JP5042817B2

JP5042817B2 - ウイルス安全精製抗体調製物を提供する方法

Info

Publication number: JP5042817B2
Application number: JP2007500224A
Authority: JP
Inventors: ブーチヤチヤー，アンドレア; イーベラー，ギユンター; レーミツシユ，ユルゲン
Original assignee: オクタフアルマ・アー・ゲー
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: CA2557229A1; BRPI0508096A; CN1922207B; DK1718675T3; BRPI0508096B8; US20070173638A1; KR20060131920A; US7553938B2; RU2337109C2; WO2005082937A3; ES2407380T5; IL177541A; NO20063784L; PT1718675E; CN1922207A; KR101206788B1; WO2005082937A2; AU2005217148B2; BRPI0508096B1; RU2006134285A

Description

本発明は、抗体と汚染物質とを含む出発溶液からウイルス精製安全抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄｖｉｒｕｓｓａｆｅａｎｔｉｂｏｄｙ）調製物を調製する方法に関する。本発明は、ヒト血しょうなどから得られたガンマ−グロブリンの精製プロセスを記述する。ウイルス不活性化及び除去段階は、本明細書に記載の製造プロセスに含まれる。

沈殿及び生成したウイルスの除去／不活性化
１９４０年代、Ｃｏｈｎ等はヒト血しょうの冷エタノール分画を導入した。このスキームのいくつかの変形によって、さまざまな中間体の純度及び／又は収率が増加するようになった。Ｃｏｈｎ分画においては、一部の段階は、ウイルス不活性化及び除去に効率的に寄与することが確認された。ＩｇＧプロセスにおいては、特に、ＣｏｈｎＩ＋ＩＩＩ画分の分離はこの点できわめて有効である。いくつかの感受性ウイルス（主にエンベロープに包まれたウイルス）は、低ｐＨ及びＥｔＯＨの存在によって破壊され、エンベロープに包まれたウイルス及びエンベロープに包まれていないウイルスの大部分は、通常廃棄される沈殿物Ｉ＋ＩＩＩにおける分割によって除去される。

１９６０年代、短鎖脂肪酸（Ｃ６−Ｃ１２）がα及びβ−グロブリンと不溶性複合体を形成する一方で、γ−グロブリンが容易に沈澱しないことが示された（Ｃｈａｎｕｔｉｎｅｔａｌ．，１９６０）。Ｓｔｅｉｎｂｒｕｃｈ等（１９９６）は、沈殿剤としてカプリル酸塩（すなわちオクタン酸塩、Ｃ８飽和脂肪酸）を用いたＩｇＧ富化プロセスを記述した。非免疫グロブリンは、酢酸緩衝剤で希釈して最終ｐＨ４．８に達するとヒト血しょうから沈澱した。激しく撹拌しながらカプリル酸塩を添加すると、ＩｇＧ濃縮溶液が得られた。純度及び収率は、カプリル酸量、ｐＨ、緩衝剤のモル濃度及び希釈係数に依存した。Ｓｔｅｉｎｂｒｕｃｈ等は、カプリル酸塩の有効量を、沈殿物の除去を間に挟んで２段階で添加することが有利であるとも述べた。エンベロープに包まれていないウイルス及びエンベロープに包まれたウイルスは、Ｉ＋ＩＩＩ画分を分離する場合と同様に、非ＩｇＧタンパク質の沈殿物における分割によって除去される。

クロマトグラフィー
いくつかの特許は、いわゆるネガティブモードのＩｇＧ溶液精製を記載している。非ＩｇＧ画分タンパク質の大部分は、ＩｇＧは（ほんのごく微量しか）結合せずに通過するのに対して、陰イオン性リガンドに結合する（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉｅｔａｌ．１９９８、国際公開第９８／０５６８６号；Ｌｅｂｉｎｇ１９９９，ＵＳ−Ａ−５，８８６，１５４；Ｆｒｉｅｓｅｎｅｔａｌ．，１９８６，ＣＡ１２０１０６３）。ＩｇＧを精製するための、カプリル酸塩沈殿とそれに続くイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせが、多数の刊行物に記載された。初期の１つは、Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ等（１９６９）によって記述された。彼は、ＤＥＡＥ−セルロースを用いたカプリル酸塩沈殿後のＩｇＧのさらなる精製を記述した。Ｌｅｂｉｎｇ等（２００３）による最近の刊行物は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、アルブミン及び他の不純物を除去するために連結して使用される２本の陰イオン交換カラムを記述している。Ｌｅｂｉｎｇ等は、カプリル酸塩によって媒介される効果、すなわち沈殿とそれによるウイルス分割（ｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）を用いた非ＩｇＧタンパク質の本質的な削減と、別個のインキュベーション段階における、エンベロープに包まれたウイルスの脂肪酸による不活性化特性とを組み合わせた。ペースト／沈殿物を含むＩｇＧのｐＨ４．２における再構成に始まり、続いてｐＨ５．２に調節後、カプリル酸塩を添加する、いわゆる「ｐＨスイング」Ｌｅｂｉｎｇｅｔａｌ．（２００３）の重要性は、ＩｇＧ濃縮手順に必須であり、したがって非ＩｇＧタンパク質を効果的に削減するのに必要であることが強調されている。続いて、ＩｇＡ及びＩｇＭのような少数の他の不純物並びにカプリル酸塩は、前記イオン交換クロマトグラフィー段階によって削減された。

驚くべきことに、本発明者らは、上で概説されＬｅｂｉｎｇ等によって記述されたｐＨシフトが、カプリル酸塩添加によるかなりの精製効果及び生成した沈殿物の除去を達成するのに不要であることを見出した。その代わり、ペーストの再構成及びカプリル酸塩インキュベーション及び沈殿物除去のプロセス全体を通してｐＨをｐＨ４．６から４．９５で一定に維持すると、有効なＩｇＧ富化が達成される。また、不純物、特にアルブミンの量は、ｐＨを４．８から４．９５の範囲で一定に維持することによって、より効率的に削減される。同時にウイルスも除去される。その後、残留不純物及びカプリル酸塩は、イオン交換段階で分離される。

古典的なウイルス不活性化
溶媒洗浄剤及びｐＨ４処理は、周知の方法であり、免疫グロブリンに対して広く用いられている。ＳＤ処理は、エンベロープに包まれたウイルスを不活性化する点で優れているので、通常、これらのプロセスに導入される（ＢｉｅｓｅｒｔＬ．ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ１９９６；１４：４７）。エンベロープに包まれたウイルスとエンベロープに包まれていないウイルスのどちらも低ｐＨ暴露の影響を受けるが、エンベロープに包まれたウイルスは、エンベロープに包まれていないウイルスよりも影響を受ける（Ｂｉｅｓｅｒｔ．ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ１９９６；１４：４７、Ｂｏｓｅｔａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ１９９８；２６：２６７、ＩｎＳｅｏｐｅｔａｌ．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００１；１１：６１９）。

ＥＰ−Ａ−０５２５５０２には、ウイルス不活性化段階として溶媒洗浄剤とｐＨ４インキュベーションとの組み合わせが記載されている。

ウイルスろ過
ＩｇＧ溶液は、ウイルスに対する安全性を高めるために、主としてサイズ排除に基づく機序によってウイルスを保持する条件下で、きわめて小さな孔径（一般に１５から５０ｎｍ）の膜によってろ過される（ＢｕｒｎｏｕｆａｎｄＲａｄｏｓｅｖｉｃｈ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ２００３；９：２４）。イオン交換吸着によってウイルスを保持するように設計されたデプスフィルターも、免疫グロブリンのろ過に使用される。

発明の要旨
本発明は、古典的Ｃｏｈｎ−Ｏｎｃｌｙ分画プロセスよりも収率が高く、プロセス時間が短いＩｇＧ精製プロセスを記述する。ＩｇＧは、４．６０から４．９５、優先的に４．９の酸性ｐＨ範囲において緩衝剤で再構成される。非ＩｇＧタンパク質は、１０から３０ｍＭカプリル酸塩、好ましくは２０ｍＭの濃度範囲のカプリル酸塩を用いた２つのインキュベーション段階によって分離される。

エンベロープに包まれたウイルスを有効に不活性化するために、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０など及びＴＮＢＰを用いた溶媒洗浄剤処理として知られるインキュベーションを追加して、プロセス全体のウイルス不活性化能力を増強することができる。ろ過、ｉ．ｐ．いわゆるナノろ過又は荷電デプスフィルターによるウイルス除去をウイルス除去手順に追加することができる。また、ＵＶＣ処理は、前記処理と組み合わせても実施することができる。かかる処理は、例えば、ＥＰ−Ａ−０８４０６２４又はＥＰ−Ａ−０４２２００７に記載されている。

また、カプリル酸塩／カプリル酸は、ヘプタン酸塩／ヘプタン酸と組み合わせて、又はヘプタン酸塩／ヘプタン酸で置換して、上述の沈殿及びインキュベーションプロセス段階を実施することができる。

本発明による方法によって得ることができる生成物は、ウイルス不活性化されている。プリオンもカプリル酸塩処理によって不活性化／除去される。

発明の詳細な説明
本発明は、
（ａ）出発溶液のｐＨを約４．６から約４．９５、特に約４．８から約４．９５に調節して、中間体溶液を製造する段階と、
（ｂ）カプリル酸イオン及び／又はヘプタン酸イオンを前記中間体溶液に添加し、ｐＨを約４．６から約４．９５、特に約４．８から約４．９５に維持し、それによって沈殿物が形成され、抗体がその上清中に本質的に存在する段階と、
（ｃ）ｐＨ調節前にろ過溶液を場合によっては濃縮及び透析ろ過してもよい、カプリル酸イオン及び／又はヘプタン酸イオン濃度、時間、ｐＨ及び温度の条件下で前記上清溶液をインキュベートする段階と、
（ｄ）前記ろ過溶液に（場合によっては２種類の異なる陰イオン交換樹脂でもよい）少なくとも１種類の陰イオン交換樹脂を、汚染物質が該樹脂に結合可能であるが、前記抗体が該樹脂にさほど結合しない条件下で適用し、ウイルス不活性化及びウイルス安全精製抗体調製物が生成される段階と
を含む、抗体と汚染物質とを含む出発溶液からウイルス不活性化及びウイルス安全精製抗体調製物を調製する方法に関する。

本発明の一実施形態においては、ウイルス不活性化溶液は、段階（ｄ）において、少なくとも１種類の陰イオン交換樹脂と約５．０から５．２のｐＨで接触される。陰イオン交換体クロマトグラフィーが２回実施される場合には、第２のクロマトグラフィーを６．７から６．９のｐＨ範囲で実施することができる。場合によっては、段階（ｂ）と（ｃ）を少なくとも１回繰り返してもよい。ｐＨ４．９でカプリル酸塩処理すると、望ましくないタンパク質は激減する。

一般に、出発溶液は、血しょう由来の抗体を含む。

段階（ｄ）において、不活性化溶液は、汚染物質は該樹脂に選択的に結合するが抗体は該樹脂にさほど結合しない条件下で、２種類の異なる陰イオン交換樹脂と接触されることが有利であり得る。

抗体は免疫グロブリンＧ−タイプであることが好ましい。

２回の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）段階の間にｐＨを特に６．８±０．１に変更することができる。ＡＥＸフロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）は、６０から９０ｍｇ／ｍｌに濃縮され、例えばリン酸緩衝液で透析ろ過される。本発明による方法の別の実施形態において、第１のＡＥＸのフロースルーは、脂質で覆われたウイルスを不活性化するために、好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｎＢＰ、好ましくは１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．３％ＴｎＢＰの濃度で４．５から８時間溶媒洗浄剤処理される。本方法は、溶媒−洗浄剤−処理として知られ、（参照により本明細書に組み込む）ＥＰ−Ａ−０１３１７４０に開示されている。本発明によれば、インキュベーション混合物の洗浄剤は、特に固相及び液相抽出によって除去される。固相抽出後、本溶液のｐＨは６．７から６．９に調節される。Ｓ／Ｄ処理とカプリル酸塩ウイルス不活性化との組み合わせによってより安全な生成物がもたらされる。

こうして調節された溶液は、２回目のＡＥＸカラムにかけることができる。ここで、ＡＥＸフロースルーは、例えば３．５から４．５、特に４．０±０．１にｐＨ調節することができる。本発明によれば、ｐＨ調節されたＩｇＧ溶液はウイルスフィルターと接触される。この任意に選択される段階は、カプリル酸塩処理と相まってより高いウイルス安全性をもたらす。

ＩｇＧ溶液は、３７℃±１で少なくとも２４時間インキュベートすることもできる。抗体産物のウイルス安全性を改善するために、ＵＶ−Ｃ処理を抗体含有画分のカプリル酸塩処理と組み合わせることができる。ＴｎＢＰ処理、ＵＶ−Ｃ処理、ウイルスろ過、加熱などの単独又は併用不活性化方法を本発明のプロセスと組み合わせることができる。

本発明による方法は、プリオンの除去又は不活性化方法、例えば、従来技術、例えばＥＰ−Ａ−０９５４５２８、Ｔｒｅｊｏ，Ｓ．Ｒ．ｅｔａｌ．，ＶｏｘＳａｎｇｕｉｎｉｓ，（２００３）８４，１７６−１８７に開示されたろ過法、吸着法又はクロマトグラフィー法と組み合わせることができる。本発明に従って得られたＩｇＧ溶液は、意図する治療用途のために一般に５又は１０％の濃度に濃縮され、濃縮物のモル浸透圧濃度は、適切な添加剤によって２００から４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに調節される。しかし、薬剤として許容される限り、任意の他の値も可能である。かかる添加剤は、専門家に周知であり、糖、糖アルコール、アミノ酸などが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＩｇＧ溶液は、３．５から６．０、特に４．０から５．５にｐＨ調節することができる。最後に、ＩｇＧ溶液は無菌ろ過され、ガラスビン又はプラスチック容器に充填される。或いは、第１又は第２のＡＥＸ段階後のフロースルーは、ナノフィルターにかけられさらに安全な生成物にされる。

本発明のプロセスは、より詳細に説明され、概説されたように優先的に実施される。

出発材料として、ヒト血しょう画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ又は画分ＩＩ＋ＩＩＩが使用された。これらの画分はＣｏｈｎ等（１９４６）によって記述されたとおりに生成された。プロセス中のｐＨ調節は、１Ｍ酢酸、０．１ＭＮａＯＨ又は０．３ＭＨＣｌを用いて実施された。カプリル酸塩は、１Ｍカプリル酸ナトリウム原液として添加された。この原液は、カプリル酸ナトリウム１６６ｇを注射用水（ＷＦＩ）１リットルに溶解し、カプリル酸ナトリウムが全部溶解するまで撹拌することによって調製された。

ＳＤ処理の例示としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｎＢＰが使用された。ＳＤ試薬を除去するために、ダイズ油、ヒマシ油などの植物油が使用された。

試薬は、ＵＳＰグレード以上であった。

定量サイズ排除クロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡを使用してＩｇＧ濃度を測定した。分析ＨＰＬＣは、ＴｏｓｏＨａａｓＧ３０００ＳＷカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔＨＰＬＣＳｙｓｔｅｍを用いて実施された。

プロセスの概略図を図１に示す。このプロセスは、ペーストと呼ばれるＩｇＧ沈殿物を精製水に溶解することによって開始される。通常、ペーストを再構成する水の体積が大きいほどＩｇＧの収率は高くなる。溶液のｐＨは、１Ｍ酢酸を用いて４．６０から４．９５、好ましくは４．９０に調節される。この溶液は、溶液状態のＩｇＧをできるだけ得るために数時間撹拌される。その後、カプリル酸塩が、濃度１０から３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭカプリル酸塩まで１Ｍ原液として添加される。カプリル酸塩添加中のｐＨは４．８０から４．９５、好ましくは４．９０一定に維持される。ＩｇＧ溶液をカプリル酸塩と一緒にインキュベーション中に非ＩｇＧタンパク質及び脂質が沈澱する。形成された沈殿物は、ＩｇＧ溶液からろ過除去される。第１の沈殿段階後、一部の不純物はＩｇＧ溶液中に残留する。したがって、第２のカプリル酸塩処理が必要である。第１の段階同様、カプリル酸塩は、４．８０から４．９５、好ましくは４．９の一定ｐＨにおいて約２０ｍＭカプリル酸塩溶液の濃度まで１Ｍ原液として添加される。インキュベーション後、沈殿物はろ過除去され、又は遠心分離される。ろ過中の作業性を改善するためにろ過助剤が使用される。ろ過溶液は、ｐＨ５．０から５．２、好ましくは５．１に調節され、陰イオン交換カラムにかけられる。陰イオン交換カラムとしては、好ましくはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＸＬ、ＳｏｕｒｃｅＱ１５又は３０（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｑ−Ｔｈｒｕｐｕｔ、Ｑ−Ｔｈｒｕｐｕｔｐｌｕｓ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐＱ及びＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＱ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＱＨｙｐｅｒＤ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）、ＰｏｒｏｓＨＱ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの強陰イオン交換体が選択された。

ＩｇＧは、選択された条件下でカラムを通過するのに対して、カプリル酸塩、ＩｇＡなどの一部の添加剤／不純物は樹脂に結合する。タンパク質溶液は、４０から１２０ｍｇ、特に４０から９０ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂の比でカラムに充填される。得られたフロースルーは６０から９０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に濃縮され、５から２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭリン酸ナトリウム濃度のリン酸緩衝液５体積で透析ろ過される。任意選択のウイルス不活性化段階として、透析ろ過後にＳＤ処理を選択することができる。次いで、透析ろ過溶液は、Ｈｏｒｏｗｉｔｚによって例えばＥＰ−Ａ−０１３１７４０に記載されたＳＤ処理を用いてウイルス不活性化される。ＳＤ試薬として、ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００が使用された。撹拌後、この溶液は温度４から１０℃で最高８時間インキュベートされる。次いで、ダイズ油又はヒマシ油などの植物油、好ましくはヒマシ油が最高３から５％（ｗ／ｗ）の濃度まで溶液に添加される。油相が水相から分離された後、水相がろ過される。したがって、適切なデプスフィルターが使用される。これらのフィルターの例は、ＰｏｌｙｓｅｐＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳａｒｔｏｆｉｎｅＰＰ及びＳａｒｔｏｂｒａｎＰ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）である。後続の固相抽出は、シリカ、スチレン−コ−ジビニルベンゼン（ＳＤＶＢ）、メタクリル酸グリシジル−コ−ジメタクリル酸エチレン又は多環芳香族でできたゲルマトリックスを備えた逆相クロマトグラフィーにおいても使用される疎水性支持媒体を用いて好ましい形式で実施される。これらの媒体の例は、μＢｏｎｄａｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−１６１Ｍ及びＳ，ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−０７０（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｅｐ）、ＰＬＲＰ−Ｓ（ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＲＰＣ−１及びＴｏｙｏｐｅａｒｌＨｅｘｙｌ６５０Ｃ（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｅｐ）、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐＳｉ６０（Ｍｅｒｃｋ）、ＣｈｒｏｍａｂｏｎｄＳｏｒｂｅｎｔＨＲ−Ｐ及びＥＡＳＹ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）、ＰｒｏｎｔｏＳＯＲＢＳＰＥ（ＢｉｓｃｈｏｆｆＣｈｒｏｍ．）である。タンパク質溶液は、０．５から１．５ｍｇ／ｍｌ乾燥樹脂の比でカラムに充填される。固相抽出（又はクロマトグラフィー段階、それぞれ）のフロースルーは、ＵＶＣ処理され、次いで０．１ＭＮａＯＨを温度４から１０℃で添加することによってｐＨ６．７から６．９、好ましくは６．８に調節される。その後、ＩｇＧ溶液は第２の陰イオン交換カラムにかけられる。ＩｇＧは、保持されずにカラムを通過するのに対して、不純物及びポリマーはカラムと結合する。陰イオン交換カラムとしては、好ましくはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＸＬ、ＳｏｕｒｃｅＱ１５又は３０（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｑ−Ｔｈｒｕｐｕｔ、Ｑ−Ｔｈｒｕｐｕｔｐｌｕｓ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐＱ及びＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＱ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＱＨｙｐｅｒＤ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）、ＰｏｒｏｓＨＱ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの強陰イオン交換体が選択された。カラムは、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液と平衡にある。ＩｇＧ溶液を流通させた後、カラムを平衡緩衝剤で洗浄して、カラムからすべての非結合ＩｇＧを得る。タンパク質溶液は、１２０から３００ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂の比でカラムに充填される。収集されたＩｇＧ溶液は、０．３ＭＨＣｌを用いて温度４から１０℃でｐＨ３．９から４．１、好ましくは４．０に調節される。次いで、溶液は無菌ろ過され、３７℃で少なくとも２４時間保存される。低ｐＨ処理に続いて、溶液のｐＨは、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度４から１０℃で４．７に調節される。追加のウイルス削減段階として、適切なウイルスフィルターを使用することができる。ウイルスろ過の場合には、ＩｇＧ溶液は０．１μｍフィルター、続いて孔径２００から１５ｎｍのウイルスフィルターを通してろ過された。これらのフィルターの例は、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（Ｐａｌｌ）、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＮＦＰ、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＮＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ７５、３５、２０、１５Ｎ（ＡｓａｈｉＫａｓｅｉＰｈａｒｍａ）である。ＺｅｔａＰｌｕｓＶＲ（Ｃｕｎｏ）のような荷電デプスフィルターも使用することができる。このろ過段階は、ｐＨ４インキュベーション後に適用することもできる。この段階は、低ｐＨ処理後のプロセスにおいて実施されることが好ましい。高度に精製されたＩｇＧ溶液は、透析ろ過され、最終処方値に濃縮される。液体処方タンパク質濃度の最終濃度として５又は１０％（ｗ／ｖ）が選択された。濃縮後、モル浸透圧濃度は、適切な添加剤によって静脈内注射に適合するように調節される。糖、糖アルコール及びアミノ酸を使用することができる。ｐＨは再検査され、４．５から５．０、好ましくは４．７に調節される。続いて、別の無菌ろ過が実施され、溶液は注入ビンに充填される。

以下の例によって発明のプロセスをより詳細に説明する。

Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ又はＩＩ＋ＩＩＩを水１２体積に溶解し、１Ｍ酢酸を用いてｐＨを４．９に調節し、ＩｇＧの大部分が溶解するまで溶液を温度２から８℃で最高５時間撹拌した。その後、カプリル酸塩は、１Ｍ酢酸を添加してｐＨを４．９一定に維持しながら、１Ｍカプリル酸ナトリウム原液として、２０ｍＭカプリル酸塩濃度までＩｇＧ溶液に添加された。この溶液を１時間撹拌した。これらの条件下で沈澱した脂質及び不純物は、ろ過除去された。その後、ｐＨを４．９一定に維持しながら、カプリル酸塩をその溶液に２０ｍＭ濃度まで再度添加した。再度、沈殿が生成し、この沈殿はろ過除去された。ろ過後、透明溶液が得られた。この溶液は、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃でｐＨ５．１に調節され、ＳｏｕｒｃｅＱ３０カラムにかけられた。ＩｇＧ溶液はカラムを通過したのに対して、不純物及びカプリル酸塩はカラムと結合した。収集されたＩｇＧ溶液は、タンパク質濃度７０ｍｇ／ｍｌに濃縮され、リン酸緩衝液ｐＨ５．１５体積で透析ろ過された。続いて、ＴｎＢＰ０．３％（ｗ／ｗ）及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００１％（ｗ／ｗ）を溶液に添加し、続いて激しく撹拌した。７±３℃で少なくとも４．５時間撹拌後、ヒマシ油５％（ｗ／ｗ）を添加する。油抽出は、室温で実施された。油相と水相は分離され、水相はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＯｐｔｉｃａｐＰｏｌｙｓｅｐフィルターでろ過された。ろ過溶液は、μＢｏｎｄａｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）と称する逆相マトリックスが充填されたカラムにかけられた。次いで、溶液は、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃でｐＨ６．８に調節され、強陰イオン交換体、すなわちＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＸＬにかけられた。ＩｇＧはカラムを通過したのに対し、不純物はカラムと結合した。収集されたＩｇＧ溶液のｐＨは、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃で４．７に調節された。再度、限外ろ過が実施されて、タンパク質濃度が最終濃度５０又は１００ｍｇ／ｍｌに調節され、続いてマルトースが濃度範囲２から１０％（重量）、好ましくは８％まで添加され、又は濃度範囲０．１から０．５Ｍ、特に０．１から０．３、好ましくは０．３Ｍ、特に０．２のグリシンが添加された。その後の無菌ろ過に続いて、溶液は、異なる体積（５０、１００、２００ｍｌ）のシリコン処理滅菌注入ビンに充填された。ビンは、栓をして密封された。

この実施例は、特に、ｐＨ４インキュベーション段階を実施する点で実施例１と異なる。Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ又はＩＩ＋ＩＩＩを水１２体積に溶解し、ｐＨを１Ｍ酢酸で４．９に調節し、ＩｇＧの大部分が溶解するまで溶液を温度２から８℃で５時間まで撹拌した。その後、カプリル酸塩が、１Ｍカプリル酸ナトリウム原液として、２０ｍＭカプリル酸塩溶液濃度までＩｇＧ溶液に添加され、ｐＨは、１Ｍ酢酸を添加することによって４．９一定に維持された。この溶液を１時間撹拌した。脂質及び不純物は、この環境下で沈澱し、ろ過除去された。その後、ｐＨを４．９一定に維持しながら、カプリル酸塩をその溶液に２０ｍＭ濃度まで再度添加した。再度、形成された沈殿物はろ過除去された。ろ過後、透明溶液が得られた。収集されたＩｇＧ溶液は、タンパク質濃度７０ｍｇ／ｍｌに濃縮され、リン酸緩衝液ｐＨ５．１５体積で透析ろ過された。溶液は、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃でｐＨ５．１に調節され、強陰イオン交換体Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＸＬにかけられた。ＩｇＧはカラムを通過したのに対して、不純物及びカプリル酸塩はカラムと結合した。続いて、ＴｎＢＰ０．３％（ｗ／ｗ）及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００１％（ｗ／ｗ）をこの溶液に添加し、続いて激しく撹拌した。４から１０℃で少なくとも４．５時間撹拌後、ヒマシ油５％（ｗ／ｗ）を添加した。油抽出は、室温で実施された。油相と水相は分離され、水相はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＯｐｔｉｃａｐＰｏｌｙｓｅｐフィルターでろ過された。ろ過溶液は、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ−１６１Ｍが充填されたカラムにかけられた。次いで、溶液は、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃でｐＨ６．８に調節され、強陰イオン交換体Ｑ−ＨｙｐｅｒＤにかけられた。ＩｇＧはカラムを通過したのに対し、不純物はカラムと結合した。収集されたＩｇＧ溶液のｐＨは、０．３ＭＨＣｌを用いて温度７±３℃で４．０に調節された。溶液は、無菌ろ過され、３７±３℃で少なくとも２４時間保存された。その後、溶液のｐＨは、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃で４．７に調節された。再度、限外ろ過が実施され、マルトース又はグリシンと一緒に調合された後にタンパク質濃度が最終濃度５０又は１００ｍｇ／ｍｌとなるように調節された。その後の無菌ろ過に続いて、溶液は、異なる体積（５０、１００、２００ｍｌ）のシリコン処理滅菌注入ビンに充填された。ビンは、栓をして密封された。

この実施例は、特に、１回目のＡＥＸ段階前の７０ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度までの濃縮ＩｇＧ溶液及びナノろ過段階の実施の点で前の試料と異なる。Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ又はＩＩ＋ＩＩＩを水１２体積に溶解し、ｐＨを１Ｍ酢酸で４．９に調節し、ＩｇＧの大部分が溶解するまで溶液を温度２から８℃で５時間まで撹拌した。その後、カプリル酸塩は、１Ｍカプリル酸ナトリウム原液として、２０ｍＭカプリル酸塩溶液濃度まで溶液に添加され、ｐＨは、１Ｍ酢酸を添加することによって４．９一定に維持された。この溶液を１時間撹拌した。脂質及び不純物は、これらの条件下で沈澱し、ろ過除去された。その後、ｐＨを４．９一定に維持しながら、カプリル酸塩をその溶液に２０ｍＭ濃度まで再度添加した。再度、沈殿が生成され、ろ過除去された。ろ過後、透明溶液が得られた。収集されたＩｇＧ溶液は、タンパク質濃度７０ｍｇ／ｍｌに濃縮され、リン酸緩衝液ｐＨ５．１５体積で透析ろ過された。溶液は、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃でｐＨ５．１に調節され、強陰イオン交換体にかけられた。ＩｇＧはカラムを通過したのに対して、不純物及びカプリル酸塩はカラムと結合した。次いで、溶液は、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃でｐＨ６．８に調節され、２回目の強陰イオン交換体にかけられた。ＩｇＧはカラムを通過したのに対し、不純物はカラムと結合した。収集されたＩｇＧ溶液のｐＨは、０．３ＭＨＣｌを用いて温度７±３℃で４．０に調節された。溶液は、０．１μｍフィルターを通してろ過され、その後、２０ｎｍまで低下し始める孔径を有する一連のＰＡＬＬフィルター、すなわちＰＡＬＬＤＶＤ、ＤＶ５０及びＤＶ２０がナノろ過に使用された。ナノろ過溶液は、３７±３℃で少なくとも２４時間貯蔵される。その後、溶液のｐＨは、０．１ＭＮａＯＨを用いて温度７±３℃で４．７に調節された。再度、限外ろ過が実施され、マルトース又はグリシンの添加によってマルトース又はグリシンと一緒に調合された後にタンパク質濃度が最終濃度５０又は１００ｍｇ／ｍｌとなるように調節された。その後の無菌ろ過に続いて、溶液は、異なる体積（５０、１００、２００ｍｌ）のシリコン処理滅菌注入ビンに充填された。ビンは、栓をして密封された。

比較例
本発明の方法
（ろ過助剤を含めて）画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ約３１０ｇは、ろ過助剤を含まない画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの理論重量から計算されたＷＦＩ１２体積で再構成される。溶液は５℃で１時間撹拌される。次いで、ｐＨは４．９±０．１に調節される（約９５０ｇ）。再構成は５℃で２時間続けられる。次いで、試料「再構成画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ」が抜き取られる。１モルカプリル酸塩溶液は、濃度２０ｍＭまで添加される。ｐＨは４．９一定に維持される。溶液は、５℃で１時間インキュベートされる。溶液は、デプスフィルター及び紙シート（ｐａｐｅｒｓｈｅｅｔ）を用いて５℃でろ過される（約１０５０ｇ）。フィルターは、１０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で後洗浄される。ろ液は２５℃に加温され、１モルカプリル酸塩は、さらに１０ｍＭ濃度添加される。溶液は、２５℃で１時間インキュベートされる。溶液は遠心分離され、上清は、孔径１μｍから０．５μｍのフィルターでろ過される（１１１０ｇ）。試料「カプリル酸塩後」が抜き取られる。

ＥＰ０８９３４５０による
（ろ過助剤を含めて）画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ約３１０ｇは、ろ過助剤を含まない画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの理論重量から計算されたＷＦＩ７体積で再構成される。溶液は５℃で１時間撹拌される。ｐＨは４．１±０．１に調節される。再構成は５℃で２時間続けられる。次いで、試料「再構成画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ」が抜き取られる。１モルカプリル酸塩溶液は、濃度２０ｍＭまで添加される。ｐＨは、カプリル酸塩添加直後に４．９に変化し、５．１に調節される。溶液は、５℃で１時間インキュベートされる。溶液は、デプスフィルター及び紙シートを用いて５℃でろ過される。フィルターは、１０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で後洗浄される（約１０５０ｇ）。ろ液は２５℃に加温され、１モルカプリル酸塩は、さらに１０ｍモル濃度添加される。溶液は、２５℃で１時間インキュベートされる。溶液は遠心分離され、上清は０．４５μｍフィルターでろ過される（約１１１０ｇ）。試料「カプリル酸塩後」が抜き取られる。

図１は、本発明のプロセスの特定の実施形態のフローチャートを示す。図２は、本発明のプロセスの特定の実施形態のフローチャートを示す。

Claims

（ａ）出発溶液のｐＨを４．８〜４．９５に調節して、中間体溶液を製造する段階と、
（ｂ）カプリル酸イオン及び／又はヘプタン酸イオンを前記中間体溶液に添加し、ｐＨを４．８〜４．９５に維持し、それによって沈殿物が形成され、抗体がその上清中に本質的に存在する段階と、
（ｃ）カプリル酸イオン及び／又はヘプタン酸イオンを２回目に添加して第２の沈殿物が形成された後、前記上清溶液をインキュベートし、ろ過して、ろ過溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記ろ過溶液を、５．０〜５．２のｐＨで第１の陰イオン交換樹脂に適用して汚染物質を第１の陰イオン交換樹脂に結合し、ウイルス不活性化及びウイルス安全精製抗体調製物が生成される段階と
を含む、抗体と汚染物質とを含む出発溶液からウイルス不活性化及びウイルス安全精製抗体調製物を調製する方法。
さらに、第２の陰イオン交換クロマトグラフィーを６．７〜６．９のｐＨ範囲で実施する、請求項１に記載の方法。
前記出発溶液が血しょう由来の抗体を含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記抗体が免疫グロブリンＧである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記陰イオン交換クロマトグラフィーのフロースルーが６０〜９０ｍｇ／ｍｌに濃縮され、緩衝液で透析ろ過される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記緩衝液がリン酸緩衝液である、請求項５に記載の方法。
第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのフロースルーが、脂質で覆われたウイルスを不活性化するために、４．５〜８時間での溶媒洗浄剤で処理される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
溶媒洗浄剤がＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｎＢＰである、請求項７に記載の方法。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度が１％であり、ＴｎＢＰの濃度が０．３％である、請求項８に記載の方法。
溶媒洗浄剤が固相及び液相抽出によって除去される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
ＵＶ−Ｃ処理、熱処理、ウイルスろ過及びプリオン除去又は不活性化からなる群から選択される方法の少なくとも１つが、請求項１に記載のカプリル酸塩処理と組み合わされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
固相抽出時のｐＨ値が６．７〜６．９に調節される、請求項１０に記載の方法。
前記溶液が、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィーに供される、請求項１２に記載の方法。
陰イオン交換体フロースルーのｐＨ値が３．５〜４．５に調節される、請求項１３に記載の方法。
ＩｇＧ溶液がウイルスフィルターによって接触される、請求項１４に記載の方法。
ＩｇＧ溶液がナノフィルターによって接触される、請求項１４に記載の方法。
ＩｇＧ溶液が少なくとも２４時間、３７℃±１でインキュベートされる、請求項１４に記載の方法。
ＩｇＧ溶液が５又は１０％に濃縮される、請求項１４に記載の方法。
前記濃縮物のモル浸透圧濃度が、適切な添加剤によって２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに調節される、請求項１８に記載の方法。
ＩｇＧ溶液が、ｐＨ値３．５〜６．０にｐＨ調節される、請求項１９に記載の方法。
ＩｇＧ溶液が、無菌ろ過され、ガラスビン又はプラスチック容器に充填される、請求項２０に記載の方法。
請求項１〜２１のいずれか一項に従って得ることができるＩｇＧ含有画分。