CN103160486A - 一种猪凝血酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪凝血酶的制备方法,它涉及一种凝血酶的制备方法。本发明要解决现有方法制备猪凝血酶产率低以及不适于大规模生产的问题。本发明的方法包括:一、分离猪血浆;二、化学法病毒灭活;三、吸附凝血酶原;四、收集凝血酶原;五、纳米过滤;六、凝血酶原的活化;七、凝血酶的冻干保存。本发明能够提高凝血酶产品的生物安全性,同时,采用特定的离子交换树脂提取工艺,获得更高的凝血酶收获率,可以达到80000IU/L血浆以上,由于本发明是采用将离子交换树脂直接按比例投入到血浆中吸附的方法,故每次可以处理1吨到数吨的血浆,便于大规模生产。本发明应用于凝血酶工业生产领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种凝血酶的制备方法。
背景技术
凝血酶是一种广泛存在于动物和人体血液中的与血液凝固系统相关的一种凝血酶前体物(凝血酶原)经激活后形成的一种丝氨酸蛋白酶,是主导凝血反应的一种主要酶类。
临床上,凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血。用于外伤、手术、口腔、耳鼻喉、泌尿、烧伤、骨科、等出血的止血凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原,促使转变为纤维蛋白,加速血液的凝固而止血。临床用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血。
目前,临床上应用的凝血酶产品,主要是从人血、猪、牛等动物血中分离提取的,其中,由于猪血的来源充分,原料成本低等因素,所以大部分凝血酶是从猪血中分离提取的,少部分是从人血及牛血等血液中分离提取的。
但是,不论是从动物血或人血中分离的凝血酶产品都可能存在感染各种病毒的风险,也为产品的应用埋下了安全隐患,为此,国家食品药品监督管理局曾下发文件,要求所有的动物源性生化药物,在生产中都应有相应的去除或灭活病毒的工艺,以保证产品的生物安全性,参见《多组分生化药注射剂基本技术要求(试行)》和《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》。为此,在生产工艺上和产品的最终处方上必须做出相应的调整来适应病毒去除或灭活工艺的开展。
目前,猪凝血酶生产工艺方法上主要有钡盐吸附的方法,就是将血浆中加入钡盐吸附,然后再进一步精制,如公开工艺CN1063789C和CN102337255A,这类工艺的主要缺点就是产出率低;另外,专利CN1294257C还公开了一种采用阴离子交换层析的方法来提取凝血酶,但是,在其公开资料中并没有公开使用哪一种型号的阴离子交换剂,因为不同的阴离子交换剂所需要的工艺条件是不同的(如PH值,离子浓度等),所以其公开的离子交换的的工艺条件是没有意义的,同时由于层析柱自身体积限制,一次加工的血浆量有限,一般每次只能处理数升到十几升血浆,不适合大规模生产。
发明内容
本发明目的是为了解决现有方法制备猪凝血酶产率低以及不适于大规模生产的问题,而提供了一种猪凝血酶的制备方法。
本发明的一种猪凝血酶的制备方法,是按照以下步骤进行的:
一、分离猪血浆:取新鲜猪血,加入抗凝剂,离心分离,得猪血浆;其中,新鲜猪血与抗凝剂的质量比为250:1;
二、化学法病毒灭活:按照猪血浆总重量的10%加入病毒灭活试剂,在24~26℃下保温6~8h,进行病毒灭活;
三、吸附凝血酶原:按照猪血浆总重量的1.5%加入离子交换树脂,在室温下吸附40~60min,然后用滤布过滤收集离子交换树脂,用5~10倍离子交换树脂重量的洗涤液,洗涤离子交换树脂,弃去洗涤液;
四、收集凝血酶原:将步骤三经洗涤液洗涤的离子交换树脂,用3倍树脂体积的洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析,去除多余的盐类物质,使收集的洗脱液的电导率降到3ms/cm以下,即得到凝血酶原溶液;
五、纳米过滤:将步骤四得到的凝血酶原溶液,用孔径为20nm的过滤器进行过滤,收集滤过液;
六、凝血酶原的活化:按质量百分含量为1%的比例向步骤五中得到的滤过液中加入兔脑磷脂粉末,然后在20~30℃下保温6~8h,即得猪凝血酶;
七、凝血酶的冻干保存:将步骤六获得的猪凝血酶用生理盐水稀释至500IU/ml后,加入冻干赋形剂和保护剂,灌装入西林瓶中,进行冻干,真空压塞轧盖,得到凝血酶冻干粉。
本发明包含以下有益效果:
本发明工艺过程中包含去除和杀灭病毒的方法,能够提高凝血酶产品的生物安全性,同时,采用特定的离子交换树脂提取工艺,获得更高的凝血酶收获率,可以达到80000IU/L血浆以上,由于本发明是采用将离子交换树脂直接按比例投入到血浆中吸附的方法,故每次可以处理1吨到数吨的血浆,便于大规模生产。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式的一种猪凝血酶的制备方法,是按照以下步骤进行的:
一、分离猪血浆:取新鲜猪血,加入抗凝剂,离心分离,得猪血浆;其中,新鲜猪血与抗凝剂的质量比为250:1;
二、化学法病毒灭活:按照猪血浆总重量的10%加入病毒灭活试剂,在24~26℃下保温6~8h,进行病毒灭活;
三、吸附凝血酶原:按照猪血浆总重量的1.5%加入离子交换树脂,在室温下吸附40~60min,然后用滤布过滤收集离子交换树脂,用5~10倍离子交换树脂重量的洗涤液,洗涤离子交换树脂,弃去洗涤液;
四、收集凝血酶原:将步骤三经洗涤液洗涤的离子交换树脂,用3倍树脂体积的洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析,去除多余的盐类物质,使收集的洗脱液的电导率降到3ms/cm以下,即得到凝血酶原溶液;
五、纳米过滤:将步骤四得到的凝血酶原溶液,用孔径为20nm的过滤器进行过滤,收集滤过液;
六、凝血酶原的活化:按质量百分含量为1%的比例向步骤五中得到的滤过液中加入兔脑磷脂粉末,然后在20~30℃下保温6~8h,即得猪凝血酶;
七、凝血酶的冻干保存:将步骤六获得的猪凝血酶用生理盐水稀释至500IU/ml后,加入冻干赋形剂和保护剂,灌装入西林瓶中,进行冻干,真空压塞轧盖,得到凝血酶冻干粉。
本实施方式的工艺过程中包含去除和杀灭病毒的方法,能够提高凝血酶产品的生物安全性,同时,采用特定的离子交换树脂提取工艺,获得更高的凝血酶收获率,可以达到80000IU/L血浆以上,由于本实施方式是采用将离子交换树脂直接按比例投入到血浆中吸附的方法,故每次可以处理1吨到数吨的血浆,便于大规模生产。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一中所述的抗凝剂为质量百分含量为0.4%的枸橼酸三钠。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤二中所述的病毒灭活试剂包含聚山梨酸甲酯-80和磷酸三丁酯的水溶液,其中聚山梨酸甲酯-80为体积百分比含量11%,磷酸三丁酯为体积百分比含量3.3%,其余为水。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤三中所述的离子交换树脂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤三中所述的洗涤液由100~150mM氯化钠和10mM的枸橼酸钠的水溶液组成,其中,洗涤液pH值为6~7。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤四中所述的洗脱液由1.0M~2.0M氯化钠和10mM的枸橼酸钠的水溶液组成,其中,洗脱液pH值为6~7。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是:步骤七中所述的的冻干赋形剂为右旋糖酐-40或甘露醇,冻干赋形剂按质量百分含量为1%的添加量添加。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:步骤七中所述的保护剂为人血白蛋白,保护剂按质量百分含量为0.3-0.5%的添加量添加。其它与具体实施方式一至七之一相同。
通过以下实例来对本发明的作进一步说明,但并不限于以下实例。
实例1:
本实施例的一种猪凝血酶的制备方法,是按照以下步骤进行的:
一、分离猪血浆:采集屠宰(哈尔滨市呼兰区付江动物脏器经销部)中的新鲜猪血2000L,加入0.4%(W/V)即8000g的质量百分含量为0.4%的枸橼酸三钠作为抗凝剂,室温离心分离得猪血浆1200L;
二、化学法病毒灭活:按照猪血浆总量的10%(V/V)即加入病毒灭活试剂120L,在24℃下保温6小时;
三、吸附凝血酶原:按照猪血浆总量的1.5%(W/V)的比例加入离子交换树脂即18Kg,在室温下吸附40min,用滤布过滤收集离子交换树脂,用10倍于树脂量的洗涤液180L洗涤离子交换树脂,去除残余血浆和化学病毒灭活试剂,弃去洗涤液;
四、收集凝血酶原:将经洗涤液洗涤的离子交换树脂,用树脂体积3倍量的洗脱液进行洗脱,收集洗脱液54L,将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析,去除多余的盐类物质,使收集的洗脱液的电导率降到3ms/cm,即得到凝血酶原溶液54L;
五、纳米过滤:将步骤四得到的凝血酶原溶液,用孔径为20nm的过滤器进行过滤,收集滤过液54L;
六、凝血酶原的活化:向步骤五收集的滤过液中按照1%(W/V)的比例加入兔脑磷脂粉末540g,在20℃下保温6h,使凝血酶原充分活化,转变成猪凝血酶,0.22μm滤器过滤,收集过滤液53L;
七、凝血酶的冻干保存:将步骤六获得的猪凝血酶凝血酶用生理盐水稀释到药典规定的浓度500IU/ml后,加入冻干赋形剂甘露醇1%(W/V)和保护剂人血白蛋白0.5%(W/V),灌装入西林瓶中,进行冻干,真空压塞轧盖,得到凝血酶冻干粉。
本实施例步骤二中所述的病毒灭活试剂,是一种含聚山梨酸甲酯-80和磷酸三丁酯的水溶液,其中,聚山梨酸甲酯-80为总体积百分比含量11%,磷酸三丁酯为总体积百分比含量3.3%,其余为水;
本实施例步骤三中所述的离子交换树脂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂;
本实施例步骤三中所述的洗涤液是一种同时含有100~150mM氯化钠溶液和10mM的枸橼酸钠的水溶液,其中,洗涤液pH值为6~7;
本实施例步骤四中所述的洗脱液是一种同时含有1.0M~2.0M氯化钠溶液和10mM的枸橼酸钠的水溶液,其中,洗脱液pH值为6~7;
本实施例步骤七中所述的冻干赋形剂为右旋糖酐-40或甘露醇,冻干赋形剂按质量百分含量为1%的添加量添加;
本实施例步骤七中所述的步骤七中所述的保护剂为人血白蛋白,保护剂按质量百分含量为0.3-0.5%的添加量添加。
实例2
对实施例1制得的猪凝血酶活性和收率进行测量
取实例1中步骤六中获得的滤液样品,按照《中国药典》2010年版二部凝血酶项下的标准方法检验,测得凝血酶活性:
A,纤维蛋白原溶液的制备,取纤维蛋白原,加0.9%氯化钠溶液溶解并制成含0.1%凝固物的溶液。
B,标准曲线的制备,取凝血酶标准品,用0.9%氯化钠溶液溶解并分别定量稀释制成每1ml中含5.0单位、6.4单位、8.0单位与10.0单位的标准品溶液。
C,供试品溶液的制备,取本品5甁,分别加适量0.9%氯化钠溶液溶解,并全量转移至同以量瓶中,用上述溶液稀释至刻度,摇匀。精密量取适量,用上述氯化钠溶液定量稀释制成每1ml中含7单位的供试品溶液。
D,测定法,取内径1cm、长10cm的试管4支,各精密加入纤维蛋白原溶液0.9ml,置37℃±0.5℃水浴中保温5分钟,再分别精密量取上述4种浓度的标准品溶液各0.1ml,迅速加入各试管中,立即计时、摇匀,置37℃±0.5℃水浴中,观察纤维蛋白原的初凝时间。每种浓度测5次,求平均值(5次测定之最大值与最小值的差不得超过平均值的10%,否则重测)。标准品溶液的浓度应控制凝结时间在14~60秒为宜。以标准品效价(单位)的对数为横坐标,凝结时间(秒)的对数为纵坐标,进行直线回归。精密量取供试品溶液0.1ml,按上述方法平行测定5次,求出凝结时间的平均值(误差要求同标准曲线),用直线回归方程求得单位数,计算,即得。
结果:在获得的53L凝血酶溶液中,凝血酶活性为1857.17IU/ml,共计获得98430000IU凝血酶,起始血浆量为1200L,相当于每一升血浆中获得82025IU。
Claims (8)
1.一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于所述的猪凝血酶的制备方法,具体步骤步骤为:
一、分离猪血浆:取新鲜猪血,加入抗凝剂,离心分离,得猪血浆;其中,新鲜猪血与抗凝剂的质量比为250∶1;
二、化学法病毒灭活:按照猪血浆总重量的10%加入病毒灭活试剂,在24~26℃下保温6~8h,进行病毒灭活;
三、吸附凝血酶原:按照猪血浆总重量的1.5%加入离子交换树脂,在室温下吸附40~60min,然后用滤布过滤收集离子交换树脂,用5~10倍离子交换树脂重量的洗涤液,洗涤离子交换树脂,弃去洗涤液;
四、收集凝血酶原:将步骤三经洗涤液洗涤的离子交换树脂,用3倍树脂体积的洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析,去除多余的盐类物质,使收集的洗脱液的电导率降到3ms/cm以下,即得到凝血酶原溶液;
五、纳米过滤:将步骤四得到的凝血酶原溶液,用孔径为20nm的过滤器进行过滤,收集滤过液;
六、凝血酶原的活化:按质量百分含量为1%的比例向步骤五中得到的滤过液中加入兔脑磷脂粉末,然后在20~30℃下保温6~8h,即得猪凝血酶;
七、凝血酶的冻干保存:将步骤六获得的猪凝血酶用生理盐水稀释至500IU/ml后,加入冻干赋形剂和保护剂,灌装入西林瓶中,进行冻干,真空压塞轧盖,得到凝血酶冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤一中所述的抗凝剂为质量百分含量为0.4%的枸橼酸三钠。
3.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤二中所述的病毒灭活试剂包含聚山梨酸甲酯-80和磷酸三丁酯的水溶液,其中聚山梨酸甲酯-80为体积百分比含量11%,磷酸三丁酯为体积百分比含量3.3%,其余为水。
4.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤三中所述的离子交换树脂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂。
5.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤三中所述的洗涤液由100~150mM氯化钠和10mM的枸橼酸钠的水溶液组成,其中,洗涤液pH值为6~7。
6.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤四中所述的洗脱液由1.0M~2.0M氯化钠和10mM的枸橼酸钠的水溶液组成,其中,洗脱液pH值为6~7。
7.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤七中所述的的冻干赋形剂为右旋糖酐-40或甘露醇,冻干赋形剂按质量百分含量为1%的添加量添加。
8.根据权利要求1所述的一种猪凝血酶的制备方法,其特征在于步骤七中所述的保护剂为人血白蛋白,保护剂按质量百分含量为0.3-0.5%的添加量添加。
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