BRPI0508096B1

BRPI0508096B1 - Método de preparação de um preparado de anticorpo seguro purificado contra vírus e vírus inativado

Info

Publication number: BRPI0508096B1
Application number: BRPI0508096-7A
Authority: BR
Inventors: Jürgen Römisch; Andrea Buchacher; Günther Iberer
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2019-04-02
Also published as: US20070173638A1; EP1718675B1; DK1718675T3; CA2557229A1; WO2005082937A3; IL177541A; EP2277915A1; ZA200607119B; UA87836C2; NO20063784L; US7553938B2; ES2407380T3; EP1718675A2; PT1718675E; RU2006134285A; JP5042817B2; CA2557229C; PL1718675T3; IL177541A0; AU2005217148A1

Abstract

método de preparação de preparado de anticorpo seguro contra vírus, vírus inativo, purificado e fração contendo igg. a presente invenção refere-se a um método de preparação de um preparado de anticorpo seguro contra vírus, vírus inativo, purificado, a partir de uma solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes, o método compreendendo as etapas de: (a) ajuste do ph da solução de partida para cerca de 4,6 a cerca de 4,95, em particular para cerca de 4,8 a cerca de 4,95, para produzir uma solução de intermediário; (b) adição de íons de caprilato e/ou heptanoato à solução de intermediário e manutenção do ph em cerca de 4,6 a cerca de 4,95, em particular em cerca de 4,8 a cerca de 4,95, com o que um precipitado é formado e os anticorpos estão essencialmente presentes no sobrenadante; (c) incubação da solução de sobrenadante sob condições de concentração, tempo, ph e temperatura de íon de caprilato e/ou heptanoato opcionalmente concentração e diafiltragem da solução filtrada antes do ajuste do ph; (d) aplicação da solução filtrada com pelo menos uma resina de troca de ânion e opcionalmente com duas resinas de troca de ânion diferentes sob condições que permitem a ligação de contaminantes à resina enquanto não permitindo ligação significante dos anticorpos à resina, onde uma preparação de anticorpo de vírus seguro e de vírus inativado, purificada, é produzida.

Description

A presente invenção refere-se a um método de preparação de um preparado de anticorpo seguro contra vírus, purificado, a partir de uma 5 solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes. Descrevese um processo de purificação de gama-globulinas a partir de plasma humano e outras fontes. Etapas de inativação e remoção de vírus estão incluídas no processo de fabricação descrito aqui.

Precipitação e remoção/inativação de vírus resultante

Nos anos 40, Cohn e outros introduziram o fracionamento de etanol a frio de plasma humano. Muitas variações desse esquema surgiram para aumentar a pureza e/ou rendimento dos diferentes intermediários. No fracionamento de Cohn, algumas etapas foram identificadas para contribuir eficientemente para inativação e remoção de vírus. No processo de IgG es15 pecialmente a separação de fração de Cohn I+III é muito eficaz com relação a isso. Alguns vírus sensíveis (principalmente vírus envelopados) são destruídos por pH baixo e presença de EtOH e uma grande parte de vírus envelopados e não-envelopados é removido através de divisão no precipitado I+III que é geralmente descartado.

Nos anos 60, foi mostrado que ácidos graxos curtos (C6-C12) formam complexos insolúveis com a- ou β-globulinas enquanto γ-globulinas não são precipitadas tão prontamente (Chanutin e outros, 1960). Steinbruch e outros (1996) descreveram um processo de purificação para IgG com caprilato (isto é, octanoato, um ácido graxo C8 saturado) como agente de pre25 cipitação. Não-imunoglobulinas foram precipitadas de plasma humano após diluição com um tampão de acetato para atingir um pH final de 4,8. Após adição de caprilato sob agitação vigorosa, uma solução enriquecida com IgG foi obtida. A pureza e o rendimento dependem da quantidade de ácido caprílico, do pH, da molaridade do tampão e do fator de diluição. Steinbruch e 30 outros também declararam que é vantajoso adicionar a quantidade eficaz de caprilato em duas etapas com a remoção dos precipitados entre elas. Vírus

Petição 870180146882, de 31/10/2018, pág. 7/13 não-envelopados e envelopados são removidos através de divisão no precipitado de proteínas não-lgG como é o caso para a separação da fração l+lll. Cromatografia

Várias patentes descrevem a purificação da solução de IgG no chamado modo negativo; IgG se movimenta sem ligação (apenas em traços) enquanto a maioria das proteínas de fração não-lgG se liga aos ligantes aniônicos (Bertolini e outros, 1998, WO-A-98/05686; Lebing 1999, US-A5.886.154; Friesen e outros, 1986, CA 1201063). A combinação de precipitação de caprilato seguida por cromatografia de troca de íon para a purifica10 ção de IgG foi descrita em muitas publicações. Uma das primeiras foi descrita por Steinbuch e outros (1969). Descreveu-se a purificação adicional de

IgG após precipitação de caprilato com DEAE-celulose. A publicação recente de Lebing e outros (2003) descreve duas colunas de troca de ânion usadas em série para a remoção de IgM, IgA, albumina e outras impurezas. Lebing 15 e outros combinaram ambos efeitos mediados por caprilato, a saber, a redução essencial de proteínas não-lgG através de precipitação, desse modo usando a divisão de vírus, e as propriedades de inativação do vírus envelopado do ácido graxo em uma etapa de incubação separada. A importância da chamada mudança do pH Lebing e outros (2003), partindo da reconsti20 tuição de uma pasta/precipitado contendo IgG em pH 4,2 e a subsequente

adição de caprilato sob ajuste do pH 5,2, é enfatizada ser essencial para o procedimento de enriquecimento de IgG, desse modo é necessário reduzir eficazmente proteínas não-lgG. Uma vez que algumas outras impurezas, tal como IgA e IgM, bem como o caprilato, foram subsequentemente reduzidas 25 através das etapas de cromatografia de troca de íon mencionadas.

Surpreendentemente foi verificado que tal mudança de pH conforme acima mostrado e descrito por Lebing e outros não é necessária para atingir um efeito de purificação significante quando da adição de caprilato e remoção do precipitado resultante. Pelo contrário, quando da manutenção 30 do pH constante em pH 4,6 a 4,95 durante todo o processo de reconstituição de pasta e incubação de caprilato e remoção de precipitado, um enriquecimento de IgG eficaz é conseguido. Também a quantidade de impurezas, φ 10 • · ·· • · · • · · · • · · • · · · • · • · • · • · • · • ♦ • · • · • · especialmente albumina, é reduzida mais eficientemente mantendo o pH constante na faixa de 4,8 a 4,95. Ao mesmo tempo vírus são removidos. Em seguida impurezas residuais e caprilato são separados através de etapas de troca de íon.

Inativação de vírus clássico

Tratamentos com solvente detergente e pH 4 são métodos bem conhecidos e amplamente usados para imunoglobulinas. O tratamento com SD é normalmente introduzido nesses processos devido à sua superioridade em termos de inativação de vírus envelopados (Biesert L., Clinicai and Experimental Rheumatoloy, 1996; 14: 47). Ambos vírus envelopados e não-envelopados são afetados pela exposição a pH baixo, embora vírus envelopados sejam mais afetados do que os não-envelopados (Biesert, Clinicai and Experimental Rheumatology, 1996; 14: 47, Bos e outros, Biologicals, 1998; 26; 267, em Seop e outros, J. Microbiol Biotechnol, 2001; 11:619). Na EP-A-0 525 502 a combinação de solvente detergente e incubação de pH 4 como etapas de inativação de vírus é descrita.

Filtragem do vírus

Soluções de IgG são filtradas através de membranas de tamanho de poro muito pequeno (tipicamente 15 a 50 nm) sob condições quer retêm vírus através de um mecanismo amplamente baseado em exclusão de tamanho (Burnouf e Radosevich, Haemophilia, 2003; 9:24) para aumentar a segurança do vírus. Também filtros de profundidade que são feitos para reter vírus através de absorção de troca de íon são usados para filtragem de imunoglobulinas.

Sumário da Invenção

A invenção descreve um processo de purificação para IgG com um rendimento aumentado e tempo de processo mais curto comparado com o processo de fracionamento de Cohn-Oncly clássico. IgG é reconstituída em tampão em uma faixa de pH ácidos de a partir de 4,60 a 4,95, de preferência 4,9. Proteínas não-lgG são separadas através de duas etapas de incubação com caprilato em uma faixa de concentração de a partir de 10 a 30 mM de caprilato, de preferência 20 mM.

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Para inativação eficaz de vírus envelopados, uma incubação conhecida como tratamento de solvente detergente com Triton X-100, Tween etc, e TNBP pode ser adicionada para aumentar a capacidade de inativação do vírus de todo o processo. Uma remoção de vírus através de filtragem, 5 i.p. através da chamada nanofiltragem ou filtros de profundidade carregados, pode ser adicionada aos procedimentos de remoção de vírus. Ainda, tratamento de UVC pode ser realizado também em combinação com os tratamentos mencionados antes. Tais tratamentos são descritos, por exemplo, na

EP-A-0 840 624 ou na EP-A-0 422 007.

Ainda, caprilato/ácido caprílico pode ser combinado com ou substituído por heptanoato/ácido heptanóico para realizar as etapas do processo de precipitação e incubação acima mencionadas.

O produto obtenível através do métodos da invenção é vírus inativado. Príons são inativados/removidos também devido a tratamento com 15 caprilato.

As Figuras 1 e 2 mostram um fluxograma de modalidades particulares do processo da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se a um método de preparação de um prepa20 rado de anticorpo seguro contra vírus, vírus inativado, purificado, a partir de

uma solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes, o método compreendendo as etapas de:

(a) ajuste do pH da solução de partida para cerca de 4,6 a cerca de 4,95, em particular para cerca de 4,8 a cerca de 4,95 para produzir uma solução intermediária:

(b) adição de íons de caprilato e/ou heptanoato à solução intermediária e manutenção do pH em cerca de 4,6 a cerca de 4,95, em particular em cerca de 4,8 a cerca de 4,95, com o que um precipitado é formado e os anticorpos estão essencialmente presentes no sobrenadante;

(c) incubação da solução de sobrenadante sob condições de concentração, tempo, pH e temperatura de ion de caprilato e/ou heptanoato; opcionalmente concentração e diafiltragem da solução filtrada antes «

• · • · • · • · • · ·· • · ·· •· ·· • «· •·· • ¹⁰

do ajuste do pH;

(d) aplicação da solução filtrada com pelo menos uma resina de troca de íon e opcionalmente com duas resinas de troca de íon diferentes sob condições que permitem a ligação de contaminantes à resina enquanto não permitindo ligação significante de anticorpos à resina, onde um preparado de anticorpo seguro contra vírus, vírus inativado, purificado, é produzido.

Em uma modalidade da invenção, a solução de vírus inativado é contatada com a etapa (d) com pelo menos uma resina de troca de íon em pH de a partir de cerca de 5,0 a 5,2. Se duas cromatografias de trocador de ânion forem realizadas, a segunda cromatografia pode ser realizada em uma faixa de pH de a partir de 6,7 a 6,9. Opcionalmente as etapas (b) e (c) podem ser repetidas pelo menos uma vez. O tratamento com caprilato em pH

4,9 leva a uma depleção significante de proteínas indesejadas.

Tipicamente, a solução de partida compreende anticorpos derivados de plasma.

Pode ser vantajoso contatar na etapa (d) a solução inativada com duas resinas de troca de ânion diferentes sob condições de modo que contaminantes sejam seletivamente ligados às resinas enquanto os anticorpos não são significantemente ligados às resinas.

De preferência, os anticorpos são do tipo Imunoglobulina G.

Entre as duas etapas de cromatografia de troca de ânion (AEX), o pH pode ser mudado em particular para 6,8 ± 0,1. O fluxo de AEX pode ser concentrado para 60 a 90 mg/ml e diafiltrado contra, por exemplo, tampão de fosfato. Em uma outra modalidade do método da invenção, o fluxo da primeira AEX é tratado com solvente detergente, de preferência através de Triton X-100 e TnBP, de preferência em concentrações de 1% de Triton X-100 e 0,3% de TnBP por 4,5 a 8 horas para inativar vírus revestidos com lipídeo. O método é conhecido como tratamento de solvente detergente e descrito na EP-A-0 131 740 (incorporado a título de referência). De acordo com a invenção, os detergentes da mistura de incubação são em particular removidos através de extração de fase sólida e líquida. Após extração de fase sólida, o

• · · · · * • · · · · · · ....... • · · · · · · ....... ·_Β· « · · · • · • · • · • · ρΗ da solução é ajustado para 6,7 a 6,9. A combinação do tratamento de S/D e inativação de vírus por caprilato leva a um produto mais seguro.

A solução então ajustada pode ser aplicada à segunda coluna de AEX onde o fluxo de AEX pode ter o pH ajustado para cerca de 3,5 a 4,5, 5 em particular, 4,0 ± 0,1. De acordo com a invenção, a solução de IgG com pH ajustado é contatada por um filtro de vírus. Esta etapa opcional leva, em combinação com o tratamento com caprilato, a mais segurança de vírus.

A solução de IgG pode ser também Incubada a 37°C ± 1 por pelo menos 24 horas. A fim de melhorar a segurança do vírus do produto de 10 anticorpo, tratamento com UV-C pode ser combinado com o tratamento com caprilato da fração contendo anticorpo. Os métodos de inativação sozinhos ou em combinação tal como tratamento com TnBP, tratamento com UV-C, filtragem ou aquecimento de vírus podem ser combinados com o processo da invenção.

O método de acordo com a invenção pode ser combinado com métodos para remoção ou inativação de príons, por exemplo, métodos de filtragem ou absorção ou métodos cromatográficos conforme descrito na técnica anterior, por exemplo, EP-A-0 954 528, Trejo, S.R. e outros, Vox

Sanguinis, (2003) 84, 176-187. A solução de IgG obtida de acordo com a invenção é concentrada devido ao uso terapêutico pretendido, tipicamente

para concentrações de 5 ou 10% e a osmolaridade do concentrado é ajustada para 200 a 400 mOsmol/kg através de um aditivo apropriado. No entanto, qualquer outro valor é possível contanto que farmaceuticamente aceitável. Tais aditivos são bem conhecidos do especialista e incluem, mas não estão limitados a, açúcares, álcoois de açúcar e aminoácidos. A solução de IgG pode ter o pH ajustado para 3,5 a 6,0, em particular, 4,0 a 5,5. Finalmente, a solução de IgG é filtrada estéril e enchida em garrafas de vidro ou recipientes plásticos. Altemativamente, o fluxo após as primeira e segunda etapas de AEX é aplicado a nanofiltros para conseguir um produto ainda mais seguro.

O processo da invenção é descrito em mais detalhes, de preferência realizado conforme descrito:

Como material de partida fração de plasma humano l+ll+lll ou

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fração ll+lll foi usada. Essas frações foram produzidas conforme descrito por

Cohn e outros (1946). O ajuste do pH durante o processo foi feito com ácido acético 1M, NaOH 0,1 M ou HCI 0,3M. Caprilato foi adicionado como um solução de estoque de caprilato de sódio 1M. Esta solução de estoque foi pre5 parada dissolvendo 166 g de caprilato de sódio em 1 litro de água para injeções (WFI) e agitação até dissolução total do caprilato de sódio.

Exemplar para o tratamento de SD Triton X-100 e TnBP foram usados. Para a remoção dos reagentes de SD, óleo vegetal tal como óleo de soja ou óleo de rícino foi usado.

Todos os reagentes eram de grau USP ou melhor.

Cromatografia de exclusão de tamanho quantitativa e ELISA foram usados para determinar a concentração de lgG. HPLC analítica foi feita com um Agilent HPLC System com coluna TosoHaas G3000SW.

Um desenho esquemátíco do processo é mostrado na Figura 1.

O processo inicia com a dissolução da precipitado de lgG, chamado pasta, em água purificada. Geralmente quanto maior o volume de água para reconstituir a pasta maior o rendimento de lgG. O pH da solução é ajustado para 4,60 a 4,95, de preferência 4,90 com ácido acético 1 Μ. A solução é agitada por várias horas para obter o máximo de lgG possível em solução. Em seguida caprilato é adicionado como uma solução estoque 1M até concen-

trações entre 10 e 30 mM, de preferência 20 mM, de caprilato. O pH durante a adição de caprilato é mantido constante entre 4,80 θ 4,95, de preferência a

4,90. Durante a incubação da solução de lgG com caprilato proteínas e lipí deos não-lgG precipitam. O precipitado formado é removido através de fil25 tragem a partir da solução de lgG. Após a primeira etapa de precipitação, algumas impurezas permanecem na solução de lgG. Deste modo, um trata mento com caprilato secundário é necessário. Similar à primeira etapa, o caprilato é adicionado como uma solução de estoque 1M até uma concen tração de aproximadamente 20 mM de caprilato em solução em um pH cons30 tante entre 4,80 e 4,95, de preferência em 4,9. Após a incubação o precipitado é removido através de filtragem ou centrifugação. Para uma melhor performance durante a filtragem ajuda de filtro é usada. A solução filtrada é a8 • · · · ♦ • · · · · • · ·· · · * · · · · ······ « · ·

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• · • · • · • · justada para pH entre 5,0 e 5,2, de preferência para 5,1, e aplicada a uma coluna de troca de íon. Como uma coluna de troca de ânion, de preferência trocadores de ânion fortes tal como Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose-HP, QSepharose-XL, Source Q 15 ou 30 (Amersham Bioscíence), Q-Thruput, Q5 Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q e Macro Prep High Q (Bio-Rad), Q Hyper D (BioSepra) e Poros HQ (PerSeptive Biosystems) foram escolhidos.

A IgG flui através da coluna sob as condições escolhidas, enquanto alguns aditivos/impurezas, tal como caprilato e IgA, se ligam à resina.

A solução de proteína é carregada na coluna em uma razão de 40 para 120 10 mg, em particular de 40 a 90 mg de proteína por ml de resina. O fluxo obtido é concentrado para uma concentração de proteína de 60 a 90 mg/ml, de preferência 70 mg/ml, e diafiltrado contra 5 volumes de tampão de fosfato com uma concentração de 5 a 20 mM, de preferência 10 mM, de fosfato de sódio. Como uma etapa de inativação de vírus opcional o tratamento com SD pode 15 ser escolhido após a diafiltragem. A solução diafiltrada tem então o vírus inativado usando o tratamento de SD descrito por Horowitz, por exemplo, na EP-A-0 131 740. Como reagentes de SD TnBP eTríton X-100 foram usados.

Após agitação, a solução é incubada até 8 horas em uma temperatura entre e 10°C. Então um óleo vegetal tal como óleo de solha ou óleo de rícino, de preferência óleo de rícino, é adicionado à solução até uma concentração de

a 5% (p/p). Após a separação da fase de óleo a partir da fase aquosa, a fase aquosa é filtrada. Deste modo, um filtro de profundidade apropriada é usado. Exemplos desses filtros são Polysep II (Millipore), Sartofine PP e Sartobran P (Sartorius). A extração de fase sólida subseqüente é realizada em 25 um modo preferido usando meios de apoio hidrofóbicos que são também usados em cromatografia de fase reversa com uma matriz de gel feita de sílica, estireno-co-divinil benzeno (SDVB), glicidil metacrilato-co-etileno dímetacrilato ou poliaromático.

Exemplos desses meios são pBondapak (Waters), Amberchrom

CG-161 M e S, Amberchrom CG-070 (Tosoh Biosep), PLRP-S (Polymer Laboratories), RPC-1 eToyopearl Hexyl 650C (Tosoh Biosep), Source 15 RPC (Amersham Biosiences), LiChropep SI60 (Merck), Chromabond Sorbent HR9 •· • · ·♦ • ·· • · ·· • · ·· •·

P e EASY (Machery-Nagel), ProntoSORB SPE (Bischoff Chrom.). A solução de proteína é carregada na coluna em uma razão de 0,5 a 1,5 mg/ml de resina seca. O fluxo da extração da fase sólida (ou etapa de cromatografia, respectivamente) é tratado com UVC e então ajustado para um pH entre 6,7 5 e 6,9, de preferência 6,8, através da adição de NaOH 0,1 M em uma temperatura entre 4 e 10°C. Em seguida, a solução de IgG é aplicada a uma segunda coluna de troca de ânion. A IgG flui sem retenção através da coluna, enquanto impurezas e polímeros se ligam à coluna. Como uma coluna de troca de ânion, de preferência trocadores de ânion fortes tal como Q10 Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source Q 15 ou 30 (Amersham Bioscience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q e Macro Prep High Q (Bio-Rad), Q Hyper D (BioSepra) e Poros HQ (PerSeptive Biosystems) foram escolhidos. A coluna é equilibrada com um tampão de fosfato de sódio 10 mM. Após a aplicação da solução de IgG, a colu15 na é lavada com tampão de equilíbrio para se obter toda IgG não-ligada da coluna. A solução de proteína é carregada na coluna em uma razão de 120 a 300 mg proteína/ml de resina. A solução de IgG coletada é ajustada para um pH entre 3,9 e 4,1, de preferência 4,0 com HCl 0,3M em uma temperatura entre 4 e 10°C. Então a solução é filtrada estéril e armazenada a 37°C por pelo menos 24 horas. Subsequente ao tratamento de pH baixo, o pH da so-

lução é ajustado para 4,7 com NaOH 0,1 M em uma temperatura entre 4 e

10°C. Como uma etapa de redução de vírus adicional filtros de vírus apropri ados podem ser usados. Para filtragem de vírus a solução de IgG foi filtrada através de um filtro de 0,1 pm seguido por filtros de vírus com um tamanho de poro entre 200 e 15 nm. Exemplos desses filtros são DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 75, 35, 20, 15N (Asahi Kasei Pharma). Também um filtro de profundidade carregado tipo Zeta Plus VR (Cuno) pode ser usado. A etapa de filtragem pode ser também aplicada após uma incubação em pH 4. De preferência esta etapa será im plementada no processo antes do tratamento com pH baixo. A solução de

IgG altamente purificada é diafiltrada e concentrada para os valores de formulação final. Como concentrações finais para uma proteína de formulação

líquida concentrações de 5 ou 10% (p/v) foram escolhidas. Após a concentração a osmolaridade é ajustada para ser compatível para injeção intravenosa através de um aditivo apropriado. Açúcares, álcoois de açúcar e aminoácidos podem ser usados. O pH é checado novamente e ajustado para

4,5 a 5,0, de preferência para 4,7. Subseqüentemente, uma outra filtragem estéril é realizada e a solução é enchida em garrafas de infusão.

Os exemplos que seguem explicam o processo da invenção em mais detalhes:

Exemplo 1:

A fração de Cohn l+ll+lll ou ll+lll foi dissolvida em 12 volumes de água, o pH foi ajustado para 4,9 com ácido acético 1M e a solução foi agitada até 5 horas até que a maioria da IgG fosse dissolvida em uma temperatura de 2 a 8°C. Em seguida caprilato foi adicionado como solução de estoque de caprilato de sódio 1M à solução de IgG até uma concentração de 15 20 mM de caprilato enquanto mantendo o pH constante a 4,9 através da adição de ácido acético 1M. Esta solução foi agitada por uma hora. Lipídeos e impurezas precipitaram sob essas condições e foram removidos através de filtragem. Em seguida, caprilato foi adicionado novamente à solução até uma concentração de 20 mM em solução quando da manutenção do pH constan20 te em 4,9. Novamente um precipitado foi gerado e removido através de fil-

tragem. Uma solução clara foi obtida após a filtragem. A solução foi ajustada para um pH de 5,1 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada a uma solução Source Q 30. A solução de IgG fluiu através da coluna enquanto as impurezas e caprilato foram ligados à coluna. A solução de IgG coletada foi concentrada para uma concentração de proteína de 70 mg/ml e diafiltrada contra 5 volumes de um tampão de fosfato pH 5,1. Subseqüentemente, 0,3% (p/p) de TnBP e 1% (p/p) de Triton X-100 foram adicionados à solução, seguido por agitação vigorosa. Após pelo menos 4,5 horas de agitação a 7 ± 3°C, 5% (p/p) de óleo de rícino são adicionados. A extração do 30 óleo foi realizada em temperatura ambiente. O óleo e as fases aquosas foram separados e a fase aquosa foi filtrada com um filtro Millipore Opticap

Polysep. A solução filtrada foi aplicada a uma coluna cheia com uma matriz

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de fase reversa chamada pBondapak (Waters). Então a solução foi ajustada para pH 6,8 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada a um trocador de ânion forte, a saber, Q-Sepharose-XL. A IgG passa pela coluna enquanto as impurezas são ligadas à coluna. O pH da solução de IgG coletada foi ajustado para 4,7 com 0,1 M de NaOH em uma temperatura de 7 ± 3°C. Novamente uma ultrafiltragem foi realizada para ajustar a concentração da proteína para a concentração final de 50 ou 100 mg/ml, seguindo pela adição de maltose para uma faixa de concentração de 2 a 10% (peso), de preferência 8%, ou glicina em uma faixa de concentração de a partir de 0,1 a 10 0,5M, em particular 0,1 a 0,3, de preferência 0,3M, em particular 0,2. Subsequentemente à filtragem estéril que segue, a solução foi enchida em garrafas de infusão esterilizadas e siliconizadas com volumes diferentes (50, 100, 200 ml). As garrafas foram vedadas com rolhas.

Exemplo 2:

Este exemplo difere em particular do Exemplo 1 pela implementação de uma etapa de incubação de pH 4. A fração Cohn l+ll+lll ou ll+lll foi dissolvida em 12 volumes de água, o pH foi ajustado para 4,9 com ácido acético 1M e a solução foi agitada por até 5 horas até que quase toda IgG fosse dissolvida em uma temperatura de 2 a 8°C. Em seguida caprilato foi adicionado como uma solução estoque de caprilato de sódio 1M à solução de IgG até uma concentração de 20 mM de caprilato em solução e o pH foi mantido constante a 4,9 através da adição de ácido acético 1M. Esta solução foi agitada por uma hora. Lipídeos e impurezas precipitaram sob essas circunstâncias e foram removidos através de filtragem. Em seguida, caprilato foi novamente adicionado à solução até uma concentração de 20 mM sob manutenção do pH constante a 4,9. Novamente o precipitado formado foi removido através de filtragem. Uma solução clara foi obtida após filtragem. A solução de IgG coletada foi concentrada para uma concentração de proteína de 70 mg/ml e diafiltrada contra 5 volumes de um tampão de fosfato pH 5,1. A solução foi ajustada para um pH de 5,1 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada ao trocador de ânion forte Q-Sepharose-XL. A IgG fluiu através da coluna enquanto as impurezas e caprilato foram ligados à

• · · coluna. Subseqüentemente, 0,3% (p/p) de TnBP e 1% (p/p) de Triton X-100 foram adicionados à solução, seguido por agitação vigorosa. Após pelo menos 4,5 horas de agitação de 4 a 10°C, 5% (p/p) de óleo de rícino foram adicionados. A extração do óleo foi realizada em temperatura ambiente. As fa5 ses de óleo e aquosa foram separadas e a fase aquosa foi filtrada com um filtro Millipore Opticap Polysep. A solução filtrada foi aplicada a uma coluna cheia com Amberchrom CG-161M. Então a solução foi ajustada para pH de

6,8 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada ao trocador de ânion forte Q-Hyper D. A IgG fluiu através da coluna enquanto as impure10 zas foram ligadas à coluna. O pH da solução de IgG foi ajustado para 4,0 com HCl 0.3M em uma temperatura de 7 + 3°C. A solução foi filtrada estéril e armazenada a 37 ± 3°C por pelo menos 24 horas. Em seguida, o pH da solução foi ajustado para 4,7 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C. Novamente uma ultrafiltragem foi realizada para ajustar a concentração 15 de proteína para a concentração final de 50 ou 100 mg/ml a ser obtida após formulação com mattose ou glicina. Subseqüentemente à filtragem estéril que segue, a solução foi enchida em garrafas de infusão esterilizadas e siliconizadas com volumes diferentes (50, 100, 200 ml). As garrafas foram vedadas por rolhas.

Exemplo 3:

Este exemplo difere em particular das amostras anteriores pela concentração da solução de IgG para concentração de proteína de 70 mg/ml antes da primeira etapa de AEX e pela implementação de uma etapa de nanofiltragem.

A fração Cohn l+ll+lll ou ll+lll foi dissolvida em 12 volumes de água, o pH foi ajustado para 4,9 com ácido acético 1Mea solução foi agitada por até 5 horas até a maioria da IgG ser dissolvida em uma temperatura de 2 a 8°C. Em seguida caprilato foi adicionado como uma solução estoque de caprilato de sódio 1M à solução até uma concentração de 20 mM de ca30 prilato em solução e o pH foi mantido constante a 4,9 através da adição de ácido acético 1M. Esta solução foi agitada por uma hora. Lipídeos e impurezas precipitaram sob essas condições e foram removidos com filtragem. Em

• · • · · · • · ♦ • · · · • · · · • · seguida, caprilato foi adicionado novamente à solução até uma concentração de 20 mM quando da manutenção do pH constante a 4,9. Novamente um precipitado foi gerado e removido através de filtragem. Uma solução clara foi obtida após a filtragem. A solução de IgG coletada foi concentrada para uma concentração de proteína de 70 mg/ml e diafiltrada contra 5 volumes de um tampão de fosfato de pH 5,1. A solução foi ajustada para um pH 5,1 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada a um trocador de ânion forte. A IgG fluiu através da coluna enquanto as impurezas e o caprilato foram ligados à coluna. Então a solução foi ajustada para pH de 6,8 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C e aplicada a um segundo trocador de ânion forte. A IgG passou pela coluna enquanto as impurezas foram ligadas à coluna. O pH da solução de IgG coletada foi ajustado para 4,0 com HCl 0,3M em uma temperatura de 7 ± 3°C. A solução foi filtrada em um filtro de 0,1 μ, em seguida uma cascata de filtros PALL, a saber PALL DVD, DV 50 e DV 20, com um tamanho de poro começando de menos de 20 nm foi usada para nanofiltragem. A solução nanofiltrada é armazenada a 37 + 3°C por pelo menos 24 horas. Em seguida, o pH da solução foi ajustado para 4,7 com NaOH 0,1 M em uma temperatura de 7 ± 3°C. Novamente uma ultrafiltragem foi realizada para ajustar a concentração de proteína para a concentração final de 50 ou 100 mg/ml a ser obtida após a formulação com maltose ou glicina através da adição de maltose ou glicina. Subseqüentemente à filtragem estéril que segue, a solução foi enchida em garrafas de infusão esterilizadas ou siliconizadas com volumes diferentes (50, 100, 200 ml). As garrafas foram vedadas por rolhas.

Exemplos Comparativos

Método da Invenção

Aproximadamente 310 g de Fração l+ll+lll (incluindo auxiliares de filtro) são reconstituídos em 12 volumes de WFI calculado a partir do peso teórico de fração l+ll+lll sem auxiliares de filtro. A solução é agitada por 1 hora a 5°C. Então, o pH é ajustado para 4,9 ± 0,1 (cerca de 950 g). A reconstituição é continuada por 2 horas a 5°C. Então a amostra Fração l+ll+lll reconstituída é retirada. Uma solução de caprilato de 1 molar é adicionada

φ 10

• ♦· • · • ·· • · · · • · · • · para atingir uma concentração de 20 mM. O pH é mantido constante em 4,9. A solução é incubada por 1 hora a 5°C. A solução é filtrada em um filtro de profundidade e uma folha de papel a 5°C (cerca de 1050 g). O filtro é póslavado com uma solução de cloreto de sódio 10 mM. O filtrado é aquecido para 25°C, o caprilato 1 molar é adicionado para atingir uma concentração de mais 10 mM. A solução é incubada por 1 hora a 25°C. A solução é centrifugada e o sobrenadante é filtrado em um filtro (1110 g) tendo um tamanho de poro de 1 pm e 0,5 pm. A amostra após caprilato é retirada.

De acordo com a EP 0 893 450.

Aproximadamente 310 g de Fração l+ll+lll (incluindo auxiliares de filtro) são reconstituídos em 7 volumes de WFI calculado a partir do peso teórico da fração l+ll+lll sem auxiliares de filtro. A solução é agitada por 1 hora a 5°C. O pH é ajustado para 4,1 ± 0,1. A reconstituição é continuada por 2 horas a 5°C. Então a amostra ”Fr. l+ll+lll rec. é retirada. Uma solução de caprilato 1 molar é adicionada para atingir uma concentração de 20 mM. O pH muda para 4,9 quando da adição de caprilato e é ajustado para 5,1. A solução é incubada por 1 hora a 5°C. A solução é filtrada em um filtro de profundidade e uma folha de papel a 5°C. O filtro é pós-lavado com uma solução de cloreto de sódio 10 mM (cerca de 1050 g). O filtrado é aquecido para 25°C, o caprilato 1 molar é adicionado para atingir concentração de 10 mMolar adicional. A solução é incubada por 1 hora a 25°C. A solução é centrifugada e o sobrenadante é filtrado em um filtro de 0,45 pm (cerca de 1110 g). A amostra após caprilato é retirada.

Depleção de albumina e IgA

Experimento	Amostras	pH 4,9 Invenção	5,1 EP 0 893 450
Albumina [pg/mg de IgG]	Albumina [pg/mg de IgG]
1	Fr. rec. l+ll+lll	27,1	32,9
após caprilato	0,2	10,2
2	Fr. rec. l+ll+lll	44,2	32,6
após caprilato	0,2	2,2

• · • ·· • ··· • · ·· • ·· ·· ·

Experimento	Amostras	pH 4,9 Invenção	5,1 EP 0 893 450
Albumina [pg/mg de IgG]	Albumina [pg/mg de IgG]
3	Fr. rec. I+II+III	30,2	31,2
após caprilato	0,8	9,9
4	Fr. rec. I+II+III	22,7	33,1
Após caprilato	0,9	10,7
	Fr. rec. média I+II+III	31,1	32,5
	Fr. rec. desvio padrão I+II+III	9,3	0,9
	Média após caprilato	0,5	8,3
	Desvio padrão após caprilato	0,4	4,0

Experimento	Amostras	pH 4,9 Invenção	5,1 EP 0 893 450
IgA [pg/mg de IgG]	IgA [pg/mg de IgG]
1	Fr. rec. I+II+III	86	106
após caprilato	40,9	49,3
2	Fr. rec. I+II+III	74,3	120,7
após caprilato	23,7	60,5
3	Fr. rec. I+II+III	88,5	114
após caprilato	30,8	56,9
4	Fr. rec. I+II+III	115,5	113,6
Após caprilato	34,4	51,3
	Fr. rec. média I+II+III	91,1	113,6
	Fr. rec. desvio padrão l+ II+ III	1M	6.0
	Media após caprilato	32,5	54,5
	Desvio padrão após caprilato	7,2	5,1

Claims

1. Método de preparação de um preparado de anticorpo seguro purificado contra vírus e vírus inativado a partir de uma solução de partida compreendendo anticorpos e contaminantes, sendo o referido método caracterizado por compreender as etapas de:

(a) ajuste do pH da solução de partida para 4,6 a 4,95, em particular para 4,8 a 4,95, para produzir uma solução de intermediário;

(b) adição de íons de caprilato ou heptanoato à solução de intermediário e manutenção do pH em 4,8 a 4,95, com o que um precipitado é formado e os anticorpos estão presentes no sobrenadante;

(c) incubação da solução de sobrenadante após a segunda adição de íon de caprilato ou heptanoato nas mesma condições da etapa b), filtração da solução resultante e opcionalmente concentração e diafiltragem da solução filtrada antes do ajuste do pH;

(d) aplicação da solução filtrada a pelo menos uma resina de troca de ânion e opcionalmente com duas resinas de troca de ânion em um pH de 5,0 a 5,2 diferentes que permitem a ligação de contaminantes à resina enquanto não permitindo ligação dos anticorpos à resina, onde uma preparação de anticorpo segura de vírus e de vírus inativado, purificada, é produzida.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela segunda cromatografia de troca de ânion ser realizada em uma faixa de pH de a partir de 6,7 a 6,9.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelas etapas (b) e (c) serem repetidas pelo menos uma vez.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

3, caracterizado pela solução de partida compreender anticorpos derivados de plasma.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

4, caracterizado por na etapa (d) a solução inativada ser contatada com duas resinas de troca de ânion diferentes de modo que os contaminantes são seletivamente ligados às resinas enquanto os anticorpos não são

Petição 870180146882, de 31/10/2018, pág. 8/13 significantemente ligados às resinas.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelos anticorpos serem imunoglobulina G.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo pH ser ajustado para pH 6,8 ± 0,1 antes da segunda cromatografia de troca de ânion.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

7, caracterizado pela fração contendo as proteínas que não se ligam à coluna da cromatografia de troca de ânion ser concentrado para 60 a 90 mg/ml e diafiltrado contra uma solução de tamponamento, de preferência um tampão de fosfato.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

8, caracterizado pela fração contendo as proteínas que não se ligam à coluna da primeira cromatografia de troca de ânion ser tratado com solvente detergente, de preferência por Triton X-100 e TnBP, com mais preferência por concentrações de 1% de Triton X-100 e 0,3% de TnBP por 4,5 a 8 horas para inativar vírus revestidos com lipídeo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelos detergentes da mistura de incubação serem removidos através de extração de fases sólida e líquida.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por pelo menos um dos métodos selecionados do grupo consistindo em tratamento com UV-C, tratamento com calor, filtragem de vírus e remoção e inativação de príon é combinado com um tratamento de caprilato de acordo com a reivindicação 1.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo valor do pH quando da extração da fase sólida ser ajustado para 6,7 a 6,9.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela solução ser submetida à segunda cromatografia de troca de ânion.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo valor do pH da fração contendo as proteínas que não se ligarem à

Petição 870180146882, de 31/10/2018, pág. 9/13 coluna do trocador de ânion é ajustado para 3,5 a 4,5, de preferência para pH 4,0 ± 0,1.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela solução de IgG ser contatada por um filtro de vírus.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela solução de IgG ser contatada por um nanofiltro.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela solução ser IgG é incubada por pelo menos 24 horas, de preferência a 37°C ± 1.

18. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela solução de IgG ser concentrada para 5%.

19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela solução de IgG ser concentrada para 10%.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pela osmolaridade do concentrado ser ajustada para 200 a 400 mOsmol/kg.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela solução de IgG ter o pH ajustado para 3,5 para 6,0, de preferência para um valor de pH de 4,0 a 5,5.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pela solução de IgG ser filtrada estéril e enchida em garrafas de vidro ou recipientes de plástico.