CZ20013792A3

CZ20013792A3 - Způsob přípravy intravenozně podávaného gama globulinu

Info

Publication number: CZ20013792A3
Application number: CZ20013792A
Authority: CZ
Inventors: Raja R. Mamidi; Andranik Bagdasarian; Gorgonio Canaveral; Kazuo Takechi
Original assignee: Alpha Therapeutic Corporation
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2002-04-17
Also published as: IL146039A0; JP2003528803A; BR0010815A; EP1183036A4; CA2371356A1; EP1183036A1; US6504012B2; CN1351500A; PL361133A1; KR20020019916A; AU757568B2; WO2000071142A1; ZA200109516B; US20010044524A1; US6441144B1; AU4641000A

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se vztahuje na integrální, mnohastupňový komerční postup pro výrobu imunoglobulinu pro intravenosní podávání, který obsahuje IgG (γ-globulin) jako hlavní složku,

Dosavadní stav techniky

Jsou známé různé postupy pro přípravu roztoku γ-globulinu pro intravenosní podávání, při čemž se vychází z Cohnovy frakcionace humánního plazmatu. Některé Cohnovy frakce obsahují vyšší množství γ-globulinu než jiné. Obvyklý výchozí materiál pro roztok γ-globulinu je Cohnova frakce II nebo Cohnova frakce II + III.

Ačkoliv dřívější postupy doporučují různé dělící a sterilizační techniky, je stále hledána taková modifikace postupů, která by zlepšila konečný výrobek, jeho čistotu a bezpečnost a zvětšila rovněž výtěžnost.

Řada komerčních způsobů doporučuje pro virovou inaktivaci postup rozpouštění/detergence, nebo pro virovou inaktivaci postup tepelného zpracování. Do dnešního dne známé postupy nevyužívají mnohostupňové způsoby výroby, počínaje využitím pasty Cohnovy frakce II nebo pasty frakcí II + III, včetně dvou rozdílných postupů pro virovou inaktivaci jako výkonný výrobní postup, poskytující vysokou výtěžnost γ-globulinu.

Patent US 5 151 499, Kameyama a kol., je zaměřen na způsob výroby inaktivovaného virového proteinu, při kterém se virová inaktivace dosáhne zaobálkováním virů při zpracování proteinové složky způsobem rozpouštědlo/detergent a inaktivace nezaobálkovaných virů se provede tepelným zpracováním proteinové složky. Uvedený patent ·

·· fc • · fcfc • fcfc • fcfc fcfcfc • fc fcfcfc sděluje, zeje výhodné využít způsob rozpouštědlo/detergent jako první postupový krok a za přítomnosti inhibitoru proteinasy, a následně provést tepelné zpracování, což je ve většině případů suché tepelné zpracování. Pokud se má tepelné zpracování provést v kapalné fázi, je třeba napřed před tepelným zpracováním odstranit protein z rozpouštědla/detergentu adsorpcí na iontoměničové koloně, a to před jakýmkoliv tepelným zpracováním. Tepelné zpracování v kapalné fázi může být provedeno za přítomnosti cukru, cukrového alkoholu nebo aminokyselinového stabilizátoru. Ačkoliv zmíněný patent vypisuje řadu výchozích proteinových složek včetně imunoglobulínu, pro výrobu se doporučuje využití faktoru Vlil, faktoru IX, thrombinu, fibrinogenu a fibronektinu.

Patent US 5 371 196, Uuki a kol., je zaměřen na přečištění sekrečního imunoglobulinu A. Pro postup virové inaktivace je popisováno tepelné zpracování v kapalné fázi nebo kombinace různých způsobů tepelného zpracování v kapalné fázi. Doporučuje se frakcionace s polyethylenglykolem následně po každém pracovním kroku a rovněž jako konečný pracovní krok. Uvedený patent se nevztahuje na imunní sérum globulinu s vysokým obsahem γ-globulinu.

Některé dříve používané způsoby pro přípravu roztoků γ-globulinu pro intravenosní injektáž popisují využití tepelného zpracování provedeného za přítomnosti sorbítolového tepelného stabilizátoru v mnohonásobném čistícím postupu s Cohnovou pastou frakce II + III jako výchozí látkou. V patentu US 4 845 199, Hirao a kol., je Cohnova frakce II + III frakcionována s polyethylenglykolem (následně označovaného jen jako „PEG“) (8 hmotn. % roztok PEG pro vysrážení nečistot a agregátů s následným vysrážením γ-globulinu roztokem 12 hmotn. % PEG), pak zpracování iontovýměnnou chromatografií (DEAE-Sephadex®, Pharmacia, aniontový iontoměnič) k odstranění humánních krevních skupinových antilátek před tepelným zpracováním v kapalné fázi za přítomnosti sorbitolu jako proteinového stabilizátoru. Na druhou stranu, příklad 1 patentu US 4 876 088, Hirao a kol., popisuje přípravu roztoku γ-globulinu pro intravenosní injektáž z pasty Cohnovy frakce II + III, kdy je pasta suspendována do vody, pH nastaveno na 5,5 a odstředěno, s následným provedením virové aktivace za přítomnosti 33 hmotn. % sorbitolu, a pak frakcionací s PEG (6 %/12 %) a následně provedení čistících kroků včetně iontovýměnné chromatografie DEAE-Sephadex.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je provedení integrálního, komečně využitelného způsobu výroby vysoce čistého roztoku γ-globulinu za využití Cohnova trakčního postupu.

Jiným předmětem vynálezu je příprava velmi čistého roztoku γ-globulinu pro intravenosní podávání, který neobsahuje jak zaobálkované, tak nezaobálkované viry, včetně všech virů citlivých na teplo.

Dalším předmětem vynálezu je způsob provedení komerční výroby γ-globulinu včetně dvoustupňové virové inaktivace bez potřeby vyprecipitování γ-globulinového proteinu před provedením prvního kroku virové inaktivace, ani před provedením druhého kroku virové inaktivace.

Shora uvedené i jiné způsoby jsou zkušenému pracovníkovi v oboru zřejmé na základě předloženého postupu, ve kterém alkoholová Cohnova frakce, která je částečně vyčištěna, ale je bohatá na γ-globulin, je zprvu zpracována frakcionací s PEG a pak podrobena dvěma způsobům virové inaktivace. Z nich jedna inaktivace je provedena rozpouštědlem, přednostně směsí rozpouštědla/detergentu, pro rozrušení virových obálek, a druhá spočívá ve virové inaktivaci tepelným zpracováním, bez potřeby precipitace γ-globulinu mezi oběma virovými inaktivačními postupy. V zápětí je odstraněn jakýkoliv agregát vzniklý tepelným zpracováním a zpracováním rozpouštědlem.

V předloženém vynálezu je dávána přednost sorbitolu jako tepelnému stabilizátoru a trialkylfosfátu jako rozpouštědlu.

•	4· ·	4·	• 4
44	• 4	• 9	4 4	» 4
•	• ·	9	4 4	4
				4
•	• ·	9	• 4	4
444		»44	44	9999

Jiným předmětem předloženého vynálezu je odstranění všech specifičností před zpracováním rozpouštědlem/detergentem.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je podrobení roztoku γ-globulinu trakčnímu dělení PEG následně po dokončení virové inaktivace.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zpracování roztoku γ-globulinu kationtovou iontoměničovou pryskyřicí následně po dokončení virové inaktivace.

Některým z dalších předmětů předloženého vynálezu je jednostupňové trakční zpracování polyethylenglykolem bez precipitace γ-globulinu.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je virová inaktivace rozpouštědlem/detergentem před provedením virové inaktivace tepelným zpracováním.

Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je příprava tepelně sterilizovaného a v rozpouštědle/detergentu sterilizovaného γ-globulinu vhodného pro intravenosní injekční podávání.

Jako výchozí materiál se použije frakce obsahující imiinoglobulin. Druh této frakce není v podstatě omezen, pokud se jedná o původní humánní plazma a obsahuje imunoglobulinovou frakci. Specifické příklady takové frakce obsahující imunoglobulin zahrnují frakce II + III a frakci II, získané ethanolovým dělením podle Cohna, a pasty ekvivalentní frakce obsahující imunoglobulin. Jiné výchozí materiály jsou frakce I + II + III a frakce II + lllw. Výchozí materiál může obsahovat nečistoty, jako jsou skupiny antilátek lidské krve, plasminogen, plasmin, kalikrein, prekalikreinový aktivátor, polymery IgM, IgA, IgG (zde a následně označované jako „agregáty“), atd.

Vhodný výchozí materiál je Cohnova frakce II nebo Cohnovy frakce II + III. Pokud se použije pasta Cohnovy frakce II + III, doporučuje se předem provést čistění, aby se připravila frakce II + lllw, která se pak použije ke zpracování podle předloženého vynálezu. „Frakce II + lllw“ představuje precipitát Cohnovy frakce II + III po promytí • · roztokem dinatriumfosfátu.

Frakce II + lllw může být získána suspendováním precipitátu frakce II + III ve studené vodě pro injekce v poměru asi 1 kg pasty II + III v asi 20 objemech vody. Přidá se roztok natriumdifosfátu, aby se získala konečná koncentrace, přibližně 0,003 M roztok natriumfosfátu, pro rozpuštění lipidů, lipoproteinů a albuminu. Pak se přidá studený alkohol do jeho koncentrace asi 20 %. Během přidávání alkoholu se teplota postupně sníží na -5 ± 1 °C a pH se zachová nebo nastaví na 7,2 ± 0,1, např. použitím acetátového pufru nebo zředěného roztoku hydroxidu sodného. Precipitát frakce II + lllw se shromáždí odstředěním a/nebo filtrací při zachování teploty -5 ± 1 °C .

Před dělením za použití PEG je provedeno v souhlase s předloženým vynálezem přípravné čistění a/nebo postupy zmenšující agregaci. Např. pokud je použita pasta frakce II + lllw, obsahující obvykle 20 % alkoholu a více než 70 % přítomného proteinu je IgG, pasta frakce II + lllw může být suspendována v 3 až 10 násobném objemu, výhodněji v 3 až 5násobném objemu studené vody při teplotě kolem 0 °C až 5 °C a s hodnotou pH nastavenou mezi 4,5 až 6, výhodně 5,0 až 5,5 za použití acetátového pufru o pH 4,0 nebo kyselinou chlorovodíkovou. Směs se míchá asi 2 až 15 h, aby veškerý γ-globulin přešel do roztoku. Pak se nerozpuštěný protein, jako je albumin a a-globuliny mohou odstranit odstředěním a/nebo filtrováním.

Pokud je použita jiná Cohnova frakce jako výchozí materiál, první postupový krok nebo kroky mohou být úměrně vybrány podle potřeby pro provedení prvotního přečištění pro získání frakce s vysokým obsahem IgG pro další postup. Např., pokud se Cohnova frakce II (obsahující přes 95 % čistého IgG) oddělí od Cohnovy frakce III společně s frakcí II, může k prvotnímu přečištění být použito kyselé pH 3,2 až 5,0, výhodněji 3,8 až 4,2, jak popisuje Uemura a kol., patent US 4 371 520, aby se rozložily přítomné agregáty imunoglobulinu na imunoglobulinové monomery a dimery, protože je známo, že agregáty vykazují antikomplementární aktivitu (ACA). Jako jinou možnost při použití výchozího materiálu jako Cohnovy frakce II + III, Uemura a kol. patentují zpracování při nízkém pH s následným prvotním čistícím krokem před dělícím postupem s PEG, jako bylo popsáno dříve.

Frakční dělení PEG se provede před virovou inaktivací. Frakční dělení PEG je v oboru dobře známý postup pro čistění imunoglobulinu k oddělení požadovaného IgG monomeru a dimeru od IgG agregátů a od některých jiných nečistot, které se přirozeně objevují ve výchozí frakci plazmového proteinu. Odstranění agregátů a některých přítomných nečistot před virovou inaktivací snižuje stupeň agregace a zákalu, který se jinak objevuje během postupu tepelného zpracování, např. při jeho provedení při 60 °C po 10 h.

Druhý krok trakčního dělení PEG, následující po virové inaktivací tepelným zpracováním, je vhodný pro odstranění závadných nečistot a/nebo agregátů vytvořených během tepelného zpracování.

K trakčnímu dělení PEG může být použit jakýkoliv dříve popsaný postup. Obecně se provádí frakční dělení v jednom nebo ve dvou stupních. V prvním stupni trakčního dělení PEG je koncentrace PEG a pH vybráno tak, aby požadovaný IgG monomer a dimer zůstaly v roztoku, zatím co nežádoucí proteiny, jako agregáty, z roztoku vyprecipitujř. Následuje odstředění a/nebo filtrace, koncentrace PEG se vhodně zvýší za nastavení pH na takovou hodnotu, aby vyprecipitoval IgG monomer a dimer.

Např. v prvním postupovém kroku se provede frakční dělení PEG při pH asi 5,0 do 7,0, výhodněji od asi 6,5 do 7,5 pH, pokud se použije pasta frakce II + lllw jako výchozí materiál, a výhodněji od asi 5,5 do 6,0 pH, pokud se jako výchozí materiál použije pasta frakce II + lllw, s koncentrací PEG od asi 4 % do 8 %, nebo výhodněji 6 % až 8 %, použije- li se pasta frakce II + III. Při zachování teploty od asi 0 °C do 2 °C trvá první krok trakčního dělení PEG od asi 1 do 8 h, pak se precipitát obsahující nežádoucí proteiny včetně agregátů odstraní, jak bylo shora popsáno. Když se vyžaduje nahromadění vyčištěného imunoglobulinu, nastaví se pH filtrátu na asi 8,0 do 9,0, výhodněji od asi 8,5 do 8,9, přidá se dodatečný PEG pro vytvoření konečné koncentrace od asi 10 % do 15 %, výhodně asi 12 %. Vytvořený precipitát, který tvoří přečištěný imunoglobulin, se získá filtrací a/nebo odstředěním.

Další podrobnosti o praktickém postupu při trakčním dělení podle předloženého vynálezu je možno nalézt ve shora uvedeném patentu US 4 876 088, Hirao a kol., a patentu US 4 845 199, Hirao a kol.

Dalším důležitým krokem podle předloženého vynálezu je provedení prvního stupně virové Inaktivace, který je možno vybrat z tepelného zpracování a zpracování v rozpouštědle nebo ve směsi rozpouštědla/detergentu. Pak se provede druhá virová inaktivace, která je jiná a která nebyla použita v prvním postupu virové inaktivace, tedy spočívající v tepelném zpracování nebo v inaktivaci v rozpouštědle nebo směsi rozpouštědla/detergentu. Jak je níže popsáno, mohou být použity další čistící postupy, především takové, spočívající v použití iontovýměnné pryskyřice, před a/nebo po zpracování ve směsi rozpouštědlo/detergent a/nebo po následném tepelném zpracování.

Obzvlášt výhodný postup je provedení zpracování aniontovou iontoměničovou pryskyřicí před virovou inaktivaci rozpouštědlem/detergentem, která tvoří první virovou inaktivaci a pak zpracování kationtovou iontoměničovou pryskyřicí po virové inaktivaci tepelným zpracováním, představující druhou virovou inaktivaci. Při tomto postupu mohou být odstraněny nežádoucí proteinové materiály (jako prekalikreinový aktivátor, IgA, IgM a albumin), která se nalézají v humánním plazmatu a odděleny od IgG za použití aniontové iontoměničové pryskyřice a pak odstraněny další rušící materiály (jako prekalikreinový aktivátor, IgA, IgM a albumin) pomocí PEG, a stejně i zbytkové reagencie po zpracování rozpouštědlem/detergentem a rovněž závadné rušící proteiny (nečistoty a/nebo agregáty), vznikající při tepelném zpracování, mohou být odstraněny postupem kationtové výměny. Postup kationtové výměny může být doporučen namísto druhého trakčního dělení PEG po dokončení virové inaktivace pro odstranění nežádoucích nečistot a agregátů vzniklých při tepelném postupu virové inaktivace.

Pokud zpracování není celkově dokončeno, roztok zpracovaný rozpouštědlem/detergentem se zpracuje pro odstranění všech zbylých nežádoucích látek, které mohou obsahovat denaturovaný protein. Proto je dávána přednost filtraci roztoku 1 mikronovým filtrem nebo ještě jemnějším filtrem před přidáním rozpouštědla/·>>

detergentu. Tím se rovněž sníží pravděpodobnost přítomnosti virů ve velkých částicích a je možno tomu zamezit při vystavení rozpouštědlu/detergentu.

Dnes je dávána přednost trialkylfosfátu jako rozpouštědlu pro inaktivaci zaobálkovaných virů. Trialkylfosfát použitý v předloženém vynálezu není předmětem zvláštního omezení, ale je výhodné použít tri(n-butyl)fosfát (v následujícím označovaný jako „TNBP“). Jiné použitelné trialkylfosfáty jsou tri(terc.butyl)fostát, tri(n-hexyl)fosfát, tri(2-ethylhexyl)fosfát a pod. Je možné použít i směs 2 nebo více rozličných trialkylfostátů.

Trialkylfosfát je používán v množství mezi 0,01 do 10 hmot. %, výhodněji asi v množství 0,1 % až 3 hmotn. %.

Trialkylfosfáty jsou využívány za přítomnosti nebo nepřítomnosti detergentu nebo povrchově aktivní látky. Je výhodné použít trialkylfosfáty v kombinaci s detergentem. Detergent působí jako prostředek zdokonalující styk s viry ve složení imunoglobulínu s trialkylfosfátem.

Příklady detergentu zahrnují polyoxyethylenové deriváty mastných kyselin, částečné sorbitolanhydridu, jako je Polysorbate 80 (obchodní název: Tween 80 atd.) a Polysorbate 20 (obchodní název: Tween 20 atd.); a neiontová oplachovací olejová činidla, jako oxyethylovaný alkylfenol (obchodní název: Triton X100 atd.). Příklady zahrnují i jiné povrchově aktivní látky, jako jsou obojetné iontové detergenty a pod.

Pokud se použije detergent, nepřidává se v kritickém množství; např. bývá použit v poměrech od asi 0,001 % do asi 10 %, výhodněji mezi 0,01 % a 3 %.

Podle předloženého vynálezu, prostředek obsahující imunoglobulin se zpracuje s trialkylfostátem při teplotách asi 20 °C až 35 °C, výhodněji 25 °C až 30 °C, po dobu delší než 1 h, výhodně asi 5 až 8 h, nejvýhodnějí asi 6 až 7 h.

Během zpracování s trialkylfosfátem je imunoglobulin přítomný v množství asi od 3 do 8 % v roztoku proteinu ve vodném prostředí.

Trialkylfosfát a vhodný detergent mohou být přidány přímo do filtrátu vznikajícího při jednostupňovém pochodu frakcionace PEG, když γ-globulin se nevysráží přídavkem přebytečného PEG. Zředění proteinu je nezbytné. Jinak se vyprecipitovaný γ-globulin suspenduje v chladné vodě pro injekce, pH se nastaví na asi 5,0 do 6,0, a organické rozpouštědlo a vhodný detergent se přidají následně.

Pro postup tepelné sterilizace se roztok imunoglobulinového proteinu, získaného frakcionováním pomocí PEG nebo pomocí rozpouštědla (detergentu) použije bez přečištění, tak jaký je, a k roztoku se přidá cukr, cukrový alkohol a/nebo aminokyselina jako tepelný stabilizátor. pH se nastaví na asi 4,5 do 6,0; výhodné je pH asi 5,0 do 5,5. Tepelným stabilizátorem je vhodně sacharosa, maltosa, sorbitol nebo manitol, nejvýhodněji sorbitol. Cukr nebo cukrový alkohol se přidává do roztoku imunoglobulinu jako prášek nebo se napřed smísí s malým objemem vody a pak teprve přidá, aby konečná koncentrace byla asi 10 % až 50 hmotn. % do saturace.

Po přídavku tepelného stabilizátoru se směs zahřeje na asi 50 °C až 70 °C po dobu asi 10 až 100 h, výhodněji na 60 °C po 10 až 20 h, aby se inaktivovaly viry citlivé na teplo. Tepelné zpracování nejen inaktivuje viry, ale má za následek i denaturalizaci proteinu, a může tak výhodně redukovat množství některých nežádoucích proteinů, které jsou normálně obsaženy v Cohnových frakcích II + III, jako prekalikreinový aktivátor, plasmin a plasminogen.

Po tepelném zpracování se roztok ochladí na asi 0 °C až 30 °C, výhodně na asi 10 °C a pH se nastaví na asi 5,0 až 6,0, výhodněji na pH asi 5,0 až 5,5.

Pokud se předem neprovede zpracování rozpouštědlem-detergentem, může se provést zpracování tepelně zpracovaného imunoglobulinu aniontovým měničem. Vhodné je provedení nejméně kationtovým měničem tepelně zpracovaného produktu po dokončení virové inaktivace a aniontovým měničem před zpracováním rozpouštědlem-detergentem jako první virovou inaktivaci. Zpracování iontovým měničem se provede s • · 9 · * « · imunoglobulinem rozpuštěném ve vodném rozpouštědle, obvykle při pH od asi 5,0 do 5,5, s měničem o malé iontové síle pro maximální adsorpci IgG. Proteinová koncentrace je obvykle v rozsahu od asi 1 % do 15 hmotn. %, výhodněji od asi 3 % do 10 hmotn. %. Iontový měnič se přivede do rovnováhy se stejným vodným rozpouštědlem, které se použije později, a použije se buď periodický postup nebo kontinuální systém. Např. při použití aniontové měničové periodické lázně se smísí roztok imunoglobulinu s aniontových měničem v množství asi od 10 do 100 ml předzpracovaného iontoměniče (např. 1 g pryskyřice DEAE Sephadex A-50 se nabobtná 0,4% roztokem chloridu sodného o netto hmotností asi 20 g), směs se míchá při 0 °C až 5 °C po asi 0,5 až 5 h, pak se filtruje nebo odstředí při 6 000 až 8 000 o/min. po 10 až 30 min., aby se odstranila přebytečná kapalina. Při kontinuálním zpracování se může roztok imunoglobulinu provést kolonou s aniontovým měničem při dostatečně pomalém průtoku, aby se nečistoty stačily zachytit na iontoměniči a získala se neadsorbovaná frakce.

Použitý aniontový iontoměnič může mít aniontové měničové skupiny vázané na nerozpustný nosič. Aniontové měničové skupiny zahrnují diethylaminoethyl (DEAE), kvaternární aminoethylové skupiny (QAE) a pod. a nerozpustný nosič představují agarosa, celulosa, dextran, polyakrylamid a pod.

Příklady vhodného kationtového iontoměniče jsou karboxymethylový Sephadex® Pharmacia (CM-Sephadex® Pharmacia), CM-celulosa, SP-Sephadex® Pharmacia, CM-Sepharose a SP-Sepharose. 1 ml předzpracovaného kationtového iontoměniče (např. 1 g pryskyřice CM-Sephadex®, Pharmacia C-50, se nabobtná v 0,4% roztoku chloridu sodného o netto hmotnosti asi 30 až 35 g) se smísí s 0,5 až 5 ml roztoku imunoglobulinu a míchá při 0 °C až 5 °C po dobu 1 až 6 h. Suspenze se odstředí nebo filtruje, aby se získala pryskyřice s adsorbovaným IgG. Doporučuje se rovněž kontinuální způsob.

Pokud se využijí shora uvedené podmínky s kationtovým iontoměničem, IgG se adsorbuje a po následném promytí kationtové měničové pryskyřice s adsorbovaným IgG, může být IgG vymyt, např. roztokem 1,4 N chloridu sodného.

• · ··· • *· · · · ·· ··· ·· ····

Po provedených předcházejících pracovních postupech se IgG vyčeří, diafiltruje a koncentruje na potřebný rozsah. Podle přání se může přidat stabilizátor, jako je např.

D-sorbitol a provede se konečné nastavení roztoku prostředku na obsah asi 50 mg/ml nebo 100 mg/ml IgG a 50 mg/ml D-sorbitolu a pH 5,4. Tento roztok se pak po sterilizaci filtruje sterilizovaným bakterie zadržujícím filtrem a plní do vial.

Příklad provedení vynálezu

Následující příklad ilustruje, ale neomezuje, předložený vynález.

Podle přání je možno využít i jiné čistící způsoby pro imunoglobulín, rovněž v kombinaci se zde předem uvedeným způsobem. Např. pro přečištění může být použit bentonit, vhodný pro snížení množství kalikreinu a prekalikreinového aktivátoru. Ilustrací je níže uvedený příklad 1.

Příklad 1. γ-Globulin připravený rozpouštědlem-detergentem a tepelným zpracováním

685 g pasty frakce II + lllw se suspenduje v asi 11,9 kg chladné vody. K suspenzi se přidá roztok trihydrátu acetátu sodného, aby konečná koncentrace byla přibližně 0,04 M pro selektivní rozpuštění IgG. Po míchání po 15 minut se pH suspenze nastaví na 5,2 pomocí acetátového pufru 4,0. K suspenzi se přidá tolik studeného alkoholu (95 %), aby konečná koncentrace byla 17 %. Během přidávání alkoholu se teplota suspenze snižuje postupně na asi -6 °C. Jako pomocná látka pro filtraci se přidají 303 g kysele promyté infuzoriové hlinky, Celíte®, získané od Celíte Corporation, aby konečná koncentrace byla asi 2,0 %. Po míchání po 1 h se Celíte a pasta frakce III obsahující nežádoucí protein jako plasmin, plasminogen, IgA a IgM odfiltrují za použití filtračního lisu. Filtrát se dále čeří filtry 0,45 pm a 0,2pm. Nato se pH kalů frakce III nastaví na 7,0 pomocí 1,0 M roztoku bikarbonátu sodného, teplota se sníží na -7 °C a přidá se vychlazený alkohol (95 %), aby konečná koncentrace byla 25 %. Pokud je třeba, nastaví se pH suspenze na 7,2 a precipitát frakce II se získá filtrací při -7 °C.

Každý kilogram pasty frace II se suspenduje v přibližně 1,5 kg chladného vodného

roztoku při 0 °C až 2 °C, který obsahuje 0,2 % albuminu (humánního) a asi 2,0 % polyethylenglykolu. pH se nastaví na 3,7 ± 0,2 zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a suspenze se při dodržení tohoto pH míchá po 15 h.

pH roztoku se nastaví na 5,3 zředěným roztokem hydroxidu sodného při zachování teploty 0 °C až 2 °C a přidá se 50 % polyethylenglykolu (PEG) 3350, aby jeho konečná koncentrace v roztoku byla 4 %. Vytvořený precipitát se při 1 °C odfiltruje nebo odstředí. pH filtrátu se nastaví na 4,9 pomocí 1 N HCI a přidá se bentonit na konečnou koncentraci asi 0,25 %. pH bentonitové suspenze se znovu nastaví na asi 5,2 a pak se suspenze odfiltruje nebo odstředí při teplotě 1 °C, aby se odstranil bentonit. pH filtrátu se nastaví na 8,0 roztokem 0,25 N NaOH a přidá se 50% PEG 3350 v takovém množství, aby konečná koncentrace PEG byla 12 %. Vytvořený precipitát (přečištěný imunoglobulin) se získá při 0 °C až 2 °C filtrací nebo odstředěním.

Shora uvedený způsob je typickým postupem vhodným pro zpracování frakčním dělením pomocí PEG. V oboru jsou však známé i jiné frakční postupy.

100 g imunoglobulinové pasty přečištěné PEG se suspenduje v 450 ml chladné vody pro injekce. pH suspenze se nastaví na 5,5 přidáním 5% kyseliny octové. Po míchání suspenze po 2 h při +5 °C se přidají 33,3 g roztoku DEAE Sephadex A-50, předzpracovaného do rovnovážného stavu roztokem 0,3 % NaCl při pH 5,5. Po dvouhodinové absorpci se pryskyřice DEAE odstraní filtrací.

K filtrátu se přidá směs tri-n-butylfosfátu a Polysorbatu 80, aby se získala konečná koncentrace TNBP 0,3 % a 1,0 % Polysorbatu 80. Roztok se inkubuje přes noc při +5 °C. Pak se k takto zpracovávanému roztoku přidá D-sorbítol na konečnou koncentraci 33 % a stabilizovaný roztok IgG se míchá po 1 h při pH nastaveném na 5,5 a zahřívá přes noc na 60 °C.

Směs se ochladí na +5 °C a pH nastaví na 5,8. K odstranění rozpouštědla-detergentu,

PEG a sorbitolu se směs zpracuje pomocí CM-Sephadex® C-50 Pharmacia následovně: roztok zpracovaný rozpouštědlem-detergentem a tepelně zpracovaný se

I čtyřnásobně zředí studenou vodou. Zředěný roztok se rozdělí na tři díly. K alikvotním dílům se přidá NaCI, aby se získaly konečné koncentrace 0,2 %, 0,4 % a 0,6 % pro suspenze a, b a c. Každý alikvotní podíl se pak zpracuje 0,65 g pryskyřice CMSephadex® C-50, vztaženo na suchou hmotnost 1 gramu proteinu. Pryskyřice se předzpracuje do rovnovážného stavu roztokem NaCI s odpovídající koncentrací při pH 5,8.

Po adsorpcí proteinu na pryskyřicí během 3 ± 2 h se kapalina odstraní filtrací. Protein adsorbovaný na pryskyřici se promyje roztoky chloridu sodného o koncentracích 0,2 %, 0,4 % a 0,6 %, aby se odstranil zbytek Polysorbatu 80, TNBP, PEG a sorbitolu. Promytý protein absorbovaný na pryskyřici CM-Sephadex C-50 se resuspenduje v roztoku 1,5 ± 0,5 N NaCI po 2 ± 1 h k desorbci adsorbovaného proteinu. Pryskyřice se odstraní z roztoku desorbovaného proteinu filtrací.

Jak je zde diskutováno, způsob využívající 12 % PEG a aniontovou iontoměničovou pryskyřici je nejvýhodnějším způsobem. Dále může být doporučen druhý trakční způsob s PEG namísto nebo jako dodatek ke zpracování kationtovou iontoměničovou pryskyřicí. Rovněž tepelné zpracování a roztoková (rozpouštědlo-detergent) virová inaktivace může být provedena v jakémkoliv pořadí.

Obměny předloženého vynálezu jsou zkušenému odborníkovi zřejmé.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy intravenosně podávaného roztoku γ-globulinu, vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) zpracování znečistěného roztoku γ-globulinu polyethylenglykolovým trakčním dělením pro přípravu čištěného γ-globulinu;

(b) zpracování polyethylenglykolem čištěného γ-globulinu organickým rozpouštědlem pro inaktivaci zaobálkovaných virů;

(c) časově řízené tepelné zpracování γ-globulinu čištěného polyethylenglykolem za tepelných podmínek dostačujících k inaktivaci virů citlivých na teplo; a pak (d) odstranění agregátů vzniklých při tepelném zpracování.

a kde postupový krok tepelného zpracování (c) je proveden s roztokem γ-globulinu v organickém rozpouštědle, který byl získán z kroku (b), a který nebyl podroben žádnému mezizpracovatelskému úkonu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok nečistého γ-globulinu je Cohnova frakce I + II + III, Cohnova frakce II + III, Cohnova frakce II + lllw nebo Cohnova frakce II.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok nečistého γ-globulinu se podrobí nejméně jednomu čistícímu kroku před provedením trakčního dělení pomocí polyethylenglykolu (a).
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že postup tepelného zpracování (c) se provede při asi 50 °C až 70 °C po dobu 10 až 100 h.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že postup tepelného zpracování (c) se provede po dobu asi 10 h při asi 60 °C.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že postup (d) se provede frakcionací • ·· · roztoku po tepelném zpracování pomocí polyethylenglykolu.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo použité v postupu (b) je alkylfosfát.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo použité při postupu (b) je alkylfosfát.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že alkylfosfát je tri-n-butylfosfát.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo obsahuje detergent.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo obsahuje detergent.
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že po postupovém kroku (a) je γ-globulin zpracován aniontovou iontoměničovou pryskyřicí a kationtovou iontoměničovou pryskyřicí.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že postupový krok (b) se provede před postupovým krokem (c) a zpracování aniontovou iontoměničovou pryskyřicí předchází postupový krok (b) a zpracování kationtovou iontoměničovou pryskyřicí se provede po postupovém kroku (c).
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že postupový krok tepelného zpracování (c) se provede s roztokem γ-globulinu v organickém rozpouštědle, který pochází z předcházejícího postupového kroku (b), bez jakéhokoliv mezizpracovatelského postupu.
15. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že čistění bentonitem se provede po prvním postupu frakcionace polyethylenglykolem.
16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že postupový krok (d) se provede s tepelně zpracovaným roztokem pomocí kationtové iontoměničové pryskyřice.
17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že frakcionace polyethylenglykolem (a) se provede bez vyprecipitování γ-globulinu.
18. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že frakcionace polyethylenglykolem (d) se provede bez vyprecipitování γ-globulinu.
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že frakcionace polyethylenglykolem (a) se provede nejméně ve dvou krocích, ve kterých se odstraní nečistoty jako precipitát v prvním kroku trakčního dělení s polyethylenglykolem, a γ-globulin se získá jako precipitát v druhém postupovém kroku trakčního dělení s polyethylenglykolem.
20. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že frakcionace polyethylenglykolem (d) se provede nejméně ve dvou krocích, ve kterých se odstraní nečistoty jako precipitát v prvním kroku trakčního dělení s polyethylenglykolem, a γ-globulin se získá jako precipitant v druhém postupovém kroku trakčního dělení s polyethylenglykolem.
21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že postupový krok (b) se provede před postupovým krokem (c).
22. Roztok γ-globulinu pro intravenosní podávání, vyznačující se tím, že je připravený podle způsobu, který je uveden v nároku 14.
23. Roztok γ-globulinu pro intravenosní podávání, vyznačující se tím, že je připravený podle způsobu, který je uveden v nároku 15.