KR20060131920A

KR20060131920A - 정제된, 바이러스 안전한 항체 제제를 제공하는 방법

Info

Publication number: KR20060131920A
Application number: KR1020067019926A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 부흐악커; 귄터 이베러; 유르겐 뢰미쉬
Original assignee: 옥타파르마 아게
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2006-12-20
Also published as: BRPI0508096A; US7553938B2; AU2005217148B2; JP2007533660A; IL177541A; ZA200607119B; WO2005082937A3; CN1922207A; ES2407380T3; EP2277915A1; EP1718675A2; CA2557229C; EP1718675B1; CA2557229A1; ES2407380T5; KR101206788B1; JP5042817B2; DK1718675T3; PT1718675E; PL1718675T3

Abstract

하기 단계를 포함하는, 항체 및 오염물질을 포함하는 출발 용액으로부터 정제된, 바이러스 불활성화되고, 바이러스 안전한 항체 제제를 제조하는 방법:

(a) 약 4.6 내지 약 4.95, 특히 약 4.8 내지 약 4.95로 출발 용액의 pH를 조절하여 중간체 용액을 제조하는 단계; (b) 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트 이온을 중간체 용액에 첨가하고, pH를 약 4.6 내지 약 4.95, 특히 약 4.8 내지 약 4.95로 유지하여, 이로 인해 침전물이 형성되고, 항체가 상층액에 본질적으로 존재하는 단계; (c) 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트 이온 농도, 시간, pH 및 온도의 조건하에 상기 상층액을 인큐베이션하고, 임의로 pH 조절 전에 여과된 용액을 농축 및 정용여과(diafiltration)하는 단계; (d) 수지에 오염 물질의 결합을 허용하는 반면, 수지에 항체의 현저한 결합을 허용하지 않는 조건하에 여과된 용액을 하나 이상의 음이온 교환 수지 및 임의로 2개의 상이한 음이온 교환 수지에 적용하는 단계로서, 정제된, 바이러스 불활성화되고, 바이러스 안전한 항체 제제가 제조된다.

Description

정제된, 바이러스 안전한 항체 제제를 제공하는 방법{A method of providing a purified, virus safe antibody preparation}

본 발명은 항체 및 오염물질을 포함하는 출발 용액으로부터 정제된, 바이러스 안전한 항체 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인간 혈장 및 기타 공급원으로부터 감마-글로불린의 정제 방법을 기재한다. 바이러스 불활성화 및 제거 단계는 본원에 기재된 제조 방법에 포함된다.

침전 및 생성된 바이러스 제거/불활성화

1940년대에, Cohn 등은 인간 혈장의 냉 에탄올 분획화를 도입하였다. 상기 구성의 수 개의 변이는 상이한 중간체의 순도 및/또는 수율을 증가시키기에 이르렀다. Cohn 분획화에서, 특정 단계는 바이러스 불활성화 및 제거에 효율적으로 기여하는 것으로 확인되었다. IgG 방법에서, 특히 Cohn I+III 분획의 분리는 상기 면에서 매우 효과적이다. 일부 민감한 바이러스 (주로 외피보유(enveloped) 바이러스)는 낮은 pH 및 EtOH 존재에 의해 파괴되며, 대부분의 외피보유 및 비-외피보유 바이러스는 통상적으로 버리는 침전물 I+III에서 분배에 의해 제거된다.

1960년대에, 짧은 지방산 (C6-C12)은 α- 및 β-글로불린과 불용성 복합체를 형성하는 반면, γ-글로불린은 용이하게 침전되지 않는다는 것을 보여주었다 (Chanutin et al., 1960). Steinbruch 등(1996)은 침전제로서 카프릴레이트 (즉, 옥타노에이트, C8-포화 지방산)를 이용한 IgG의 정제 방법을 기재하였다. 비-면역글로불린은 최종 pH 4.8에 도달하는 아세테이트 완충액을 이용한 희석 후에 인간 혈장으로부터 침전되었다. 격렬한 교반 하에 카프릴레이트의 첨가 후에, IgG 농축 용액을 수득하였다. 순도 및 수율은 카프릴산의 양, pH, 완충액의 몰농도 및 희석 배수에 의존하였다. Steinbruch 등은 또한 그 사이에 침전물의 제거를 갖는 2 단계로 유효량의 카프릴레이트를 첨가하는 것이 유리하다고 언급하였다. 비-외피보유 및 외피보유 바이러스는 I+III 분획의 분리에서처럼, 비 IgG 단백질의 침전물에서 분배에 의해 제거된다.

크로마토그래피

수 개의 특허는 소위 음성 방식(negative mode)으로 IgG 용액의 정제를 기재하며; IgG는 (단지 미량으로) 결합하지 않고 통과하는 반면, 비-IgG 분획 단백질의 대부분은 음이온 리간드에 결합한다 (Bertolini et al. 1998, WO-A-98/05686; Lebing 1999, US-A-5,886,154; Friesen et al., 1986, CA 1201063). IgG의 정제를 위해 카프릴레이트 침전에 이은 이온 교환 크로마토그래피의 조합은 많은 공보에서 기재되었다. 첫번째는 Steinbuch 등(1969)에 의해 기재되었다. Steinbuch는 DEAE-셀룰로오스를 이용한 카프릴레이트의 침전 후에 IgG의 추가의 정제를 기재하였다. Lebing 등(2003)에 의한 최근의 문헌은 IgM, IgA, 알부민 및 기타 불순물의 일련의 제거에 이용된 2개의 음이온 교환 칼럼을 기재한다. Lebing 등은 카프릴레이트 매개된 효과, 즉 바이러스 분배를 이용한 침전에 의한 비-IgG 단백질의 본질 적인 감소, 및 별개의 인큐베이션 단계에서 지방산의 외피보유 바이러스 불활성화 성질 양자를 조합하였다. pH 4.2에서 페이스트/침전물을 포함하는 IgG의 재구성으로부터 출발하여, 이은 pH 5.2로 조절시 카프릴레이트의 첨가라는 소위 "pH-스윙(swing)" (Lebing et al. (2003))의 중요성은 IgG 농축 절차에 본질적이므로, 비-IgG 단백질을 효과적으로 감소시키는데 필요하다는 것이 강조되었다. 수 개의 기타 불순물로서, IgA 및 IgM뿐만 아니라 카프릴레이트가 전술한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 감소되었다.

놀랍게도, 상기 요약되고, Lebing 등에 의해 기재된 상기 pH-시프트(shift)는 카프릴레이트 첨가 및 생성된 침전물의 제거에 대한 현저한 정제 효과를 달성하는데 필요하지 않다는 것을 발견하였다. 대신에, 페이스트 재구성 및 카프릴레이트 인큐베이션 및 침전물 제거의 전체 과정 동안 pH를 pH 4.6-4.95로 일정하게 유지시, 효과적인 IgG 농축이 달성된다. 또한, 불순물, 특히 알부민의 양은 pH를 4.8-4.95의 범위로 일정하게 유지함으로써 더욱 효율적으로 감소된다. 동시에 바이러스가 제거된다. 이후에 잔류 불순물 및 카프릴레이트는 이온 교환 단계에 의해 분리된다.

고전적인 바이러스 불활성화

용매 세제(detergent) 및 pH 4 처리는 주지된 방법이며, 면역글로불린에 대해 널리 이용된다. 상기 SD 처리는 외피보유 바이러스의 불활성화의 면에서 이의 우수성으로 인해 상기 과정 내로 통상적으로 도입된다 (Biesert L. Clinical and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47). 외피보유 및 비-외피보유 바이러스 양 자는 외피보유 바이러스가 비-외피보유 바이러스보다 영향을 더 받지만 낮은 pH에 대한 노출에 의해 영향을 받는다 (Biesert. Clinical and Experimental Rheumatology 1996; 14: 47, Bos et al. Biologicals 1998; 26: 267, In Seop et al. J Microbiol Biotechnol 2001; 11: 619).

EP-A-0 525 502에서, 바이러스 불활성화 단계로서 용매 세제 및 pH 4 인큐베이션의 조합이 기재된다.

바이러스 여과

IgG 용액은 바이러스 안전성을 증가시키기 위해 크기 배제에 주로 기초한 기작(Burnouf and Radosevich. Haemophilia 2003; 9: 24)에 의해 바이러스를 보유하는 조건하에 매우 작은 공극 크기(전형적으로 15-50 nm)의 막을 통해 여과된다. 또한, 이온 교환 흡착에 의해 바이러스를 보유하도록 고안된 심층 필터가 면역글로불린의 여과에 이용된다.

발명의 요약

본 발명은 고전적인 Cohn-Oncly 분획화 방법과 비교하여 증가된 수율 및 더 짧은 프로세스 시간을 갖는 IgG의 정제 방법을 기재한다. IgG는 4.60 내지 4.95, 바람직하게는 4.9의 산성 pH 범위의 완충액에서 재구성된다. 비-IgG 단백질은 10 내지 30 mM 카프릴레이트 농도 범위, 바람직하게는 20 mM의 농도의 카프릴레이트를 이용한 2번의 인큐베이션 단계에 의해 분리된다.

외피보유 바이러스의 효과적인 불활성화를 위해, Triton X-100, Tween 80 등 및 TNBP를 이용한 용매 세제 처리로서 알려진 인큐베이션이 전체 과정의 바이러스 불활성화 능력을 증가시키기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들면, 소위 나노여과 또는 하전된 심층 필터에 의한 여과에 의한 바이러스 제거가 바이러스 제거 절차에 첨가될 수 있다. 더욱이, UVC 처리가 또한 전술한 처리와 조합되어 수행될 수 있다. 상기 처리는 예를 들면, EP-A-0 840 624 또는 EP-A-0 422 007에 기재된다.

더욱이, 카프릴레이트/카프릴산은 전술한 침전 및 인큐베이션 과정 단계를 수행하기 위해 헵타노에이트/헵탄산과 조합되거나 헵타노에이트/헵탄산에 의해 대체될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수득가능한 산물은 산물은 불활성화된 바이러스이다. 프리온은 또한 카프릴레이트 처리로 인해 불활성화/제거된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 항체 및 오염물질을 포함하는 출발 용액으로부터 정제된, 바이러스 불활성화되고, 바이러스 안전한 항체 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(a) 약 4.6 내지 약 4.95, 특히 약 4.8 내지 약 4.95로 출발 용액의 pH를 조절하여 중간체 용액을 제조하는 단계;

(b) 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트 이온을 중간체 용액에 첨가하고, pH를 약 4.6 내지 약 4.95, 특히 약 4.8 내지 약 4.95로 유지하여, 이로 인해 침전물이 형성되고, 항체가 상층액에 본질적으로 존재하는 단계;

(c) 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트 이온 농도, 시간, pH 및 온도의 조건하에 상기 상층액을 인큐베이션하고; 임의로 pH 조절 전에 여과된 용액을 농축 및 정용여과(diafiltration)하는 단계;

(d) 수지에 오염 물질의 결합을 허용하는 반면, 수지에 항체의 현저한 결합을 허용하지 않는 조건하에 여과된 용액을 하나 이상의 음이온 교환 수지 및 임의로 2개의 상이한 음이온 교환 수지에 적용하는 단계로서, 정제된, 바이러스 불활성화되고, 바이러스 안전한 항체 제제가 제조된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 바이러스 불활성화된 용액은 단계 (d)에서 약 5.0 내지 5.2의 pH에서 하나 이상의 음이온 교환 수지와 접촉된다. 2개의 음이온 교환 크로마토그래피가 수행된다면, 두번째 크로마토그래피는 6.7 내지 6.9의 pH 범위에서 수행될 수 있다. 임의로 단계 (b) 및 (c)는 1회 이상 반복될 수 있다. pH 4.9에서 카프릴레이트를 이용한 처리는 원하지 않는 단백질의 현저한 감소를 초래한다.

전형적으로, 상기 출발 용액은 혈장 유래 항체를 포함한다.

단계 (d)에서 오염물질이 수지에 선택적으로 결합하는 반면, 항체는 수지에 현저하게 결합하지 않도록 하는 조건 하에, 불활성화된 용액과 2개의 상이한 음이온 교환 수지를 접촉시키는 것이 유리할 수 있다.

바람직하게는, 상기 항체는 면역글로불린 G-타입이다.

2개의 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 단계 사이에, pH는 특히 6.8±0.1로 변할 수 있다. AEX 통과액은 60 내지 90 mg/ml로 농축될 수 있으며, 예를 들면, 인산 완충액에 대해 정용여과될 수 있다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 첫번째 AEX의 통과액은 지질 외피 바이러스를 불활성화시키기 위해 4.5 내지 8 시간 동안 바람직하게는 Triton X-100 및 TnBP에 의해, 바람직하게는 1% Triton X-100 및 0.3% TnBP에 의해 용매 세제 처리된다. 상기 방법은 용매-세제-처리로서 알려져 있으며, EP-A-0 131 740 (원용됨)에 개시된다.

본 발명에 따라, 인큐베이션 혼합물의 세제는 특히 고체 및 액체 상 추출에 의해 제거된다. 고체상 추출 후에 용액의 pH는 6.7 내지 6.9로 조절된다. S/D 처리 및 카프릴레이트 바이러스 불활성화의 조합은 더욱 안전한 산물을 초래한다.

상기 조절된 용액은 두번째 AEX 칼럼에 적용될 수 있으며, 거기에서 AEX 통과액은 예를 들면, 3.5 내지 4.5, 특히 4.0±0.1의 pH로 조절될 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 pH 조절된 IgG 용액은 바이러스 필터에 의해 접촉된다. 상기 임의의 단계는 카프릴레이트 처리와 조합되어 더욱 바이러스 안전성을 초래한다.

상기 IgG 용액은 또한 적어도 24시간 동안 37℃±1에서 인큐베이션될 수 있다. 항체 산물의 바이러스 안전성을 개선하기 위해, UV-C 처리가 항체를 포함하는 분획의 카프릴레이트 처리와 조합될 수 있다. 상기 불활성화 방법은 단독으로 또는 TnBP, UV-C 처리, 바이러스 여과 또는 가열과 같은 처리와 조합하여 본 발명의 방법과 조합될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 프리온의 제거 또는 불활성화 방법, 예를 들면, 여과 또는 흡착 방법 또는 예를 들면 [EP-A-0 954 528, Trejo, S. R. et al., Vox Sanguinis, (2003) 84, 176-187]과 같은 선행 기술에 개시된 크로마토그래피 방법과 조합될 수 있다. 본 발명에 따라 수득된 IgG 용액은 의도한 치료학적 용도로 인해, 전형적으로 5 또는 10% 농도로 농축되며, 상기 농축물의 오스몰농도는 적당한 첨가제에 의해 200 내지 400 mOsmol/kg으로 조절된다. 그러나, 약학적으로 허용가능한 한 임의의 기타 값이 가능하다.

상기 첨가제는 전문가에게 주지되어 있으며, 당, 당 알코올 및 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IgG 용액의 pH는 3.5 내지 6.0, 특히 4.0 내지 5.5로 조절될 수 있다. 최종적으로, 상기 IgG 용액은 멸균 여과되며, 유리병 또는 플라스틱 용기에 충전된다. 대안적으로, 첫번째 또는 두번째 AEX 단계 후의 통과액은 더욱 안전한 산물을 수득하기 위해 나노필터에 적용된다.

본 발명의 방법은 더욱 상세히 기재되며, 우선적으로 하기 요약된 바와 같이 수행된다:

출발 물질로서, 인간 혈장 분획 I+II+III 또는 분획 II+III이 이용되었다. 상기 분획은 Cohn 등(1946)에 의해 기재된 바와 같이 제조되었다. 과정 동안 pH 의 조절은 1 M 아세트산, 0.1 M NaOH 또는 0.3 M HCl을 이용하여 수행되었다. 카프릴레이트는 1 M 소듐 카프릴레이트 스톡 용액으로서 첨가되었다. 상기 스톡 용액은 주사용 물(WFI) 1리터에 166g의 소듐 카프릴레이트을 용해하고, 소듐 카프릴레이트의 전체 용해까지 교반함으로써 제조되었다.

SD 처리의 전형으로서, Triton X-100 및 TnBP를 이용하였다. SD 시약의 제거를 위해, 대두유 또는 피마자유와 같은 식물성 오일을 이용하였다.

모든 시약은 USP 등급 또는 그 이상이었다.

정량적인 크기 배제 크로마토그래피 및 ELISA를 이용하여 IgG 농도를 측정하였다. 분석 HPLC은 TosoHaas G3000SW 칼럼을 갖는 Agilent HPLC System을 이용하여 수행하였다.

상기 과정의 모식도는 도 1에 보여준다. 과정은 정제수에 페이스트라 불리는 IgG 침전물의 용해와 함께 시작한다. 통상적으로, 페이스트를 재구성하는 물의 부피가 클수록, IgG의 수율은 더 높다. 상기 용액의 pH는 1 M 아세트산을 이용하여 4.60 내지 4.95, 바람직하게는 4.90로 조절된다. 상기 용액은 용액 중에 가능한 한 많은 IgG를 수득하기 위해 수 시간 동안 교반된다. 그 후에, 카프릴레이트가 10 내지 30 mM, 바람직하게는 20 mM 카프릴레이트의 농도까지 1 M 스톡 용액으로서 첨가된다. 카프릴레이트의 첨가 동안 pH는 4.80 내지 4.95, 바람직하게는 4.90로 일정하게 유지된다. IgG 용액과 카프릴레이트의 인큐베이션 동안, 비-IgG 단백질 및 지질이 침전된다. 형성된 침전물은 IgG 용액으로부터 여과에 의해 제거된다. 첫번째 침전 단계 후에, 일부 불순물이 IgG 용액에 남아 있다. 그러므로, 두번째 카프릴레이트 처리가 필요하다.

첫번째 단계와 유사하게, 카프릴레이트가 4.80 내지 4.95, 바람직하게는 4.9의 일정한 pH에서 용액 중에 대략 mM 카프릴레이트의 농도까지 1 M 스톡 용액으로서 첨가된다. 인큐베이션 후에, 침전물은 여과 또는 원심분리에 의해 제거된다. 여과 동안 더욱 양호한 수행을 위해, 여과 보조기가 이용된다. 여과된 용액은 pH를 5.0 내지 5.2, 바람직하게는 5.1로 조절하고, 음이온 교환 칼럼에 적용한다. 음이온 교환 칼럼으로서, 바람직하게는 강한 음이온 교환기, 예를 들면, Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source Q 15 또는 30 (Amersham Biosience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q 및 Macro Prep High Q (Bio-Rad), Q Hyper D(BioSepra) 및 Poros HQ (PerSeptive Biosystems)을 선택하였다.

IgG는 선택된 조건하에 칼럼을 통과하는 반면, 카프릴레이트 및 IgA와 같은 일부 첨가제/불순물은 수지에 결합된다. 단백질 용액은 수지 ml 당 40 내지 120 mg, 특히 40 내지 90 mg 단백질의 비율로 칼럼에 로딩된다. 수득된 통과액은 60 내지 90mg/ml, 바람직하게는 70mg/ml의 단백질 농도로 농축되며, 5 내지 20 mM, 바람직하게는 10 mM 소듐 포스페이트의 농도로 5 부피의 인산 완충액에 대해 정용여과된다. 임의의 바이러스 불활성화 단계로서, SD 처리가 정용여과 후에 선택될 수 있다. 정용여과된 용액은 이어서 예를 들면 EP-A-0 131 740에서 Horowitz에 의해 기재된 SD 처리를 이용하여 바이러스 불활성화된다. SD 시약으로서, TnBP 및 Triton X-100을 이용하였다. 교반 후에, 용액을 4 내지 10℃의 온도에서 8시간까지 인큐베이션한다.

이어서, 대두유 또는 피마자유와 같은 식물성 오일, 바람직하게는 피마자유를 3 내지 5 %(w/w)의 농도까지 용액에 첨가한다. 수성상으로부터 오일상의 분리 후에, 수성상을 여과한다. 그러므로, 적당한 심층 필터가 이용된다. 상기 필터의 예는 Polysep II (Millipore), Sartofine PP 및 Sartobran P (Sartorius)이다. 이은 고체상 추출을 실리카, 스티렌-co-디비닐 벤젠 (SDVB), 글리시딜 메타크릴레이트-co-에틸렌 디메타크릴레이트 또는 다핵방향족(polyaromatic)으로 제조된 겔 매트릭스를 이용한 역상 크로마토그래피에 이용되는 소수성 지지체 매질을 이용한 바람직한 방식으로 수행한다.

상기 매질의 예는 μBondapak (Waters), Amberchrom CG-161 M 및 S, Amberchrom CG-070 (Tosoh Biosep), PLRP-S (Polymer Laboratories), RPC-1 및 Toyopearl Hexyl 650C (Tosoh Biosep), Source 15 RPC (Amersham Biosiences), LiChroprep Si60 (Merck), Chromabond Sorbent HR-P 및 EASY(Machery-Nagel), ProntoSORB SPE (Bischoff Chrom.)이다 상기 단백질 용액은 0.5 내지 1.5 mg/ml 건조 수지의 비율로 칼럼 상에 로딩된다. 고체상 추출(또는 각각 크로마토그래피 단계)의 통과액은 UVC 처리된 후, 4 내지 10℃의 온도에서 0.1 M NaOH의 첨가에 의해 6.7 내지 6.9, 바람직하게는 6.8의 pH로 조절된다. 그 후에, IgG 용액은 두번째 음이온 교환 칼럼에 적용된다. IgG는 칼럼을 통해 보유되지 않은 채 흐르는 반면, 불순물 및 중합체는 칼럼에 결합한다. 음이온 교환 칼럼으로서, 바람직하게는 강한 음이온 교환기, 예를 들면, Q-Sepharose-FF, Q-Sepharose HP, Q-Sepharose-XL, Source Q 15 또는 30 (Amersham Biosience), Q-Thruput, Q-Thruput plus (Sterogene), Macro Prep Q 및 Macro Prep High Q (Bio-Rad), Q Hyper D (BioSepra) 및 Poros HQ (PerSeptive Biosystems)를 선택하였다. 칼럼을 10 mM 소듐 인산 완충액으로 평형화시킨다. IgG 용액의 적용 후에, 칼럼을 평형화 완충액으로 세정하여 칼럼으로부터 모든 비결합 IgG를 수득한다.

단백질 용액을 120 내지 300 mg 단백질/ml 수지의 비율로 칼럼에 로딩한다. 수집된 IgG 용액을 4 내지 10℃의 온도에서 0.3 M HCl을 이용하여 3.9 내지 4.1, 바람직하게는 4.0의 pH로 조절한다. 이어서 상기 용액을 멸균 여과하고, 24시간 이상 동안 37℃에서 저장한다.

낮은 pH 처리에 따라, 용액의 pH는 4 내지 10℃의 온도에서 0.1 M NaOH을 이용하여 4.7로 조절한다. 부가적인 바이러스 감소 단계로서, 적당한 바이러스 필터가 이용될 수 있다. 바이러스 여과를 위해, IgG 용액을 0.1 ㎛ 필터에 이은 200 내지 15 nm의 공극 크기를 갖는 바이러스 필터를 통해 여과하였다. 상기 필터의 예는 DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 75, 35, 20, 15N (Asahi Kasei Pharma)이다. 또한, Zeta Plus VR (Cuno)와 같은 충전된 심층 필터가 이용될 수 있다.

상기 여과 단계는 또한 pH 4 인큐베이션 후에 적용될 수 있다. 바람직하게는 상기 단계는 낮은 pH 처리 전의 과정에서 수행될 수 있다. 매우 정제된 IgG 용액은 최종 제형물 값으로 정용여과 및 농축된다. 액체 제형물에 대한 최종 농도로서, 5 또는 10%(w/v)의 단백질 농도가 선택되었다. 농축 후에, 오스몰농도는 적당한 첨가제에 의한 정맥내 주사에 적합하도록 조절된다. 당, 당 알코올 및 아미노산이 이용될 수 있다. pH를 다시 검사하고, 4.5 내지 5.0, 바람직하게는 4.7로 조절된다. 이어서, 또 다른 멸균 여과를 수행하고, 상기 용액을 주입 병에 충전한다.

도 1 및 2는 본 발명의 방법의 특정 구현예의 흐름도를 나타낸다.

하기 실시예는 본 발명의 방법을 더욱 상세히 설명한다:

실시예 1:

Cohn 분획 I+II+III 또는 II+III을 12 부피의 물에 용해하고, pH를 1 M 아세트산을 이용하여 4.9로 조절하고, 용액을 IgG의 대부분이 2 내지 8℃의 온도에서 용해될 때까지 5시간 이하 동안 교반하였다. 그 후에, 1 M 아세트산을 첨가함으로써 pH를 4.9로 일정하게 유지하면서 20 mM 카프릴레이트의 농도까지 IgG 용액에 1 M 소듐 카프릴레이트 스톡 용액으로서 카프릴레이트를 첨가하였다. 상기 용액을 1 시간 동안 교반하였다.

지질 및 불순물이 상기 조건하에 침전되었으며, 여과에 의해 제거되었다. 그 후에, pH를 4.9로 유지하면서 용액 중에 20 mM의 농도까지 상기 용액에 다시 카프릴레이트를 첨가하였다. 다시 침전물이 생성되었으며, 여과에 의해 제거되었다. 투명 용액이 여과 후에 수득되었다. 상기 용액은 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 pH 5.1로 조절되었으며, Source Q 30 칼럼에 적용되었다. IgG 용액은 칼럼을 통과한 반면, 불순물 및 카프릴레이트는 칼럼에 결합되었다. 수집된 IgG 용액은 70 mg/ml의 단백질 농도로 농축되었으며, 5 부피의 인산 완충액 pH 5.1에 대해 정용여과되었다. 이어서, 0.3 %(w/w)의 TnBP 및 1 %(w/w)의 Triton X-100을 상기 용액에 첨가한 후, 격렬하게 교반하였다. 7±3℃에서 4.5시간 이상의 교반 후에, 5 %(w/w)의 피마자유가 첨가된다. 오일 추출을 실온에서 수행하였다. 오일상 및 수성상을 분리하고, 수성상을 Millipore Opticap Polysep 필터로 여과하였다. 여과된 용액을 μBondapak (Waters)로 불리는 역상 매트릭스로 충전된 칼럼에 적용하였다. 이어서, 상기 용액을 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 pH 6.8로 조절하였으며, 강한 음이온 교환기, 즉 Q-Sepharose-XL에 적용하였다. IgG는 칼럼을 통과한 반면, 불순물은 칼럼에 결합하였다. 수집된 IgG 용액의 pH는 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 4.7로 조절하였다. 다시 한외여과를 수행하여 단백질 농도를 50 또는 100mg/ml의 최종 농도로 조절한 후, 말토오스를 2 내지 10 중량%, 바람직하게는 8 %의 농도 또는 글리신을 0.1 내지 0.5 M, 특히 0.1 내지 0.3, 바람직하게는 0.3 M 특히 0.2의 농도로 첨가하였다. 따르는 멸균 여과에 이어, 용액을 상이한 부피(50, 100, 200 ml)를 갖는 멸균되고, 실리콘화된 주입 병에 충전하였다. 상기 병을 마개로 봉합하였다.

실시예 2:

본 실시예는 특히 pH 4 인큐베이션 단계의 수행에 의해 실시예 1과 상이하다. Cohn 분획 I+II+III 또는 II+III을 12 부피의 물에 용해하고, pH를 1M 아세트산을 이용하여 4.9로 조절하고, 용액을 대부분의 IgG가 2 내지 8℃의 온도에서 용해될 때까지 5시간 이하 동안 교반하였다. 그 후에, 용액 중에 20 mM 카프릴레이트의 농도까지 IgG 용액에 1 M 소듐 카프릴레이트 스톡 용액으로서 카프릴레이트를 첨가하고, pH를 1 M 아세트산을 첨가함으로써 4.9로 일정하게 유지하였다. 상기 용액을 1 시간 동안 교반하였다. 지질 및 불순물이 상기 조건하에 침전되었으며, 여과에 의해 제거되었다. 그 후에, pH를 4.9로 유지하면서 20 mM의 농도까지 상기 용액에 다시 카프릴레이트를 첨가하였다. 다시 형성된 침전물은 여과에 의해 제거되었다. 투명 용액이 여과 후에 수득되었다. 수집된 IgG 용액은 70 mg/ml의 단백질 농도로 농축되었으며, 5 부피의 인산 완충액 pH 5.1에 대해 정용여과되었다. 이어서, 상기 용액을 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 pH 5.1로 조절하였으며, 강한 음이온 교환기 Q-Sepharose-XL에 적용하였다. IgG는 칼럼을 통과한 반면, 불순물 및 카프릴레이트는 칼럼에 결합하였다. 이어서, 0.3 %(w/w)의 TnBP 및 1 %(w/w)의 Triton X-100을 상기 용액에 첨가한 후, 격렬하게 교반하였다. 4 내지 10℃에서 4.5시간 이상의 교반 후에, 5 %(w/w)의 피마자유가 첨가되었다. 오일 추출을 실온에서 수행하였다. 오일상 및 수성상을 분리하고, 수성상을 Millipore Opticap Polysep 필터로 여과하였다. 여과된 용액을 Amberchrom CH-161M으로 충전된 칼럼에 적용하였다. 이어서, 상기 용액을 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 pH 6.8로 조절하고, 강한 음이온 교환기 Q-Hyper D에 적용하였다. IgG는 칼럼을 통과한 반면, 불순물은 칼럼에 결합하였다. 수집된 IgG 용액의 pH는 7±3℃의 온도에서 0.3 M HCl을 이용하여 4.0으로 조절하였다. 상기 용액을 멸균 여과하고, 24 시간 이상 동안 37±3℃에서 저장하였다. 그 후에, 용액의 pH를 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 4.7로 조절하였다. 다시 한외여과를 수행하여 말토오스 또는 글리신과의 제형화 후에 수득되는 단백질 농도가 50 또는 100 mg/ml의 최종 농도로 조절하였다. 따르는 멸균 여과에 이어, 용액을 상이한 부피(50, 100, 200 ml)를 갖는 멸균되고, 실리콘화된 주입 병에 충전하였다. 상기 병을 마개로 봉합하였다.

실시예 3:

본 실시예는 특히 첫번째 AEX 단계 전에 70 mg/ml 단백질 농도로 IgG 용액을 농축하고, 나노여과 단계의 수행에 의해 이전 시료와 상이하다.

Cohn 분획 I+II+III 또는 II+III을 12 부피의 물에 용해하고, pH를 1M 아세트산을 이용하여 4.9로 조절하고, 용액을 대부분의 IgG가 2 내지 8℃의 온도에서 용해될 때까지 5시간 이하 동안 교반하였다. 그 후에, 용액 중에 20 mM 카프릴레이트의 농도까지 상기 용액에 1 M 소듐 카프릴레이트 스톡 용액으로서 카프릴레이트를 첨가하고, pH를 1 M 아세트산을 첨가함으로써 4.9로 일정하게 유지하였다. 상기 용액을 1 시간 동안 교반하였다. 지질 및 불순물이 상기 조건하에 침전되었으며, 여과에 의해 제거되었다. 그 후에, pH를 4.9로 유지하면서 20 mM의 농도까지 상기 용액에 다시 카프릴레이트를 첨가하였다. 다시 침전물이 생성되었으며, 여과에 의해 제거되었다. 투명 용액이 여과 후에 수득되었다. 수집된 IgG 용액은 70 mg/ml의 단백질 농도로 농축되었으며, 5 부피의 인산 완충액 pH 5.1에 대해 정용여과되었다. 상기 용액은 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 pH 5.1로 조절되었으며, 강한 음이온 교환기에 적용되었다. IgG는 칼럼을 통과한 반면, 불순물 및 카프릴레이트는 칼럼에 결합되었다. 이어서, 상기 용액은 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 pH 6.8로 조절되었으며, 두번째 강한 음이온 교환기에 적용되었다. IgG는 칼럼을 통과한 반면, 불순물은 칼럼에 결합되었다. 수집된 IgG 용액의 pH는 7±3℃의 온도에서 0.3 M HCl을 이용하여 4.0으로 조절하였다. 상기 용액을 0.1㎛ 필터를 통해 여과한 후, 일련의 PALL 필터, 즉 공극 크기가 20 nm까지 감소한 PALL DVD, DV 50 및 DV 20를 나노여과에 이용하였다. 나노여과된 용액을 24 시간 이상 동안 37±3℃에서 저장하였다. 그 후에, 상기 용액의 pH를 7±3℃의 온도에서 0.1 M NaOH를 이용하여 4.7로 조절하였다. 다시 한외여과를 수 행하여 말토오스 또는 글리신의 첨가에 의해 말토오스 또는 글리신과의 제형화 후에 수득되는 단백질 농도가 50 또는 100 mg/ml의 최종 농도로 조절하였다. 따르는 멸균 여과에 이어, 용액을 상이한 부피(50, 100, 200 ml)를 갖는 멸균되고, 실리콘화된 주입 병에 충전하였다. 상기 병을 마개로 봉합하였다.

비교예

본 발명의 방법

대략 310g 분획 I+II+III (필터 보조기 포함)을 필터 보조기가 없는 분획 I+II+III의 이론적인 중량으로부터 계산된 12 부피의 WFI에서 재구성한다. 상기 용액을 5℃에서 1 시간 동안 교반한다. 이어서 pH를 4.9±0.1 (약 950g)로 조절한다. 재구성은 5℃에서 2 시간 동안 계속한다. 이어서 시료 "재구성된 분획 I+II+III"을 표시한다. 1 몰 카프릴레이트 용액을 20 mM의 농도가 되도록 첨가한다. pH를 4.9에서 일정하게 유지한다. 상기 용액을 5℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 상기 용액을 5℃에서 심층 필터 및 페이퍼 시트 상에서 여과한다 (약 1050g). 상기 필터를 10 mM 염화나트륨 용액으로 후세정한다. 여과액을 25℃로 가온하고, 1몰 카프릴레이트를 부가적인 10 mM 농도에 도달하도록 첨가한다. 상기 용액을 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 상기 용액을 원심분리하고, 상층액을 1㎛ 및 0.5㎛의 공극 크기를 갖는 필터 (1110g) 상에서 여과한다. 시료 "카프릴레이트 후"를 표시한다.

EP 0 893 450의 방법

대략 310g 분획 I+II+III (필터 보조기 포함)을 필터 보조기가 없는 분획 I+II+III의 이론적인 중량으로부터 계산된 7 부피의 WFI에서 재구성한다. 상기 용액을 5℃에서 1 시간 동안 교반한다. 이어서 pH를 4.1±0.1로 조절한다. 재구성은 5℃에서 2 시간 동안 계속한다. 이어서 시료 "재구성된 분획 I+II+III"을 표시한다. 1 몰 카프릴레이트 용액을 20 mM의 농도가 되도록 첨가한다. pH는 카프릴레이트의 첨가시 4.9로 변하며, 5.1로 조절한다. 상기 용액을 5℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 상기 용액을 5℃에서 심층 필터 및 페이퍼 시트 상에서 여과한다. 상기 필터를 10 mM 염화나트륨 용액(약 1050g)으로 후세정한다. 여과액을 25℃로 가온하고, 1몰 카프릴레이트를 부가적인 10 mM 농도에 도달하도록 첨가한다. 상기 용액을 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 상기 용액을 원심분리하고, 상층액을 0.45㎛ 필터 (약 1110g) 상에서 여과한다. 시료 "카프릴레이트 후"를 표시한다.

알부민 및 IgA의 감소

		pH 4.9 본 발명	5.1 EP 0 893 450
실험	시료	알부민	알부민
		[㎍/mg IgG]	[㎍/mg IgG]
1	재구성된 분획 I+II+III	27.1	32.9
	카프릴레이트 후	0.2	10.2
2	재구성된 분획 I+II+III	44.2	32.6
	카프릴레이트 후	0.2	2.2
3	재구성된 분획 I+II+III	30.2	31.2
	카프릴레이트 후	0.8	9.9
4	재구성된 분획 I+II+III	22.7	33.1
	카프릴레이트 후	0.9	10.7
	평균 재구성된 분획 I+II+III	31.1	32.5
	표준 편차 재구성된 분획 I+II+III	9.3	0.9
	평균 카프릴레이트 후	0.5	8.3
	표준 편차 카프릴레이트 후	0.4	4.0

		pH 4.9 본 발명	5.1 EP 0 893 450
실험	시료	IgA	IgA
		[㎍/mg IgG]	[㎍/mg IgG]
1	재구성된 분획 I+II+III	86	106
1	카프릴레이트 후	40.9	49.3
2	재구성된 분획 I+II+III	74.3	120.7
2	카프릴레이트 후	23.7	60.5
3	재구성된 분획 I+II+III	88.5	114
3	카프릴레이트 후	30.8	56.9
4	재구성된 분획 I+II+III	115.5	113.6
4	카프릴레이트 후	34.4	51.3
	평균 재구성된 분획 I+II+III	91.1	113.6
	표준 편차 재구성된 분획 I+II+III	17.4	6.0
	평균 카프릴레이트 후	32.5	54.5
	표준 편차 카프릴레이트 후	7.2	5.1

Claims

하기 단계를 포함하는, 항체 및 오염물질을 포함하는 출발 용액으로부터 정제된, 바이러스 불활성화되고, 바이러스 안전한 항체 제제를 제조하는 방법:

(a) 약 4.6 내지 약 4.95, 특히 약 4.8 내지 약 4.95로 출발 용액의 pH를 조절하여 중간체 용액을 제조하는 단계;

(b) 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트 이온을 상기 중간체 용액에 첨가하고, pH를 약 4.6 내지 약 4.95, 특히 약 4.8 내지 약 4.95로 유지하여, 이로 인해 침전물이 형성되고, 항체가 상층액에 본질적으로 존재하는 단계;

(c) 카프릴레이트 및/또는 헵타노에이트 이온 농도, 시간, pH 및 온도의 조건하에 상기 상층액을 인큐베이션하고, 임의로 pH 조절 전에 여과된 용액을 농축 및 정용여과(diafiltration)하는 단계;

(d) 수지에 오염 물질의 결합을 허용하는 반면, 수지에 항체의 현저한 결합을 허용하지 않는 조건하에, 상기 여과된 용액을 하나 이상의 음이온 교환 수지 및 임의로 2개의 상이한 음이온 교환 수지에 적용하는 단계로서, 정제된, 바이러스 불활성화되고, 바이러스 안전한 항체 제제가 제조된다.
제 1 항에 있어서,

단계 (d)에서, 상기 바이러스 불활성화된 용액은 약 5.0 내지 5.2의 pH에서 하나 이상의 음이온 교환 수지와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 및/또는 제 2 항에 있어서,

제2 음이온 교환 크로마토그래피가 6.7 내지 6.9의 pH 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

단계 (b) 및 (c)는 1회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 출발 용액은 혈장 유래 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

단계 (d)에서 상기 불활성화된 용액은 오염물질이 수지에 선택적으로 결합하는 반면, 항체는 수지에 현저하게 결합하지 않도록 하는 조건 하에, 2개의 상이한 음이온 교환 수지와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체는 면역글로불린 G인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,

상기 pH는 제2 음이온 교환 크로마토그래피 전에 pH 6.8±0.1로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 음이온 교환 크로마토그래피 통과액(flow-through)이 60 내지 90 mg/ml로 농축되고, 완충액, 바람직하게는 인산 완충액에 대해 정용여과되는(diafiltrated) 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 제1 음이온 교환 크로마토그래피의 통과액이 지질 외피 바이러스를 불활성화시키기 위해 4.5 내지 8 시간 동안 바람직하게는 Triton X-100 및 TnBP에 의해, 가장 바람직하게는 1% Triton X-100 및 0.3% TnBP에 의해 용매 세제(detergent) 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,

상기 인큐베이션 혼합물의 세제가 고체 및 액체 상 추출에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

UV-C 처리, 열 처리, 바이러스 여과 및 프리온 제거 또는 불활성화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법이 제 1 항의 카프릴레이트 처리와 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서,

고체상 추출시 pH 값이 6.7 내지 6.9로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,

상기 용액이 제2 음이온 교환 크로마토그래피에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서,

상기 음이온 교환기 통과액의 pH 값이 3.5 내지 4.5, 바람직하게는 pH 4.0±0.1로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 IgG 용액이 바이러스 필터에 의해 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 IgG 용액이 나노필터에 의해 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 IgG 용액이 바람직하게는 37℃±1에서 24 시간 이상 동안 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 IgG 용액이 5 또는 10%로 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서,

상기 농축액의 오스몰농도가 적당한 첨가제에 의해 200 내지 400 mOsmol/kg으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서,

상기 IgG 용액이 3.5 내지 6.0으로 조절된 pH, 바람직하게는 4.0 내지 5.5의 pH 값인 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서,

상기 IgG 용액이 멸균 여과되고, 유리병 또는 플라스틱 용기에 충전되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따라 수득가능한 IgG 함유 분획.