BE1029863B1

BE1029863B1 - WERKWIJZEN VOOR HET PRODUCEREN VAN IMMUNOGLOBULINE G (IgG) PREPARATEN EN/OF OPLOSSINGEN

Info

Publication number: BE1029863B1
Application number: BE20225354A
Authority: BE
Inventors: Jean-Sébastien Sohier; Anna Hull; Stéphane Baurin
Original assignee: Prothya Biosolutions Belgium
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2023-05-12

Abstract

De huidige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het produceren van immunoglobulineG (IgG) preparaten of oplossingen, omvattende onder andere de stappen - het toevoegen van caprylzuur aan een eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie 4,60 tot 5,00 bedraagt; - het filtreren van het IgG supernatant; - het bereiden van een IgG oplossing met een eiwit-concentratie van minstens ongeveer 40,0 g/L en een pH van minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; - het opzuiveren van de IgG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie. Verder voorziet de uitvinding ook in een IgG preparaat, bij voorkeur omvattende: - immunoglobuline G (IgG); - ongeveer 8,4 gewichtsprocent sucrose; - ongeveer 0,6 gewichtsprocent glycine; - ongeveer 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; - acetaat buffer; waarbij de pH van het preparaat ongeveer 4,40 is.

Description

1 BE2022/5354

WERKWIJZEN VOOR HET PRODUCEREN VAN IMMUNOGLOBULINE G (IgG) PREPARATEN EN/OF

OPLOSSINGEN

GEBIED VAN DE UITVINDING

Hierin worden werkwijzen beschreven voor het produceren van immunoglobuline G (lgG) preparaten en/of immunoglobuline G (IgG) oplossingen. De werkwijzen die worden beschreven kunnen worden gebruikt voor het opzuiveren van IgG en/of het op-concentreren van IgG. Verder worden ook IgG oplossingen en IgG preparaten hierin beschreven.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Het gebruik van IgG oplossingen en preparaten in de behandeling van verschillende ziektes is gekend.

Vaak dienen hiervoor IgG oplossingen en preparaten intraveneus worden toegediend. Dit leidt dan weer tot een vraag naar uiterst zuivere IgG oplossingen en preparaten.

Klassiek wordt IgG gewonnen uit plasma van donoren door het neer te slaan in een pasta, waarna het nog een hele reeks zuiveringstappen dient te ondergaan vooraleer het kan worden gebruikt voor de behandeling van ziektes en aandoeningen. Door dat het opzuiveren zo complex is en veel stappen omvat is uiteindelijke opbrengst (rendement) echter laag. Er is dus een vraag naar werkwijzen IgG oplossingen en preparaten met een hogere opbrengst. Een vraag naar meer efficiënte zuiveringsprocessen. Omdat het hier gaat om een product dat zijn oorsprong vindt in gedoneerd plasma, is zelfs een kleine verhoging in opbrengst al een aanzienlijk voordeel.

Er is ook een vraag naar halffabricaten, zijnde IgG oplossingen of preparaten die nog verdere productiestappen of zuiveringsstappen dienen te ondergaan. Vaak worden deze verdere productiestappen of zuiveringsstappen op een andere locatie uitgevoerd of op een ander tijdstip. Om te vermijden dat het IgG in de halffabricaten destabiliseert, neerslaat of denaturaliseert, worden deze halffabricaten vaak bevroren. Echter het ondergaan van verschillende vries/dooi cycli komt de kwaliteit en hoeveelheid IgG niet ten goede. En het vergt ook extra handelingen en apparatuur. Daarom is er vraag naar stabiele, bij voorkeur vloeibare, IgG preparaten en oplossingen, die ofwel gestockeerd kunnen worden en/of getransporteerd kunnen worden.

Er is verder ook een vraag naar IgG preparaten en oplossingen die over een breed deel van de bevolking toepasbaar zijn in hierboven genoemde behandelingsmethodes. Bij voorkeur veroorzaken de IgG preparaten geen hemolyse.

2 BE2022/5354

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De huidige uitvinding voorziet een oplossing voor één of meerdere van de hierboven vermeldde uitdagingen en/of vragen. De uitvinders hebben gevonden dat het gebruik van caprylzuur voor het neerslaan van onzuiverheden in de werkwijzen voor het bereiden van IgG oplossingen een hoger rendement kan opleveren. Het laat de uitvinders toe om onzuiverheden af te filteren bij een pH waarop de IgG stabiel in oplossing blijft, en waardoor er dus minder IgG neerslaat en/of denatureert. Hierdoor dient pas net voor het uitvoeren van chromatografie de pH te worden aangepast naar een meer kritische waarde, maar omdat er dan al veel onzuiverheden verwijderd zijn, kan ook bij deze kritische pH-waarde meer IgG in suspensie gehouden worden.

In een eerste aspect voorziet de uitvinding in een werkwijze voor het produceren van immunoglobuline

G (lgG) preparaten of immunoglobuline G (lgG) oplossingen, omvattende de stappen: a) het voorzien van een IgG bevattende pasta; b} het resuspenderen van de pasta in een eerste buffer om een eerste IgG suspensie te vormen; c) het toevoegen van caprylzuur aan de eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een neerslag en een IgG supernatant; d) het filtreren van het IgG supernatant bekomen in stap c) doorheen een filter, daarbij bekomende een IgG filtraat; e) optioneel, het concentreren van het IgG filtraat bekomen in stap d), bij voorkeur over een eerste semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing; f) optioneel, het uitwisselen van de buffer uit de eerste geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap d), bij voorkeur door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer bij een pH die minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een tweede

IgG oplossing; g) optioneel, het concentreren van de tweede IgG oplossing bekomen in stap f), bij voorkeur over het tweede semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een tweede ultrafiltratie, daarbij bekomende een derde geconcentreerde IgG oplossing; h} het verdunnen van: - het IgG filtraat, wanneer stap e), stap f) en stap g) niet zijn uitgevoerd;

3 BE2022/5354 - de eerste geconcentreerde IgG oplossing, wanneer stap e) is uitgevoerd, en stappen f) en g) niet zijn uitgevoerd; - de tweede IgG oplossing, wanneer stappen e) en f) zijn uitgevoerd, en stap g) niet is uitgevoerd; of, - de derde geconcentreerde IgG oplossing; wanneer stappen e), f) en g) zijn uitgevoerd; door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met: - een eiwit-concentratie van minstens 10,0 g/L tot hoogstens 70,0 g/L, bij voorkeur minstens 15,0 g/L tot hoogstens 65,0 g/L, bij voorkeur minstens 20,0 g/L tot hoogstens 60,0 g/L, bij voorkeur minstens 25,0 g/L tot hoogstens 55,0 g/L, bij voorkeur minstens 30,0 g/L tot hoogstens 50,0 g/L, bij voorkeur minstens 35,0 g/L tot hoogstens 45,0 g/L, bij voorkeur minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur 40,0 g/l; en, - een pH van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens 6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; ij) het opzuiveren van de vierde IgG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie, daarbij bekomende eerste IgG omvattende doorstroom; j) optioneel, het opzuiveren van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen is stap i) via van affiniteitschromatografie, daarbij bekomende een tweede IgG omvattende doorstroom.

In een uitvoeringsvorm omvat de werkwijze verder: k) het aanpassen van de pH van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen in stap i} of van de tweede IgG omvattende doorstroom wanneer stap j) is uitgevoerd, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur 4,40; en,

I) optioneel, het concentreren van de vijfde IgG oplossing bekomen in stap k), bij voorkeur over het derde semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een derde ultrafiltratie, daarbij bekomende een zesde geconcentreerde IgG oplossing.

4 BE2022/5354

In een uitvoeringsvorm omvat de werkwijze verder: m) het stabiliseren van de bekomen IgG oplossing of IgG doorstroom, door het toevoegen van één of meerdere excipiënt en/of het aanpassen van de pH, daarbij bekomende een stabiele IgG preparaat.

In een uitvoeringsvorm wordt de één of meerdere excipiënt in stap m) gekozen uit de lijst van sucrose, glycine en/of natriumchloride.

In een uitvoeringsvorm is de vierde IgG oplossing: - een eiwit-concentratie van minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur 40,0 g/L heeft; en, - een pH minstens 6,30 tot hoogstens 6,50 heeft.

In een uitvoeringsvorm is het eerste semipermeabel membraan, het tweede semipermeabel membraan en/of het derde semipermeabel membraan, hetzelfde membraan is. In een uitvoeringsvorm is het eerste semipermeabel membraan en het tweede semipermeabel membraan, hetzelfde semipermeabel membraan. Bij voorkeur wordt hetzelfde semipermeabel membraan hergebruikt in de verschillende werkwijzestappen.

In een uitvoeringsvorm laat het eerste semipermeabel membraan, tweede semipermeabel membraan en/or derde semipermeabel membraan, moleculen met een moleculairgewicht van lager dan 5 kDa, bij voorkeur lager dan 10 kDa, bij voorkeur lager dan 15 kDa, bij voorkeur lager dan 20 kDa, bij voorkeur lager dan 25 kDa, bij voorkeur lager dan 30 kDa, bij voorkeur lager dan 40 kDa, bij voorkeur lager dan 50 kDa door.

In een uitvoeringsvorm omvat de pasta, fracties II+III, bij voorkeur fracties I+II+IIl bekomen uit het Cohn proces.

In een uitvoeringsvorm omvat stap c) na het toevoegen van het caprylzuur een rijpingsstap, van minstens min, bij voorkeur minstens 60 min, bij voorkeur minstens 90 min, bij voorkeur minstens 120 min, bij voorkeur minstens 150 min, bij voorkeur minstens 120 min.

In een uitvoeringsvorm maakt de anionuitwisselingschromatografie in stap i} gebruik van een sterk basisch anionuitwisselaarhars.

In een uitvoeringsvorm wordt bij het opzuiveren via affiniteitschromatografie gebruik gemaakt van een medium of een mengsel van media, waarop N-acetyl-galactosamine (GalNAc) - Galactose (Gal) - Fucose (Fuc), en Galactose-Galactose-Fucose groepen voorzien zijn.

In een tweede aspect voorziet de uitvinding Een IgG preparaat, bij voorkeur een intraveneus IgG 5 preparaat, bekomen uit een werkwijze volgens minsten één van voorgaande conclusies.

In een uitvoeringsvorm omvat het IgG preparaat: - immunoglobuline G (lgG}; - minstens 7,0 gewichtsprocent tot hoogstens 10,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,0 gewichtsprocent tot hoogstens 9,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,2 gewichtsprocent tot hoogstens 8,6 gewichtsprocent, bij voorkeur 8,4 gewichtsprocent sucrose; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 1,2 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 1,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,5 gewichtsprocent tot hoogstens 0,8 gewichtsprocent, bij voorkeur 0,6 gewichtsprocent glycine; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 0,6 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 0,4 gewichtsprocent, bij voorkeur 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; - acetaat buffer; waarbij de pH van het preparaat minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur 4,40.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Hoewel ze potentieel dienen als een gids voor het begrip, zal elk verwijzingsteken in de conclusies niet opgevat worden als een beperking voor de beschermingsomvang ervan.

Zoals hierin gebruikt, omvatten de enkelvoudige vormen "een", "het" en "de" zowel enkelvoud als meervoud tenzij de context duidelijk anders aangeeft.

De termen "omvattende", "omvat" en "omvattend" zoals hierin gebruikt, zijn synoniem met "met inbegrip van", "bevat" of "bevatten", "bevat", en zijn inclusief of open-einde en sluiten bijkomende, niet- genoemde leden, elementen of werkwijzestappen niet uit. De termen "omvattende", "omvat" en "omvattend", wanneer verwezen wordt naar genoemde bestanddelen, elementen of werkwijzestappen, omvat ook uitvoeringen die "bestaat uit", genoemde gereciteerde componenten, elementen of werkwijzestappen.

6 BE2022/5354

Bovendien worden de termen eerste, tweede, derde en dergelijke in de beschrijving en in de conclusies gebruikt om onderscheid te maken tussen gelijkaardige elementen en niet noodzakelijk voor het beschrijven van een opeenvolgende of chronologische volgorde, tenzij anders aangegeven. Het zal duidelijk zijn dat de aldus gebruikte termen onderling verwisselbaar zijn onder geschikte omstandigheden en dat de hierin beschreven uitvoeringsvormen kunnen werken in een andere volgorde dan hierin beschreven of geïllustreerd.

De waarden, zoals hierin gebruikt voor het verwijzen naar een meetbare waarde, zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur, en dergelijke, zijn bedoeld om variaties van +/-10 % of minder te omvatten, bij voorkeur +/-5 % of minder, meer bij voorkeur +/-1 % of minder, en nog meer bij voorkeur +/-0,1 % of minder van de opgegeven waarde, voor zover dergelijke variaties geschikt zijn om één of meer van de technische effecten die hierin overwogen worden, te verzekeren. Het zal duidelijk zijn dat elke waarde zoals hierin gebruikt, zelf ook specifiek en bij voorkeur onthuld wordt.

Het vermelden van numerieke bereiken door eindpunten omvat alle getallen en fracties die binnen de respectievelijke bereiken liggen, evenals de vermelde eindpunten.

Alle documenten, geciteerd in de huidige beschrijving, worden hierbij opgenomen door verwijzing in hun geheel.

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle termen die gebruikt worden in de hierin beschreven concepten, met inbegrip van de technische en wetenschappelijke termen, de betekenis zoals gewoonlijk begrepen door een vakman. Voor verdere begeleiding werden definities voor de gebruikte termen in de beschrijving opgenomen om beter de leer van de huidige beschrijving te begrijpen. De begrippen en definities die hierin gebruikt worden, zijn uitsluitend bedoeld om te helpen bij het begrijpen van de leer die hierin voorzien wordt.

De term “caprylzuur” zoals gebruikt hierin verwijst naar een verzadigd carbonzuur met brutoformule

CsH:1s02, en kan worden voorgesteld door structuurformule (1): a A0

OH (1) “Octaanzuur” wordt als synoniem voor caprylzuur gebruikt. Caprylzuur heeft 124-07-2 als CAS nummer.

Verwijzing in deze beschrijving naar " één uitvoeringsvorm " of" een uitvoering " betekent dat een bepaald kenmerk, structuur of eigenschap, beschreven in verband met de uitvoeringsvorm omvat is in ten minste

7 BE2022/5354 één uitvoeringsvorm die hierin overwogen wordt. Dus, het gebruik van de bewoordingen "in één uitvoeringsvorm" of "in een uitvoeringsvorm" op verschillende plekken in deze beschrijving verwijst niet noodzakelijk allemaal naar dezelfde uitvoeringsvorm, maar het kan. Verder kunnen de specifieke kenmerken, structuren of eigenschappen gecombineerd worden op elke geschikte wijze, zoals duidelijk zou zijn voor een vakman uit deze openbaring, in één of meer uitvoeringsvormen. Bovendien, terwijl sommige uitvoeringsvormen die hierin beschreven worden, sommige, maar niet andere kenmerken omvatten die omvat zijn in andere uitvoeringsvormen, worden combinaties van kenmerken van verschillende uitvoeringsvormen ook hierin overwogen, en vormen ze verschillende uitvoeringsvormen, zoals duidelijk zal zijn voor de vakman. Bijvoorbeeld kunnen in de bijgevoegde conclusies, elk van de kenmerken van de geclaimde uitvoeringsvormen worden gebruikt in elke combinatie.

Geprefereerde stellingen (kenmerken), uitvoeringsvormen en gebruiken van de uitvinding zijn hierin beschreven. Elke stelling en uitvoeringsvorm van de uitvinding hierin beschreven kan gecombineerd worden met elke andere stelling en/of uitvoeringsvorm, tenzij het tegengestelde is aangegeven. In het bijzonder kan elk kenmerk dat is aangegeven als zijnde de voorkeur of voordelig zijn, worden gecombineerd met elk ander kenmerk of kenmerken of stelling die zijn aangegeven als zijnde de voorkeur of voordelig. Hiertoe wordt de onderhavige uitvinding in het bijzonder vastgelegd door een of een combinatie van een of meer van de hieronder genummerde stellingen en uitvoeringsvormen, met ieder ander aspect en/of uitvoeringsvormen. 1. Een werkwijze voor het produceren van immunoglobuline G (IgG) preparaten of immunoglobuline

G (IgG) oplossingen, omvattende de stappen: a) het voorzien van een IgG bevattende pasta; b} het resuspenderen van de pasta in een eerste buffer om een eerste IgG suspensie te vormen; c) het toevoegen van caprylzuur aan de eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een neerslag en een IgG supernatant; d) het filtreren van het IgG supernatant bekomen in stap c) doorheen een filter, daarbij bekomende een IgG filtraat; e) optioneel, het concentreren van het IgG filtraat bekomen in stap d), bij voorkeur over een eerste semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing;

8 BE2022/5354 f) optioneel, het uitwisselen van de buffer uit de eerste geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap d), bij voorkeur door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer bij een pH die minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een tweede

IgG oplossing; g) optioneel, het concentreren van de tweede IgG oplossing bekomen in stap f), bij voorkeur over het tweede semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een tweede ultrafiltratie, daarbij bekomende een derde geconcentreerde IgG oplossing; h} het verdunnen van: - het IgG filtraat, wanneer stap e), stap f) en stap g) niet zijn uitgevoerd; - de eerste geconcentreerde IgG oplossing, wanneer stap e) is uitgevoerd, en stappen f) en g) niet zijn uitgevoerd; - de tweede IgG oplossing, wanneer stappen e) en f) zijn uitgevoerd, en stap g) niet is uitgevoerd; of, - de derde geconcentreerde IgG oplossing; wanneer stappen e), f) en g) zijn uitgevoerd; door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met: - een eiwit-concentratie van minstens 10,0 g/L tot hoogstens 70,0 g/L, bij voorkeur minstens 15,0 g/L tot hoogstens 65,0 g/L, bij voorkeur minstens 20,0 g/L tot hoogstens 60,0 g/L, bij voorkeur minstens 25,0 g/L tot hoogstens 55,0 g/L, bij voorkeur minstens 30,0 g/L tot hoogstens 50,0 g/L, bij voorkeur minstens 35,0 g/L tot hoogstens 45,0 g/L, bij voorkeur minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur ongeveer 40,0 g/l; en, - een pH van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens 6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; ij) het opzuiveren van de vierde 1gG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie, daarbij bekomende eerste IgG omvattende doorstroom; j) optioneel, het opzuiveren van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen is stap i) via van affiniteitschromatografie, daarbij bekomende een tweede IgG omvattende doorstroom. 2. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, verder omvattende:

9 BE2022/5354 k) het aanpassen van de pH van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen in stap i} of van de tweede IgG omvattende doorstroom wanneer stap j) is uitgevoerd, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur ongeveer 4,40; en,

I) optioneel, het concentreren van de vijfde IgG oplossing bekomen in stap k), bij voorkeur over het derde semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een derde ultrafiltratie, daarbij bekomende een zesde geconcentreerde IgG oplossing. 3. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, verder omvattende: - het stabiliseren van de bekomen IgG oplossing of IgG doorstroom, door het toevoegen van één of meerdere excipiënt en/of het aanpassen van de pH, daarbij bekomende een stabiele IgG preparaat. 4. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, omvattende de stappen: a) het voorzien van een IgG bevattende pasta; b} het resuspenderen van de pasta in een eerste buffer om een eerste IgG suspensie te vormen; c) het toevoegen van caprylzuur aan de eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een neerslag en een IgG supernatant; d) het filtreren van het IgG supernatant bekomen in stap c) doorheen een filter, daarbij bekomende een IgG filtraat; e) optioneel, het concentreren van het IgG filtraat bekomen in stap d), bij voorkeur over een eerste semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing; f) optioneel, het uitwisselen van de buffer uit de eerste geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap d), bij voorkeur door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer bij een pH die minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een tweede

10 BE2022/5354 - de eerste geconcentreerde IgG oplossing, wanneer stap e) is uitgevoerd, en stappen f) en g) niet zijn uitgevoerd; - de tweede IgG oplossing, wanneer stappen e) en f) zijn uitgevoerd, en stap g) niet is uitgevoerd; of, - de derde geconcentreerde IgG oplossing; wanneer stappen e), f) en g) zijn uitgevoerd; door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met: - een eiwit-concentratie van minstens 10,0 g/L tot hoogstens 70,0 g/L, bij voorkeur minstens 15,0 g/L tot hoogstens 65,0 g/L, bij voorkeur minstens 20,0 g/L tot hoogstens 60,0 g/L, bij voorkeur minstens 25,0 g/L tot hoogstens 55,0 g/L, bij voorkeur minstens 30,0 g/L tot hoogstens 50,0 g/L, bij voorkeur minstens 35,0 g/L tot hoogstens 45,0 g/L, bij voorkeur minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur ongeveer 40,0 g/l; en, - een pH van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens 6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; ij) het opzuiveren van de vierde 1gG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie, daarbij bekomende eerste IgG omvattende doorstroom; j) optioneel, het opzuiveren van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen is stap i) via van affiniteitschromatografie, daarbij bekomende een tweede IgG omvattende doorstroom; k) het aanpassen van de pH van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen in stap i} of van de tweede IgG omvattende doorstroom wanneer stap j) is uitgevoerd, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur ongeveer 4,40;

I) optioneel, het concentreren van de vijfde IgG oplossing bekomen in stap k), bij voorkeur over het derde semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een derde ultrafiltratie, daarbij bekomende een zesde geconcentreerde IgG oplossing; en,

11 BE2022/5354 m) optioneel, het stabiliseren van de vijfde IgG oplossing of de zesde geconcentreerde IgG oplossing wanneer stap |) is uitgevoerd, door het toevoegen van één of meerdere excipiënt en/of het aanpassen van de pH, daarbij bekomende een stabiele IgG preparaat.

5. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, omvattende de stappen: a) het voorzien van een IgG bevattende pasta;

b} het resuspenderen van de pasta in een eerste buffer om een eerste IgG suspensie te vormen;

c) het toevoegen van caprylzuur aan de eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een neerslag en een IgG supernatant;

d) het filtreren van het IgG supernatant bekomen in stap c) doorheen een filter, daarbij bekomende een IgG filtraat;

e) het concentreren van het IgG filtraat bekomen in stap d), bij voorkeur over een eerste semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing;

f) het uitwisselen van de buffer uit de eerste geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap d), bij voorkeur door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer bij een pH die minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een tweede IgG oplossing;

g) het concentreren van de tweede IgG oplossing bekomen in stap f), bij voorkeur over het tweede semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een tweede ultrafiltratie,

daarbij bekomende een derde geconcentreerde IgG oplossing;

h} het verdunnen van de derde geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap g)door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met:

- een eiwit-concentratie van minstens 10,0 g/L tot hoogstens 70,0 g/L, bij voorkeur minstens 15,0 g/L tot hoogstens 65,0 g/L, bij voorkeur minstens 20,0 g/L tot hoogstens

60,0 g/L, bij voorkeur minstens 25,0 g/L tot hoogstens 55,0 g/L, bij voorkeur minstens 30,0 g/L tot hoogstens 50,0 g/L, bij voorkeur minstens 35,0 g/L tot hoogstens 45,0 g/L, bij voorkeur minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur ongeveer 40,0 g/l; en,

- een pH van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens

6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot

12 BE2022/5354 hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; ij) het opzuiveren van de vierde 1gG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie, daarbij bekomende eerste IgG omvattende doorstroom; j) het opzuiveren van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen is stap i) via van affiniteitschromatografie, daarbij bekomende een tweede IgG omvattende doorstroom; k) het aanpassen van de pH van de tweede IgG doorstroom bekomen in stap j}, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, bij voorkeur minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur ongeveer 4,40;

I) het concentreren van de vijfde IgG oplossing bekomen in stap k), bij voorkeur over het derde semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een derde ultrafiltratie, daarbij bekomende een zesde geconcentreerde IgG oplossing; en, m) het stabiliseren van de zesde geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap |), door het toevoegen van één of meerdere excipiënt en/of het aanpassen van de pH, daarbij bekomende een stabiele IgG preparaat. 6. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij de vierde IgG oplossing: - een eiwit-concentratie van minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur ongeveer 40,0 g/L heeft; en, - een pH minstens 6,30 tot hoogstens 6,50 heeft. 7. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij: - de vierde IgG oplossing: o een eiwit-concentratie van minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur ongeveer 40,0 g/L heeft; en, o een pH minstens 6,30 tot hoogstens 6,50 heeft; en, - de vijfde IgG oplossing een pH heeft van minstens 4,20 tot hoogstens 4,70. 8. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij: - de vierde IgG oplossing:

13 BE2022/5354 o een eiwit-concentratie van minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur ongeveer 40,0 g/L heeft; en, o een pH minstens 6,30 tot hoogstens 6,50 heeft; - de vijfde IgG oplossing een pH heeft van minstens 4,20 tot hoogstens 4,70; en, - de het IgG preparaat bekomen in stap m) een pH heeft van minstens 4,20 tot hoogstens 4,70. 9. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij het eerste semipermeabel membraan, het tweede semipermeabel membraan en/of het derde semipermeabel membraan, hetzelfde membraan is. 10. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij de één of meerdere excipiënt in stap m) gekozen wordt uit de lijst van sucrose, glycine en/of natriumchloride. 11. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij de IgG bevattende pasta verkregen werd uit plasma; bij voorkeur humaan plasma. 12. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de pasta fracties III, bij voorkeur fracties I+II+IIl bekomen uit het Cohn proces omvat. 13. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij het IgG preparaat een intraveneus

IgG preparaat is. 14. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de fracties |, Il en/of Ill tijdens het Cohn proces bekomen worden door neerslagvorming uit plasma, startende bij een ethanolgradiënt van 8% ethanol tot 25% ethanol, gecombineerd met een temperatuurgradiënt over dezelfde periode van de ethanolgradiënt startende van -3°C tot -5°C. 15. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij het IgG, humaan IgG is. 16. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste buffer een acetaat buffer is. 17. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste buffer een pH heeft van minstens 4,0 tot hoogstens 5,6; bij voorkeur minstens 4,2 tot hoogstens 5,4; bij voorkeur minstens 4,4 tot hoogstens 5,2; bij voorkeur minstens 4,6 tot hoogstens 5,0; bij voorkeur minstens 4,7 tot hoogstens 5,9; bij voorkeur ongeveer 4,8.

14 BE2022/5354

18. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste buffer een pH heeft van minstens 3,50 tot hoogstens 6,00, bij voorkeur minstens 3,80 tot hoogstens 5,80, bij voorkeur minstens 4,00 tot hoogstens 5,60, bij voorkeur minstens 4,20 tot hoogstens 5,40, bij voorkeur minstens 4,40 tot hoogstens 5,20, bij voorkeur minstens 4,60 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur ongeveer 4,80.

19. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste buffer een conductiviteit heeft van minstens 2,10 mS/cm tot hoogstens 4,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,40 mS/cm tot hoogstens 4,10 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,60 mS/cm tot hoogstens 3,90 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,80 mS/cm tot hoogstens 3,70 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,00 mS/cm tot hoogstens 3,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,10 mS/cm tot hoogstens 3,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,20 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 3,30 mS/cm.

20. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste buffer een concentratie heeft van minstens 25,0 mM tot hoogstens 150,0 mM, bij voorkeur minstens 50,0 mM tot hoogstens 125,0 mM; minstens 60,0 mM tot hoogstens 100,0 mM; minstens 70,0 mM tot hoogstens 90,0 mM; minstens 75,0 mM tot hoogstens 85,0 mM, bij voorkeur een ongeveer 80,0 mM acetaat buffer.

21. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij bij het resuspenderen in stap b) minstens 2,0 kg eerste buffer/kg pasta, bij voorkeur minstens 4,0 kg buffer/kg pasta, bij voorkeur minstens 6,0 kg buffer/kg pasta, bij voorkeur minstens 8,0 kg buffer/kg pasta wordt toegevoegd.

22. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de conductiviteit van de eerste IgG suspensie gevormd in stap b) minstens 2,10 mS/cm tot hoogstens 4,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,40 mS/cm tot hoogstens 4,10 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,60 mS/cm tot hoogstens 3,90 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,80 mS/cm tot hoogstens 3,70 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,00 mS/cm tot hoogstens 3,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,10 mS/cm tot hoogstens 3,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,20 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 3,30 mS/cm bedraagt.

23. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij in stap c) na het toevoegen van het caprylzuur de pH van de eerste suspensie minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur minstens 4,75 tot hoogstens 4,85, bij voorkeur ongeveer 4,80 bedraagt.

15 BE2022/5354 24. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij in stap c) minstens 0,8 wt% (gewichtsprocent) tot hoogstens 1,6 wt%, bij voorkeur minstens 1,0 wt% tot hoogstens 1,4 wt% bij voorkeur minstens 1,1 wt% tot hoogstens 1,3 wt%, bij voorkeur ongeveer 1,2 wt% caprylzuur toegevoegd wordt ten opzichte van het gewicht van de eerste IgG suspensie.

25. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij in stap c) het caprylzuur toegevoegd wordt over een periode van minstens 15 minuten, bij voorkeur minstens 30 minuten, bij voorkeur minstens 45 minuten, nog meer bij voorkeur minstens 60 minuten.

26. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij stap c) na het toevoegen van het caprylzuur een rijpingsstap omvat, van minstens 30 min, bij voorkeur minstens 60 min, bij voorkeur minstens 90 min, bij voorkeur minstens 120 min, bij voorkeur minstens 150 min, bij voorkeur minstens 120 min. 27. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de filter in stap d) een dieptefilter is. 28. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de poriegrootte van de filter in stap d} minstens 0,5 tot hoogstens 15,0 um, bij voorkeur minstens 0,7 um tot hoogstens 12,0 um, bij voorkeur minstens 1,0 um tot hoogstens 10,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 9,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 7,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 5,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 3,0 um is. 29. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij het filtreren in stap d) gebeurt aan ratio van hoogstens 120 kg, bij voorkeur hoogstens 100 kg, bij voorkeur hoogstens 80 kg suspensie per vierkante meter filter. 30. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij het residu op de filter in stap d) wordt gewassen met een derde buffer. 31. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de derde buffer een pH heeft van minstens 4,0 tot hoogstens 5,6; bij voorkeur minstens 4,2 tot hoogstens 5,4; bij voorkeur minstens 4,4 tot hoogstens 5,2; bij voorkeur minstens 4,6 tot hoogstens 5,0; bij voorkeur minstens 4,7 tot hoogstens 4,9; bij voorkeur ongeveer 4,8. 32. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de derde buffer een acetaat buffer is.

16 BE2022/5354

33. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste buffer en de derde buffer dezelfde zijn.

34. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij de vierde buffer een acetaat buffer is.

35. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij de vierde buffer een minstens 5,0 mM tot hoogstens 50,0 mM, bij voorkeur minstens 7,0 mM tot hoogstens 40,0 mM; minstens 10,0 mM tot hoogstens 30,0 mM; minstens 12,0 mM tot hoogstens 20,0 mM; minstens 12,0 mM tot hoogstens 17,0 mM, bij voorkeur een ongeveer 15,0 mM acetaatsbuffer is.

36. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij bij het eerste semipermeabel membraan, tweede semipermeabel membraan en/or derde semipermeabel membraan, moleculen met een moleculairgewicht van lager dan 5 kDa, bij voorkeur lager dan 10 kDa, bij voorkeur lager dan 15 kDa, bij voorkeur lager dan 20 kDa, bij voorkeur lager dan 25 kDa, bij voorkeur lager dan 30 kDa, bij voorkeur lager dan 40 kDa, bij voorkeur lager dan 50 kDa doorlaat.

37. De werkwijze volgens minsten één van de voorgaande stellingen waarbij het eerste semipermeabel membraan, tweede semipermeabel membraan en/or derde semipermeabel membraan, moleculen met een moleculairgewicht hoger dan 50 kDa, bij voorkeur hoger dan 40 kDa, bij voorkeur hoger dan 30 kDa tegenhoudt.

38. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij het eerste semipermeabel membraan, tweede semipermeabel membraan en/or derde semipermeabel membraan een polyethersulfon membraan omvat.

39. De werkwijze volgens één der voorgaande stellingen, waarbij het eerste semipermeabel membraan, het tweede semipermeabel membraan en/of het derde semipermeabel membraan, hetzelfde semipermeabel membraan is; bij voorkeur waarbij het eerste semipermeabel membraan, het tweede semipermeabel membraan en het derde semipermeabel membraan, hetzelfde semipermeabel membraan is.

40. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de eerste geconcentreerde IgG oplossing in stap e) geconcentreerd wordt met minstens een factor 2, bij voorkeur minstens een factor 3, bij voorkeur minstens een factor 4, bij voorkeur minstens een factor 5, bij voorkeur minstens een factor 6 ten opzichte van het IgG filtraat bekomen in stap d).

17 BE2022/5354 41. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de diafiltratie in step f) plaatsvindt met behulp van minstens 1 volume tweede buffer, bij voorkeur bij minstens 2 volumes tweede buffer, bij voorkeur minstens 3 volumes tweede buffer, ten opzichte van 1 volume geconcentreerde IgG oplossing. 42. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de tweede buffer een pH heeft van minstens 3,50 tot hoogstens 6,00, bij voorkeur minstens 3,80 tot hoogstens 5,80, bij voorkeur minstens 4,00 tot hoogstens 5,60, bij voorkeur minstens 4,20 tot hoogstens 5,40, bij voorkeur minstens 4,40 tot hoogstens 5,20, bij voorkeur minstens 4,60 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur ongeveer 4,80. 43. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de tweede buffer een conductiviteit heeft van minstens 0,50 mS/cm tot hoogstens 1,90 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,60 mS/cm tot hoogstens 1,80 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,70 mS/cm tot hoogstens 1,70 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,80 mS/cm tot hoogstens 1,60 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,90 mS/cm tot hoogstens 1,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,00 mS/cm tot hoogstens 1,40 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,10 mS/cm tot hoogstens 1,30 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 1,20 mS/cm. 44. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de tweede buffer een concentratie heeft van minstens 15,0 mM tot hoogstens 50,0 mM, bij voorkeur minstens 20,0 MM tot hoogstens 40,0 mM; minstens 22,0 mM tot hoogstens 37,0 mM; minstens 25,0 mM tot hoogstens 35,0 mM; minstens 27,0 mM tot hoogstens 32,0 mM, bij voorkeur een ongeveer 30,0 mM acetaat buffer. 45. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de tweede buffer een acetaat buffer is. 46. .De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de conductiviteit van de

IgG oplossing gevormd in stap f) minstens 0,5 mS/cm en hoogstens 2,0 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,7 mS/cm en hoogstens 1,5 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,0 mS/cm en hoogstens 1,4 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,1 mS/cm en hoogstens 1,3 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 1,2 mS/cm bedraagt. 47. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik maakt van een sterk basisch anionuitwisselaarhars.

18 BE2022/5354

48. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik maakt van een epoxy hars.

49. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik maakt van een hars dat -N*(CH:)}3 functionele groepen omvat.

50. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik maakt van een hars met een deeltjesgrootte van minstens 30 um tot hoogstens 60 um, bij voorkeur van minstens 35 um tot hoogstens 55 um, bij voorkeur van minstens 38 um tot hoogstens 53 um.

51. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij in stap i) de vierde IgG oplossing geladen wordt op het hars na een filtratie, bij voorkeur door een filter met een poriegrootte van minstens 0,5 tot hoogstens 15,0 um, bij voorkeur minstens 0,7 um tot hoogstens 12,0 um, bij voorkeur minstens 1,0 um tot hoogstens 10,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 9,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 7,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 5,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 3,0 um.

52. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij in stap i) het IgG door de kolom loopt door afstoting van het hars met een anion oplossing, bij voorkeur een equilibratie- oplossing; bij voorkeur een acetaat oplossing.

53. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anion/equilibratie oplossing een conductiviteit heeft van minstens 1,00 mS/cm en hoogstens 3,00 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,50 mS/cm en hoogstens 2,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,80 mS/cm en hoogstens 2,20 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,90 mS/cm en hoogstens 2,10 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 2,00 mS/cm.

54. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anion/equilibratie oplossing pH heeft van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens 6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50.

55. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de anion/equilibratie oplossing een concentratie heeft van minstens 5,0 mM tot hoogstens 50,0 mM, bij voorkeur

19 BE2022/5354 minstens 7,0 mM tot hoogstens 40,0 mM; minstens 10,0 mM tot hoogstens 30,0 mM; minstens 12,0 mM tot hoogstens 20,0 mM; minstens 12,0 mM tot hoogstens 17,0 mM, bij voorkeur ongeveer 15,0 mM acetaat. 56. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij bij het opzuiveren via affiniteitschromatografie gebruik gemaakt wordt van een medium of een mengsel van media, waarop N-acetyl-galactosamine (GalNAc} - Galactose (Gal) - Fucose (Fuc), en Galactose-Galactose-

Fucose groepen voorzien zijn. 57. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij bij het opzuiveren via affiniteitschromatografie gebruik gemaakt wordt van een medium of een mengsel van media, waarop groepen voorzien zijn die overeenkomende met de epitopen van bloed groepen A en B. 58. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij de zesde geconcentreerde

IgG oplossing in stap |) geconcentreerd wordt met minstens een factor 2, bij voorkeur minstens een factor 3, bij voorkeur minstens een factor 4, bij voorkeur minstens een factor 5, bij voorkeur minstens een factor 6 ten opzichte van de vijfde IgG oplossing bekomen in stap k). 59. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande stellingen, waarbij het IgG preparaat een zuiverheid van minstens 90%, bij voorkeur minstens 95%, nog meer bij voorkeur minsten 99% heeft. 60. Een IgG preparaat, bij voorkeur een intraveneus IgG preparaat, bekomen uit een werkwijze volgens minsten één van voorgaande stellingen. 61. Het IgG preparaat van stelling 60, waarbij het IgG preparaat een zuiverheid op eiwitniveau van minstens 90,0 %, bij voorkeur minstens 95,0 %, bij voorkeur minsten 99,0 %, bij voorkeur minsten 99,5 %, bij voorkeur minsten 99,7 %, bij voorkeur minsten 99,9 %, bij voorkeur 100,0 % heeft. 62. Een IgG preparaat omvattende: - minstens 1,0 gewichtsprocent tot hoogstens 10,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 2,0 gewichtsprocent tot hoogstens 8,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 3,0 gewichtsprocent tot hoogstens 7,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 3,5 gewichtsprocent tot hoogstens 6,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 4,0 gewichtsprocent tot hoogstens 5,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 4,0 gewichtsprocent tot hoogstens 5,0 gewichtsprocent immunoglobuline G (IgG);

20 BE2022/5354 - minstens 7,0 gewichtsprocent tot hoogstens 10,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 7,5 gewichtsprocent tot hoogstens 9,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,0 gewichtsprocent tot hoogstens 9,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,1 gewichtsprocent tot hoogstens 8,8 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,2 gewichtsprocent tot hoogstens 8,6 gewichtsprocent, bij voorkeur ongeveer 8,4 gewichtsprocent sucrose; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 1,2 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,2 gewichtsprocent tot hoogstens 1,1 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 1,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,4 gewichtsprocent tot hoogstens 0,9 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,5 gewichtsprocent tot hoogstens 0,8 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,6 gewichtsprocent tot hoogstens 0,7 gewichtsprocent, bij voorkeur ongeveer 0,6 gewichtsprocent glycine; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 0,6 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,2 gewichtsprocent tot hoogstens 0,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 0,4 gewichtsprocent, bij voorkeur ongeveer 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; - acetaat buffer; waarbij de pH van het preparaat minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur ongeveer 4,40 is. 63. Een IgG preparaat volgens minstens één van de stellingen 60 tot 62, omvattende: - minstens 4,0 gewichtsprocent tot hoogstens 5,0 gewichtsprocent immunoglobuline G (IgG); - minstens 8,2 gewichtsprocent tot hoogstens 8,6 gewichtsprocent, bij voorkeur ongeveer 8,4 gewichtsprocent sucrose; - minstens 0,6 gewichtsprocent tot hoogstens 0,7 gewichtsprocent, bij voorkeur ongeveer 0,6 gewichtsprocent glycine; - minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 0,4 gewichtsprocent, bij voorkeur ongeveer 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; - acetaat buffer;

21 BE2022/5354 waarbij de pH van het preparaat minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur ongeveer 4,40 is. 64. Een IgG preparaat volgens minstens één van de stellingen 60 tot 62, waarbij de acetaat buffer minstens 5,0 mM tot hoogstens 50,0 mM, bij voorkeur minstens 7,0 mM tot hoogstens 40,0 mM; minstens 10,0 mM tot hoogstens 30,0 mM; minstens 12,0 MM tot hoogstens 20,0 mM; minstens 12,0 mM tot hoogstens 17,0 mM, bij voorkeur ongeveer 15,0 mM acetaat omvat.

In een eerste aspect voorziet de uitvinding in een werkwijze voor het produceren van immunoglobulineG (IgG) preparaten of immunoglobuline G (lgG) oplossingen, omvattende de stappen: a) het voorzien van een IgG bevattende pasta; b} het resuspenderen van de pasta in een eerste buffer om een eerste IgG suspensie te vormen; c) het toevoegen van caprylzuur aan de eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een neerslag en een IgG supernatant; d) het filtreren van het IgG supernatant bekomen in stap c) doorheen een filter, daarbij bekomende een IgG filtraat; e) optioneel, het concentreren van het IgG filtraat bekomen in stap d), bij voorkeur over een eerste semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing; f) optioneel, het uitwisselen van de buffer uit de eerste geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap d), bij voorkeur door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer bij een pH die minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een tweede

IgG oplossing; g) optioneel, het concentreren van de tweede IgG oplossing bekomen in stap f), bij voorkeur over het tweede semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een tweede ultrafiltratie, daarbij bekomende een derde geconcentreerde IgG oplossing; h} het verdunnen van: - het IgG filtraat, wanneer stap e), stap f) en stap g) niet zijn uitgevoerd; - de eerste geconcentreerde IgG oplossing, wanneer stap e) is uitgevoerd, en stappen f) en g) niet zijn uitgevoerd; - de tweede IgG oplossing, wanneer stappen e) en f) zijn uitgevoerd, en stap g) niet is uitgevoerd; of,

22 BE2022/5354 - de derde geconcentreerde IgG oplossing; wanneer stappen e), f) en g) zijn uitgevoerd; door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met: - een eiwit-concentratie van minstens 10,0 g/L tot hoogstens 70,0 g/L, bij voorkeur minstens 15,0 g/L tot hoogstens 65,0 g/L, bij voorkeur minstens 20,0 g/L tot hoogstens 60,0 g/L, bij voorkeur minstens 25,0 g/L tot hoogstens 55,0 g/L, bij voorkeur minstens 30,0 g/L tot hoogstens 50,0 g/L, bij voorkeur minstens 35,0 g/L tot hoogstens 45,0 g/L, bij voorkeur minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur 40,0 g/l; en, - een pH van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens 6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; ij) het opzuiveren van de vierde 1gG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie, daarbij bekomende eerste IgG omvattende doorstroom; j) optioneel, het opzuiveren van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen is stap i) via van affiniteitschromatografie, daarbij bekomende een tweede IgG omvattende doorstroom.

In een uitvoeringsvorm omvat de werkwijze de verdere stappen van: k) het aanpassen van de pH van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen in stap i) of van de tweede IgG omvattende doorstroom wanneer stap j) is uitgevoerd, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur 4,40; en,

In een uitvoeringsvorm omvat de werkwijze de verdere stappen van: - het stabiliseren van de bekomen IgG oplossing of IgG doorstroom, door het toevoegen van één of meerdere excipiënt en/of het aanpassen van de pH, daarbij bekomende een stabiele IgG preparaat.

23 BE2022/5354

In een uitvoeringsvorm heeft de vierde IgG oplossing: - een eiwit-concentratie van minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur 40,0 g/l; en, - een pH minstens 6,30 tot hoogstens 6,50.

In een uitvoeringsvorm bedraagt de eiwitconcentratie van de vierde IgG oplossing 40,0 g/L en is de pH van de vierde IgG oplossing minstens 6,30 en hoogstens 6,50.

In een uitvoeringsvorm is het eerste semipermeabel membraan, het tweede semipermeabel membraan en/of het derde semipermeabel membraan, hetzelfde membraan. Hierdoor kan eenzelfde membraan hergebruikt worden tijdens de werkwijze, al dan niet met een was-stap tussen de verschillende gebruiken, bij voorkeur een was-stap met een zout oplossing, bij voorkeur een natriumchloride zout oplossing.

In een uitvoeringsvorm wordt de één of meerdere excipiënten gekozen uit de lijst van sucrose, glycine en/of natriumchloride. In een uitvoeringsvorm wordt sucrose, glycine en natriumchloride toegevoegd als exipiënt.

Immunoglobuline G (IgG) is een immunoglobuline dat wordt aangemaakt bij grotere hoeveelheden of bij een herhaald contact met het antigeen. Het lgG-molecuul is typisch opgebouwd uit twee zware ketens en twee lichte ketens. Binnen de lichte keten bevinden zich twee disulfidebruggen; één in het variabele gebied en één in het constante gebied. Typisch zijn er vier van deze disulfidebruggen in de zware keten, die ongeveer twee keer zo lang is als de lichte keten. Typisch vormt elke disulfideverbinding een — peptidelus van 60 tot 70 aminozuurresiduen; als de aminozuursequenties van deze lussen vergeleken worden, valt een grote mate van homologie op. Dit houdt in dat elke immunoglobuline-peptideketen uit series van globulaire gebieden bestaat met een zeer gelijksoortige secundaire en tertiaire structuur. IgG is onder te verdelen in vier subklassen: lgG1, lgG2, lgG3 en IgG4. De vier subklassen van humaan IgG verschillen weinig van elkaar in de aminozuursequentie.

IgG kan gewonnen worden uit plasma, bijvoorbeeld afkomstig van donoren. Een welgekend proces daarvoor is het Cohn proces, dat een ethanol gradiënt combineert met een temperatuurgradiënt en een pH gradiënt, om verschillende fracties neer te slaan. Typisch worden de verschillende fracties gedefinieerd zoals weergegeven in Tabel 1.

24 BE2022/5354 == B eea

Temperatuur -3 -5 -5 -5 -5 (°C)

Proteïne 5.1 3 3 3 1 fractie (%):

Tabel 1: fracties van het Cohn proces

In een uitvoeringsvorm worden pasta fracties II+III of fracties I+II+II gebruikt in de werkwijze van de uitvinding.

In een uitvoeringsvorm is de eerste buffer een acetaat buffer. In een uitvoeringsvorm zijn zowel de eerste buffer, de tweede buffer, de derde buffer, de vierde buffer, een acetaat buffer.

In een uitvoeringsvorm heeft de eerste buffer een pH van minstens 3,50 tot hoogstens 6,00, bij voorkeur minstens 3,80 tot hoogstens 5,80, bij voorkeur minstens 4,00 tot hoogstens 5,60, bij voorkeur minstens 4,20 tot hoogstens 5,40, bij voorkeur minstens 4,40 tot hoogstens 5,20, bij voorkeur minstens 4,60 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur 4,80.

In een uitvoeringsvorm heeft de eerste buffer een conductiviteit heeft van minstens 2,10 mS/cm tot hoogstens 4,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,40 mS/cm tot hoogstens 4,10 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,60 mS/cm tot hoogstens 3,90 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,80 mS/cm tot hoogstens 3,70 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,00 mS/cm tot hoogstens 3,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,10 mS/cm tot hoogstens 3,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,20 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur 3,30 mS/cm.

In een uitvoeringsvorm heeft de eerste buffer een concentratie heeft van minstens 25,0 mM tot hoogstens 150,0 mM, bij voorkeur minstens 50,0 mM tot hoogstens 125,0 mM; minstens 60,0 mM tot hoogstens 100,0 mM; minstens 70,0 mM tot hoogstens 90,0 mM; minstens 75,0 mM tot hoogstens 85,0 mM, bij voorkeur een 80,0 mM acetaat buffer.

In een uitvoeringsvorm heeft de tweede buffer een pH heeft van minstens 3,50 tot hoogstens 6,00, bij voorkeur minstens 3,80 tot hoogstens 5,80, bij voorkeur minstens 4,00 tot hoogstens 5,60, bij voorkeur

25 BE2022/5354 minstens 4,20 tot hoogstens 5,40, bij voorkeur minstens 4,40 tot hoogstens 5,20, bij voorkeur minstens 4,60 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur 4,80.

In een uitvoeringsvorm heeft de tweede buffer een conductiviteit van minstens 0,50 mS/cm tot hoogstens 1,90 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,60 mS/cm tot hoogstens 1,80 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,70 mS/cm tot hoogstens 1,70 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,80 mS/cm tot hoogstens 1,60 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,90 mS/cm tot hoogstens 1,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,00 mS/cm tot hoogstens 1,40 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,10 mS/cm tot hoogstens 1,30 mS/cm, bij voorkeur 1,20 mS/cm.

In een uitvoeringsvorm heeft de tweede buffer een concentratie heeft van minstens 15,0 mM tot hoogstens 50,0 mM, bij voorkeur minstens 20,0 mM tot hoogstens 40,0 mM; minstens 22,0 mM tot hoogstens 37,0 MM; minstens 25,0 mM tot hoogstens 35,0 mM; minstens 27,0 MM tot hoogstens 32,0 mM, bij voorkeur een 30,0 mM acetaat buffer.

De werkwijze volgens de uitvinding laat toe dat dat er gefilterd kan worden met buffer condities (bij voorbeeld de eerste buffer) waarbij IgG stabiel in suspensie vertoeft en pas net voor de chromatografie- stappen in een minder stabiele maar voor de chromatografie nodig buffer gebracht wordt. Hierdoor wordt verlies van het IgG vermeden.

In een uitvoeringsvorm is de eerste buffer gelijk aan de derde buffer.

In een uitvoeringsvorm is de conductiviteit van de eerste IgG suspensie minstens 2,10 mS/cm tot hoogstens 4,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,40 mS/cm tot hoogstens 4,10 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,60 mS/cm tot hoogstens 3,90 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,80 mS/cm tot hoogstens 3,70 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,00 mS/cm tot hoogstens 3,50 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,10 mS/cm tot hoogstens 3,30 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,20 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur 3,30 mS/cm bedraagt.

In een uitvoeringsvorm is de conductiviteit van de eerste IgG suspensie minstens 2,80 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur minstens 2,90 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,00 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,10 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur minstens 3,20 mS/cm tot hoogstens 3,40 mS/cm, bij voorkeur 3,30 mS/cm bedraagt.

26 BE2022/5354

In een uitvoeringsvorm bedraagt in stap c) na het toevoegen van het caprylzuur de pH van de eerste suspensie minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur minstens 4,75 tot hoogstens 4,85, bij voorkeur 4,80.

Het gebruik van caprylzuur heeft als voordeel a dat het een virale inactivatiestap en/of een virale verwijderingsstap faciliteert voor zowel omhulde als niet-omhulde virussen. Carpylzuur heeft een prionverwijderingscapaciteit, zoals geëvalueerd op humaan overdraagbare spongiforme encefalopathie (TSE) agens. Capryl zuur kan verder een procoagulant activiteit verwijderen en het laat toe dat het IgG eiwit in suspensie blijft. Buten de hierin genoemde pH range zullen deze effecten niet vooledig zijn en zullen er dus onzuiverheden in suspensie blijven.

In een uitvoeringsvorm wordt in stap c) het caprylzuur toegevoegd wordt over een periode van minstens minuten, bij voorkeur minstens 30 minuten, bij voorkeur minstens 45 minuten, nog meer bij voorkeur minstens 60 minuten. Bij voorkeur wordt in stap c) de pH na deze tijd gecontroleerd. Het toevoegen over een dergelijke periode zorgt ervoor dat er geen lokale uitschieters zijn van de pH op de plaats waar het caprylzuur wordt toegevoegd, wat voor een verlaagd rendement zou kunnen zorgen. 15 In een uitvoeringsvorm omvat de werkwijze in stap c) na het toevoegen van het caprylzuur een rijpingsstap, van minstens 30 min, bij voorkeur minstens 60 min, bij voorkeur minstens 90 min, bij voorkeur minstens 120 min, bij voorkeur minstens 150 min, bij voorkeur minstens 120 min. Bij voorkeur wordt tijdens de rijpingsstap de IgG suspensie geagiteerd.

In een uitvoeringsvorm bedraagt de conductiviteit van de IgG oplossing gevormd in stap f) minstens 0,5 mS/cm en hoogstens 2,0 mS/cm, bij voorkeur minstens 0,7 mS/cm en hoogstens 1,5 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,0 mS/cm en hoogstens 1,4 mS/cm, bij voorkeur minstens 1,1 mS/cm en hoogstens 1,3 mS/cm, bij voorkeur 1,2 mS/cm.

In een uitvoeringsvorm maakt de anionuitwisselingschromatografie in stap i} gebruik van een sterk basisch anionuitwisselaarhars of een strek anionisch anionuitwisselaarhars.

In een uitvoeringsvorm maakt de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik van een epoxy hars.

In een uitvoeringsvorm maakt de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik van een hars dat —N*(CH:}3 functionele groepen omvat.

In een uitvoeringsvorm maakt de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik van een hars met een totale ionische capaciteit van minstens 30 jeq tot hoogstens 120 Heg, bij voorkeur van minstens 40 ueg tot hoogstens 100 ueg, bij voorkeur van minstens 48 ueq tot hoogstens 88 Hed.

27 BE2022/5354

In een uitvoeringsvorm maakt de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik van een hars met een deeltjesgrootte van minstens 30 um tot hoogstens 60 um, bij voorkeur van minstens 35 um tot hoogstens 55 um, bij voorkeur van minstens 38 um tot hoogstens 53 um.

In een uitvoeringsvorm wordt in stap i) de vierde IgG oplossing geladen op het hars na een filtratie, bij voorkeur door een filter met een poriegrootte van minstens 0,5 tot hoogstens 15,0 um, bij voorkeur minstens 0,7 um tot hoogstens 12,0 um, bij voorkeur minstens 1,0 um tot hoogstens 10,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 9,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 7,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 5,0 um, bij voorkeur minstens 2,0 um tot hoogstens 3,0 um. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt dezelfde filter gebruikt al in de eerste ultrafiltratie.

In een uitvoeringsvorm wordt bij het opzuiveren via affiniteitschromatografie gebruik gemaakt van een medium of een mengsel van media, waarop N-acetyl-galactosamine (GalNAc) - Galactose (Gal) - Fucose (Fuc), en Galactose-Galactose-Fucose groepen voorzien zijn. Dit bindt antilichamen gericht op bloedgroepen A en B, hierdoor wordt vermeden dat er hemolyse ontstaat bij persoenen die het IgG preparaat worden toegediend, waardoor het IgG preparaat breed kan worden ingezet, bij voorkeur zonder dat de donors van het plasma dienen te woerden beperkt tot donors met de bloedgroep O.

In een uitvoeringsvorm wordt bij het opzuiveren via affiniteitschromatografie gebruik gemaakt van een medium of een mengsel van media, waarop groepen voorzien zijn die overeenkomende met de epitopen van bloed groepen A en B. In een uitvoeringsvorm wordt de affiniteitschromatografie uitgevoerd zoals beschreven in EP 1 968 634 B1.

In een tweede aspect voorziet de uitvinding in een IgG preparaat, bij voorkeur een intraveneus IgG preparaat, bekomen uit een werkwijze volgens een uitvoeringsvorm beschreven hierin.

De uitvinding voorziet verder in een IgG preparaat, omvattende: - immunoglobuline G (lgG}; - minstens 7,0 gewichtsprocent tot hoogstens 10,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 7,5 gewichtsprocent tot hoogstens 9,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,0 gewichtsprocent tot hoogstens 9,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,1 gewichtsprocent tot hoogstens 8,8 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,2 gewichtsprocent tot hoogstens 8,6 gewichtsprocent, bij voorkeur 8,4 gewichtsprocent sucrose; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 1,2 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,2 gewichtsprocent tot hoogstens 1,1 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot

28 BE2022/5354 hoogstens 1,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,4 gewichtsprocent tot hoogstens 0,9 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,5 gewichtsprocent tot hoogstens 0,8 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,6 gewichtsprocent tot hoogstens 0,7 gewichtsprocent, bij voorkeur 0,6 gewichtsprocent glycine; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 0,6 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,2 gewichtsprocent tot hoogstens 0,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 0,4 gewichtsprocent, bij voorkeur 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; - acetaat buffer; waarbij de pH van het preparaat minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur 4,40.

VOORBEELDEN

Meetmethoden

De pH van een oplossing, een preparaat of een buffer werd gemeten volgens 07/2016:20203; Ph. Eur. 2.2.3; potentiometric determination of pH, glass electrodes.

De conductiviteit van een oplossing, een preparaat of een buffer werd gemeten volgens 01/2021:20238;

Ph. Eur. 2.2.38; Equipment: resistance-measuring circuit and the conductivity sensor.

De eiwitconcentratie van een oplossing of een preparaat werd gemeten volgens 01/2008:20533; Ph. Eur. 2.5.33; Total protein: 1) UV light absorption at 280nm according to Ph. Eur. 2.2.25. ABSORPTION

SPECTROPHOTOMETRY, ULTRAVIOLET AND VISIBLE.

Gewichtsprocenten hierin zijn telkens uitgedrukt ten opzichte van het gewicht van het volledige preparaat of de volledige oplossing.

Voorbeeld werkwijze 270 kg van een pasta werd voorzien waarbij de pasta, pastafracties I+II+IIl bekomen bij uit het Cohn proces uitgevoerd op humaan plasma, omvat. Deze hoeveelheid pasta werd geresuspendeerd in een 8,0 kg eerste buffer per kilo pasta om een eerste IgG suspensie te vormen. De eerste buffer was een 80,0 mM acetaat buffer, met een pH van 4,80 en een conductiviteit van 3,30 mS/cm.

Aan de hierboven bekomen eerste IgG suspensie werd over de periode van 60 minuten een 1,2 wt% caprylzuur toegevoegd tot dat de pH van de eerste IgG suspensie 4,80 bedraagt. Hierna onderging het

29 BE2022/5354 geheel een rijpingsstap van 60 minuten waarbij de aangezuurde eerste IgG suspensie lichtjes werd geagiteerd. Tijdens het aanzuren met caprylzuur werd er een neerslag gevormd, echter het IgG blijft in oplossing, met andere woorden er werd een IgG supernatant gevormd.

Het neerslag werd vervolgens af gefilterd door een dieptefilter met een poriegrootte van 2 tot 3 um, bij voorbeeld BECOPAD® P 550 van Eaton) om zo een IgG filtraat te bekomen.

Het bekomen IgG filtraat werd vervolgens geconcentreerd over een eerste semipermeabel membraan door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing met een eiwit concentratie van 70 g/L. Het eerste semipermeabel membraan was bij voorbeeld een

TangenX® FLAT SHEET MEMBRANES PES filter van Repligen met een cut of van 30 kDa.

Hetzelfde eerste semipermeabel membraan werd vervolgens gebruikt voor het uitwisselen van de buffer door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer met een pH va 4,80, een conductiviteit van 1.20 mS/cm en 30 mM acetaat, om daarbij een tweede IgG oplossing te bekomen.

Hierna werd de tweede IgG oplossing verder geconcentreerd over hetzelfde semipermeabel membraan door middel van een tweede ultrafiltratie, daarbij bekomende een derde geconcentreerde IgG oplossing met een eiwit concentratie van 90 g/L.

Vervolgens wordt de derde geconcentreerde IgG verdunt door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met een eiwit-concentratie 40,0 g/L en een pH van minstens 6,30 tot hoogstens 6,50. De vierde buffer is bijvoorbeeld een 15.0 mM acetaat buffer met een pH van 6,50 en een conductiviteit van 2,00 mS/cm.

De vierde IgG oplossing is hierbij geschikt om te worden opgezuiverd via anionuitwisselingschromatografie, met bij voorbeeld een sterk basisch epoxy hars gefunctionaliseerd met -N*(CH3)3 groepen. In dit voorbeeld werd gekozen voor een Nuvia HP-Q hars van BIO-RAD. Het IgG verliet hierbij het hars als een eerste IgG omvattende doorstroom. Als eluens werd hier gebruik gemaakt van de vierde buffer.

Vervolgens werden Anti-A en Anti-B antilichamen verwijderd uit de eerste IgG omvattende doorstroom via affiniteitschromatografie, waarbij een hars gebruik werd dat gefunctionaliseerd met N-acetyl- galactosamine (GalNAc}, Galactose (Gal), Fucose (Fuc), en Galactose-Galactose-Fucose groepen, overeenkomende met de epitopen van bloedgroepen A en B. Bij voorkeur wordt de affiniteitschromatografie uitgevoerd zoals beschreven in EP 1 968 634 B1. Het IgG verliet hierbij het hars als een tweede IgG omvattende doorstroom.

30 BE2022/5354

Vervolgens werd de pH van de bekomen tweede IgG doorstroom aangepast, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van 4,40.

De vijfde IgG oplossing werd dan geconcentreerd over hetzelfde semipermeabel membraan door middel van een derde ultrafiltratie, daarbij bekomende een zesde geconcentreerde IgG oplossing met een eiwitconcentratie van 70 g/L.

Vervolgens werd de zesde geconcentreerde IgG gestabiliseerd door het toevoegen van sucrose, glycine en natriumchloride, zodat een stabiele IgG preparaat ontstond met de volgende samenstelling: - 40-55 g/L immunoglobuline G (IgG); - 8,4 gewichtsprocent sucrose; - 0,6 gewichtsprocent glycine; - 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; in een acetaat buffer en met een pH van 4,40.

De hierboven beschreven werkwijze haalde iedere keer een rendement tussen 70% en 80%. Het bekomen

IgG was 1005 zuiver op eiwitniveau.

Voor het semipermeabel membraan hergebruikt werd in de hierboven beschreven werkwijze, werd het semipermeabel membraan gewassen met een natriumchloride oplossing.

Stabiliteitstesten

Het hierboven preparaat werd 3 maand op kamertemperatuur gestockeerd, zonder verlies van IgG.

Claims

31 BE2022/5354 CONCLUSIES (hertypt)

1. Een werkwijze voor het produceren van immunoglobuline G (IgG) preparaten of immunoglobuline G (lgG) oplossingen, omvattende de stappen: a) het voorzien van een IgG bevattende pasta; b} het resuspenderen van de pasta in een eerste buffer om een eerste IgG suspensie te vormen; c) het toevoegen van caprylzuur aan de eerste IgG suspensie waarna de pH van de eerste IgG suspensie minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een neerslag en een IgG supernatant; d) het filtreren van het IgG supernatant bekomen in stap c) doorheen een filter, daarbij bekomende een IgG filtraat; e) optioneel, het concentreren van het IgG filtraat bekomen in stap d), bij voorkeur over een eerste semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een eerste ultrafiltratie, daarbij bekomende een eerste geconcentreerde IgG oplossing; f) optioneel, het uitwisselen van de buffer uit de eerste geconcentreerde IgG oplossing bekomen in stap d), bij voorkeur door middel van diafiltratie, tegenover een tweede buffer bij een pH die minstens 4,60 tot hoogstens 5,00 bedraagt, daarbij bekomende een tweede IgG oplossing; g) optioneel, het concentreren van de tweede IgG oplossing bekomen in stap f), bij voorkeur over het tweede semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een tweede ultrafiltratie, daarbij bekomende een derde geconcentreerde IgG oplossing; h} het verdunnen van: - het IgG filtraat, wanneer stap e), stap f) en stap g) niet zijn uitgevoerd; - de eerste geconcentreerde IgG oplossing, wanneer stap e) is uitgevoerd, en stappen f) en g) niet zijn uitgevoerd; - de tweede IgG oplossing, wanneer stappen e) en f) zijn uitgevoerd, en stap g) niet is uitgevoerd; of, - de derde geconcentreerde IgG oplossing; wanneer stappen e), f) en g) zijn uitgevoerd; door het toevoegen van water en/of een vierde buffer om een vierde IgG oplossing te bekomen met:

32 BE2022/5354 - een eiwit-concentratie van minstens 10,0 g/L tot hoogstens 70,0 g/L, bij voorkeur minstens 15,0 g/L tot hoogstens 65,0 g/L, bij voorkeur minstens 20,0 g/L tot hoogstens 60,0 g/L, bij voorkeur minstens 25,0 g/L tot hoogstens 55,0 g/L, bij voorkeur minstens 30,0 g/L tot hoogstens 50,0 g/L, bij voorkeur minstens 35,0 g/L tot hoogstens 45,0 g/L, bij voorkeur minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur 40,0 g/l; en, - een pH van minstens 5,80 tot hoogstens 7,00, bij voorkeur minstens 5,90 tot hoogstens 6,90, bij voorkeur minstens 6,00 tot hoogstens 6,80, bij voorkeur minstens 6,10 tot hoogstens 6,70, bij voorkeur minstens 6,20 tot hoogstens 6,60, bij voorkeur minstens 6,30 tot hoogstens 6,50; ij) het opzuiveren van de vierde 1gG oplossing bekomen in stap h) via anionuitwisselingschromatografie, daarbij bekomende eerste IgG omvattende doorstroom; j) optioneel, het opzuiveren van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen is stap i) via van affiniteitschromatografie, daarbij bekomende een tweede IgG omvattende doorstroom, k) het stabiliseren van de bekomen IgG oplossing of IgG doorstroom, door het toevoegen van sucrose, glycine en natriumchloride, daarbij bekomende een stabiel IgG preparaat.

2. De werkwijze volgens conclusie 1, verder omvattende: I) het aanpassen van de pH van de eerste IgG omvattende doorstroom bekomen in stap i} of van de tweede IgG omvattende doorstroom wanneer stap j) is uitgevoerd, daarbij bekomende een vijfde IgG oplossing met een pH van minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur 4,40; en, m) optioneel, het concentreren van de vijfde IgG oplossing bekomen in stap k), bij voorkeur over het derde semipermeabel membraan en bij voorkeur door middel van een derde ultrafiltratie, daarbij bekomende een zesde geconcentreerde IgG oplossing.

3. De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de vierde IgG oplossing:

33 BE2022/5354 - een eiwit-concentratie van minstens 37,0 g/L tot hoogstens 43,0 g/L, bij voorkeur minstens 38,0 g/L tot hoogstens 42,0 g/L, bij voorkeur minstens 39,0 g/L tot hoogstens 41,0 g/L, bij voorkeur 40,0 g/L heeft; en, - een pH minstens 6,30 tot hoogstens 6,50 heeft.

4. De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het eerste semipermeabel membraan, het tweede semipermeabel membraan en/of het derde semipermeabel membraan, hetzelfde membraan is.

5. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande conclusies, waarbij bij het eerste semipermeabel membraan, tweede semipermeabel membraan en/or derde semipermeabel membraan, moleculen met een moleculairgewicht van lager dan 5 kDa, bij voorkeur lager dan 10 kDa, bij voorkeur lager dan 15 kDa, bij voorkeur lager dan 20 kDa, bij voorkeur lager dan 25 kDa, bij voorkeur lager dan 30 kDa, bij voorkeur lager dan 40 kDa, bij voorkeur lager dan 50 kDa doorlaat.

6. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande conclusies, waarbij de pasta fracties III, bij voorkeur fracties I+II+IIl bekomen uit het Cohn proces omvat.

7. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande conclusies, waarbij stap c} na het toevoegen van het caprylzuur een rijpingsstap omvat, van minstens 30 min, bij voorkeur minstens 60 min, bij voorkeur minstens 90 min, bij voorkeur minstens 120 min, bij voorkeur minstens 150 min, bij voorkeur minstens 120 min.

8. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande conclusies, waarbij: - de eerste buffer en de tweede buffer een pH hebben van minstens 4,60 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,70 tot hoogstens 4,90, bij voorkeur 4,80; - de eerste buffer: o een conductiviteit heeft van minstens 3.0 mS/cm tot hoogstens 3,6 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 3,3 mS/cm; en, o een concentratie heeft van minstens 50,0 mM tot hoogstens 110,0 mM, bij voorkeur ongeveer 80,0 mM; en,

34 BE2022/5354 - de tweede buffer: o een conductiviteit heeft van minstens 3.0 mS/cm tot hoogstens 3,6 mS/cm, bij voorkeur ongeveer 3,3 mS/cm; en, o een concentratie heeft van minstens 10,0 mM tot hoogstens 47,0 mM, bij voorkeur ongeveer 30,0 mM.

9. De werkwijze volgens minstens één der voorgaande conclusies, waarbij de vierde buffer een minstens 5,0 mM tot hoogstens 50,0 mM acetaatbuffer, bij voorkeur minstens 7,0 mM tot hoogstens 40,0 mM acetaatbuffer; minstens 10,0 mM tot hoogstens 30,0 mM acetaatbuffer; minstens 12,0 mM tot hoogstens 20,0 mM acetaatbuffer; minstens 12,0 mM tot hoogstens 17,0 mM acetaatbuffer, bij voorkeur een 15,0 mM acetaatsbuffer is.

10. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande conclusies, waarbij de anionuitwisselingschromatografie in stap i) gebruik maakt van een sterk basisch anionuitwisselaarhars.

11. De werkwijze volgens minstens één van voorgaande conclusies, waarbij bij het opzuiveren via affiniteitschromatografie gebruik gemaakt wordt van een medium of een mengsel van media, waarop N-acetyl-galactosamine (GalNAc} - Galactose (Gal) - Fucose (Fuc), en Galactose-Galactose- Fucose groepen voorzien zijn.

12. Een IgG preparaat, bij voorkeur een intraveneus IgG preparaat, bekomen uit een werkwijze volgens minsten één van voorgaande conclusies.

13. Een IgG preparaat omvattende: - immunoglobuline G (IgG); - minstens 7,0 gewichtsprocent tot hoogstens 10,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 7,5 gewichtsprocent tot hoogstens 9,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,0 gewichtsprocent tot hoogstens 9,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,1 gewichtsprocent tot hoogstens 8,8 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 8,2 gewichtsprocent tot hoogstens 8,6 gewichtsprocent, bij voorkeur 8,4 gewichtsprocent sucrose;

35 BE2022/5354 - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 1,2 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,2 gewichtsprocent tot hoogstens 1,1 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 1,0 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,4 gewichtsprocent tot hoogstens 0,9 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,5 gewichtsprocent tot hoogstens 0,8 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,6 gewichtsprocent tot hoogstens 0,7 gewichtsprocent, bij voorkeur 0,6 gewichtsprocent glycine; - minstens 0,1 gewichtsprocent tot hoogstens 0,6 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,2 gewichtsprocent tot hoogstens 0,5 gewichtsprocent, bij voorkeur minstens 0,3 gewichtsprocent tot hoogstens 0,4 gewichtsprocent, bij voorkeur 0,3 gewichtsprocent natrium chloride; - acetaat buffer; waarbij de pH van het preparaat minstens 4,00 tot hoogstens 5,00, bij voorkeur minstens 4,10 tot hoogstens 4,80, minstens 4,20 tot hoogstens 4,70, bij voorkeur minstens 4,30 tot hoogstens 4,50, bij voorkeur 4,40.