KR20020019916A - 이중으로 바이러스 비활성화 처리된 정맥투여용면역글로불린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

불순물이 있는 감마 글로불린 용액을 분획화하고, 정제된 감마 글로불린 용액에 바이러스 비활성화를 위한 용매-세제 처리 및 열처리를 함으로써(아무 순서로) 바이러스가 오염되지 않은 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법. 이 후, 변성된 불순물, 잔류 용매 및 열처리에 의해 생성된 응집물은 감마 글로불린으로부터 제거된다.

Description

이중으로 바이러스 비활성화 처리된 정맥투여용 면역글로불린의 제조방법{Method for preparing dual virally inactivated immune globulin for intravenous administration}

인간 혈장의 콘(Cohn) 분획에서 나온 출발물질로부터 정맥내 투여가능한 γ-글로불린 용액을 수득하는 다양한 공정이 알려져 있다. 어떤 콘 분획은 다른 것들보다 훨씬 높은 γ-글로불린 역가를 가지고 있다. 일반적인 γ-글로불린 용액 제조용 출발물질은 콘 분획 II 또는 콘 분획 II + III이다.

선행기술 공정이 다양한 분리법 및 멸균기술을 이용하지만, 최종 산물의 순도, 안전성 및 전체 수율을 증진시키기 위해 공정의 변경이 끊임없이 요구된다.

많은 상업적 공정이 바이러스 비활성화를 위해 용매/세제(detergent) 단계 또는 열처리 단계를 이용한다. 현재, 선행기술은, 효율적이고 고수율의 γ-글로불린 제조공정의 부분으로서, 콘 분획 II 반죽 또는 콘 분획 II + III 반죽으로부터 출발하는 두 가지의 서로 다른 바이러스 비활성화 공정을 포함한 다단계 공정을 제공하고 있지 않다.

카메야마(Kameyama) 등의 미합중국특허 제 5,151,499호는 단백질 혼합물을 용매/세제에 처리하여 외피(envelope) 바이러스에 대한 비활성화 및 단백질 혼합물을 열처리하여 비외피(nonenvelope) 바이러스에 대해 비활성화시키는 바이러스 비활성화된 단백질 혼합물의 생산공정에 관한 것이다. 상기 특허는 바람직하게 프로테아제(protease) 억제제 존재하에 용매/세제 단계를 먼저 수행하고, 대부분의 실시예에서 건식 열처리 방식인 열처리를 바로 뒤에 하는 것을 개시한다. 액체 상태에서 열처리 수행시, 단백질은 열처리 전에 이온교환 컬럼에 흡착시켜 용매/세제로부터 먼저 회수된다. 액체 열처리는 당, 당 알코올 또는 아미노산 안정화제의 존재하에 수행될 수 있다. 상기 특허가 면역글로불린을 포함하는 많은 단백질 혼합물을 열거하였지만, 주요 생산예는 Factor VIII, Factor IX, 트롬빈, 피브리노오겐 및 파이브로넥틴이다.

우우키(Uuki) 등의 미합중국특허 제 5,371,196호는 분비형 면역글로불린 A의 정제법에 관한 것이다. 바이러스 비활성화를 위해 액체 열처리 또는 액체 열처리와 용매처리의 다양한 조합을 기술하고 있다. 폴리에틸렌 글리콜 분획화가 마지막 단계로서 항상 각 단계의 뒤에 사용된다. 상기 특허는 높은 γ-글로불린 역가의 면역 혈청 글로불린에 관한 것은 아니다.

정맥주사용 γ-글로불린 용액 생산을 위한 일부 선행기술 공정은 콘 분획 II + III 반죽으로 시작하는 다단계 정제공정에서 소비톨(sorbitol) 열안정화제의 존재하에 수행되는 액체 열처리 단계의 도입을 기술하고 있다. 히라오(Hirao) 등의 미합중국 특허 제 4,845,199호에서, 단백질 안정화제인 소비톨 존재하의 액체 열처리 전에, 콘 분획 II + III는 폴리에틸렌 글리콜(이후부터, "PEG"라고 명명) 분획(불순물 및 응집물을 침전시키기 위한 8% w/v PEG 처리 후 γ-글로불린을 침전시키기 위한 12% w/v PEG 처리) 처리되고, 그 다음 이온교환 크로마토그래피(DEAE-Sephadex) 및 인간 혈액형 항체의 제거 단계를 겪는다. 반면, 히라오 등의 미합중국 특허 제 4,876,088호의 실시예 1은 콘 분획 II + III 반죽을 물에 현탁시키고, pH를 5.5로 조정한 후 원심분리하여, 여기서 획득한 상등액을 PEG 분획(6%, 12%) 처리하고 DEAE-Sephadex 이온교환 크로마토그래피를 포함하는 다른 정제 단계를 거친 후, 바이러스 비활성화를 위해 33% w/v 소비톨의 존재하에 열처리하는, 콘 분획 II + III 반죽으로부터 정맥주사용 γ-글로불린 용액의 제조법을 기술한다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 콘 분획 공정으로부터 고순도의 γ-글로불린 용액을 생산하는 완전하고 상업적으로 이용가능한 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 열에 민감한 모든 바이러스를 포함하여, 외피 및 비외피 바이러스 모두가 제거된 매우 순수한 정맥 투여용 γ-글로불린 용액을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 첫번째 바이러스 비활성화 단계 후 및 두 번째 바이러스 비활성화 단계 전에 γ-글로불린 단백질 회수 단계의 필요성이 없는 두 개의 연속적인 바이러스 비활성화 단계를 포함하는 상업적인 γ-글로불린 제조공정을 제공하는 것이다.

당업계의 전문가에게 명백한 상기 및 다른 목적들은 본 발명에 의해 제공되는데, 본 발명에서는, 부분정제되었으나 γ-글로불린이 풍부한 알코올성 콘 분획을 먼저 PEG 분획 처리하고, 그 후 두 번의 바이러스 비활성화 처리를 하는데, 첫 번째 바이러스 비활성화 처리는 외피 바이러스의 파괴를 위해 용매, 바람직하게는 용매/세제 혼합물 존재하에 처리하고, 두 번째 바이러스 비활성화 처리는 두 단계 사이의 γ-글로불린 회수 단계가 전혀 필요없이 열처리를 한다. 그 후, 열처리에 의해 형성된 응집물을 열처리 및 용매처리된 용액으로부터 제거한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 소비톨은 열안정화제이며 트리알킬 포스페이트(trialkyl phosphate)가 용매이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 용매-세제 처리전에 존재하는 입자들을 제거한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, γ-글로불린 용액은 바이러스 비활성화 완료 전에 PEG 분획 처리된다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, γ-글로불린 용액은 바이러스 비활성화 완료 전에 양이온 교환수지로 처리된다.

본 발명의 어떤 바람직한 실시태양에서, γ-글로불린 침전없이 한 단계의 폴리에틸렌글리콜 분획화 단계를 행한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양에서, 용매/세제 바이러스 비활성화는 열처리 바이러스 비활성화 전에 행해진다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 열 및 용매-세제 멸균화되고 정맥투여에적합한 γ-글로불린이 제공된다.

본 발명은 주성분으로 IgG(γ-globulin)을 포함하는 정맥투여용 면역글로불린의 상업적인 다단계 생산공정에 관한 것이다.

면역글로불린을 포함하는 분획이 출발물질로 사용된다. 상기 분획은 그것이 인간혈장으로부터 유래하고 면역글로불린 분획을 포함하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 면역글로불린 포함 분획의 특정적 예로는 콘(Cohn)의 에탄올 분획법에 의해 획득된 분획 II + III과 분획 II 및 그것에 등가적인 면역글로불린 포함분획의 반죽형태이다. 다른 출발물질은 분획 I + II + III 및 분획 II + IIIw이다. 출발물질은 인간 혈액형 항체, 플라스미노오겐, 플라스민, 칼리크레인, 프리칼리크레인 활성인자, IgM, IgA, IgG 중합체 등(이후로 또는 이전에 "응집물"라고 명명)의 불순물을 포함할 수 있다.

바람직한 출발물질은 콘 분획 II 또는 콘 분획 II + III이다. 콘 분획 II + III 반죽이 사용될 때는, 먼저 전기 분획을 예비 세척하여 콘 분획 II + IIIw를 만들고 이것을 본 발명의 공정에 사용하는 것이 바람직하다. "분획 II + IIIw"는 인산나트륨(dibasic) 용액으로 세척된 콘 분획 II + III 침전이다.

분획 II + IIIw는 약 20배 부피의 물에 약 1kg의 분획 II + III 반죽 비율로 차가운 주사용 물에 분획 II + III 침전을 현탁시킴으로써 획득할 수 있다. 지질, 지질단백질 및 알부민을 용해시키기 위해 약 0.003M 인산나트륨 최종 농도가 되도록 인산나트륨 용액을 첨가한다. 최종 농도가 20%가 되도록 차가운 알코올을 첨가한다. 알코올 첨가 중에, 온도를 점차적으로 -5±1℃로 낮추고 pH는 예를 들어, 아세트산 완충액이나 수산화나트륨을 사용하여 7.2±0.1로 유지되거나 조정된다.분획 II + IIIw의 형성된 침전을 온도를 -5±1℃로 유지하면서 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한다.

본 발명의 공정순서에 따라 수행되는 PEG 분획화 이전에, 다양한 예비 정제 및/또는 응집물 감소 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 약 20%의 알코올을 포함하는 분획 II + IIIw 반죽이 사용되고, 존재하는 단백질의 70% 이상이 IgG일 때, 분획 II + IIIw 반죽을 3 내지 10배 부피, 바람직하게는 3 내지 5배 부피의 차가운 물로 약 0 내지 5℃의 온도에서 pH 4.0 아세트산 완충액 또는 염산을 사용하여 pH를 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 5.0 내지 5.5가 되도록 조정하면서 현탁시킬 수 있다. 모든 γ-글로불린이 용액속으로 흩어지도록 약 2 내지 15시간 동안 혼합물을 교반한다. 그 후, 알부민 및 α-글로불린 등의 녹지 않은 단백질을 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거할 수 있다.

다른 콘 분획을 출발물질로 사용할 때는, 추가적으로 처리될 IgG를 많이 함유하는 분획을 획득하기 위한 예비 정제를 수행하기 위해 공정의 초기 단계 또는 단계들을 원하는 곳에서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 콘 분획 II(순수한 IgG를 95% 이상 포함하는)를 콘 분획 III로부터 분리하고, 콘 분획 II는 추가적인 공정을 필요로 할 때, 초기 단계는 우에무라(Uemura) 등의 미합중국 특허 제 4,371,520호에 개시된 바와 같이, 항-상보적 활성(anti-complementary activity, ACA)을 지니고 있다고 알려진 면역 글로불린 응집물을 면역 글로불린 단일체(monomer) 및 이합체(dimer)로 나누기 위해, 산성 pH 3.2 내지 5.0 바람직하게는 3.8 내지 4.2이다. 선택적으로, 콘 분획 II + III 출발물질에 대한, 우에무라 등의 특허에 개시된 낮은 pH 처리는 상기 기술된 초기 정제 단계 후에 수반되는 부가적 단계로서 PEG 분획화 단계 전에 수행될 수 있다.

PEG 분획화는 바이러스 비활성화 전에 수행한다. PEG 분획화는 IgG 응집물 및 혈장단백질 분획에 자연적으로 발생하는 불순물로부터 원하는 IgG 단일체 및 이합체를 분리하기 위하여 면역글로불린 정제 기술에 잘 알려진 공정이다. 바이러스 비활성화 전의 응집물 및 존재하는 다른 불순물의 제거는, 예를 들어 60℃에서 10시간동안 수행되는 열처리 단계 동안에 일어날 수 있는 응집도 및 혼탁도를 감소시킨다.

바이러스 비활성화 열처리 후 수반되는 두 번째 PEG 분획화 단계는 열처리 과정중 발생하는 변성된 불순물 및/또는 응집물을 제거하는데 효과적이다.

선행기술에 문서화된 아무 PEG 분획화 공정이 사용될 수 있다. 일반적으로, 한 단계 또는 두 단계의 PEG 분획화를 수행한다. 첫 단계의 PEG 분획화에서, 원하는 Ig 단일체 및 이합체는 용액내에 존재하고 응집물 등의 불필요한 단백질들은 용액 밖으로 침전되도록 PEG 농도 및 pH를 선택한다. 원심분리 및/또는 여과를 한 후, 원하는 IgG 단일체 및 이합체가 참전하도록 pH를 조정하면서 PEG의 농도를 증가시킨다.

예를 들어, 약 5.0 내지 7.5 pH, 분획 II + IIIw 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 약 6.5 내지 7.5 pH에서, 분획 II + III 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 약 5.5 내지 6.0 pH에서, 약 4 내지 8%의 PEG 농도, 분획 II + IIIw 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 약 4 내지 6%에서, 분획 II + III반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 약 6 내지 8%의 PEG 농도로 첫 단계의 PEG 분획화를 수행한다. 온도를 약 0 내지 2℃로 유지하면서, 첫 단계의 PEG 분획화를 약 1 내지 8시간동안 수행하고, 그 후 응집물을 포함한 불필요한 단백질을 포함하는 침전을 상기 기술된대로 제거한다. 순수한 면역글로불린을 수집하기를 원하면, 여과물의 pH를 약 8.0 내지 9.0, 바람직하게는 약 8.5 내지 8.9로 조정하고, 최종 농도가 약 10 내지 15%, 바람직하게는 약 12%가 되도록 PEG를 추가한다. 침전이 형성되는데, 이것은 순수한 면역글로불린이며, 여과 및/또는 원심분리에 의해 제거한다.

본 발명의 실시에 사용가능한 PEG 분획화의 보다 자세한 사항은 상기 기술된 히라오 등의 미합중국특허 제 4,876,088호 및 히라오 등의 미합중국특허 제 4,845,199호에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 다음 필수 단계는 열처리 및 용매 혹은 용매-세제 혼합물 처리로부터 선택되는 첫번째 바이러스 비활성화 과정을 수행하는 것이다. 따라서, 첫 번째 바이러스 비활성화 과정으로 사용되지 않은 열처리 및 용매 혹은 용매-세제 처리 중의 하나가 두 번째 바이러스 비활성화 과정으로 수행된다. 하기 기술되다시피, 추가적인 정제공정, 특히 이온교환수지의 사용을 포함하는 공정을 용매-세제 처리 전 및/또는 후에, 및/또는 열처리 후에 수행할 수 있다.

특히 유용한 공정은, 첫 번째 바이러스 비활성화로서의 용매-세제 바이러스 비활성화 이전에 음이온 교환처리를 하고, 두 번째 바이러스 비활성화로서의 열처리 바이러스 비활성화 후에 양이온 교환처리를 수행하는 것이다. 이 공정에 의해서, 인간 혈장에서 발견되는 불필요한 단백질 물질(예를 들어, 프리칼리크레인 활성인자, IgA, IgM 및 알부민)을 음이온 교환기의 사용으로 제거할 수 있고, 더 나아가서 PEG와 같이 있는 불필요한 단백질 물질(프리칼리크레인 활성인자, IgA, IgM 및 알부민), 용매-세제 처리후의 잔류시약 및 열처리 후의 변성된 단백질(불순물 및/또는 응집물)을 양이온 교환과정을 통해 제거할 수 있다. 따라서, 양이온 교환과정은 열처리 바이러스 비활성화에 의해 발생한 변성된 불순물 및 응집물을 제거하기 위하여 바이러스 비활성화 완료 후의 두 번째 PEG 분획화 대신에 사용될 수 있다.

전체 공정 동안에 만약 정제가 달성되지 않는다면, 변성된 단백질을 포함하는 모든 입자 물질을 제거하기 위해 용액을 용매-세제 처리해야 한다. 따라서, 용매-세제 첨가 전에 1 미크론(micron) 또는 더 미세한 필터로 용액을 여과하는 것이 바람직하다. 이 단계는 또한 커다란 입자 내에 존재하는 바이러스가 용매-세제에 대한 노출을 회피할 가능성을 감소시킨다.

오늘날, 외피 바이러스 비활성화용으로 바람직한 용매는 트리알킬 포스페이트(trialkyl phosphate)이다. 본 발명에 사용되는 트리알킬 포스페이트는 특별히 제한된 것은 아니나, 바람직하게는 트리(n-부틸)포스페이트(이후로, "TNBP"라고 명명)를 사용한다. 다른 사용가능한 트리알킬 포스페이트는 트리(ter-부틸)포스페이트, 트리(n-헥실)포스페이트, 트리(2-에틸헥실)포스페이트 등이다. 2 또는 그 이상의 서로 다른 트리알킬 포스페이트의 혼합물을 사용하는 것도 가능하다.

트리알킬 포스페이트는 0.01 내지 10(w/v)%, 바람직하게는 약 0.1 내지3(w/v)% 사이의 양으로 사용된다.

트리알킬 포스페이트는 세제(detergent) 또는 계면활성제(surfactant)의 존재 또는 비존재하에 사용될 수 있다. 세제와 조합하여 트리알킬 포스페이트를 사용하는 것이 바람직하다. 세제는 면역글로불린 혼합물 내 바이러스의 트리알킬 포스페이트와의 접촉을 증가시키는 기능을 한다.

세제의 예로는 지방산의 폴리옥시에틸렌 유도체; 폴리소베이트 (polysorbate) 80(상품명: Tween 80 등) 및 폴리소베이트 20(상품명: Tween 20 등) 등의 무수 소비톨의 부분 에스테르; 및 옥시에틸렌화 알킬페놀(oxyethylated alkylphenol, 상품명: Triton X 100 등) 등의 비이온성 목욕기름 린스제를 포함한다. 즈비터(zwitter) 이온 세제 등의 다른 계면활성제 및 세제도 포함된다.

세제를 사용할 때는. 그것은 임계량(critical amount)으로 첨가되지 않는다; 예를 들어, 약 0.001% 내지 10%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 3%의 비율로 세제를 사용할 수 있다.

본 발명에서, 면역글로불린 포함 혼합물의 트리알킬 포스페이트 처리를 약 20 내지 35℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서, 1시간 이상, 바람직하게는 약 5 내지 8시간, 보다 바람직하게는 약 6 내지 7시간 동안 수행한다.

트리알킬 포스페이트 처리 동안, 면역글로블린은 액체상에서 약 3 내지 8% 단백질 용액으로 존재한다.

PEG를 더 첨가함으로써 γ-글로불린을 침전시키지 않는 한 단계의 PEG 분획화로 생성된 여과물에 트리알킬 포스페이트 및 다른 조건적인 세제를 직접 첨가할수 있다. 단백질의 희석은 필수적이다. 그렇지 않다면, 침전된 γ-글로불린을 주사용 찬 물에 현탁시키고, pH를 약 5.0 내지 6.0으로 조정하고, 거기에 유기용매 및 조건적인 세제를 첨가한다.

열멸균화 단계에서, PEG 분획화 또는 정제단계가 없는 용매(세제) 단계로부터 획득된 면역글로불린 단백질 용액을 사용하고, 당, 당 알코올 및/또는 아미노산 열안정화제가 전기 단백질 용액에 첨가된다. pH는 약 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5이다. 열안정화제는 바람직하게는 설탕(sucrose), 엿당(maltose), 소비톨(sorbitol) 또는 만니톨(mannitol)이며, 가장 바람직하게는 소비톨이다. 당 또는 당 알코올을 분말로서 면역글로불린 용액에 첨가하거나 또는 먼저 작은 부피의 물과 섞은 후 약 10 내지 50(w/w)%의 최종농도가 되도록 포화상태로 첨가한다.

열안정화제를 첨가한 후, 열에 민감한 바이러스의 비활성화를 위해서 혼합물을 약 50 내지 70℃에서 10 내지 100시간 동안, 바람직하게는 60℃에서 10 내지 20시간 동안 가열한다. 열처리 단계는 바이러스를 비활성화시킬 뿐만 아니라, 단백질 변성화 작용을 통해 콘 분획 II +III과 연관되어 있는, 예를 들어 프리칼리크레인 활성인자, 플라스민 및 플라스미노오겐 등의 불필요한 단백질의 양을 상당히 감소시킨다.

열처리 후, 용액을 약 0 내지 30℃, 바람직하게는 10℃로 냉각하고 pH를 약 5.0 내지 6.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5로 조정한다.

용매-세제 처리 전에 음이온 교환 처리를 수행하지 않았다면, 열처리된 면역글로불린에 음이온 교환 처리를 할 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 비활성화 단계 완료 후 열처리된 산물에 적어도 한 번의 양이온 교환 처리를 하고, 음이온 교환 처리는 첫 번째 바이러스 비활성화 단계인 용매-세제 처리 전에 수행한다. 음이온 교환 처리는 일반적으로 약 5.0 내지 5.5의 pH를 가지고 IgG의 최대흡착을 위해 낮은 이온화 세기(ionic strength)를 가지는 수용액에 용해된 면역글로불린에 대해 수행된다. 단백질 농도는 일반적으로 약 1 내지 15(w/v)%의 범위, 보다 바람직하게는 약 3 내지 10(w/v)% 내의 범위에 있다. 음이온 교환기를 사용된 것과 같은 수성 용매로 평형시키고 배치(batch) 또는 연속 시스템을 수행할 수 있다. 예를 들어, 선처리된 음이온 교환기(예를 들어, 1g의 DEAE Sephadex A-50 수지를 0.4% 염화나트륨 용액에 약 20g으로 부풀린 것) 약 1ml당 10 내지 100ml의 비율로 면역글로불린 용액과 음이온 교환기를 혼합하고, 약 0 내지 5℃에서 약 0.5 내지 5시간 동안 혼합물을 교반한 후 6000 내지 8000 rpm에서 10 내지 30분 동안 원심분리하거나 여과하여 상등액 액체를 회수함으로써 음이온 교환 배치 처리를 수행할 수 있다. 불순물을 이온교환기에 흡착시키기 충분한 속도로 면역 글로불린 용액을 음이온 교환기 컬럼에 통과시켜 흡착되지 않은 부분을 회수함으로써 연속 처리를 수행할 수 있다.

사용되는 음이온 교환기는 예를 들어, 불용성 담체에 결합된 음이온 교환 그룹을 포함한다. 음이온 교환 그룹은 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl, DEAE), 쿼터나리 아미노에틸(quaternary aminoethyl, QAE)기 등을 포함하며 불용성 담체는 아가로오스, 셀룰로오스, 텍스트란, 폴리아크릴아마이드 등을 포함한다.

사용가능한 양이온 교환기의 예로는 카르복시 메틸 세파덱스(CM-Sephadex),CM-cellulose, SP-Sephadex, CM-Sepharose 및 SP-Sepharose 등이다. 1ml의 선처리된 양이온 교환기(예를 들어, 1g의 CM-Sephadex C-50 수지를 0.4% 염화나트륨 용액에 약 30 내지 35g으로 부풀린 것)를 0.5 내지 5ml의 면역 글로불린 용액과 혼합하여 0-5℃에서 1-6시간 동안 교반한다. 현탁액을 원심분리하거나 여과하여 IgG가 흡착된 수지를 회수한다. 또한, 연속적 공정이 사용될 수 있다.

상기 기술된 조건이 양이온 교환기에 사용될 때는, IgG가 흡착되고, 그 후 단백질이 흡착된 양이온 교환 수지를 세척한 후 1.4N 염화나트륨 용액으로 IgG를 용출시킬 수 있다.

상기 단계의 공정 후, IgG를 정화하고, 투석하고 필요한 농도로 농축한다. 원한다면, D-소비톨과 같은 안정화제를 첨가하고, pH 5.4의 50mg/ml 또는 100mg/ml IgG 및 50mg/ml D-소비톨의 조성을 갖는 용액이 되도록 최종 조정을 한다. 상기 용액을 멸균된 필터를 통해 멸균여과하고 바이알에 채운다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

원한다면, 다른 면역 글로불린 정제 공정을 여기 기술된 공정과 적절히 조합할 수 있다. 예를 들어, 칼리크레인 및 프리칼리크레인 활성인자를 감소시키는 데 유용한 벤토나이트(bentonite) 정화 단계를 사용 할 수 있다. 이 보기가 바로 아래 기술되는 실시예 1에 나타난다.

실시예 1: 용매-세제 및 열처리된 γ-글로불린

685g의 콘 분획 II + IIIw 반죽을 약 11.9kg의 차가운 물에 현탁시켰다. 아세트산 나트륨 삼수화물 용액을 이 현탁액에 첨가하여 IgG를 선택적으로 용해시키기 위해 약 0.04M의 최종농도가 되게 하였다. 15분간 혼합한 후, pH 4.0 아세트산 완충액으로 상기 현탁액의 pH를 5.2로 조정하였다. 차가운 알코올(95%)을 최종 농도 17%가 되도록 현탁액에 첨가하였다. 알코올 첨가 동안, 현탁액의 온도를 점차적으로 -6℃로 낮추었다. 셀라이트(Celite) 사로부터 이용가능한 산으로 세척된 셀라이트 535 303g을 최종농도 2%가 되도록 여과 보조물질로서 첨가하였다. 한시간 정도 혼합한 후, 플라스민, 플라스미노오겐, IgA 및 IgM 등의 불필요한 단백질을 포함하고 있는 셀라이트 및 콘 분획 III 반죽을 여과 프레스를 사용하여 제거하였다. 여과물을 0.45μm 및 0.2μm 필터로 추가적으로 정화하였다. 그 후, 1.0M sodium bicarbonate로 분획 III 상등액의 pH를 7.0으로 조정하고, 차가운 알코올(95%)을 최종농도 25%가 되도록 첨가하면서 온도를 -7℃로 낮추었다. 필요하다면, 현탁액의 pH를 7.2로 조정하고, -7℃에서 여과에 의해 분획 II를 제거하였다.

0.2% 알부민(인간) 및 2.0% 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 차가운 수용액(0 내지 2℃로 유지된) 1.5kg에 1kg의 분획 II 반죽을 현탁시켰다. 희석된 염산으로 pH를 3.7±0.2로 조정하고, 그 후 15시간 동안 혼합하는 과정에서 현탁액의 pH를 그대로 유지하였다.

온도를 0 내지 2℃로 유지하면서 희석된 수산화나트륨으로 용액의 pH를 5.3으로 조정하고, 50% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 3350를 최종농도 4%가 되도록 용액에첨가하였다. 이렇게 형성된 침전을 1℃에서 여과 또는 원심분리에 의해 제거하였다. 1.0N 염산으로 여과물의 pH를 4.9로 조정하고 벤토나이트를 최종농도 0.25%가 되도록 첨가하였다. 벤토나이트 현탁액의 pH를 5.2로 재조정하고 벤토나이트를 제거하기 위해 1℃에서 현탁액을 여과 또는 원심분리하였다. 0.25N 수산화나트륨으로 여과물의 pH를 8.0으로 조정하고 50% PEG 3350 용액을 최종농도 12%가 되도록 첨가하였다. 이렇게 형성된 침전(순수한 면역 글로불린)을 0 내지 2℃에서 여과 또는 원심분리에 의해 제거하였다.

상기 과정은 PEG 분획화 수행에 사용가능한 전형적인 공정을 나타낸다. 다른 PEG 분획화 공정이 당업계에 알려져 있다.

PEG-정제된 면역 글로불린 반죽 100g을 450ml의 차가운 주사용 물에 현탁하였다. 5% 초산을 첨가하여 현탁액의 pH를 5.5로 조정하였다. +5℃에서 2시간 동안 현탁액을 혼합한 후, pH 5.5에서 0.3% 염화나트륨으로 평형화된 33.3g의 DEAE Sephadex A 50을 첨가하였다. 두 시간의 흡수 후, DEAE 수지를 여과에 의해 제거하였다.

트리(n-부틸)포스페이트(TNBP) 및 폴리소베이트(polysorbate) 80 혼합물을 0.3% TNBP 및 1.0% 폴리소베이트 80의 최종농도가 되도록 여과물에 첨가하였다. 용액을 +5℃에서 밤새도록 반응하였다. 그 후, D-소비톨을 최종농도 33%가 되도록 용액에 첨가하고 안정화된 IgG 용액을 1시간 동안 혼합하고, pH를 5.5로 조정한 후 60℃에서 밤새도록 가열하였다.

혼합물을 +5℃로 냉각하고 pH를 5.8로 조정하였다. 용매, 세제, PEG 및 소비톨을 제거하기 위해, 혼합물을 하기와 같이 CM-Sephadex C-50으로 처리하였다: 용매/세제 및 열처리된 용액을 차가운 물로 4배 희석하였다. 희석된 용액을 33부분으로 균등분할하였다. 현탁액 a, b, c 각각에 대하여 0.2%, 0.4% 및 0.6%의 최종농도가 되도록 염화나트륨을 각 균등분할액에 첨가하였다. pH 5.8에서 각각에 해당하는 동일한 염화나트륨 농도로 평형화된 CM-Sephadex C-50 수지 0.65g(단백질 1g 당)을 각각의 균등분할액에 처리하였다.

단백질을 수지에 3±2 시간 동안 흡착시킨 후, 여과에 의해 용액을 제거하였다. 잔류한 폴리소베이트 80, TNBP, PEG 및 소비톨을 제거하기 위해 단백질이 흡착된 수지를 0.2%, 0.4% 및 0.6% 염화나트륨 용액으로 각각 세척하였다. 흡착된 단백질을 떼어내기 위해 단백질이 흡착되고 세척된 CM-Sepharose C-50 수지를 1.5±0.5N 염화나트륨 용액에 2±1 시간 동안 재현탁시켰다. 여과에 의해 떨어져 나간 단백질로부터 수지를 분리하였다.

여기서 의논되었듯이, 12% PEG 단계 및 음이온 교환 수지 처리는 조건적인 단계이다. 더 나아가서, 양이온 교환 수지 처리 대신에 또는 부가적으로 두 번째 PEG 분획화 단계를 사용할 수 있다. 또한, 어떤 순서로도 열처리 및 용매(용매-세제) 바이러스 비활성화 단계를 수행할 수 있다.

본 발명의 변형은 당업계의 전문가에게 명백할 것이다.

Claims (25)

1. 하기 각 단계를 포함하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법:

   (a) 순수한 감마 글로불린을 획득하기 위해 불순물이 섞인 감마 글로불린 용액을 폴리에틸렌 글리콜 분획화로 처리하는 단계;

   (b) 외피 바이러스를 비활성화시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜로 정제된 감마 글로불린을 유기용매로 처리하는 단계;

   (c) 열에 민감한 바이러스를 비활성화시키기에 충분한 시간 및 온도 하에서 폴리에틸렌 글리콜로 정제된 감마 글로불린을 열처리하는 단계; 및

   (d) 열처리에 의해 생성된 응집물을 제거하는 단계.
2. 제 1항에 있어서, 불순물이 섞인 감마 글로불린 용액은 콘(Cohn) 분획 I + II + III, 콘 분획 II + III, 콘 분획 II + IIIw 또는 콘 분획 II인 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 폴리에틸렌 글리콜 분획화 이전에 불순물이 섞인 감마 글로불린 용액을 적어도 하나의 정제 단계를 거치도록 하는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 단계 (c)의 열처리는 10 내지 100 시간 동안 50 내지 70℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 단계 (c)의 열처리는 10 시간 동안 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
6. 제 1항에 있어서, 단계 (d)는 열처리된 용액의 폴리에틸렌 글리콜 분획화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
7. 제 1항에 있어서, 단계 (b)에 사용되는 유기용매는 알킬 포스페이트(alkyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
8. 제 6항에 있어서, 단계 (b)에 사용되는 유기용매는 알킬 포스페이트(alkyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 알킬 포스페이트는 트리-n-부틸 포스페이트(tri-n-butyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
10. 제 1항에 있어서, 유기용매는 세제(detergent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
11. 제 9항에 있어서, 유기용매는 세제(detergent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
12. 제 1항에 있어서, 단계 (a) 후, 감마 글로불린 용액을 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지로 처리하는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
13. 제 12항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (c) 전에 수행되고 음이온 교환 수지 처리는 단계 (b) 전에, 양이온 교환 수지 처리는 단계 (c) 후에 처리되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
14. 제 1항에 있어서, 열처리 단계 (c)는 어떠한 중간 과정 없이 단계 (b)로부터의 면역 글로불린-유기용매 용액에 직접 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
15. 제 13항에 있어서, 열처리 단계 (c)는 어떠한 중간 과정 없이 단계 (b)로부터의 면역 글로불린-유기용매 용액에 직접 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
16. 제 6항에 있어서, 첫 번째 폴리에틸렌 글리콜 분획화 후벤토나이트(bentonite) 정화 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
17. 제 1항에 있어서, 단계 (d)는 열처리된 용액을 양이온 교환 수지로 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
18. 제 1항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 분획화 단계 (a)는 감마 글로불린의 침전 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
19. 제 6항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 분획화 단계 (d)는 감마 글로불린의 침전 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
20. 제 1항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 분획화 단계 (a)는 불순물이 침전으로서 제거되는 첫 번째의 폴리에틸렌 글리콜 분획화 및 감마 글로불린이 침전으로서 회수되는 두 번째 폴리에틸렌 글리콜 분획화의 적어도 두 가지 단계로서 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
21. 제 6항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 분획화 단계 (d)는 불순물이 침전으로서 제거되는 첫 번째의 폴리에틸렌 글리콜 분획화 및 감마 글로불린이 침전으로서 회수되는 두 번째 폴리에틸렌 글리콜 분획화의 적어도 두 가지 단계로서 수행되는것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
22. 제 1항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (c) 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
23. 제 1항에 있어서, 단계 (c)는 단계 (b) 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
24. 제 14항의 공정에 의해 생산된 정맥투여용 감마 글로불린 용액.
25. 제 15항의 공정에 의해 생산된 정맥투여용 감마 글로불린 용액.