CN105039295A - 一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，首先用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原，后洗脱、过滤得到凝血酶原溶液；再用？CaCL2？溶液激活凝血酶原，得到凝血酶溶液；然后对凝血酶溶液进行S/D病毒灭活处理；用阳离子柱进行层析，得到纯化的凝血酶溶液；将凝血酶溶液进行超滤、透析、浓缩，得到效价符合产品规格要求的凝血酶溶液；然后用20nm滤芯进行除病毒过滤；再用0.22μm滤芯进行除菌过滤，后按所需规格进行分装；然后冻干；将冻干粉进行干热病毒灭活处理获得人凝血酶成品。本发明采用一步阳离子柱纯化凝血酶，操作简单，凝血酶比活高，用三步病毒灭除方式保证了产品临床使用的安全性。

Description

一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种人凝血酶，具体来说是一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法。
背景技术
人凝血酶(humanthrombin)是一种丝氨酸蛋白酶，分子量37KD，由1条3kD的轻链和另1条31kD的重链通过二硫键连接而成，主要功能是将可溶性的纤维蛋白原水解成不溶性的纤维蛋白，并通过激活凝血因子XIII使纤维蛋白交联形成网状，从而起到止血的作用。正常情况下，人血液循环中的凝血酶以非活化的形式即以凝血酶原存在，在体内或体表出现出血倾向时，凝血酶原通过一系列复杂的过程转换成具有活化形式的凝血酶。利用现代生物制药技术，可以将血浆中所含的凝血酶原制成冻干人凝血酶，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处来控制毛细血管血液渗出，如骨出血及扁桃腺摘除和拔牙时出血等。进行局部止血时，常用氯化钠注射液溶解成50～200IU/mL的溶液喷雾或用本品干粉喷洒于创面，有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位止血。凝血酶另一个广泛的用途在于与人纤维蛋白原配伍，组成人纤维蛋白粘合剂，利用双联给药装置将凝血酶与纤维蛋白原混合后喷射至创口处瞬间成胶止血。其中的凝血酶可不经过血液凝固的前期阶段而直接使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，使血液快速凝固、填塞出血点而达到止血目的，故可适用于各种原因引起的出血症状，如消化道、气管、各种手术出血等，近年在组织修复、肿瘤靶位治疗等领域也有相关的研究进展，因此，随着该药临床使用日渐广泛，凝血酶的生产技术显得越来越重要。
凝血酶的制备通常是经过一系列工序获得凝血酶原的粗品，然后用特定方式进行激活，使凝血酶原转变为凝血酶，再对凝血酶进行纯化，经超滤、浓缩获得凝血酶原液，按所需规格进行无菌分装，然后进行冻干，最后获得冻干粉成品.按最新药典要求整个制备过程中必须经过脂包膜病毒和非脂包膜病毒的灭活或去除步骤。
提取凝血酶原的原料有血浆、去冷胶血浆及cohn组分三沉淀等，由于血浆中含有人凝血因子VIII，如果从血浆中直接制备凝血酶，则对人凝血因子VIII的生产造成影响，而从组分三沉淀中制备凝血酶，虽然利用了废弃沉淀，但由于cohn组分三沉淀已经过三次乙醇沉淀，凝血酶原损失较多，且由于乙醇的存在，凝血酶原的稳定性也受到一定损害，故以cohn组分三沉淀为起始原料的凝血酶制备工艺，得率较低，制品稳定性较差，特别是，如果血制品生产线已含有从去冷胶血浆中生产凝血酶原复合物(PCC)的生产线设置，则凝血酶原即凝血因子II大部分被提取，组分III沉淀中几乎不含凝血酶原，此时组分III就不再适合做为凝血酶的起始原料了。所以，综合考虑，以去冷胶血浆为原料制备凝血酶是较佳选择。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，所述的这种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法解决了现有技术的制备人凝血酶的方法工艺流程复杂、激活条件苛刻、生产周期长、病毒灭活不彻底及制品外观不佳的技术问题。
本发明提供了一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，包括如下步骤：
1)一个用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原的步骤；根据去冷胶血浆的体积，称取阴离子树脂，所述阴离子树脂和去冷胶血浆的质量体积比为0.5-1.5g：1L，将阴离子树脂用热注射用水充分溶胀，所述的热注射用水的温度不低于70℃，然后再用冷注射用水冷却，所述的冷注射用水的温度为10～25℃，然后用平衡缓冲液A平衡后加到去冷胶血浆中，在10-30℃，缓慢搅拌0.5-1.5小时，用滤网过滤，收集树脂，滤出的血浆进入后续产品的加工程序中；
2)用平衡缓冲液A连续冲洗树脂，平衡缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量的4-8倍，然后用洗脱缓冲液A缓慢、连续洗脱树脂，洗脱缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量的2-6倍，收集洗脱液即为凝血酶原溶液；
3)一个激活凝血酶原的步骤；在10～30℃条件下，在上述洗脱液中加入硅藻土，所述的硅藻土的质量为上述洗脱液质量的0.1～1％，搅拌0.5-1小时，加入0.5-1MCaCL2溶液，温和搅拌2-10小时，将凝血酶原激活；
4)加入质量百分比浓度为25-50％聚乙二醇溶液，所述的聚乙二醇的加入量为步骤3)溶液的2-8％，搅拌0.5-2小时；
5)过滤，后洗滤芯，收集滤液即凝血酶溶液，弃去沉淀；
6)一个采用S/D病毒灭活处理的步骤，在上述的滤液中加磷酸三丁脂，所述的磷酸三丁脂的加入量为所述的滤液的0.3％，然后加入Tween-80，所述的Tween-80的加入量为所述的滤液的1％，在24-26℃下缓慢搅拌6～7小时；
7)一个采用阳离子柱层析纯化凝血酶的步骤，将以上溶液降温至5～20℃，上阳离子柱进行层析；先用平衡缓冲液B进行洗涤；再用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液，即纯化的凝血酶溶液；在洗脱液中及时加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为凝血酶溶液的1-5％；
8)用0.45μm滤芯进行澄清过滤，收集滤液；后进行超滤浓缩并透析，最后浓缩至合适的活力单位；
9)加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为上述超滤浓缩溶液的1-5％；按产品规格调节凝血酶溶液效价至500-550IU/ml，调PH值至6.50-7.50；
10)用0.10μm的滤芯串联20nm的除病毒滤芯进行除病毒过滤，过滤的温度为5～25℃；
11)用0.22μm的滤芯进行除菌过滤，后分装；
12)一个冻干的步骤；
13)一个进行干热病毒灭活的步骤；将冻干粉在100℃水浴中加热30分钟，进行干热病毒灭活处理获得人凝血酶。
进一步的，所述的阴离子树脂为DEAE-SephadexA-50树脂。
进一步的，步骤2)中所述的连续洗涤或洗脱是指在在树脂桶中，一边搅拌一边加入洗涤或洗脱缓冲液，同时从树脂桶底阀排出洗涤液或洗脱液的过程。
进一步的，所述的平衡缓冲液A由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的平衡缓冲液A中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.1-0.2M，PH为6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液A由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的洗脱缓冲液A中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.5-1.0M，所述的洗脱缓冲溶液的PH6.50-7.50。
进一步的，所述的平衡缓冲液B由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的平衡缓冲液B中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.1-0.2M，PH为6.60-7.50；所述的洗脱缓冲液B由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的洗脱缓冲液B中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.5-1.5M，所述的缓冲溶液的PH6.60-7.50。
进一步的，步骤3)中，所述的CaCL2的最终浓度为0.02M-0.2M；
进一步的，步骤7)所述的阳离子树脂是CM-SepharoseFF，SP-SepharoseFF或SP-SephadexC-50批量处理树脂中的任何一种。
进一步的，步骤7)所述的稳定剂为甘氨酸。
进一步的，步骤9)所述的稳定剂为甘氨酸。
进一步的，步骤12)所述的冻干的步骤如下：
先将制品预冷至0-5℃，然后将搁板温度设为-50℃以下，使制品温度达到-40℃及以下，然后迅速将制品温度升至-20～-30℃，保温1-3小时，再重新将制品温度降至-40℃以下，然后将搁板温度设为-20～-30℃，开启真空泵，进入升华干燥阶段，待水线消失结束升华干燥；然后将搁板温度逐步升温，进入解析干燥阶段，最高设定温度30℃，当制品温度达到28℃以上保持3-5小时即停机，出箱。
具体的，所述的热注射用水的温度在70～90℃范围。
本发明从去冷胶血浆中用阴离子树脂吸附制备凝血酶原，单纯氯化钙激活凝血酶原，一步阳离子柱层析纯化凝血酶，三步病毒灭除(S/D结合20nm膜过滤及冻干粉干热处理)生产人凝血酶。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。
一，用去冷胶血浆为起始原料，得率高，蛋白变性少；
二，用阴离子树脂吸附凝血酶原，设备简单，处理时间短；
三，采用连续洗涤与连续洗脱工艺，代替传统的间歇洗涤与洗脱操作，节省大量的操作时间；
四，改变了前人先S/D病毒灭活后激活的工艺，而是采用先激活后S/D病毒灭活，从而避免了S/D化学品对激活的干扰，使得激活过程稳定，可靠；
五，用单纯氯化钙激活凝血酶原，避免引入动物或人体组织器官制成的激酶，免除了异源蛋白产生的副反应；
六，在激活过程中，溶液中加入硅藻土，其多孔性所含的巨大比表面给激活反应提供了大量的活化中心，使得激活过程快速、均匀；
七，加入PEG(聚乙二醇)至合适浓度，沉淀去除杂蛋白，减少柱层析的压力；
八，用一步阳离子柱纯化凝血酶，操作简单，凝血酶比活高；
九，用三步病毒灭除方式保证了脂包膜病毒、非脂包膜病毒及细小病毒被彻底灭活或去除，极大保证了产品临床使用的安全性；
十，改进了冻干工艺，用该冻干工艺制备的凝血酶冻干粉复溶后澄清透明，几无乳光，比现在市面上使用的凝血酶外观有很大的改善。
附图说明
图1是从去冷胶血浆中制备人凝血酶的生产流程图。
具体实施方式
实施例1
步骤1，称取10克DEAE-SephadexA-50干胶，用1kg热注射用水溶胀后，用约1kg冷WFI冷却，然后用1kg平衡缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—0.15MNacL缓冲液，PH7.15，10℃)平衡，将平衡好的树脂加到10升去冷胶血浆中，保持血浆温度约10-15℃，缓慢搅拌约1小时，然后用树脂桶的滤网过滤，收集树脂，滤出的血浆进入其它血浆分离工序中；
步骤2，用平衡缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—0.15MNacL缓冲液，PH7.15，10℃)约1.2kg连续冲洗树脂，然后用洗脱缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—0.5MNacL缓冲液，PH7.15，10℃，)约0.6kg缓慢、连续洗脱树脂，不停搅拌树脂使其均匀悬浮，收集洗脱液460g；
步骤3，加入硅藻土2.5克，搅拌0.5小时，在20℃下，加入0.5MCaCL2溶液25g，温和搅拌8小时；
步骤4，加入50％PEG溶液100g，搅拌1小时；
步骤5，过滤并后洗滤芯，收集滤液820g；
步骤6，用0.45μm滤芯进行澄清过滤，后洗滤芯，收集滤液860g；
步骤7，S/D病毒灭活处理：滤液中加TNBP至0.3％，加Tween-80至1％，在24-26℃下缓慢搅拌6小时；
步骤8，将以上溶液降温至15℃左右，上SP-sepharoseFF柱(100ml)进行层析。先用6倍柱体积平衡缓冲液B(0.01M柠檬酸钠—0.15MNacL缓冲液，PH7.35，15℃，)进行洗涤，去除杂蛋白；再用4倍洗脱缓冲液B(0.01M柠檬酸钠—0.5MNacL缓冲液，PH7.35，15℃)，进行洗脱，收集洗脱液约305g，加入甘氨酸15.5克；
步骤9，超滤浓缩以上溶液，先浓缩至约200g，再用1kg含5％甘氨酸的溶液进行透析，转移并后洗超滤膜，收集620g，测凝血酶活力687IU/ml；
步骤10，以上溶液中加入含5％甘氨酸的溶液150g，搅匀取样，测凝血酶活力542IU/ml，调PH值至7.15；
步骤11，用0.10μm的滤芯串联DV20的滤芯进行除病毒过滤，收集738g；
步骤12，用0.22μm的滤芯进行除菌过滤，收集725g
步骤13，按2ml/瓶，1000IU/瓶规格进行分装；
步骤14，将制品放进冻干机，先将制品预冷至3℃，然后将搁板温度设为-50℃使制品温度达到-43℃，然后迅速将制品温度升至-30℃，保温1小时，重新将制品温度降至-41℃，然后将搁板温度设为-30℃，开启真空泵，进入升华干燥阶段，水线消失后结束升华干燥；然后逐步升高搁板温度至30℃，制品温度达到28℃以上保持5小时停机、压塞、出箱，共耗时40小时。
步骤15，将冻干粉在100℃水浴中加热30分钟，进行干热病毒灭活处理。
实施例2
步骤1，同实施例1；
步骤2，用平衡缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—0.15MNacL缓冲液，PH7.15，12℃)约1.8kg连续冲洗树脂，然后用洗脱缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—1MNacL缓冲液，PH7.15，12℃，)约1.2kg缓慢、连续洗脱树脂，不停搅拌树脂使其均匀悬浮，收集洗脱液850g；
步骤3，加入硅藻土8.5克，搅拌1小时，升温至30℃，加入1MCaCL2溶液180g，温和搅拌4小时；
步骤4，加入50％PEG溶液125g，搅拌1小时；
步骤5，6，7同实施例1；
步骤8，将以上溶液降温至5℃左右，上CM柱(100ml)进行层析。先用8倍柱体积的平衡缓冲液B(0.02M柠檬酸钠—0.1MNacL缓冲液，PH7.15，5℃，)进行洗涤，去除杂蛋白；再用6倍洗脱缓冲液B(0.02M柠檬酸钠—1.0MNacL缓冲液，PH7.15，5℃)，进行洗脱，收集洗脱液约365g，加入甘氨酸7.3克；
步骤9，超滤浓缩以上溶液，先浓缩至约200g，再用1kg含1％甘氨酸的溶液进行透析，转移并后洗超滤膜，收集658g，测凝血酶活力612IU/ml；
步骤10，以上溶液中加入含2％甘氨酸的溶液74g，搅匀取样，测凝血酶活力526IU/ml，调PH值至7.10；
步骤11，12，13，同实施例1；
步骤14，将制品放进冻干机，先将制品预冷至3℃，然后将搁板温度设为-50℃，使制品温度达到-43℃，然后迅速将制品温度升至-25℃，保温2小时；重新将制品温度降至-41℃，然后将搁板温度设为-25℃，开启真空泵，进入升华干燥阶段，水线消失后结束升华干燥；然后逐步升高搁板温度至30℃，制品温度达到28℃以上保持4小时停机、压塞、出箱，共耗时47小时。
步骤16，同实施例1；
实施例3
步骤1，同实施例1；
步骤2，用平衡缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—0.15MNacL缓冲液，PH7.15，15℃)约1.5kg连续冲洗树脂，然后用洗脱缓冲液A(0.01M柠檬酸钠—0.75MNacL缓冲液，PH7.15，15℃，)约0.9kg缓慢、连续洗脱树脂，不停搅拌树脂使其均匀悬浮，收集洗脱液675g；
步骤3，加入硅藻土3.35克，搅拌0.5小时，在25℃下，加入0.5MCaCL2溶液80g，温和搅拌6小时；
步骤4，加入40％PEG溶液62g，搅拌1小时；
步骤5，6，7同实施例1；
步骤8，将以上溶液降温至10℃左右，上SP-sepharoseFF柱(100ml)进行层析。
先用5倍柱体积平衡缓冲液B(0.02M柠檬酸钠—0.15MNacL缓冲液，PH6.80，10℃，)进行洗涤，去除杂蛋白；再用4倍洗脱缓冲液B(0.02M柠檬酸钠—0.75MNacL缓冲液，PH6.80，10℃)进行洗脱，收集洗脱液约332g，加入甘氨酸10克；
步骤9，超滤浓缩以上溶液，先浓缩至约200g，再用1kg含3％甘氨酸的溶液进行透析，转移并后洗超滤膜，收集561g，测凝血酶活力663IU/ml；
步骤10，以上溶液中加入含3％甘氨酸的溶液115g，搅匀取样，测凝血酶活力533IU/ml，调PH值至7.08；
步骤11，12，13，同实施例1；
步骤14，将制品放进冻干机，先将制品预冷至5℃，然后将搁板温度设为-50℃，使制品温度达到-41℃，然后迅速将制品温度升至-20℃，保温3小时，重新将制品温度降至-41℃，然后将搁板温度设为-20℃，开启真空泵，进入升华干燥阶段，水线消失后结束升华干燥；然后逐步升高搁板温度至30℃，制品温度达到28℃以上保持3小时停机、压塞、出箱，共耗时42小时。
步骤15，同实施例1。
附表本发明工艺的产品与国内某公司上市产品对比

Claims (10)

1.一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）一个用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原的步骤；根据去冷胶血浆的体积，称取阴离子树脂，所述阴离子树脂和去冷胶血浆的质量体积比为0.5-1.5g：1L，将阴离子树脂用热注射用水充分溶胀，所述的热注射用水的温度为不低于70℃，然后再用冷注射用水冷却，所述的冷注射用水的温度为10~25℃，然后用平衡缓冲液A平衡后加到去冷胶血浆中，在10-30℃，缓慢搅拌0.5-1.5小时，用滤网过滤，收集树脂，滤出的血浆进入后续产品的加工程序中；
2）用平衡缓冲液A连续冲洗树脂，平衡缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量的4-8倍，然后用洗脱缓冲液A缓慢、连续洗脱树脂，洗脱缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量的2-6倍，收集洗脱液即为凝血酶原溶液；
3）一个激活凝血酶原的步骤；在10~30℃条件下，在上述洗脱液中加入硅藻土，所述的硅藻土的质量为上述洗脱液质量的0.1~1%，搅拌0.5-1小时，加入0.5-1MCaCL2溶液，温和搅拌2-10小时，将凝血酶原激活；
4）加入质量百分比浓度为25-50%聚乙二醇溶液，所述的聚乙二醇的加入量为步骤3）溶液的2-8%，搅拌0.5-2小时；
5）过滤，后洗滤芯，收集滤液即凝血酶溶液，弃去沉淀；
6）一个采用S/D病毒灭活处理的步骤，在上述的滤液中加磷酸三丁脂，所述的磷酸三丁脂的加入量为所述滤液的0.3%，然后加入Tween-80，所述的Tween-80的加入量为所述滤液的1%，在24-26℃下缓慢搅拌6~7小时；
7）一个采用阳离子柱层析纯化凝血酶的步骤，将以上溶液降温至5~20℃，上阳离子柱进行层析；先用平衡缓冲液B进行洗涤；再用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液，即纯化的凝血酶溶液；在洗脱液中及时加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为凝血酶溶液的1-5%；
8）用0.45μm滤芯进行澄清过滤，收集滤液；后进行超滤浓缩并透析，最后浓缩至合适的活力单位；
9）加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为上述超滤浓缩溶液的1-5%；按产品规格调节凝血酶溶液效价至500-550IU/ml，调PH值至6.50-7.50；
10）用0.10μm的滤芯串联20nm的除病毒滤芯进行除病毒过滤，过滤的温度为5~25℃；
11）用0.22μm的滤芯进行除菌过滤，后分装；
12）一个冻干的步骤；
13）一个进行干热病毒灭活的步骤；将冻干粉在100℃水浴中加热30分钟，进行干热病毒灭活处理获得人凝血酶成品。
2.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：所述的阴离子树脂为DEAE-SephadexA-50树脂。
3.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：步骤2）中所述的连续洗涤或洗脱是指在在树脂桶中，一边搅拌一边加入洗涤或洗脱缓冲液，同时从树脂桶底阀排出洗涤液或洗脱液的过程。
4.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：所述的平衡缓冲液A由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的平衡缓冲液A中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.1-0.2M，PH为6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液A由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的洗脱缓冲液A中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.5-1.0M，所述的洗脱缓冲溶液A的PH6.50-7.50。
5.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：所述的平衡缓冲液B由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的平衡缓冲液B中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.1-0.2M，PH为6.60-7.50；所述的洗脱缓冲液B由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的洗脱缓冲液B中，所述的柠檬酸钠的浓度为0.01-0.02M，所述的NaCL的浓度为0.5-1.5M，所述的洗脱缓冲溶液B的PH6.60-7.50。
6.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：步骤3）中，所述的CaCL2的最终浓度为0.02M-0.2M。
7.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：步骤7）所述的阳离子树脂是CM-SepharoseFF，SP-SepharoseFF或SP-SephadexC-50批量处理树脂中的任何一种。
8.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：步骤7）所述的稳定剂为甘氨酸。
9.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：步骤9）所述的稳定剂为甘氨酸。
10.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于：步骤12）所述的冻干的步骤如下：
先将制品预冷至0-5℃，然后将搁板温度设为-50℃以下，使制品温度达到-40℃及以下，然后迅速将制品温度升至-20~-30℃，保温1-3小时，再重新将制品温度降至-40℃以下，然后将搁板温度设为-20~-30℃，开启真空泵，进入升华干燥阶段，待水线消失结束升华干燥；然后将搁板温度逐步升温，进入解析干燥阶段，最高设定温度30℃，当制品温度达到28℃以上保持3-5小时即停机，出箱。
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