BR102016022107A2 - Processo de preparação de imunoglobulinas - Google Patents

Abstract

processo de preparação de inunoglobulinas. a presente invenção refere-se a um processo de preparação de uma solução de imunoglobulinas a partir de uma solução inicial de imunoglobulinas com uma pureza maior ou igual a 96% na presença de um poliéter ou polímero de glicol, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) adicionar ácido caprílico ou sais do mesmo à solução inicial; b) ajustar o ph da solução obtida na etapa a); c) incubar a solução obtida na etapa b) durante um tempo e temperatura necessários para a inativação de vírus com envoltório; d) realizar uma etapa de ultrafiltração/diafiltração da solução obtida na etapa c).

Description

(54) Título: PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS (51) Int. Cl.: A61K 39/395; C07K 1/34; C07K 16/00; C07K 16/06; C12N 7/06 (52) CPC: A61K 39/395,C07K 1/34,C07K 16/00, C07K 16/06,C07K 16/065,C12N 7/06 (73) Titular(es): INSTITUTO GRIFOLS, S.A.

(72) Inventor(es): PERE RISTOL DEBART; SALVADOR GRANCHA GAMON; JUAN IGNACIO JORQUERA NIETO; MARIA MERCEDES FARO TOMAS; NURIA JORBA GRIFOLS (74) Procurador(es): DANNEMANN, SIEMSEN, BIGLER & IPANEMA MOREIRA (57) Resumo: PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE INUNOGLOBULINAS. A presente invenção refere-se a um processo de preparação de uma solução de imunoglobulinas a partir de uma solução inicial de imunoglobulinas com uma pureza maior ou igual a 96% na presença de um poliéter ou polímero de glicol, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) adicionar ácido caprílico ou sais do mesmo à solução inicial; b) ajustar o pH da solução obtida na etapa a); c) incubar a solução obtida na etapa b) durante um tempo e temperatura necessários para a inativação de vírus com envoltório; d) realizar uma etapa de ultrafiltração/diafiltração da solução obtida na etapa c).

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS.

[001] A presente invenção refere-se a um novo processo de preparação de imunoglobulinas. A composição de imunoglobulinas obtidas é adequada, por exemplo, para administração parenteral.

[002] As imunoglobulinas são glicoproteínas que podem ser encontradas de forma solúvel no sangue ou outros fluidos corporais dos vertebrados, e são empregadas pelo sistema imunológico para identificar e neutralizar elementos estranhos tais como bactérias, vírus ou parasitas. As imunoglobulinas têm diversas aplicações médicas tais como no diagnóstico de doenças, tratamentos terapêuticos e terapia pré-natal. As aplicações terapêuticas mais comuns das imunoglobulinas podem ser classificadas em três grupos gerais de patologias: imunodeficiências primárias (déficit da resposta humoral), imunodeficiências secundárias ou adquiridas (como, por exemplo, no caso de prevenção e tratamento de infecções por vírus) e aquelas de origem autoimune (desenvolvimento de anticorpos).

[003] A administração de imunoglobulinas pode ser feita por diferentes vias tais como por via intramuscular, via intravenosa e via subcutânea, entre outras. Dentre elas, é preferível utilizar a via intravenosa, já que apresenta numerosas vantagens, principalmente uma maior eficácia terapêutica.

[004] Geralmente, as imunoglobulinas são purificadas a partir de plasma humano utilizando processos baseados no método de fracionamento de Cohn (Cohn EJ. e outros, J Am Chem Soc, 1946, 62, 459475), no método de Cohn-Oncley (Oncley JL. e outros, J Am Chem Soc, 1949, 71, 541-550) ou outros equivalentes com etanol a frio, por exemplo, o método de Kistler-Nitschmann (Kistler P, Nitschmann H, 1962, 7, 414-424). Assim, a partir de frações ricas em imunoglobulinas (tais como a Fração II+III, ou a Fração II, ou o precipitado A, ou o prePetição 870170006090, de 27/01/2017, pág. 4/8

2/45 cipitado de gamaglobulina GG) obtidas por qualquer dos anteriores métodos, foram introduzidas modificações para purificar mais exaustivamente as imunoglobulinas (IgG) e torná-las toleráveis para sua administração, preferivelmente, intravenosa. As referidas modificações foram introduzidas, por exemplo, para eliminar os agregados e outras impurezas, assim como para garantir a segurança do produto. No entanto, a adição de múltiplas etapas ao processo de preparação de imunoglobulinas diminui o rendimento do referido processo e aumenta os custos de fabricação. A crescente demanda de produtos de imunoglobulinas, principalmente para administração por via intravenosa, faz com que o rendimento seja um aspecto crítico no processo de obtenção das mesmas em escala industrial.

[005] Dos métodos descritos na técnica anterior, os processos para obter composições de imunoglobulinas que são toleráveis por via intravenosa vale destacar aqueles que utilizam as etapas de: precipitação com polietileno glicol (PEG), cromatografia de troca iônica, métodos físico-químicos com capacidade para inativação viral, ou tratamento com enzimas e modificação química parcial das moléculas de imunoglobulinas.

[006] Assim sendo, é necessário garantir a segurança do produto mediante a implementação de etapas robustas com capacidade de eliminar agentes biológicos patogênicos. Geralmente, é utilizado o método do solvente-detergente com capacidade para inativar vírus com envoltório lipídico, já que não reduz de forma severa a atividade biológica das proteínas. No entanto, dada a toxicidade das misturas de solvente-detergente, este reagente utilizado têm que ser extensivamente eliminado antes da obtenção do produto final, o que aumenta o tempo do processo e diminui o rendimento. Os processos descritos para a eliminação do referido solvente-detergente não são simples e geralmente requerem a utilização de técnicas de adsorção cromatográfica,

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3/45 seja diretamente por interação hidrofóbica, ou mediante captura indireta da imunoglobulina em resinas de troca iônica e separação do solvente-detergente não retido. Em todos os casos, os processos são caros e trabalhosos, implicando perdas significativas de proteína.

[007] No entanto, no estado da técnica são conhecidos tratamentos com capacidade de inativação viral alternativos mais simples e eficientes. Por exemplo, são utilizados o ácido graxo ácido caprílico (também denominado ácido octanoico) ou sais do mesmo.

[008] Na Patente dos Estados Unidos US4446134 é utilizado o caprilato de sódio em combinação com aminoácidos e tratamento térmico como processo com capacidade de inativação viral em um processo de preparação do fator VIII. Apesar de se acreditar que o agente viricida capaz de desagregar as membranas lipídicas seja o ácido caprílico não dissociado, o processo que o utiliza é comumente chamado de inativação por caprilato, segundo a convenção bioquímica de denominar uma solução de um ácido e sua forma ionizada com o nome desta última, isto é, caprilato.

[009] O ácido caprílico também é utilizado como agente de precipitação para purificar imunoglobulinas (Steinbuch, M. e outros, Arch. Biochem. Biophys., 1969, 134(2), 279-284). A pureza das imunoglobulinas e o rendimento dependem principalmente da concentração de ácido caprílico acrescentado e do pH. Steinbuch, M. e outros também divulgam que é vantajoso acrescentar uma quantidade efetiva de caprilato em duas etapas diferentes com a eliminação do precipitado entre ambas etapas. Deste modo, o processo apresentaria capacidade para eliminar vírus com envoltório assim como sem envoltório, mediante a distribuição no precipitado das proteínas não imunoglobulinas.

[0010] Por outro lado, também já foi descrita no estado da técnica também a combinação da precipitação com caprilato seguida por uma cromatografia de troca iônica para a purificação de imunoglobulinas

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4/45 (Steinbuch, M. e outros supra).

[0011] A Patente Europeia EP0893450 divulga a purificação de IgG a partir da fração II+III (obtida utilizando processos baseados no método de Cohn mencionado anteriormente), incluindo duas colunas de troca aniônica em série posteriores às etapas de adição de caprilato a uma concentração entre 15-25 mM em etapa dupla de precipitação e combinando os dois efeitos do caprilato: a redução de proteínas não imunoglobulinas por precipitação e a capacidade de inativação viral mediante incubação. As etapas de troca aniônica posteriores, além de eliminar outras impurezas (IgM, IgA, albumina e outras impurezas), são utilizadas para eliminar o caprilato, razão pela qual é requerida uma adsorção dupla empregando quantidades relativamente importantes de resinas aniônicas.

[0012] Além disso, o pedido de Patente PCT WO2005/082937 também divulga um processo de preparação de uma composição que compreende imunoglobulinas e que compreende as etapas de adicionar caprilato e/ou heptanoato à solução ou composição que compreende imunoglobulinas e, posteriormente, aplicar a referida solução em uma coluna com resina de troca aniônica.

[0013] No entanto, os presentes inventores constataram que a utilização do caprilato a uma concentração e pH apropriados (por exemplo, pH 5,0-5,2) para conferir ao tratamento a capacidade de inativação viral, tal como se encontra descrito no estado da técnica anterior, provoca a formação de agregados proteicos de alto peso molecular, que são parcialmente irreversíveis por diluição e/ou alteração do pH. Além disso, esses agregados são apenas parcialmente separáveis por filtração, requerindo-se, portanto, uma etapa específica de separação posterior, por exemplo, por cromatografia ou precipitação. A separação dos referidos agregados provoca importantes perdas de proteína e uma diminuição do rendimento do processo industrial de obtenção de

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5/45 imunoglobulinas.

[0014] Além disso, os presentes inventores comprovaram que a presença de agregados formados durante o tratamento com caprilato, inclusive em níveis muito reduzidos, dificulta a correta eliminação do caprilato mediante aplicação direta de uma etapa de separação por membrana de ultrafiltração nas melhores condições de processo. Os referidos agregados dificultam ou impossibilitam a preparação de uma solução de imunoglobulinas a concentrações terapêuticas (por exemplo, entre 5% e 20%) ao apresentar coloides (turbidez) ou instabilidade na forma líquida, dificultando ou impedindo, portanto, etapas posteriores do processo de preparação de imunoglobulinas, tais como a nanofiltração e a filtração esterilizante.

[0015] Como consequência do acima exposto, os presentes inventores desenvolveram um processo de preparação de soluções de imunoglobulinas que, surpreendentemente, inclui um tratamento com caprilato com capacidade de inativação viral a uma concentração de caprilato mais baixa que aquela descrita no estado da técnica anterior e que, estando a solução inicial convenientemente purificada e diluída, e na presença de pelo menos um poliéter ou polímero de glicol, inibe, previne, evita ou no promove o aparecimento de agregados.

[0016] Adicionalmente, os presentes inventores descobriram que a presença de pelo menos um poliéter ou polímero de glicol no processo da presente invenção não interfere na atividade e na eficácia do caprilato em relação a sua capacidade para inativar vírus com envoltório. [0017] Em um aspecto adicional, os presentes inventores descrevem pela primeira vez um processo para a obtenção de imunoglobulinas, que além de incluir o tratamento com capacidade de inativação em condições ideais, contempla a possibilidade de eliminação ou redução dos reagentes caprilato e poliéter ou polímero de glicol (previamente presentes durante o referido tratamento) empregando unicamen8/58

6/45 te a técnica de ultrafiltração. A referida etapa de ultrafiltração permite purificar e concentrar o produto em níveis toleráveis para administração, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea, sem que sejam produzidos agregados proteicos de imunoglobulinas no produto final. Desta maneira, é eliminada a necessidade de interpor outras etapas de separação posteriores ao tratamento com caprilato, tais como, por exemplo, uma cromatografia. Além disso, os níveis remanescentes de poliéter ou polímero de glicol e caprilato depois da ultrafiltração permitem alcançar concentrações de imunoglobulinas, por exemplo, IgGs, de até 20±2%, e que, corretamente formuladas, não se desestabilizam durante sua conservação em forma líquida.

[0018] Dada a simplificação do processo da presente invenção, este permite aumentar consideravelmente o rendimento e diminuir muito significativamente os custos de produção em relação aos processos anteriores descritos no estado da técnica anterior, sem, contudo, comprometer o nível de segurança ou pureza do produto.

[0019] Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo de preparação de uma solução de imunoglobulinas que compreende a adição de ácido caprílico ou sais do mesmo, na presença de pelo menos um poliéter ou polímero de glicol, à solução de imunoglobulinas purificada e a posterior eliminação ou redução dos referidos reagentes mediante ultrafiltração/diafiltração.

[0020] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se ao uso de ácido caprílico ou sais do mesmo, na presença de pelo menos um poliéter ou polímero de glicol, para a inativação viral em processos de obtenção de proteínas e a posterior eliminação ou redução dos referidos reagentes mediante ultrafiltração/diafiltração.

[0021] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se à implementação de uma única etapa de ultrafiltração/diafiltração para a eliminação ou redução dos níveis de ácido caprílico ou sais do mesmo

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7/45 e/ou do poliéter ou polímero de glicol utilizados para a inativação viral em processos de obtenção de proteínas.

[0022] Portanto, a presente invenção, divulga um processo de preparação de uma solução de imunoglobulinas a partir de uma solução inicial de imunoglobulinas com uma pureza maior ou igual a 96% na presença de um poliéter ou polímero de glicol, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) adicionar ácido caprílico ou sais do mesmo à solução inicial;

b) ajustar o pH da solução obtida na etapa a);

c) incubar a solução obtida na etapa b) durante um tempo e temperatura necessários para a inativação de vírus com envoltório; e

d) realizar uma etapa de ultrafiltração/diafiltração da solução obtida na etapa c).

[0023] O processo da presente invenção pode compreender ainda uma etapa de formulação final da solução obtida na etapa d).

[0024] No processo da presente invenção, a solução inicial de imunoglobulinas é oriunda da fração I+II+III, da fração II+III, ou da fração II, obtidas de acordo com o método de Cohn, ou Cohn-Oncley, ou do precipitado A ou I+A ou GG, obtidos pelo método de KistlerNitschmann, ou variações dos mesmos, que foram purificadas adicionalmente até ser obtida uma pureza maior ou igual a 96% de IgG. Preferivelmente, a solução inicial de imunoglobulinas é oriunda da fração II+III do método de Cohn ou variações da mesma, que foi posteriormente purificada mediante precipitação com PEG e cromatografia aniônica, tal como descrito no documento EP1225180B1. De acordo com esta patente, qualquer uma das frações anteriores poderia ser submetida a um processo de precipitação mediante a utilização de PEG, seguido por uma filtração para eliminar o precipitado e por uma purificação adicional através de uma coluna de troca iônica (por exem10/58

8/45 plo, uma coluna com DEAE Sepharose). Em todos estes casos a solução inicial de imunoglobulinas é proveniente de plasma humano.

[0025] Na modalidade mais preferida, a solução inicial de imunoglobulinas é oriunda da fração II + III obtida por processos baseados no método de Cohn, a qual é adicionalmente purificada por qualquer dos métodos descritos na técnica anterior, até que se consiga o grau de purificação adequado para ser submetido a tratamento com caprilato nas condições não precipitantes da presente invenção, isto é, um valor de pureza maior ou igual a 96% (p/v) de IgG determinada por eletroforese em acetato de celulose, com um teor de albumina preferivelmente menor ou igual a 1% (p/v) em relação ao total de proteínas. Assim sendo, a referida solução inicial de imunoglobulinas encontra-se suficientemente purificada, antes e depois do tratamento com caprilato, para a via de administração terapêutica à qual será destinada, de forma que não se faz necessária nenhuma purificação adicional posteriormente à etapa com capacidade de inativação viral da presente invenção.

[0026] As imunoglobulinas da solução inicial do processo da presente invenção também podem ser obtidas por métodos de genética recombinante, por exemplo, por expressão em culturas celulares; métodos de síntese química; ou métodos de produção transgênica da proteína.

[0027] Na modalidade mais preferida, as imunoglobulinas mencionadas no processo da presente invenção são IgGs. Contempla-se que as referidas IgGs sejam monoclonais ou policlonais. Na modalidade mais preferida, as IgGs são policlonais.

[0028] Contempla-se que os poliéteres ou polímeros de glicol da presente invenção sejam poliéteres de alcano ou óxidos de polialcano, também denominados poliglicóis, e referem-se, por exemplo, aos derivados de etila ou etileno e propila ou propileno, mais conhecidos como

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9/45 polietileno glicol (PEG) ou polipropileno glicol (PPG) ou equivalentes dos mesmos. Adicionalmente, os referidos reagentes devem ser compatíveis com as imunoglobulinas no sentido que não comprometam a estabilidade ou a solubilidade das mesmas e que, por seu tamanho, possam ser convenientemente eliminados por técnicas de ultrafiltração, ou, por sua menor toxicidade, sejam compatíveis para o uso terapêutico das imunoglobulinas.

[0029] Em uma modalidade preferida, o poliéter ou polímero de glicol é selecionado dentre polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG) ou combinações dos mesmos. Preferivelmente, o poliéter ou polímero de glicol es PEG, mais preferivelmente um PEG de massa molecular nominal de aproximadamente entre 3350 Da e 4000 Da e o mais preferida é PEG de 4000 Da de massa molecular nominal.

[0030] O teor de poliéter ou polímero de glicol mencionado anteriormente na solução inicial de imunoglobulinas varia, preferivelmente, entre 2% e 6% (p/v), mais preferivelmente entre 3% e 5% (p/v).

[0031] Contempla-se que é possível que sejá necessário um ajuste da concentração do referido poliéter ou polímero de glicol na solução inicial de imunoglobulinas. O referido ajuste da concentração do referido poliéter ou polímero de glicol pode ser feito por diluição da solução de imunoglobulinas purificada inicial e/ou por adição do mesmo.

[0032] Em função da composição da solução inicial de imunoglobulinas contempla-se que, antes da etapa a) do processo da presente invenção, seja realizada uma série de etapas de purificação ou ajuste de concentrações, tais como, por exemplo:

- ajuste da concentração de imunoglobulinas preferivelmente entre 1 e 10 mg/ml, mais preferivelmente entre 3 e 7 mg/ml. Este ajuste pode ser feito por qualquer um dos processos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, por diluição ou concentração da proteína até a faixa estabelecida (determinada, por exemplo, de acordo com

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10/45 proteína total por densidade ótica a 280 nm E(1%) = 13,8 - 14,0 UA, pelo método de Biuret, pelo método de Bradford, ou especificamente por imunonefelometria), conforme o caso. Portanto, em uma modalidade preferida, a solução inicial de imunoglobulinas apresenta uma concentração de imunoglobulinas preferivelmente entre 1 e 10 mg/ml, mais preferivelmente entre 3 e 7 mg/ml; e/ou

- ajuste da pureza da solução de imunoglobulinas que, preferivelmente, deve atingir pelo menos o 96% de IgG em relação ao total de proteína. Esta purificação pode ser realizada por técnicas amplamente conhecidas pelo especialista na técnica como, por exemplo, por precipitação com PEG, e filtração e posterior cromatografia de troca aniônica (DEAE Sepharose).

[0033] Na etapa a) do processo da presente invenção, adiciona-se ácido caprílico ou sais do mesmo, preferivelmente utilizando uma solução concentrada do mesmo, por exemplo, entre 1,5M e 2,5M, até uma concentração final preferivelmente entre 9 mM e 15 mM.

[0034] Em uma modalidade preferida, na etapa b), a solução obtida tem o pH ajustado entre 5,0 e 5,2, mais preferivelmente a 5,1.

[0035] Em uma modalidade preferida, na etapa c), a solução obtida é incubada, por pelo menos 10 minutos, mais preferivelmente entre 1 e 2 horas, e ainda mais preferivelmente 2 horas. Adicionalmente, a temperatura à qual a referida incubação é realizada varia entre 2°C e 37°C, mais preferivelmente entre 20°C e 30°C.

[0036] Em uma modalidade preferida, antes da etapa d) do processo da presente invenção, o teor de polímeros ou agregados de alto peso molecular na solução obtida na referida etapa c) é menor ou igual a 0,2%, mais preferivelmente é inferior a 0,1%. Esta percentagem de polímeros ou agregados moleculares de imunoglobulinas em relação ao total de proteínas é determinada por HPLC em coluna de exclusão em gel de acordo com o valor da densidade ótica a 280 nm. A referida

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11/45 percentagem de polímeros ou agregados moleculares de imunoglobulinas pode ser avaliada, por exemplo, pelo método de análise descrito na monografia da gamaglobulina intravenosa da Farmacopeia Europeia.

[0037] Preferivelmente, a solução de imunoglobulinas é clarificada utilizando-se filtros de profundidade antes da modalidade da etapa d) de ultrafiltração/diafiltração.

[0038] Com relação à etapa d), contempla-se, de forma preferida, que a ultrafiltração/diafiltração no processo da presente invenção apresente etapas iniciais de diafiltração e concentração por redução de volume, para posteriormente ser aplicada a diafiltração de volume constante.

[0039] A ultrafiltração/diafiltração pode ser realizada em escala industrial preferivelmente por meio do processo de diálise e concentração simultânea, reduzindo o volume de produto e então diafiltrando o mesmo, de forma que o consumo de reagentes será um pouco menor e o processo mais eficiente, levando-se em conta que a concentração de proteínas seja ideal e preferivelmente menor ou igual a 30 mg/ml. De todo modo, o especialista na técnica pode determinar facilmente a forma mais adequada e prática de realizar esta etapa de ultrafiltração/diafiltração, podendo escolher entre os distintos modos operacionais conhecidos no estado da técnica (por exemplo, diluiçãoconcentração ou diafiltração-concentração, diafiltração de volume constante, ou modificações e combinação das anteriores).

[0040] A membrana de ultrafiltração/diafiltração utilizada na etapa d) do processo da presente invenção é preferivelmente formada por polissulfona, celulose regenerada, ou equivalentes, tais como, por exemplo, as membranas comercializadas sob as marcas Biomax® (Millipore, EUA), Omega® (Pall, EUA), Kvik-flow® (General Electric, EUA). Não obstante, o corte molecular escolhido para a membrana po14/58

12/45 de variar dependendo de diversos fatores, por exemplo, do fabricante escolhido. O especialista na técnica pode facilmente determinar qual será a membrana escolhida que se ajusta às necessidades de cada caso segundo, por exemplo, a concentração de caprilato e do poliéter ou polímero de glicol da solução a ser processado.

[0041] De forma preferida, a etapa d) de ultrafiltração/diafiltração é realizada através de uma membrana de corte molecular menor ou igual a 100kDa, ainda mais preferivelmente de 100 kDa.

[0042] Na modalidade mais preferida, a ultrafiltração/diafiltração da etapa d) é realizada em duas fases: uma primeira fase na qual o pH é ajustado entre 5,0 e 6,0 para reduzir ou eliminar principalmente o caprilato e uma segunda fase na qual o pH é ajustado abaixo de 5,0, preferivelmente a um pH entre 4,0 e 5,0, para a reduzir ou eliminar principalmente o poliéter ou polímero de glicol.

[0043] Em uma modalidade preferida, na primeira fase da etapa de ultrafiltração/diafiltração, a diafiltração é realizada utilizando um meio de diafiltração que compreende sais alcalinos de ácido carboxílico, por exemplo, de ácido acético, a uma concentração maior ou igual a 5 mM aproximadamente. Na modalidade mais preferida, a diafiltração mencionada é realizada utilizando uma solução de acetato de sódio a uma concentração maior ou igual a 5 mM ajustada no pH mencionado anteriormente, isto é, entre 5,0 e 6,0.

[0044] O número de volumes de diafiltração a serem realizados na primeira fase da etapa d) de ultrafiltração/diafiltração pode ser facilmente determinado pelo especialista na técnica em função da quantidade de caprilato utilizada inicialmente e da quantidade final aceitável. Preferivelmente, são utilizados pelo menos três volumes do meio de diafiltração que, tal como anteriormente mencionado, que é preferivelmente uma solução de acetato de sódio 5 mM a um pH de 5,0-6,0. De forma preferida, nesta primeira fase da ultrafiltração/diafiltração são

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13/45 eliminados aproximadamente 90% ou mais do caprilato inicial, de modo que nesta primeira fase a concentração de caprilato é reduzida para aproximadamente 1 mM ou menos.

[0045] Na segunda fase da etapa d) de ultrafiltração/diafiltração, passa-se à modalidade da diafiltração da solução de imunoglobulinas, preferivelmente, a um volume constante.

[0046] De forma preferida, a diafiltração na referida segunda fase da ultrafiltração/diafiltração é realizada na presença de uma solução tamponada que contém sais de metais alcalinos formados por acetato, fosfato, ou equivalentes, ou aminoácidos e/ou polióis, por exemplo, glicina e/ou sorbitol de pH no valor indicado anteriormente.

[0047] Como no caso da primeira fase da diafiltração, na segunda fase o número de volumes de diálise utilizados para reduzir convenientemente o poliéter ou polímero de glicol utilizado no processo da presente invenção pode ser facilmente determinado pelo especialista na técnica levando em conta a redução ou eliminação requerida do poliéter ou polímero de glicol. Em uma modalidade preferida, a quantidade de tampão a ser trocada na diafiltração da segunda fase da etapa d) de ultrafiltração/diafiltração é maior ou igual a seis volumes. Na modalidade mais preferida, na referida segunda fase, a troca é realizada contra o número de volumes de tampão necessários para obter uma redução do poliéter ou polímero de glicol maior ou igual a 100 vezes do teor inicial do referido poliéter ou polímero de glicol antes de ser iniciada a etapa d) de ultrafiltração/diafiltração.

[0048] Uma vez reduzidos o caprilato e o poliéter ou polímero de glicol na etapa d) de ultrafiltração/diafiltração, na etapa de formulação final mencionada anteriormente é possível ajustar-se a solução à composição final desejada por adição dos excipientes e/ou estabilizantes requeridos, de forma que o produto possa ser concentrado para ser levado à formulação final. A adição dos excipientes e/ou estabilizantes

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14/45 a ser feita depois da formulação final pode ser feita diretamente por adição dos referidos excipientes e/ou estabilizantes em forma sólida ou de solução concentrada ou, ainda mais preferivelmente, mediante diafiltração empregando o número de volumes de troca necessários de uma solução de formulação para assegurar a adequada composição do produto final.

[0049] Em outra modalidade, a adição dos excipientes e/ou estabilizantes é realizada por substituição da solução tampão de diálise formada por acetato de sódio utilizada na segunda fase da etapa d) de ultrafiltração/diafiltração, total ou parcialmente, por uma solução que compreenda os excipientes e/ou estabilizantes a serem adicionados ajustada, preferivelmente, no mesmo valor de pH de entre 4,0 e 5,0 de modo que depois da concentração final a imunoglobulina já esteja formulada.

[0050] O especialista na técnica sabe quais tipos de excipientes e/ou estabilizantes devem ser adicionados para obter uma estabilidade desejada. Contempla-se, por exemplo, que os referidos excipientes e/ou estabilizantes sejam um ou mais aminoácidos, por exemplo, glicina, preferivelmente a uma concentração de entre 0,2 e 0,3 M; um ou mais carboidratos ou polióis, por exemplo, sorbitol; ou combinações dos mesmos.

[0051] Finalmente, a concentração final de imunoglobulinas, preferivelmente IgGs, é ajustada em uma concentração adequada para uso intravenoso, intramuscular ou subcutâneo, que é conhecida pelo especialista na técnica e, por exemplo, pode variar entre 5% e 22% (p/v). A referida concentração pode ser realizada por qualquer processo conhecido no estado da técnica, por exemplo, por concentração mediante ultrafiltração. Contempla-se que no caso de a concentração das imunoglobulinas ser efetuada mediante ultrafiltração, a referida concentração pode ser realizada utilizando-se a mesma membrana que na diafil17/58

15/45 tração prévia. Evidentemente, as três diafiltrações mencionadas, assim como a concentração, também podem ser realizadas utilizando-se diferentes membranas.

[0052] O processo da presente invenção também contempla a possibilidade de introduzir uma etapa de nanofiltração para aumentar a margem de segurança do produto. Existem fases distintas do processo em que o produto é nanofiltrável por filtros comercialmente disponíveis (por exemplo, Planova® e Bioex® da Asahi-Kasei, DV® e SV4® de Pall, Virosart® da Sartorius, Vpro® da Millipore, ou equivalentes) com tamanhos de poro de 20 nm ou inferiores e até 50 nm, preferivelmente com tamanhos de poro de 20 nm ou inferiores, ou sendo possível utilizar nanofiltros de 15 nm. As etapas intermediárias nas quais é possível realizar uma etapa de nanofiltração, são, por exemplo, na solução inicial de imunoglobulinas; ou no material tratado com caprilato depois da etapa de ultrafiltração/diafiltração (uma vez reduzidos o caprilato e o poliéter ou polímero de glicol); ou no material depois de concentração e formulação da solução de imunoglobulinas, preferivelmente IgGs (produto final). O especialista na técnica decidirá qual a melhor opção em função de, entre outros, o tamanho de poro da membrana, a área de filtração requerida de acordo com o tempo do processo, o volume de produto a ser nanofiltrado, a recuperação de proteína.

[0053] O produto final obtido pelo processo da presente invenção satisfaz totalmente com os critérios da Farmacopeia Europeia no que diz respeito ao teor de iso-hemaglutininas. No entanto, o processo da presente invenção também contempla a opção de incluir uma etapa de captura seletiva e específica de anticorpos do grupo sanguíneo anti-A e/ou anti-B para maximizar sua redução. A referida etapa é efetuada, preferivelmente, utilizando resinas de afinidade bioespecífica, tal como descrito no estado da técnica. Por exemplo, utilizando-se resinas de afinidade bioespecífica com ligandos formados por trissacarídeos é

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16/45 possível conseguir uma redução significativa do nível de isohemaglutininas (Spalter e outros, Blood, 1999, 93, 4418-4424). Esta captura adicional pode ser opcionalmente incorporada, segundo critério do especialista na técnica, e em qualquer etapa do processo da presente invenção, ou pode ser realizada antes ou depois de realizado o processo da presente invenção.

[0054] Portanto, com respeito ao processo de preparação de uma solução de imunoglobulinas da presente invenção, na modalidade mais preferida utiliza-se uma solução inicial de imunoglobulinas com uma pureza maior ou igual a 96% de IgGs. Esta solução tem a concentração de IgGs ajustada preferivelmente entre 1 mg/ml e 10 mg/ml, e preferivelmente entre 3 mg/ml e 7 mg/ml, que contém (por adição em etapas anteriores) ou à qual PEG é adicionado até uma concentração de 4 ± 1% (p/v). Em seguida, o pH da solução é ajustado em entre 5,0 e 5,2 com ácido acético, e caprilato de sódio (por exemplo, utilizando uma em solução concentrada do referido caprilato de sódio) é adicionado. Na modalidade preferida, a solução de caprilato concentrada é adicionada à solução de IgGs purificada, lentamente e com agitação. Depois de adicionado todo o caprilato calculado para que a concentração final do produto atinja entre 9 e 15 mM de caprilato, se for necessário, o pH final volta a ser ajustado entre 5,0-5,2, a solução é incubada preferivelmente a uma temperatura entre 2-37°C e mais preferivelmente a uma temperatura de 25 ± 5°C por um tempo mínimo 10 minutos, e preferivelmente entre 1 e 2 horas.

[0055] Posteriormente, ela é clarificada por filtros de profundidade (por exemplo, Cuno 90LA, 50LA, Seitz EK, EK-1, EKS, ou equivalentes).

[0056] Em seguida, a solução obtida é processada através de um equipamento de ultrafiltração/diafiltração formado por membranas compostas por polissulfona, por exemplo, Biomax® da Millipore ou

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Omega® da Pall, preferivelmente, colocadas em forma de cassete empilhável. A solução é recirculada por cada unidade de ultrafiltração/diafiltração, preferivelmente, a um caudal entre 100-500 L/h aproximadamente e a uma temperatura de 5 ± 3°C. A perda de carga entre a pressão de entrada e a de saída (presión atmosférica) varia, preferivelmente, entre 1 e 3 bar. Em seguida, dá-se início à primeira fase de diafiltração da etapa de ultrafiltração/diafiltração para eliminar o caprilato, aplicando-se preferivelmente uma troca de pelo menos três volumes de tampão formado preferivelmente por uma solução de acetato de sódio a uma concentração maior ou igual a 5 mM e a um pH entre 5,0 e 6,0. Preferivelmente, a cada volume de tampão acrescentado ou consumido, o volume da solução de produto é reduzido à metade do inicial, exceto na última adição.

[0057] Depois da primeira fase de diafiltração (por diluição e concentração ou equivalente) o pH da solução retida é ajustado entre 4,0 e 5,0 com, por exemplo, ácido acético. Depois disso, dá-se início à diafiltração de volume constante, preferivelmente, contra seis ou mais volumes de uma solução tampão formada por acetato de sódio a uma concentração maior ou igual a 5 mM e a um pH entre 4,0 e 5,0.

[0058] A solução tampão de diálise anterior formada por acetato de sódio pode ser opcionalmente substituída total ou parcialmente por uma solução de aminoácidos, por exemplo, glicina a uma concentração de 0,2-0,3 M, opcionalmente combinada com carboidratos ou polióis, por exemplo, sorbitol, ajustada preferivelmente no mesmo valor de pH entre 4,0 e 5,0 de modo que depois da concentração final a imunoglobulina já esteja formulada.

[0059] Depois da aplicação de, preferivelmente, pelo menos seis volumes (mais preferivelmente entre seis e dez volumes) das soluções de diálise a um pH entre 4,0 e 5,0 mencionadas anteriormente o produto pode formulado, no caso ainda o esteja, por adição direta de excipi20/58

18/45 entes e/ou estabilizantes à solução obtida, como, por exemplo, glicina ou outros aminoácidos, assim como carboidratos, por exemplo, sorbitol, ou combinação dos mesmos, no estado sólido ou em forma de solução concentrada dos referidos excipientes e/ou estabilizantes. Em seguida, passa-se à concentração da solução de IgGs obtida mediante redução de volume que a concentração de IgG atinja valores adequados para uso intravenoso, intramuscular ou subcutâneo.

[0060] A referida solução concentrada, com a concentração de excipientes e/ou estabilizantes e o pH apropriadamente ajustados é aplicada por uma filtração absoluta utilizando filtros de 0,2 pm de poro, e, opcionalmente, nanofiltrada. Finalmente, a solução de IgGs é assepticamente dosificada em injetáveis, ampolas, frascos pequenos, garrafas ou outros frascos de vidro, que são imediatamente vedados hermeticamente. Outra opção é a dosificação em recipientes de plástico compatíveis, rígidos ou flexíveis, por exemplo, bolsas ou garrafas. [0061] O produto dosificado passa por quarentena e inspeção visual, sendo armazenado a uma temperatura entre 2 e 30°C para que seja conservado por pelo menos 2 anos.

[0062] Por outro lado, tal como anteriormente mencionado, a presente invenção também divulga pela primeira vez o uso de ácido caprílico ou sais do mesmo na presença de pelo menos um poliéter ou polímero de glicol para a inativação viral em processos de obtenção de proteínas, onde o referido poliéter ou polímero de glicol e o ácido caprílico ou sais do mesmo são posteriormente eliminados mediante ultrafiltração.

[0063] Preferivelmente, as referidas proteínas são selecionadas do grupo de proteínas plasmáticas que compreende imunoglobulinas; albumina; fatores de coagulação tais como fator VII, fator VIII e fator IX; e fator de von Willebrand, ainda mais preferivelmente as referidas proteínas são imunoglobulinas. Na modalidade mais preferida, as referi21/58

19/45 das proteínas são IgGs.

[0064] A presente invenção está descrita mais detalhadamente a seguir com referência a vários exemplos de modalidade. Esses exemplos, no entanto, não se destinam a limitar o alcance da presente invenção, mas sim a ilustrar a descrição da mesma.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Processo de acordo com a presente invenção para obtenção, a partir de plasma, de uma solução de imunoglobulinas viralmente segura, livre de agregados e com um rendimento adequado para aplicação industrial.

[0065] Como material de partida foram usados 16 litros de uma solução de imunoglobulinas, que continha IgGs como componente proteico principal, obtida de acordo com o processo descrito na Patente Europeia EP1225180B1. Em resumo, a referida solução foi obtida a partir da extração de gamaglobulina da Fração II+III do método de Cohn. Para realizar a referida extração de gamaglobulina da Fração II+III, a referida fração foi previamente isolada por fracionamento de plasma humano com etanol. Em seguida, ela foi suspendida na presença de um carboidrato, e seu teor de proteínas acompanhantes majoritárias foi reduzido mediante precipitação com PEG-4000. Finalmente a purificação final da fração foi realizada por adsorção em uma coluna de resinas de troca iônica (DEAE Sepharose). O efluente de coluna assim obtido (fração não adsorvida na resina, isto é, no DEAE), apresentou pureza eletroforética em acetato de celulose (ACE) das imunoglobulinas de 98±2% , um pH de 6,0, um valor de turbidez de 2,6 Unidades de Turbidez Nefelométrica (NTU, segundo suas siglas em inglês) e uma concentração de IgG de aproximadamente 5 mg/ml.

[0066] A solução obtida teve o pH ajustado em 5,1 e a temperatura entre 2-8°C foi ajustada a um pH de 5,1 por adição de ácido acético. Posteriormente, a referida solução de imunoglobulina foi levada a uma

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20/45 concentração final de caprilato de 13 mM mediante a adição de uma solução concentrada de caprilato de sódio.

[0067] A solução de imunoglobulinas com caprilato foi aquecida até 25°C e incubada nesta temperatura durante 2 horas com lenta agitação. Durante o referido processo de incubação o pH foi mantido em 5,10 ± 0,05. A turbidez da solução resultante foi de 17,3 NTU.

[0068] A solução tratada com caprilato foi resfriada para uma temperatura de aproximadamente 8°C para ser posteriormente clarificada através de um filtro de profundidade (CUNO®, Ultrafilter, Dinamarca). 20 litros de líquido filtrado (incluindo o pós-lavado, com uma concentração de IgG de aproximadamente 4 mg/ml e uma turbidez inferior a 3 NTU) foram recolhidos da referida clarificação.

[0069] A solução clarificada acima foi dialisada e concentrada por ultrafiltração através de membranas de corte molecular nominal de 100 kDa (Biomax®, Millipore, EUA). A ultrafiltração foi realizada em duas fases distintas: na primeira fase, o material que se encontrava a um pH de 5,1 foi submetido a três etapas de diálise e concentração sequencial, mediante diafiltração em uma solução de acetato 5 mM ajustada a um pH de 5,1 e mediante concentração até aproximadamente 30 UA. Na segunda fase, a solução que apresentava uma concentração adequada de proteínas, caprilato e pEG, foi levada a um pH de 4,5 ± 0,1 e posteriormente foi iniciada uma diálise contra oito volumes de solução de acetato 5 mM a um pH de 4,5. Posteriormente, o produto foi formulado mediante diálise em aproximadamente 20 litros de solução de glicina 200 mM a um pH de 4,2, e foi concentrado na mesma unidade de ultrafiltração até um valor de 140,5 UA a fim de obter uma solução de IgGs com uma concentração de 10% (p/v).

[0070] Finalmente, a referida solução foi filtrada através de um filtro de profundidade (CUNO®, Ultrafilter, Dinamarca) e de filtros ou membranas absolutas de 0,22 mm de poro (CVGL®, Millipore, EUA; ou

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DFL®, PALL, EUA).

[0071] A Tabela 1 mostra a caracterização do material de partida, diferentes produtos intermediários e o produto final, de acordo com o processo explicado acima. Com relação aos resultados incluídos na referida tabela, está indicado que a turbidez foi medida por nefelometria, a percentagem de polímero ou agregados moleculares de imunoglobulinas, em relação ao total de proteínas detectado, foi determinado mediante HPLC em coluna de exclusão em gel segundo o valor de densidade ótica a 280 nm; a concentração de caprilato foi determinada por um método enzimático mediante a quantificação de substrato colorimétrico, a concentração de PEG foi determinada mediante coluna de filtração em gel HPLC utilizando um detector de índice de refração, e a percentagem de recuperação do processo foi calculada de acordo com a concentração de IgG quantificada por nefelometria.

[0072] Os resultados deste exemplo demonstram que o tratamento com caprilato da referida solução purificada não induz qualquer formação de agregados de imunoglobulinas ou outros precipitados, mantendo invariável a distribuição molecular do produto. Consequentemente, não foram necessárias etapas de purificação posteriores ao tratamento com caprilato para eliminar agregados e/ou precipitados. Este fato facilitou enormemente o processo de obtenção e permitiu a aplicação direta do material à membrana de ultrafiltração.

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Tabela 1: resultados obtidos para o material de partida, para diversos produtos intermediários e para o produto final no processo do exemplo 1

Amostra:	Concentração de IgG (mg/ml)	Turbidez (NTU)	Agregados (polímero/ Dímero) (%)	Concentração de caprilato (mM)	Concentração de PEG (mg/ml)	Recuperação (%)
Material de partida (efluente da coluna de troca iônico, com o pH já ajustado em 5,1)	4,6	2,6	<0,1/3,0	0	38,4	100
Material tratado com caprilato	4,3	17,3	<0,1/3,0	12,1	38,2	97,8
Material clarificado	3,7	2,2	<0,1/2,8	11,1	38,0	95,2
Produto final	99,1	3,5	<0,1/2,7	0,1	0,1	89,4

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23/45 [0073] Assim sendo, a etapa de ultrafiltração posterior resolveu satisfatoriamente o objetivo de reduzir eficientemente os reagentes químicos do processo de fabricação (isto é, PEG e caprilato), permitindo por sua vez a posterior formulação e concentração da solução purificada de imunoglobulina até a composição adequada para uso terapêutico.

[0074] Tal como pode ser observado na Tabela 1, a recuperação de proteína obtida neste caso, desde o efluente de partida até o produto concentrado a 10%, foi de 89,4%, constatando-se a viabilidade deste processo em nível industrial. A referida recuperação foi superior ao valor obtido por processos convencionais de acordo com o estado da técnica, e tal como descrito no pedido de Patente PCT WO2005/073252 (70% de recuperação, segundo um rendimento de 4,8 g/l em relação a 6,8 g/l iniciais).

Exemplo 2. Influência da pureza da solução de imunoglobulinas inicial no tratamento com caprilato.

[0075] Neste exemplo foi avaliado o impacto da pureza da solução de imunoglobulinas inicial e a presença de proteínas acompanhantes no material de partida que foi submetido ao processo da presente invenção.

[0076] Foram realizados dois grupos de ensaio experimentalmente independentes:

- no grupo A, o material de partida foi o efluente da coluna DEAE Sepharose, de pureza eletroforética (ACE) de 98±2% de IgG, isto é, o material de partida descrito no Exemplo 1.

- no grupo B, o material de partida, denominado Filtrado PEG 4%, foi obtido pelo mesmo processo descrito no Exemplo 1 até a etapa anterior à cromatografia em DEAE Sepharose. Assim sendo, o material B foi obtido depois da precipitação com PEG da suspensão de extração da Fração II+III e apresentava uma pureza eletroforética

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24/45 (ACE) de aproximadamente 90% de IgG.

[0077] Ambos os materiais de partida (grupo A e grupo B), com um teor de PEG equivalente e aproximadamente igual a 4%, foram submetidos a um tratamento com caprilato a uma concentração de 13 mM, e a um pH entre 5,0 e 5,2 e foram purificados como indicado no Exemplo

1.

[0078] Na tabela 2 estão apresentadas as principais características do material de partida utilizado em ambos os grupos de ensaio (A e B, respectivamente), assim como do material gerado em etapas posteriores ao tratamento com caprilato.

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Tabela 2. Resultados da turbidez e percentagem de agregação obtidos nas diferentes etapas do processo da presente invenção para os grupos A e B descritos no Exemplo 2

Material de partida (grupo)	Pureza (%)	Teor de albumina (mg Alb/g IgG)	Solução antes do tratamento com caprilato	Solução depois da incubação de caprilato	Solução depois da incubação (2 horas a 25°C)
D.O. 280nm (UA)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)
Efluente de coluna (A)	97,9 ± 1,5	<0,4	6,7	2,9	<0,1	15,1	<0,1	17	<0,1
Filtrado depois de tratamento com PEG (B)	90,2 ± 2,9	36	8,3	8	1,9	517	0,9	591	1,0

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26/45 [0079] Os resultados obtidos e apresentados na Tabela 2 demonstraram que a adição de caprilato a uma concentração eficaz para a inativação (13 mM), a um material de menor pureza (aproximadamente 90% de IgG, ver grupo B), provoca a precipitação de componentes da solução dando lugar a um incremento drástico de turbidez (superior a 500 NTU). Assim sendo, os resultados de distribuição molecular da solução, demonstraram a precipitação de parte das proteínas acompanhantes de alto peso molecular.

[0080] A adição de caprilato, nas quantidades e condições mencionadas acima (13 mM de caprilato, pH entre 5,0 e 5,2), a um material de baixa pureza deu lugar a uma suspensão precipitada que gerou a necessidade de incluir etapas de separação e purificação adicionais para separar as proteínas de alto peso molecular e agregados precipitados. Portanto, a composição molecular do produto do grupo A tratado com caprilato, isto é, com um teor em agregados superior a 1%, evidencia a inviabilidade de processar este produto até o produto final purificado a menos que sejam incluídas etapas adicionais de purificação ou separação, tais como etapas de precipitação com PEG, cromatografia ou equivalentes. Finalmente, este fato comprova a viabilidade do uso do caprilato como agente com capacidade para inativação viral e em condições não precipitantes apenas quando este é adicionado a um material com pureza suficiente.

Exemplo 3. Efeito da composição do material de partida na geração de agregados.

[0081] O objetivo desta experiência foi avaliar o impacto da composição da solução inicial de imunoglobulinas à qual o tratamento com caprilato é aplicado.

[0082] Foram realizados dois grupos de ensaio experimentalmente independentes, A e B, a partir de dois materiais de pureza equivalente (97,9 ± 1,5%), porém de composição diferente.

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27/45 [0083] No grupo A, o material de partida foi o efluente de coluna (obtido de acordo com o processo inicial descrito no Exemplo 1), com uma concentração de proteínas de 5±2 mg/ml e uma concentração de PEG-4000 do 4±1%.

[0084] No grupo B, o material de partida denominado efluente concentrado e dialisado, foi o mesmo efluente de coluna mencionado para o grupo A, porém depois de concentrado e dialisado. Portanto, o efluente de coluna DEAE (mencionado no Exemplo 1 anterior e que corresponde ao grupo A do presente Exemplo), foi submetido a uma etapa adicional de diálise e concentração mediante ultrafiltração de modo que o teor de PEG foi reduzido da ordem de aproximadamente 6 vezes e a proteína foi concentrada até um valor de aproximadamente 4%, isto é, 40 mg/ml.

[0085] O material obtido em ambos os grupos experimentais, A e B, foi submetido a um tratamento com caprilato a uma concentração de 13 mM e um pH entre 5,0 e 5,2 e foi ultrafiltrado nas condições descritas no Exemplo 1 até a obtenção de um produto de IgGs concentrado a 10%.

[0086] Na tabela 3 estão apresentadas as principais características do material processado nos grupos experimentais A e B mencionados anteriormente assim como as características do material gerado na etapa posterior ao tratamento com caprilato e no produto final diafiltrado e concentrado, para cada grupo experimental.

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Tabela 3. Resultados obtidos nas diferentes etapas do processo da presente invenção para os grupos A e B do Exemplo 3

Material de partida (grupo)	Material de partida	Caprilato nominal (mM)	Solução depois da adição de caprilato	Produto final
	IgG (mg/ml)	PEG (mg/ml)	Pureza (%)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)	Caprilato (mM)	Agregados, Polímero (%)
Efluente de coluna (A)	5 ± 2	40 ± 10	97,9 ± 1,5	13	7,0	<0,1	<0,1	<0,1
9,8	<0,1	0,1	<0,1
11,9	<0,1	0,1	<0,1
Efluente concentrado e dialisado (B)	~ 40	~ 6	98 ± 2	13	11,9	0,5	0,3	0,3
13,4	0,4	0,5	0,5
10,0	0,3	0,5	0,4

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29/45 [0087] Como pode ser visto na Tabela 3, os resultados demonstram que o tratamento com caprilato nas condições especificadas, aplicado a uma solução purificada de imunoglobulina, a uma concentração de 5±2 mg/ml, e na presença de uma concentração de PEG de 40±10 mg/ml (4±1%) (grupo A, efluente de coluna), não induz alteração ou agregação da solução de imunoglobulinas, a distribuição molecular do produto sendo mantida invariável durante e depois da adição do caprilato, com uma proporção não detectável de agregados inferior a 0,1%. [0088] No entanto, quando estas mesmas condições para o tratamento com caprilato foram aplicadas a um material com um teor reduzido de PEG (<1%) (grupo B), foi observado um notável incremento de agregados de imunoglobulina depois da adição de caprilato. Além disso, este teor de agregados não pôde ser eliminado por ultrafiltração nas condições utilizadas, sendo quantificados níveis equiparáveis de polímero no produto final.

[0089] Dado que as características diferenciais entre o material de partida utilizado nos grupos experimentais A e B eram principalmente a concentração de proteína e a concentração de PEG, foi realizado um ensaio adicional com o objetivo de comprovar a influência de cada um dos referidos parâmetros no posterior tratamento com caprilato.

[0090] Nesta experiência, se parte de um único lote de Efluente Concentrado e Dialisado (material inicial do grupo B acima) que foi dividido em quatro grupos experimentalmente distintos: grupos B1, B2, B3 e B4.

[0091] O material do grupo B1 foi processado a uma concentração de proteína de aproximadamente 4% e a uma concentração de PEG de aproximadamente 0.6%.

[0092] O material do grupo B2 foi processado à mesma concentração de proteína de aproximadamente 4%, mas o teor de PEG foi reajustado até um valor de 4±1 % (p/p).

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30/45 [0093] Nos grupos B3 e B4, o material foi diluído até 0,5 ± 0,2% de proteína. Enquanto que o teor de PEG, no grupo B3, o referido foi ajustado em uma concentração de 0,6% (p/p) aproximadamente, ao passo que no grupo B4 o teor de PEG foi reajustado em 4±1 % (p/p).

[0094] O material resultante obtido nos quatro grupos experimentais teve o pH ajustado em pH 5,10 ± 0,05 e a concentração de caprilato foi ajustada em 15 mM e em seguida o material foi incubado a 25°C durante 2 horas. Os resultados obtidos estão mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Resultados obtidos para o material inicial e depois da incubação com caprilato para os grupos B1, B2, B3 e B4 do Exemplo 3.

Grupo experimental	Material de Partida	Solução tratada com caprilato 15mM a 25°C durante 2 horas
	IgG (mg/ml)	PEG (mg/ml)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)	Agregados, Polímero (%)
B1	~ 40	~ 6	1,6	< 0,1	0,5
B2	~ 40	40 ± 6	2,5	< 0,1	0,3
B3	5 ± 2	~ 6	1,3	< 0,1	0,5
B4	5 ± 2	40 ± 6	1,3	< 0,1	< 0,1

[0095] Os resultados mostrados na Tabela 4 constatam que durante o tratamento com caprilato nas condições estabelecidas foi observado um efeito protetor do PEG em combinação com uma diluição suficiente da proteína. Convém destacar que quando o material de partida se encontrava a uma concentração de proteína de aproximadamente 5±2 mg/ml e a uma concentração de PEG de 4%, foram obtidos valores não detectáveis de agregados depois do tratamento com caprilato (<0,1%).

Exemplo 4. Efeito do pH na solubilidade da solução de imunoglobulinas tratada com caprilato.

[0096] É sabido que a eliminação de PEG em soluções de imuno33/58

31/45 globulinas, assim como a concentração das referidas imunoglobulinas até concentrações adequadas para uso intravenoso, deve ocorrer preferivelmente a valores de pH próximos de 4,5.

[0097] Por outro lado, dada a insolubilidade do ácido caprílico a pHs inferiores ao seu pKa (4,89), na presente experiência foi avaliado o efeito do pH na solubilidade da solução de imunoglobulinas tratada com caprilato, com o objetivo de estabelecer um valor de pH adequado para iniciar sua ultrafiltração.

[0098] Para tanto, foi processado um lote de efluente de coluna obtido de acordo com o processo inicial descrito no Exemplo 1 até a obtenção da solução de imunoglobulinas tratada com caprilato 13 mM e clarificada.

[0099] Este intermediário, que constitui o material anterior à etapa de ultrafiltração, foi acidificado mediante a adição de ácido acético desde o pH do tratamento com caprilato (5,1) até valores de pH próximos de 4,5. Posteriormente, o aspecto e solubilidade da solução foi avaliado para cada um dos pHs avaliados e a geração de partículas coloidais foi quantificada por medição nefelométrica da turbidez.

[00100] Na tabela 5 estão mostrados os resultados obtidos de aspecto e turbidez obtidos para cada um dos pHs avaliados.

Tabela 5. Resultados de turbidez e aspecto visual obtidos para os diferentes pHs analisados no Exemplo 4.

pH	Turbidez (NTU)	Aspecto visual
5,1	5,6	Transparente
5,0	10,0	Transparente, cristais pequenos
4,8	32,5	Branco, cristais precipitados
4,6	53,0	Branco, cristais precipitados
4,4	57,1	Branco, cristais precipitados

[00101] Os resultados obtidos mostrados na Tabela 5 demostraram que com a acidificação da solução de imunoglobulinas tratada com 13

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32/45 mM de caprilato, a um pH de 5,0 foi observado o surgimento de um precipitado esbranquiçado, e um nítido aumento de turbidez. Este efeito muito provavelmente se deve à formação de ácido caprílico insolúvel na forma coloidal, o que tornaria inviável iniciar o processo de ultrafiltração a valores de pH inferiores a 5,0.

[00102] Os resultados obtidos mostraram que ao se submeter a solução purificada de imunoglobulinas a um tratamento com caprilato, na faixa de concentração eficaz para a inativação viral (entre 9-15mM de caprilato) e nas condições descritas anteriormente, é preferível que a etapa de ultrafiltração subsequente seja iniciada a um pH maior ou igual ao pH do tratamento de inativação viral, isto é, 5,1, com o objetivo de aumentar a concentração da forma ionizada e solúvel do caprilato, facilitando, portanto, sua permeabilidade através da membrana de ultrafiltração.

Exemplo 5. Efeito do teor de acetato na solução de diálise na redução do caprilato por ultrafiltração/diafiltração.

[00103] Foi realizada uma série de processos de ultrafiltração/diafiltração independentes entre si e na presença de diferentes concentrações de acetato na solução tampão utilizada para a diálise do produto.

[00104] O material de partida utilizado, denominado efluente concentrado e dialisado, é o mesmo que aquele do grupo B do Exemplo 3. O referido material de partida, com uma pureza do 98±2% de IgG, uma concentração de proteína de aproximadamente 40 mg/ml, e um teor de PEG de aproximadamente 0,6%, foi submetido a um tratamento com caprilato e em seguida foi submetido à ultrafiltração/diafiltração através de membranas de corte molecular nominal de aproximadamente 100 kDa.

[00105] A etapa de ultrafiltração/diafiltração aplicada compreendia uma primeira fase de concentração até aproximadamente 4% (p/v) de

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IgG, uma segunda fase de diálise contra oito volumes de solução de diálise e, finalmente, uma concentração até um valor de aproximadamente 9-10% (p/v) de IgGs.

[00106] A primeira das provas de ultrafiltração/diafiltração foi realizada com água para injeção, enquanto que as provas seguintes foram efetuadas utilizando-se soluções tampão com concentrações crescentes de acetato, mais concretamente 2, 5, 20 ou 50 mM de acetato, respectivamente, e a um pH ajustado entre 5,0 e 5,5 em todos os casos.

Tabela 6. Resultados obtidos para a etapa de ultrafiltração/diafiltração utilizando diferentes concentrações de acetato no tampão de diálise.

Concentração de acetato presente no tampão de diálise (mM)	Adição nominal de caprilato (mM)	Produto dialisado
		Caprilato no produto dialisado (mM)(1)	Permeabilidade do caprilato(2)
0	20	2,3	13,2
2	13	0,6	19,3
5	13	<0,2	32,8
20	13	<0,2	43,3
50	13	0,2	45,3

(1) Valores determinados depois de diálise contra 8 volumes de diálise (2) Permeabilidade calculada de acordo com a seguinte fórmula:

Número de Volumes de Diálise = ln (Cf/Co)/(R-1); onde Cf é a concentração depois de diálise com o número de diálise em questão; Co é a concentração antes da diálise e R é o coeficiente de retenção. [00107] Os resultados da Tabela 6 mostram como o processo de ultrafiltração/diafiltração através de membranas de aproximadamente 100 kDa de corte molecular, com a aplicação de 8 volumes de diálise de uma solução tampão com acetato, a um pH entre 5,0 e 5,5, e com

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34/45 uma concentração mínima de acetato em torno de 5 mM e pelo menos até 50 mM, resolve satisfatoriamente o objetivo de reduzir eficientemente o caprilato para níveis apropriados no produto final concentrado. [00108] Em contraste, quando a solução utilizada para a diálise foi água para injeção ou uma solução tampão com níveis de acetato de 2 mM, o caprilato não foi eficazmente eliminado no filtrado.

[00109] Fica claro que o processo de ultrafiltração/diafiltração através de membrana de aproximadamente 100 kDa de corte molecular, nas condições descritas anteriormente, é eficaz na redução do caprilato procedente do tratamento anterior, uma vez que foram detectados níveis corretos do referido reagente no produto final concentrado. Exemplo 6. Eliminação simultânea dos reagentes químicos (PEG e caprilato) mediante uma única etapa de ultrafiltração.

[00110] Um lote de IgGs foi processado de acordo com o processo descrito no Exemplo 1 até chegar à solução inativada com caprilato e clarificada. A referida solução, com uma concentração de proteína de aproximadamente 0.5% e um pH 5,1, foi processada através de um equipamento de ultrafiltração/diafiltração formado por membranas de polissulfona tipo Biomax® (Millipore, EUA), de 100 kDa de corte molecular. A ultrafiltração/diafiltração foi efetuada em duas fases distintas, tal como descrito no Exemplo 5.

[00111] Na primeira fase, efetuada a um pH de 5,1, 5,6 ou 5,8, o material foi submetido a etapas de diálise e concentração sequencial, mediante diafiltração contra no mínimo três volumes de solução tampão de acetato 5 mM ajustada a um pH de 5,1, 5,6 ou 5,8, e a proteína foi concentrada até um valor de aproximadamente 2%.

[00112] Na segunda fase, e uma vez que o teor de caprilato foi reduzido de aproximadamente uma décima parte, a solução foi levada até um pH 4,5 ± 0,1 ou 5,1. Posteriormente, o produto foi concentrado até uma concentração adequada de proteína e PEG para iniciar a diáli37/58

35/45 se, e a diálise foi iniciada mediante oito volumes de solução tampão de acetato 5 mM a um pH de 4,5 ou a um pH de 5,1.

[00113] Finalmente, o produto foi formulado mediante diálise contra seis volumes de solução de glicina a uma concentração 200 mM e com um pH de 4,2 e foi concentrado afim de obter uma solução de IgGs a 10%.

[00114] Na tabela 7 está mostrada a percentagem de passagem de PEG e de caprilato obtida no início de cada uma das fases da ultrafiltração/diafiltração e a diferentes pHs:

Tabela 7. Passagem de PEG e de caprilato nas duas fases da etapa de ultrafiltração/diafiltração aos diferentes pHs analisados.

Fase (Concentração de caprilato)	PH	Passagem de PEG (%)	Passagem de caprilato (%)
Início Fase I (13 mM)	5,1	17	74
	5,6	15	98
	5,8	15	100
Início Fase II (1 mM)	5,1	40	100
	4,5	82	97

[00115] Os resultados da Tabela 7 mostram que no inicio da etapa de ultrafiltração/diafiltração, na Fase I, o caprilato apresentou alguns valores de passagem muito elevados desde pH 5,1 e até pH 5,8. Estes valores levaram a uma redução muito elevada do caprilato durante a referida Fase I da etapa de ultrafiltração/diafiltração (foi obtida uma redução de caprilato de mais de 10 vezes em relação ao seu teor inicial). Ao contrário, a passagem de PEG foi muito discreta (<20%) na referida Fase I, deixando praticamente inviável sua eliminação total a um pH > 5 na presença de caprilato.

[00116] Por outro lado, na Fase II, tal como pode ser visto na Tabela 7, ficou comprovado que a passagem de PEG foi muito elevada a um pH de 4,5, com um valor do 82%. Adicionalmente, ficou comprovado que durante esta Fase II também o caprilato também foi reduzido

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36/45 uma vez que, no início da mesma, este se encontrava em um nível residual < 1mM, o que facilita que a passagem seja de praticamente 100%.

[00117] Na tabela 8 está detalhada a evolução da concentração de proteína, PEG e caprilato em cada uma das fases da etapa de ultrafiltração/diafiltração e na etapa final de formulação.

Tabela 8. Quantidade de PEG e caprilato (medidas por concentração e densidade ótica) na solução depois da etapa de inativação viral, as Fases I e II da etapa de ultrafiltração/diafiltração, a formulação a um pH de 4,2 e na solução final.

Fase/Etapa	PEG (mg/ml)	PEG (D.O. 280nm)	Caprilato (mM)	Caprilato (D.O. 280nm)
Solução inativada e clarificada	38	6,9	12	2,2
Solução ao final da Fase I da etapa de ultrafiltração/ diafiltração	45	1,8	0,9	0,04
Solução ao final da Fase II da etapa de ultrafiltração/ diafiltração	0,7	0,02	0,1	0,003
Solução formulada a um pH de 4,2	0,1	0,003	<0,1	<0,003
Solução final concentrada	0,1	0,001	<0,1	<0,001

[00118] De acordo com os valores encontrados para PEG e caprilato em cada etapa e fase e considerando a concentração de proteína de cada etapa, o fator de redução de PEG foi de 4 na Fase I (a um pH de 5,1) da etapa de ultrafiltração/diafiltração e de 90 na Fase II (a um pH de 4,5) da etapa de ultrafiltração/diafiltração, o que sugeriu um fator de redução total (Fase I e Fase II) de aproximadamente 350 vezes (uma absorvência de 6,9 inicial contra uma absorvência de 0,02 obtida ao final da etapa de ultrafiltração/diafiltração).

[00119] No caso do caprilato, o fator de redução foi de 55 na Fase I

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37/45 (a um pH de 5,1) da etapa de ultrafiltração/diafiltração e de 13 na Fase II (a um pH de 4,5) da etapa de ultrafiltração/diafiltração, o que sugeriu um fator de redução total (Fase I e Fase II) de aproximadamente 700 vezes (uma absorvência inicial de 2,2 contra uma absorvência de 0,003 obtida ao final da etapa de ultrafiltração/diafiltração).

[00120] Os resultados mostraram como foi possível reduzir eficientemente o reagente com capacidade de inativação viral (ácido caprílico ou caprilato) assim como o reagente de precipitação (PEG) mediante uma única etapa de ultrafiltração através de membrana de corte molecular nominal de aproximadamente 100 kDa, selecionando-se as condições físicas e químicas a serem aplicadas em cada fase da etapa de ultrafiltração/diafiltração (entre outros, pH, concentração de proteína, número de volumes de diálise, tampão de diálise) e dando lugar a um produto final de IgGs concentrado a 10% com algumas concentrações remanescentes de ambos os reagentes adequadas para uso intravenoso.

Exemplo 7. Avaliação da capacidade de inativação viral do tratamento com caprilato na presença de PEG.

[00121] Foram realizadas várias experiências independentes usando-se como material de partida o efluente de coluna ou então o efluente dialisado e concentrado (obtidos de acordo com os Exemplos 1 e 3, respectivamente) para avaliar a capacidade de eliminação ou inativação de vírus com envoltório lipídico de ácido caprílico ou caprilato na presença de PEG.

[00122] Ambos os materiais apresentaram uma pureza de imunoglobulina de 98±2%, uma concentração de proteína entre 5 e 10 mg/ml e um teor de PEG diferente entre si, de 40 mg/ml ou 1,5 mg/ml, respectivamente.

[00123] Foram realizados ensaios de inativação viral utilizando o vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV segundo suas siglas em inglês)

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38/45 da família Flaviviridae, de 40-60nm, com envoltório lipídico e com uma resistência média a agentes físico-químicos.

[00124] Em cada ensaio, o material de partida correspondente foi inoculado com o vírus à razão de um valor menor ou igual a 0.5% e foi submetido a um tratamento de inativação viral de duas horas e a uma temperatura de 15°C ou 25°C e com a aplicação de concentrações de caprilato de 9 mM ou de 13 mM.

[00125] A quantificação da carga viral de BVDV nas diferentes amostras geradas foi efetuada mediante o ensaio TCID50 (derivado do inglês, 50% Tissue Culture Infectious Dose) de infectividade em cultura celular utilizando-se a linhagem celular MBDK. O fator de redução viral (FR) da etapa de inativação viral foi determinado como o quociente entre a carga viral detectada no material de partida inoculado dividida pela quantidade de vírus detectada na amostra resultante ao final do tratamento, expresso em log10.

[00126] Na tabela 9 estão apresentadas as características do material de partida de cada ensaio, assim como o FR obtido.

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Tabela 9. Resultados da inativação viral observados nos ensaios de tratamento com caprilato com inóculo viral, na presença ou ausência de PEG

Grupo experimental	Material de partida	Temperatura de tratamento	Concentração de caprilato (mM)	Fator de redução viral (FR)
IgG (mg/ml)	PEG (mg/ml)	(°C)
Efluente dialisado e concentrado	10	1,5	25	9	> 4,19
> 4,36
13	> 3,95
> 4,13
Efluente de coluna	5	40	25	9	> 4,62
> 5,10
13	> 4,71
> 4,57
15	13	> 4,32
> 4,27

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40/45 [00127] Os resultados de redução viral obtidos em todos os ensaios (ver Tabela 9) mostraram uma elevada capacidade de inativação do BVDV em ambos os materiais de partida, inclusive para uma concentração mínima de caprilato de 9 mM, depois de tratamento a diferentes temperaturas (15 e 25°C). Além disso, estes ensaios revelaram que a qualquer das concentrações de PEG analisadas, não foi observada interferência por parte do PEG na capacidade de inativação viral do caprilato, uma vez que foram obtidos resultados equivalentes com ambos os materiais avaliados.

Exemplo 8. Caracterização da solução de imunoglobulina intravenosa obtida de acordo com o processo de obtenção da presente invenção.

[00128] Pretende-se estabelecer as características bioquímicas e de funcionalidade da solução de imunoglobulinas a 10% (p/v) de proteínas obtidas pelo processo da presente invenção.

[00129] Foram processados 2 lotes de efluente de coluna DEAE de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, até a obtenção da solução inativada de vírus com caprilato, a uma escala de aproximadamente 200 litros de plasma.

[00130] A solução com caprilato anterior, uma vez clarificada, foi dialisada e concentrada por ultrafiltração em fases distintas, tal como descrito no exemplo 6, com o objetivo de obter a eliminação dos principais remanescentes de processo (PEG e caprilato). Posteriormente, a referida solução purificada, e a uma concentração de proteína de aproximadamente 2,5%, foi formulada mediante diálise de volume constante contra aproximadamente 6 volumes de uma solução tampão composta por sorbitol 1% e glicina 240 mM, ajustada a um pH de 4,5±0,1. Finalmente, a referida solução foi concentrada por ultrafiltração e ajustada até uma densidade ideal de 140±5 UA (280 nm), equivalente a 10% (p/v) de proteínas e teve o pH ajustado em um pH final de 5,25±0,25.

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41/45 [00131] O produto obtido (IGIV a 10% (p/v)) estabilizado com sorbitol e glicina, e uma vez clarificado e filtrado através de membranas de grado esterilizante (0,22 pm), foi dosificado em frascos de vidro e tampa de clorobutila, sendo determinados os parâmetros analíticos mais relevantes da qualidade, inalterabilidade e estabilidade de uma solução de imunoglobulina para administração intravenosa. Os valores analíticos médios obtidos para os dois lotes, assim como os valores de especificações da Farmacopeia Europeia estão mostrados na Tabela 10.

Tabela 10. Caracterização da solução de imunoglobulinas intravenosas a 10% (p/v)

PARÂMETRO	PRODUTO OBTIDO PELO PROCESSO DA INVENÇÃO	ESPECIFICAÇÕES (Eur, Ph)
pH	5,25	4,0-7,4
Osmolalidade (mOsm/kg)	306	> 240
Sódio (mM)	<3,2	n.e.
Turbidez (NTU)	4,4	n.e.
Distribuição Molecular (%)
Polímero	<0,1	< 3,0
Dímero	7,6	Mon.+Dím._> 90
Monômero	92,5
Frações	<0,3
Subclasses IgG (%)
IgG1	66,7
IgG2	27,6	equivalente ao plasma
IgG3	3
IgG4	2,7
Integridade doFragmento Fc	93
Perfil de pureza:
Pureza Ig (ACE) (%)	99,6	> 95
IgM (mg/ml)	<0,002

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PARÂMETRO	PRODUTO OBTIDO PELO PROCESSO DA INVENÇÃO	ESPECIFICAÇÕES (Eur, Ph)
NAPTT (Dil 1/10) (s)	308
Fator XI ativado (ng/ml)	Não detectado
TGT FXI (nM Trombina)	<53
Título Isoglutininas
Anti- A	Aglutinação 1:16	Aglutinação
Anti- B	Aglutinação 1:16	< 1:64
Atividade Proteolítica	< 2	<35
PKA (UI/ml) ACA (CH50/mg)	0,6±0,07	< 1

Eur. Ph: Farmacopeia Europeia; n.e.: Não estabelecido;

TGT FXI: Teste de Geração de Trombina (mediante plasma deficiente em Fator IX); NAPTT PKA: Ativador de Precalicreína; ACA: Atividade Anticomplementar.

[00132] A partir dos resultados acima, destaca-se que o produto obtido permanece essencialmente inalterado como consequência do processo de purificação da presente invenção em termos de parâmetros tais como ausência de polímero, de atividade biológica indesejável como PKA ou ACA, entre outros, preservando algumas características de funcionalidade intactas em relação ao plasma tais como proporção de subclasses de IgG, integridade do fragmento Fc, e mostrando, por sua vez, um excelente perfil de pureza (baixo título de isohemaglutininas anti-A/anti-B, concentração de IgM, atividade prócoagulante, etc.).

[00133] Conclui-se que o processo global de obtenção de IGIV a 10% (p/v) da presente invenção, integrando a etapa de inativação viral com caprilato na presença de PEG e sua posterior separação, assim

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43/45 como a formulação final, é totalmente viável e escalável até o produto final formulado e concentrado como IGIV a 10% (p/v) de proteínas, dando lugar a um produto final que satisfaz perfeitamente com os valores estabelecidos em Farmacopeia Europeia.

[00134] Os estudos de estabilidade realizados, imprescindíveis para uma viabilidade comercial do produto, mostraram a idoneidade das formulações com sorbitol (até 5%), glicina (até a isotonia) ou combinação de ambas, na faixa de pH entre 4,2 e 6,0 para estabilizar soluções de imunoglobulina intravenosa a 10% (p/v) à temperatura ambiente (25°C-30°C) por dois anos.

Exemplo 9. Aplicabilidade do tratamento com caprilato a uma fração rica em IgG obtida por processos alternativos.

[00135] Foi avaliada a validade de aplicação do tratamento com caprilato, nas condições descritas na presente invenção, sobre outros intermediários de processo obtidos mediante processos de purificação alternativos.

[00136] Foram realizadas duas experiências independentes usandose como material de partida um intermediário plasmático rico em IgG, a chamada suspensão de Fração II do fracionamento etanólico de Cohn-Oncley.

[00137] O referido intermediário foi obtido pelo mesmo processo de fracionamento plasmático descrito na presente invenção até a Fração II+III. Posteriormente, o processo continuou com a reprecipitação alcoólica da suspensão de extração da Fração II+III, procedendo-se em seguida à separação da Fração III, sendo finalmente obtida a Fração II, com uma pureza superior a 96%. A suspensão da referida Fração II, uma vez purificada com bentonita e dialisada contra água para eliminar o teor de álcool, constituiu o material de partida dessas experiências. [00138] Nas duas experiências realizadas, o material procedente de dois lotes plasmáticos foi dividido em dois grupos diferentes, A e B, em

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44/45 função de seu teor de PEG. No grupo B, o material de partida foi levado até uma concentração nominal de 40 mg/ml de PEG, por adição de uma solução concentrada de PEG-4000.

[00139] Posteriormente, ambos os materiais procedentes de ambos os grupos (A e B) foram diluídos até uma concentração de proteína de aproximadamente 5 mg/ml, tiver o pH ajustado em um valor de pH 5,1, e foram submetidos a um tratamento com caprilato até uma concentração nominal de 13 mM, e a um pH entre 5,0 e 5,2, tal como descrito no método da invenção.

[00140] Na tabela 11 estão apresentadas as principais características do material de partida utilizado em ambos os grupos de ensaio (A e B, respectivamente), assim como as características do material gerado depois do tratamento com caprilato.

Tabela 11. Principais características do material de partida utilizado nos grupos A e B e do produto final obtido nos mesmos. A pureza da solução inicial de imunoglobulinas é de 99,6 ± 0,6% (n = 5 lotes)

grupo experimental	Solução anterior ao tratamento com caprilato:	Solução tratada com caprilato (2 horas a 25°C):
	PEG (mg/ml) (1)	D.O. 280nm (UA)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)	D.O. 280nm (UA)	Turbidez (NTU)	Agregados, Polímero (%)	Caprilato. (Mm) (1)
	<0,01	6,9	3,3	<0,1	7,0	10,1	0,5	11,2
<0,01	6,9	3,0	<0,1	7,1	16,5	1,2	11,2
	34,1	7,1	2,5	<0,1	7,2	14,5	0,1	11,9
33,6	6,9	3,0	<0,1	7,2	14,4	<0,1	12,4

(1) os valores de PEG e caprilato correspondem ao valor obtido mediante determinação analítica.) [00141] Os resultados constatam a viabilidade do tratamento de inativação com caprilato nas condições especificadas, sobre uma solução de imunoglobulina suficientemente purificada por diferentes processos, não sendo induzida formação alguma de agregados de imunoglobulina ou outros precipitados irreversíveis, o que facilita enormemente o pro47/58

45/45 cesso de purificação posterior.

[00142] Os resultados revelam que, em combinação com uma suficiente diluição da proteína e um grau de pureza suficiente, se observa o efeito protetor do PEG sobre a geração de polímeros de imunoglobulina.

[00143] Este exemplo experimental deixa clara a viabilidade do uso do caprilato unicamente como reagente com capacidade de inativação viral em condições não precipitantes e/ou promotoras de agregação quando este é adicionado a um material com pureza suficiente e com as condições especificadas quanto à concentração de proteína e de PEG sendo satisfeitas.

[00144] Embora a invenção tenha sido apresentada e descrita com referência a modalidades da mesma, ficará compreendido que estas não são limitativas da invenção, uma vez que é possível alterar múltiplos detalhes de construção ou outros que podem mostrar-se evidentes para os especialistas na técnica depois de interpretarem a matéria que divulgada na presente descrição, reivindicações e desenhos. Por conseguinte, todas as variantes e equivalentes considerados compreendidos dentro do âmbito mais amplo das reivindicações que se seguem estão incluídos no alcance da presente invenção.

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Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de preparação de uma solução de imunoglobulinas a partir de uma solução inicial de imunoglobulinas com uma pureza maior ou igual a 96% na presença de um poliéter ou polímero de glicol, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) adicionar ácido caprílico ou sais do mesmo à solução inicial;

   b) ajustar o pH da solução obtida na etapa a);

   c) incubar a solução obtida na etapa b) durante um tempo e uma temperatura necessários para a inativação de vírus com envoltório; e

   d) realizar uma etapa de ultrafiltração/diafiltração da solução obtida na etapa c).
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapa de formulação final da solução de imunoglobulinas obtida na etapa d).
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a solução inicial de imunoglobulinas é oriunda da fração I+II+III, da fração II+III ou da fração II, obtidas de acordo com o método de Cohn, ou de Cohn-Oncley, ou do precipitado A ou I+A ou GG obtidos pelo método de Kistler-Nitschmann ou variações dos mesmos, que foram adicionalmente purificadas até ser obtida uma pureza maior ou igual a 96% de IgG.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a solução inicial de imunoglobulinas é oriunda da fração II+III do método de Cohn, ou variações da mesma, que foi posteriormente purificada mediante precipitação com PEG e cromatografia aniônica.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução inicial de imuno49/58

   2/4 globulinas apresenta uma concentração de imunoglobulinas entre 1 e 10 mg/ml.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução inicial de imunoglobulinas apresenta uma concentração de imunoglobulinas entre 3 e 7 mg/ml.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o poliéter ou polímero de glicol é selecionado dentre polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG) ou combinações dos mesmos.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração de PEG na solução inicial varia entre 2% e 6% (p/v).
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração de PEG na solução inicial está entre 3% e 5% (p/v).
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o PEG é PEG de 4000 Da de massa molecular nominal.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que na etapa a) ácido caprílico ou sais do mesmo são acrescentados até uma concentração de 9 a 15 mM.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que na etapa b) a solução obtida tem o pH ajustado entre 5,0 e 5,2.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa b) a solução obtida tem o pH ajustado em um pH de 5,1.
14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que na etapa c) a solução é in50/58

    3/4 cubada por menos 10 minutos a uma temperatura entre 2°C e 37°C.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que na etapa c) a solução é incubada durante 2 horas a uma temperatura entre 20°C e 30°C.
16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a solução inicial de imunoglobulinas tem um teor de albumina menor ou igual a 1% (p/v) com relação à proteína total.
17. 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a solução inicial de imunoglobulinas é proveniente de plasma humano.
18. 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que as imunoglobulinas da solução inicial de imunoglobulinas são obtidas por métodos de genética recombinante, métodos de síntese química ou métodos de produção transgênica da proteína ou em culturas celulares.
19. 19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a etapa d) de ultrafiltração/diafiltração é realizada através de uma membrana de 100 kDa.
20. 20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a etapa d) de ultrafiltração/diafiltração é realizada em duas fases:

    - uma primeira fase na que o pH é ajustado entre 5,0 e 6,0 para reduzir ou eliminar principalmente o caprilato;

    - e uma segunda fase na qual o pH é ajustado a um valor inferior ou igual a 5,0, para reduzir ou eliminar principalmente o poliéter ou polímero de glicol.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que na segunda fase da etapa d) de ultrafiltração/diafiltração o pH é ajustado entre 4,0 e 5,0.

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22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa de formulação final são adicionados excipientes e/ou estabilizantes selecionados dentre um ou mais aminoácidos, um ou mais carboidratos ou polióis ou combinações dos mesmos.
23. 23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a concentração final de imunoglobulinas é ajustada em uma concentração adequada para uso intravenoso, intramuscular ou subcutâneo.
24. 24. Uso do ácido caprílico ou sais do mesmo na presença de pelo menos um poliéter ou polímero de glicol, caracterizado pelo fato de que é para a inativação viral em processos de obtenção de imunoglobulinas no qual o referido poliéter ou polímero de glicol e o ácido caprílico ou sais do mesmo são posteriormente eliminados mediante ultrafiltração.

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