞360mg IgG/ml凝胶，证明本发明方法的生产率远远优于现有技术中描述的常规色谱的生产率。

实施例10

在该实施例中，设计该测试以确定在完全吸附IgG(常规色谱)的全色谱循环条件(负载、清洗和洗脱)下的色谱分辨率(聚合物分离)和 IgG回收率，并且将所得结果与之前的本发明方法实施例进行比较。

步骤与实施例9相同，但是将初始量等于其最大容量的80％(约50mg IgG/ml凝胶)的IgG溶液以约5CV/h的流速注射到柱中。在所有的产物被负载之后，用等于初始平衡溶液的约8CV缓冲溶液进行后清洗，所述初始平衡溶液包含pH4.5的10nM乙酸钠。随后采用pH4.5的包含0.5M 甘氨酸的0至1M(mol/升)的NaCl浓度梯度(总共约25CV)来洗脱 IgG。在级分中收集洗脱的IgG用于后续的蛋白质分析(O.D.280nm) 并分析分子分布(HPLC)。结果示于表14中。

表14

n.d.：未测定

根据以上结果，证明了对于50mg IgG/ml凝胶的负载，得到了64％的IgG(单体/二聚体)最大回收率，聚合物含量≤0.06％，发现在拖尾级分和第2个洗脱峰中与不可回收之聚合物混合的大部分IgG。该回收率的值比不上采用本发明方法的之前实施例(其中证明了聚合物的满意消除和超过90％IgG的回收率)。

实施例11

设计另一个测试以研究可使用的pH限度和离子强度(NaCl)并且知道负载中IgG浓度的作用。

用来源于不同生产批次的以与实施例3相同的方法加工的巴氏灭菌 IgG进行了多个测试。但是，在测试之一中使用10mM乙酸钠溶液的约 4倍稀释液(至O.D.280nm＝10AU)，其余的使用约1.5至2倍稀释液 (至O.D.280nm＝20-23AU)，并且向这些中每一种中添加所需的NaCl 以实现0.275M至0.45M的期望最终浓度，分别调节至最终pH为4.2至 5.5。使用稀乙酸进行这些pH调节。以如实施例4所述的独立循环将经调节的溶液注射到

HS50柱(Applied Biosystems，United States) 中，但是在该情况下，在进行的测试中使用约150至750mg IgG/ml凝胶。

对于不同负载值，通过HPLC测定聚合物和二聚体含量(％)并且测定IgG回收率(％)。得到的结果示于表15中。

表15

N.D.：未检测

n.d.：未测定

基于初始聚合物含量等于和小于3％的不同巴氏灭菌批次，证明了对于在该实施例中采用的限度(pH4.2-5.5和NaCl0.20-0.45M)内的任何调节值来说，可选择性吸附聚合物直至≤0.06％-0.12％，相当于减少93％至≥98％，并且IgG回收率超过80％(在pH4.2至5.0实现了91.0％至 99.5％)。同样地，应指出柱的负载容量和效率不因为产物溶液中蛋白质浓度增加至23AU(280nm O.D.值)(相当于14.7至16.5mg IgG/ml) 而减少，并且实现了580至590mg IgG/ml凝胶的负载。但是在pH范围的上端(pH5.5)，盐溶液必须大大减少(从0.45M减少至0.2M)以实现聚合物的显著减少。同样，观察到较低pH值下负载容量较小，因为当使用403mg IgG/ml凝胶时，测量到较大的聚合物含量，此时的减少仅为 86％。该作用可归因于与pH4.2相比，在pH5.5下存在较大量的二聚体分子，其比例随pH增加。

实施例12

从之前的实施例6、8和11中，确定了

聚苯乙烯灌注树脂的经验公式(1)，由此可更精确地确立必需的NaCl浓度以得到对于最终聚合物和作为所用pH之函数的回收率的期望结果。表达式：(1) [NaCl]＝0.24+(5.2-pH)/5＝1.28＝0.2×pH提供了对于所研究树脂确立的pH范围(pH4.2至5.5)内大约的期望值。基于实施例中的数据，对于优选≤0.1％的最终聚合物和不小于90％的回收率，不同pH下需要的 NaCl浓度(观察值和根据公式计算的值)示于表16中。

表16

表16的结果表明了观测值与根据公式的计算值之间的良好线性相关，包括在极端pH值下。

实施例13

以与实施例1相同的方法加工血浆以通过乙醇分级(根据 Cohn-Oncley方法)得到纯化的多价IgG溶液(纯度≥97％IgG)。得到的 Fr-II通过10kDa膜渗滤至60AU，然后在33％d-山梨醇(重量/重量) 存在下和pH5.5±0.5下进行巴氏灭菌(60至61℃下10至11小时)，用pH4.85的10mM乙酸钠溶液将巴氏灭菌溶液稀释约4倍使得280nm O.D.从42.8AU变为10.7AU，并添加NaCl直至得到最终浓度为0.275摩尔/升的溶液，使用0.1M HCl将pH调节至4.85。通过HPLC测定的聚合物比例为0.88％。然后以约20CV/小时的流速立即注射到含有聚苯乙烯阳离子交换树脂(50μm

)并且体积为8.0ml(横截面0.8 cm²×高10cm)的柱中。在所采用的不同负载体积(CV)下得到柱流出液样品，并且对于最终的合并物，通过HPLC测定分子量分布(高分子量聚合物)和所获得的减少值。发现的值示于表17中。

表17

所得结果表明，在最佳吸附工艺条件下，在高注射负载(385mg IgG/ml树脂)下，可保留先前通过乙醇分级纯化的IgG巴氏灭菌中形成的所有聚合物(多至≤0.06％)。

实施例14

设计该测试以确定当将不同纯化步骤合并成单一步骤时方法的可行性。决定确定聚合物吸附是否可与用溶剂-去污剂的前处理和随后吸附这些试剂的任选步骤相组合。

为此，Fr-II+III是初始材料并且以与实施例3相同的方法加工以得到大批量巴氏灭菌溶液。将该溶液稀释至280nm O.D.为28±1AU(约2％的蛋白质)，并且添加包含磷酸三正丁酯和Triton X-100的溶剂-去污剂溶液的浓缩溶液(×10倍)，以实现最终浓度分别为0.3±0.1％和1.0±0.3％。将该溶液升温至25±2℃并均质化约30分钟。然后将其转移到另一个合适的容器中以在25±2℃孵育约6小时。处理之后，用100mM乙酸钠和2.75 M NaCl溶液将溶液稀释约10％，使得最终浓度为所添加物质的1/10部分并且蛋白质浓度为16.5mg/ml。如果需要则用0.1M HCl将溶液的pH 调节至4.85±0.05，得到167ml的体积。

在此之前，处理体积17.5ml并且高10cm之疏水树脂(C8烃)和含有硅醇基之基质的柱(Pall的

United States)和体积8.0 ml的另一种

阳离子树脂柱(50μm，Applied Biosystems， United States)。将这两根柱串联，通过这种方式使得第一柱

给第二柱

供料，并且通过流入pH4.85±0.05的包含10mM乙酸钠和0.275M NaCl的平衡溶液对这些柱进行处理，流速对于所述第一柱和第二柱分别等于6CV/h和13CV/h。

将先前制备的IgG溶液(167ml)注射到所述第一柱中并使来自所述第一柱的流出液流入所述第二

柱中。对于每个柱计算的负载值是：1)对于柱，167ml/17.5ml＝9.5CV； 2)对于

柱，167ml/8.0ml＝21CV。整个过程中的注射流速对于第一柱和第二柱分别为6和13CV/h。在负载结束时，用约2CV的平衡溶液进行后清洗，将来自柱的所有流出液收集成合并物。

对于每个步骤的分子量分布(HPLC)和蛋白质(通过280nm O.D.) 的结果归纳于表18中。

表18

步骤	聚合物(％)	蛋白质(％)	回收率(％)
				巴氏灭菌	2.22	2.75	100
SD处理	3.67	1.80	100
				调节	3.67	1.65	100
SDR+POROS流出液	≤0.06	1.58	95.7

以上结果表明，聚合物吸附方法可被完美地合并并且与该方法的其他步骤同时进行，因此，减少了总时间以及前处理和后续清洗中的试剂消耗。

实施例15

测试了不同可商购阳离子树脂的聚合物保留容量以实现关于IgG单体/二聚体的最佳可能分离。为此比较了不同来源的树脂基质，特别是丙烯酸

与琼脂糖

将树脂填充到这样的柱中：横截面为1.75cm²，填充高度为100mm(来自GE-Healthcare的

)，各自的树脂为GigaCap

和

初始材料是如实施例3处理的巴氏灭菌IgG溶液的不同批次的混合物，向其中添加NaCl直至0.275M至0.20M，如果需要则用0.1M HCl 将pH调节至4.85±0.05。溶液的蛋白质浓度为约22AU并将多至50CV 的作为待测试IgG溶液以约15CV/h的流速注射到柱中，所述柱已用相同的NaCl和pH浓度进行了制备和处理。

与初始结果相比的用不同柱体积得到的聚合物回收率结果示于表19 中。

表19

对于SP-Sepharose XL树脂，总蛋白质回收率为98％至100％，对于 GigaCap-S650M为90％至100％(在10CV和0.2M NaCl下为约98％)。

以上结果表明，丙烯酸阳离子树脂(

650M型)与

(阳离子聚苯乙烯)一样，能够选择性保留通过IgG巴氏灭菌形成的聚合物，并且对于158mg/ml凝胶的蛋白质负载而言能将存在的聚合物减少至85％(15％回收率)并且总蛋白质回收率为98％。显然，可根据pH(减小它)优化得到的结果，改善负载容量以实现例如约25CV(396mg蛋白质/ml凝胶)。

已发现，来自琼脂糖型(Sepharose XL)非合成基质的树脂不具有足够的分辨力以在用于在负载流出液中选择性吸附聚合物的明确条件下将聚合物与IgG单体/二聚体分离开。

同样，将看到最适当的pH和NaCl浓度条件对于所用的合成灌注树脂类型是特定的。因此，在pH4.85下，对于

650型丙烯酸树脂，需要不多于0.2M的NaCl，而对于

50μm树脂，将需要0.3M的NaCl。

很明显，本领域技术人员可发现对于每种类型的合成灌注树脂的pH 与NaCl之间的最适关系。

实施例16

然后通过检查产物的组成特征，检查了直至所配制的最终产物并与 10％蛋白质浓缩为IGIV的步骤中该方法的可扩展性。

用乙醇分级多于1000升的血浆合并物以得到Fr-II+III并继续纯化直至得到巴氏灭菌大量溶液，如实施例3所述。

在用注射用水稀释至光密度为27.98AU(280nm)并且电导率为 0.26mS/cm之后，获得6.34kg上述巴氏灭菌溶液(相当于26.2升的初始血浆)，检查其pH为4.65。经约5至10分钟添加3％磷酸三正丁酯和10％ Triton X-100的约0.70kg浓缩溶液(×10倍)并强力搅拌。通过添加0.1 M NaOH将pH调节至4.79。得到7.04kg溶液并在环境温度(18至25℃) 下孵育长达6小时。通过气相色谱测定磷酸三正丁酯含量为0.28％(2800 ppm)。

随后，添加pH4.85的包含10mM乙酸钠的1.5M NaCl溶液以使最终NaCl浓度达到0.275M。所得pH为4.81。随后得到6930.9g溶液并注射到直径140mm的包含770ml

树脂(来自Pall)的柱中，所述树脂高度为50mm。在环境温度下并且以6.1CV/小时的当量流速进行注射，使得所有的溶液在小于2小时内负载。所得总负载比例为9 CV(6.93kg/0.770L＝9.0CV)。随后，使用3CV的pH4.85的0.275M NaCl和10mM乙酸钠溶液进行后清洗。得到在注射产物溶液期间回收的 6.93kg柱流出液，pH为4.82并且电导率为16.75mS/cm。通过气相色谱分析测定磷酸三正丁酯含量为≤5ppm。

获得5.772kg上述流出液并注射到222ml

树脂(50μm) 柱中，所述柱直径为50mm并且床高度为113mm。在环境温度下以约 10CV/小时的流速将样品注射到柱中使得该过程持续约2.5小时。收集在负载期间得到的所有柱流出液，并且用1CV的pH4.85的0.275M NaCl、 10mM乙酸钠和17％山梨醇溶液(重量/重量)后清洗。得到在注射产物溶液期间从柱中回收的5.776kg流出液合并物，光密度是18.508AU(280 nm)，pH是4.84并且电导率是16.95mS/cm。

通过0.1μm过滤使以上流出液合并物澄清，然后用35nm(

35N)+20nm(

20N)的孔梯度逐级渗滤。当完成产物的纳滤之后，对其进行后清洗，体积等于用于

柱的相同后清洗溶液之回收体积的5％，总加工时间为约18小时。得到的纳滤物的量为6.797 kg，pH为4.83，浊度为2.71NTU并且电导率为17.1nS/cm。

通过标称截留分子量100kDa的聚醚砜膜对纳滤溶液进行超滤。产物首先被浓缩3.3倍，光密度由14.4AU(280nm)变为约50±10AU(280nm)，然后用约7体积的渗析溶液以恒定体积将其渗滤，所述渗析溶液包含2 mM乙酸并且用NaOH调节至pH4.2±0.2。检查电导率(220μs/cm)之后，添加足够量的浓缩33％山梨醇溶液以使最终山梨醇浓度为约5％(重量/体积)。最后，使其浓缩约3.5倍以实现140±5AU(280nm)的光密度，相当于约10％的蛋白质，然后用0.1M NaOH将pH调节至5.25±0.25。得到552.1g溶液，其最终pH为5.26，浊度为5.45NTU并且电导率为 1.18ms/cm。将该溶液通过0.22μm过滤并分装到瓶中，其pH为5.34，摩尔渗透压浓度为330mOsm/kg，浊度为4.62NTU并且电导率为1.34 mS/cm。该步骤的加工时间为9.5小时。

在5±3℃和25±2℃将计量瓶维持多于15天，没有显示任何胶凝化、或浊度或沉积、颜色变化或出现可见纤维或颗粒的信号。

表20示出在整个获取方法的不同步骤中，聚合物、二聚体、单体和级分的结果。

表20

由以上结果明显看出，在PORPS柱之前(在巴氏灭菌和SDR流出液中)的产物中，如前述实施例所述的通过调节pH和盐浓度实现的控制二聚体含量(≤5％)使得可极好地吸附存在的聚合物(≤0.06％)，使二聚体IgG损失最小(在SDR流出液中为2.6％，在POROS流出液中为1.9％)。

可得出结论，通过将用SD处理及其分离来消除聚集体/聚合物的步骤与纳滤、渗滤和最终配制相组合用于获得IGIV的总体方法是完全可行且可扩展的，获得了最终产物在聚合物含量(≤0.06％)和级分(0.1％)方面的优异值。

实施例17

将实施例16中得到的产物(10％IGIV)以10ml/瓶计量到20ml玻璃瓶中，用20mm

丁基胶塞密封，在环境温度(25±5℃)下避光储存 12个月。

在所确立的约1年的时间后，视觉上观察它们(物理外观)并且通过分析确定参数，最代表性的为稳定性。在储存开始时(t＝0)和结束时(t＝1 年)得到的值示于表21中。同样地，还包括了使用现有技术(专利 ES-200100101)以工业规模得到的通常值。

表21

n.e.：未建立；Eur.Ph.：欧洲药典

就涉及的可视外观而言，根据颗粒(纤维、凝块或沉淀物)的存在或浊度(透明)或着色(无色)，发现样品没有变质。得出结论：在25±5℃的环境温度下将得到的样品储存1年基本不变(聚合物，酶如PKA、ACA 等)，产物符合欧洲药典(Eur.Ph.)中规定的值。

实施例18

以相当于实施例16的制备规模大小加工一批，仅有的一个改变是病毒灭活步骤的顺序，使得在最初渗滤的材料上进行SD处理，然后用

树脂吸附这些试剂，然后进行需要的剩余的加工步骤以得到本发明的产物，即以与实施例16相同的方法进行山梨醇存在下的巴氏灭菌和使用POROS HS灌注树脂捕获分子聚集体。最后，将所得产物用 5％山梨醇稳定，产生蛋白质浓度10％的IGIV，过滤除菌并计量到20ml 玻璃瓶中。将用丁基胶塞密封的瓶子在5±3℃的冷却室中储存约1年，然后确定对于稳定性最重要的参数，包括目测。在开始时(t＝0)和储存后 (t＝约1年)得到的结果以及欧洲药典规范示于表22中。

表22

n.e.：未建立；Eur.Ph.：欧洲药典

就涉及的可视物理外观而言，通过颗粒(纤维、凝块或沉积物)的存在或浊度(透明)或着色(无色)，发现样品没有变质。将所得样品在5±3 ℃的环境温度下储存多于约1年仍基本不变(例如聚合物/片段和蛋白水解酶如PKA)，产物符合欧洲药典(Eur.Ph.)中规定的值。

Claims

1.一种用于从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的方法，所述IgG溶液的IgG含量大于总蛋白质的95％，所述方法包括以下步骤：

a)渗滤所述部分纯化的IgG溶液；

b)稳定步骤a)中得到的溶液；

c)将步骤b)中得到的溶液热处理，其特征在于，所述热处理在55℃至63℃的温度下进行，时间为1至24小时；

d)将氯化钠添加到步骤c)中经热处理的溶液中直至最终浓度为0.2至0.5M；

e)在所述氯化钠添加之后，将所述溶液的pH调节至4.2至5.5；

f)通过阳离子色谱从步骤e)中经热处理的溶液中选择性吸附高分子量聚集体和/或聚合物，所述阳离子色谱使用孔径为20至100μm的不溶性合成灌注基质；以及

g)渗滤并配制步骤f)中得到的溶液。

2.权利要求1的方法，其特征在于，以IgG含量大于总蛋白质的97％的自人血浆中纯化的IgG溶液开始进行所述方法。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于，进行所述渗滤步骤(a)直至乙醇浓度小于0.1％重量/体积。

4.权利要求1或2的方法，其特征在于，进行所述渗滤步骤(a)直至非变性沉淀剂的浓度小于2％重量/体积，并且无论如何在步骤e)后都不产生多于3％的聚合物。

5.权利要求4的方法，其中所述非变性沉淀剂选自PEG、辛酸、相容性非离子型去污剂或其任意混合物。

6.权利要求1或2的方法，其特征在于，进行所述渗滤步骤(a)直至所述初始IgG溶液的离子强度小于1mS/cm。

7.权利要求1或2的方法，其特征在于，步骤(a)结束时的pH值在4.2至6.0的范围内。

8.权利要求1或2的方法，其特征在于，用注射用水或低离子强度的缓冲溶液进行所述渗滤步骤(a)。

9.权利要求8的方法，其特征在于，所述低离子强度的缓冲溶液是乙酸或乙酸钠的≤5mM溶液，所述溶液pH为4.0至5.0。

10.权利要求1或2的方法，其特征在于，以切向流模式通过截留分子量为10kDa至100kDa的膜进行所述渗滤步骤(a)。

11.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述渗滤步骤(a)中，所述蛋白质被浓缩至浓度不超过约5％重量/体积。

12.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述渗滤步骤(a)中，所述蛋白质被浓缩至2％至4％重量/体积的浓度。

13.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述稳定步骤(b)中使用山梨醇作为稳定剂。

14.权利要求13的方法，其特征在于，用于所述稳定步骤(b)的山梨醇的浓度小于50％重量/重量。

15.权利要求13的方法，其特征在于，用于所述稳定步骤(b)的山梨醇的浓度在30％与35％重量/重量之间。

16.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述稳定步骤(b)中将pH调节至4.6至5.2。

17.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述热处理在60±1℃的温度下进行10至11小时。

18.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述选择性吸附步骤在强阳离子交换色谱柱中进行。

19.权利要求18的方法，其特征在于，所述强阳离子交换树脂包含与不溶性合成灌注基质共价键合的至少一种阳离子磺基，所述基质为聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯，其孔径为20至100μm。

20.权利要求19的方法，其中所述阳离子磺基选自磺酰基、磺酸基或磺丙基。

21.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述选择性吸附步骤中，注射流速为5至30柱体积/小时。

22.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述选择性吸附步骤中，对于每kg需要纯化的干燥IgG使用1至10升树脂，其相当于每ml树脂负载100至1000mg IgG。

23.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述选择性吸附步骤中，使用递减的盐梯度进行洗脱。

24.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述方法包括至少一个另外的病毒灭活/消除处理步骤。

25.权利要求24的方法，其特征在于，所述另外的病毒灭活/消除处理步骤在所述热处理步骤之前或之后进行。

26.权利要求24的方法，其特征在于，所述另外的病毒灭活/消除处理步骤通过以下进行：在胃蛋白酶存在或不存在下在酸性pH下孵育，或者用非离子型去污剂、离子型溶剂处理，或者通过纳滤。

27.权利要求1或2的方法，其特征在于，用注射用水或低离子强度的缓冲溶液进行所述渗滤步骤(g)。

28.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述渗滤步骤(g)中添加用于最终制剂的稳定剂。

29.权利要求28的方法，其特征在于，所述最终制剂的pH为4.6至5.8。

30.权利要求1或2的方法，其特征在于，以切向流模式通过截留分子量为10kDa至100kDa的膜进行所述渗滤步骤(g)。

31.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述渗滤步骤(g)中，所述蛋白质被浓缩至5％至22％w/v的值。