CN104328101A - 一种凝血酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种凝血酶的制备方法，其包括：过滤除去猪血浆中的杂质；加入病毒灭活试剂进行病毒灭活处理；加入吸附剂吸附凝血酶原；洗涤和浸泡吸附凝血酶原的吸附剂，再进行透析；激活经透析的溶液中的凝血酶原；将溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；经超滤膜过滤；经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；制成制剂。该制备方法在进一步稳定凝血酶产品的效价的基础上，更有效地减少了凝血酶产品中的杂质及降低杂蛋白浓度，并使病毒充分灭活后被除去。

Description

一种凝血酶的制备方法

技术领域

本发明属于生化制药领域，涉及一种凝血酶的制备方法，具体涉及一种有效降低杂质和去除/灭活病毒、效价稳定的凝血酶的制备方法。

背景技术

凝血酶是一种广泛存在于人体和动物血液中的丝氨酸蛋白酶，它是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定，从而在血栓性疾病的引发和发展中发挥核心作用。由于凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使其转变为纤维蛋白、加速血液的凝固而止血，因此临床上将其用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血，特别是用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血及外伤出血等。

目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的。其中，由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是由人血及牛血等血液制备的。但是，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下几个问题：(1)凝血酶产品效价不稳定；(2)产品杂质及杂蛋白浓度偏高；(3)存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患。

中国发明专利申请CN1031160486(以下简称在先专利)公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括以下步骤：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该专利申请并未公开用于病毒灭活的试剂和纳米膜的种类，而且所述方法得到的产品杂质含量偏高，其产品的效价也有待进一步提高。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种凝血酶的制备方法，该制备方法在进一步提高凝血酶产品的效价的基础上，更有效地去除了凝血酶产品中的杂质并使病毒充分灭活后被除去。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)过滤除去猪血浆中的杂质；

(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；

(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；

(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；

(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；

(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；

(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；

(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；

(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；

(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；

(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；

(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂。

在上述制备方法的步骤(1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-10℃下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15℃，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-10℃下保存0-6小时或者-18℃以下冰冻贮存二年以内备用；优选地，所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤。

在上述制备方法的步骤(2)中，优选地，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的Triton X-100的水溶液。

在上述制备方法的步骤(3)中，优选地，所述吸附剂为DEAE-SephadexA-50型离子交换树脂；优选地，所述吸附剂与血浆的质量比为0.5～2.5：1000，优选为1.5：1000。

在上述制备方法的步骤(4)中，优选地，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升～200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克。

在上述制备方法的步骤(5)中，优选地，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升～60毫升：1000克，更优选为35毫升：1000克。

在上述制备方法的步骤(6)中，优选地，所述透析用溶液与血浆的比为2500毫升～3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克。

在上述制备方法的步骤(8)中，优选地，采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将pH调节至5.2-5.6；优选地，采用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至6.0-6.5。

在上述制备方法的步骤(9)中，优选地，所述膜吸附器为纤维素膜吸附器，例如Sartobind Q SingleSep型囊式膜吸附器；优选地，所述洗脱的洗脱剂为先用浓度为0.15mol/L的NaCl水溶液，再用浓度为0.25mol/L的NaCl水溶液。

在上述制备方法的步骤(10)中，优选地，所述超滤膜的截留分子量为10K-150K；更优选地，所述超滤膜过滤为先用截留分子量为150K的超滤膜过滤，再用截留分子量为10K的超滤膜过滤；进一步优选地，所述截留分子量为150K的超滤膜为截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜，所述截留分子量为10K的超滤膜为截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜。

在上述制备方法的步骤(11)中，优选地，所述过滤除菌的滤膜依次为0.8μm、0.45μm和0.22μm的聚偏二氟乙烯膜。

在本发明的一个优选的技术方案中，所述凝血酶的制备方法包括以下步骤：

(1)在20±2℃下，分别经70目、100目、200目滤网过滤除去经过抗凝预处理猪血浆中的杂质；

(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，在24℃下进行病毒灭活处理4-6小时；所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的Triton X-100的水溶液；

(3)在20±2℃下，向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，搅拌45分钟后静置30分钟以吸附凝血酶原，经200目滤布过滤后抽滤；所述吸附剂与血浆的质量比为1.5：1000；

(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；所述洗涤用溶液与血浆的比为160毫升：1000克；

(5)在室温下，将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中30分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升：1000克；再将吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中20分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为15毫升：1000克，合并两次的滤液；

(6)在0-4℃下，将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析5-5.5小时；所述透析用溶液与血浆的比为3000毫升：1000克；

(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，5分钟后再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌15分钟后4℃下静置1小时；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液，并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；

(8)采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，在4℃下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟，采用饱和碳酸氢钠溶液将上清液的pH调节至6.0-6.5，在4℃下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟；

(9)将步骤(8)得到的上清液以0.4Mpa的压力、0.03～20升/分钟的流速通过膜吸附器后，先用浓度为0.15mol/L NaCl水溶液洗涤，再用浓度为0.25mol/L NaCl水溶液洗脱得到洗脱液；

(10)将步骤(9)得到的洗脱液pH控制为2-13，在5-45℃的温度和不大于0.3Mpa压力下先经截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜过滤，再在5-45℃的温度和不大于0.12Mpa压力下经截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜过滤，并浓缩滤液；

(11)将步骤(9)得到的滤液依次经孔径为0.8μm、0.45μm和0.22μm的聚偏二氟乙烯膜过滤除菌，然后经孔径为0.1μm的滤膜预过滤，再以200±10KPa的过滤压力经孔径为20nm的滤器过滤除病毒；

(12)将步骤(11)得到溶液与药学上可接受的辅料混合，经冻干制成冻干制剂。

实验结果表明，相对于现有技术，本发明的制备方法在进一步稳定凝血酶产品的效价的基础上，更有效地减少了凝血酶产品中的杂质，降低了杂蛋白浓度并使病毒充分灭活后被除去，从而延长了凝血酶产品的运输、储存和使用周期，消除了安全隐患，更有利于凝血酶产品在临床上发挥疗效，为广大患者带来益处。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的凝血酶的制备方法的工艺流程图；其中，洁净区：温度18-26℃；相对湿度45-65％；保持一定的正压，与室外的静压差≥10Pa；

图2显示了电泳法检测实施例1制备的凝血酶产品的杂质含量的结果；

图3显示了超滤前后的蛋白分子量分布的对比结果；其中，图3A：超滤前；图3B：超滤后。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1凝血酶的制备方法

一、生产处方

1、猪血预处理：

2、提取：

标准处方：100kg

二、操作过程及工艺条件

1、试液的配制：

一号液：3.8％的柠檬酸三钠溶液

二号液:饱和碳酸氢钠溶液

三号液:2M氯化钠溶液、0.3％柠檬酸三钠溶液

四号液:0.01M的柠檬酸三钠溶液，pH 7.0

五号液:3.5％凝血活酶溶液。根据透析液体积的V透〓7％计算出所需的五号液体积，按五号液体积的3.5％计算出氯化钙量，然后在电子称上准确称取，加入到五号液体积的0.9％NaCl溶液中，水浴加热(45～50℃)搅拌15分钟，然后2000转/分，离心2分钟，收取上清液即得(此步骤在C级洁净区配制)。

六号液:7％预先激活的凝血活酶溶液。将透析液体积V透的7％首先激活作为六号液。激活:首先从透析液中取出V透〓7％，再从五号液中取出V透〓7％〓7％，将取出的五号液加入到上述透析液中，搅拌5分钟，再加入V透〓7％〓7％体积1M的氯化钙溶液。六号液在C级洁净区配制。

七号液:1M的氯化钙溶液

八号液:0.075M的氯化钠溶液

九号液:1M的氯化钠溶液

十号液:1M的冰乙酸溶液

十一号液:1M的氢氧化钠溶液

十二号液:0.2M氯化钠溶液、0.3％柠檬酸三钠溶液

S/D试剂：0.3％TNBP和1％吐温-80

2、原料的预处理

(1)制备抗凝血浆：收集新鲜的猪血，立即加入1/9猪血体积的一号液抗凝，轻轻搅匀，置0-10℃的条件下放置，并于7小时内离心，离心温度为12℃，离心时间为18分钟。

(2)离心分离血浆：将抗凝猪血用离心机离心结束后，收集上层血浆，装入容积为10升的塑料桶中，下层血细胞弃去。

(3)血浆的贮存：离心分离出来的猪血浆，置0-10℃的环境中，6小时内应进行凝血酶半成品的提取，否则于-18℃以下冰冻贮存(密封、避光)，贮存期为二年。

3、凝血酶原料的提取

(1)粗提

1.除杂：如原料血浆为冻血浆，则将猪血浆从冷库中提出，水浴加热至20±2℃(水浴温度不高于35℃)，待血浆完全融化后进行逐级过滤，分别过70目、100目、200目的尼龙滤网，过滤后的血浆称重。如原料血浆为新鲜血浆，则将猪血浆进行逐级过滤，分别过70目、100目、200目的尼龙滤网，过滤后的血浆称重。

2.S/D法去脂包膜病毒：向过滤后的血浆加入S/D液(TNBP和吐温80)，并调整浓度分别为0.3％TNBP和1％吐温-80，血浆在24℃下处理6小时。

3.凝血酶原的吸附：将处理完毕的血浆加入到不锈钢反应器内，控制血浆温度为20±2℃，按照血浆重量(Kg)：吸附剂(g)＝1：1.5的比例加入预先处理好的吸附剂(DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂)，搅拌45分钟，静置30分钟。

4.吸附剂的洗涤：先将吸附完毕的血浆及沉淀下来的吸附剂一起过200目的尼龙滤布，将吸附剂中的血浆用抽滤的方法抽尽，滤液弃去；再按照血浆重量(Kg)：十二号液(ml)＝1：160的比例用十二号液洗涤吸附剂，用抽滤的方法抽尽，滤液弃去。

5.凝血酶原的洗脱：按照血浆重量(Kg)：三号液(ml)＝1：20的比例将三号液加入滤干的吸附剂中，于室温下浸泡30分钟，抽滤收集滤液，吸附剂再用血浆重量(Kg)：三号液(ml)＝1：15的比例的三号液于室温下浸泡20分钟，抽滤，收集合并二次的滤液，即A液。吸附剂进行再处理。

6.洗脱液的透析：将A液装入透析袋内两端扎紧，在血浆重量(Kg)：四号液(L)＝1：3的比例的四号液中透析5-5.5小时，透析液温度应控制在0-4℃，经透析的A液为B液。

(2)精提

1.凝血酶原的激活：将B液加入不锈钢或玻璃容器中，在37±0.5℃水浴中加热至33-36℃，加入7％的五号液，5分钟后加入7％的六号液和7％的七号液，控制B液温度为33-36℃，搅拌15分钟，4℃下静置1小时，此即C液。

2.凝血酶激活液的除杂：将C液用1M的冰乙酸调至pH 5.3，4℃下静置40分钟，离心(3000转/分钟，18分钟)，离心后沉淀弃去，收集上清液。将上清液用饱和碳酸氢钠调至pH 6.2，4℃下静置40分钟，离心(3000转/分钟，18分钟)，离心后沉淀弃去，收集上清液。

3.膜层析除杂：将得到的上清液以0.4Mpa的压力、0.03～20升/分钟的流速通过膜吸附器后，先用浓度为0.15mol/L NaCl水溶液洗涤，再用浓度为0.25mol/L NaCl水溶液洗脱得到洗脱液。

4.超滤：洗脱液在室温下用截留分子量为150K的超滤膜过滤，操作压力不大于0.3Mpa，收集透出液。膜材质为中空纤维聚偏氟乙烯膜。

透出液在室温下再用截留分子量为10K的超滤膜过滤，操作压力不大于0.12Mpa，收集浓缩液。膜材质为中空纤维聚砜膜。

操作时的室温应控制在5-45℃，料液的pH应为2-13。

4、分装

将所要分装的精制品倒入清洁的容器内，混匀，依次过孔径为0.8μm、0.45μm、0.22μm的除菌滤膜。

除菌过滤的精制品先通过0.1μm滤膜进行预过滤，再通过20nm纳米除病毒滤器过滤，过滤压力控制在200±10KPa，溶液接收入清洁、灭菌的不锈钢桶中。

除菌滤膜：聚偏二氟乙烯(293mm、0.22μm)

将装入滤膜(规格0.22μm)的圆盘过滤器上端通入无菌过滤的压缩空气，检测过滤器的完整性；

该测试在药液除菌过滤前、后各进行一次。

5、制剂的生产

(1)配液

首先配制15％的右旋糖酐-40溶液，煮沸溶解成澄明的液体后，晾至室温，将溶液边计量体积边加入配液罐中。将上述除病毒后的凝血酶原料加入配液罐，再加入注射用水至全量，封好罐口。将配液终浓度调至凝血酶：500U/ml；右旋糖酐-40：2％。开搅拌器搅拌5分钟，混匀。

(2)除菌过滤

打开输液泵，经二级0.2μm滤芯除菌过滤，接收于清洗、灭菌、密闭的药液接收罐中。控制滤芯两端压力差不超过0.2Mpa。

(3)灌装

试机正常后，按100～300瓶/分钟的速度进行灌装，灌好药液后设备迅速半压塞。

(4)冻干

开启压缩机在2.5小时内将搁板冷冻到-45℃以下，并保持0.5～1.5小时。

开启冷凝器制冷，当冷凝器温度低于-45℃后，开启真空泵，当真空值达到10Pa时，给板层升温，升华时真空值保持在10～15Pa。一次升华干燥时间不超过10小时；待制品表面呈干燥状后开始二次干燥，干燥时间不超过4小时。当搁板温度达到36±2℃时，真空度恒定时(真空度≤8Pa)，即可压塞停机。整个冻干时间视制品情况一般为15～19小时。

(5)轧盖

调整光点传感器位置，开启色标传感器。轧盖正常符合要求后，轧盖速度：200-300转/min，每隔30min检查一次刀头轧盖情况。合格的轧盖品进入出瓶联线轨道。成品入库。

实施例2凝血酶的检测

1、长期稳定性考察

对实施例1制备的凝血酶冻干制剂进行了效价的长期稳定性考察，并与在先专利公开的猪凝血酶产品进行了比较，效价测定方法按《中国药典》2010年版第一增补本“凝血酶冻干粉”中的【效价测定】项下方法进行检测。其中，两种样品均在市售包装的条件下，经过了36个月的长期稳定性考察试验。结果见表1。

表1实施例1的凝血酶冻干制剂与在先专利的猪凝血酶产品效价的长期稳定性比较

根据以上试验结果可知，在先专利公开的现有工艺生产的样品效价降低很快，到18个月时检测产品质量已经不合格；而本发明制备的凝血酶产品的效价在36个月内无明显变化，说明药品质量更加稳定。

2、杂质含量考察

对实施例1制备的凝血酶冻干制剂进行了杂质含量考察，杂质测定方法为《中国药典》2010年版附录ⅤF电泳法中的“第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”，结果见图2。结果显示，经过本发明的精提除杂步骤(照片显示了精提除杂前后的杂质对比)，凝血酶产品的杂质含量明显减少。

3、分子量及分子量分布、蛋白浓度的考察

对实施例1制备的凝血酶冻干制剂进行了分子量及分子量分布的考察，分子量及分子量分布测定方法采用《中国药典》2010年版二部附录ⅤH中的分子排阻色谱法，流动相为磷酸盐缓冲液(pH 6.864)，色谱柱为TSK-GEL G2000SW色谱柱，采用紫外检测器，检测波长为280nm，流速为0.5ml/min。结果见图3。图3显示了超滤前后的分子量分布，经对比可以发现，经过本发明的超滤步骤，较大和较小分子量的杂蛋白均被除去，留取了中间分子量的有效蛋白，凝血酶产品的杂蛋白明显减少。

另外，对超滤后的料液进行了蛋白浓度的测定，测定方法采用《中国药典》2010年版二部附录VII M的蛋白质含量测定法中的“第二法福林酚法(Lowry法)”。结果显示，蛋白浓度为30％左右。

本发明考察了超滤后的溶液的蛋白质浓度对于制备方法的影响，结果如以下表2和3所示。

表2蛋白质浓度对于膜过滤操作和效价的影响

根据以上数据可知，蛋白浓度在55％和30％左右时，超滤后基本保留了凝血酶产品的有效成份，而蛋白浓度在20％左右时效价较大程度降低，说明蛋白浓度控制过低时有效成份也被除去，即使对下一步的膜过滤没有影响，也不能采用该蛋白浓度。现对比前两个蛋白浓度，两者都保留了有效成份，但蛋白浓度为55％时，对下一步的膜过滤操作影响较大，相同时间相同膜面积过滤量大大减少，且过滤速度降低较快，过滤后的效价也降低较大，说明膜堵塞后，有效成份被截留，所以效价大大降低。控制30％的蛋白浓度不但保留了有效成份，同时也提高了下一步膜过滤的流速，缩短过滤时间，降低生产成本，更适合大批量生产。因此，该蛋白浓度为最佳值。

另外，对该超滤步骤前后进行了蛋白浓度的测定，数据如下：

表3超滤前后的蛋白浓度

蛋白溶液来源	超滤前蛋白浓度	超滤后蛋白浓度
			实施例1	59.4％	31.2％

根据表3数据可知，料液经过该超滤步骤处理后，恰好可以保证蛋白浓度在最佳范围内，在保留有效成份的同时，更有利于下一步的膜过滤操作，可以大大提高料液处理的流速，缩短过滤时间，降低生产成本，更适合大批量生产。

4、去除病毒效果考察

对实施例1制备的凝血酶冻干制剂进行了去除病毒效果考察，并与在先专利公开的猪凝血酶产品进行了比较，结果见表4和5。其中，S/D法只对去除脂包膜病毒有效，表4以伪狂犬病毒(PRV)为例列表说明。膜过滤法对去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有效，表5以最小非脂包膜病毒细小病毒(PPV)为例列表说明。

试验方法：将传代消化后的细胞稀释成约10⁵-10⁶个/mL后，转入96孔培养板中，0.18mL/孔；细胞传代时同步接种PRV和PPV，接毒时将病毒液作连续的10倍稀释，每个稀释度分别接种8孔，0.1mL/孔，并用生理盐水作阴性对照，置37℃，5％CO₂培养，样品溶液及对照液同法培养，每天观察细胞病变并记录。

表4实施例1的凝血酶冻干制剂与在先专利的猪凝血酶产品的去除病毒(PRV)效果比较

表5实施例1的凝血酶冻干制剂与在先专利的猪凝血酶产品的去除病毒(PPV)效果比较

注：#号为病变显著，多数细胞死亡；+号为可见病变，多数细胞存活；

*号为轻微可见病变，多数细胞存活；-号为无明显变化。

根据以上实验结果可见，与对照组对比，经过去除病毒工艺后，本发明的凝血酶产品的样品溶液未使细胞发生明显病变，而在先前专利的凝血酶产品的样品溶液在最高浓度时使细胞有轻微病变，提示未完全去除病毒。

Claims (12)

1.一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)过滤除去猪血浆中的杂质；

(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；

(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；

(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；

(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；

(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；

(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；

(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；

(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液。

(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；

(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；

(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂。

2.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-10℃下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15℃，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-10℃下保存0-6小时或者-18℃以下冰冻贮存二年以内备用；优选地，所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤。

3.根据权利要求1或2所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(2)中，优选地，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的Triton X-100的水溶液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在上述制备方法的步骤(3)中，优选地，所述吸附剂为DEAE-SephadexA-50型离子交换树脂；优选地，所述吸附剂与血浆的质量比为0.5～2.5：1000，优选为1.5：1000。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(4)中，优选地，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升～200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(5)中，优选地，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升～60毫升：1000克，更优选为35毫升：1000克。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(6)中，优选地，所述透析用溶液与血浆的比为2500毫升～3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(8)中，优选地，采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将pH调节至5.2-5.6；优选地，采用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至6.0-6.5。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(9)中，优选地，所述膜吸附器为纤维素膜吸附器，例如Sartobind Q SingleSep型囊式膜吸附器；优选地，所述洗脱的洗脱剂为先用浓度为0.15mol/L的NaCl水溶液，再用浓度为0.25mol/L的NaCl水溶液。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(10)中，所述超滤膜的截留分子量为10K-150K；优选地，所述超滤膜过滤为先用截留分子量为150K的超滤膜过滤，再用截留分子量为10K的超滤膜过滤；进一步优选地，所述截留分子量为150K的超滤膜为截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜，所述截留分子量为10K的超滤膜为截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(10)中，所述过滤除菌的滤膜依次为0.8μm、0.45μm和0.22μm的聚偏二氟乙烯膜。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述凝血酶的制备方法包括以下步骤：

(1)在20〒2℃下，分别经70目、100目、200目滤网过滤除去经过抗凝预处理猪血浆中的杂质；

(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，在24℃下进行病毒灭活处理4-6小时；所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的Triton X-100的水溶液；

(3)在20±2℃下，向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，搅拌45分钟后静置30分钟以吸附凝血酶原，经200目滤布过滤后抽滤；所述吸附剂与血浆的质量比为1.5：1000，

(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；所述洗涤用溶液与血浆的比为160毫升：1000克；

(5)在室温下，将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中30分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升：1000克；再将吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中20分钟，抽滤，所述浸泡用溶液与血浆的比为15毫升：1000克，合并两次的滤液；

(6)在0-4℃下，将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析5-5.5小时；所述透析用溶液与血浆的比为3000毫升：1000克；

(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，5分钟后再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌15分钟后4℃下静置1小时；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液，并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；

(8)采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，在4℃下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟，采用饱和碳酸氢钠溶液将上清液的pH调节至6.0-6.5，在4℃下静置30-45分钟后以3000转/分钟离心15-20分钟；

(9)将步骤(8)得到的上清液以0.4Mpa的压力、0.03～20升/分钟的流速通过膜吸附器后，先用浓度为0.15mol/L NaCl水溶液洗涤，再用浓度为0.25mol/L NaCl水溶液洗脱得到洗脱液；

(10)将步骤(9)得到的洗脱液pH控制为2-13，在5-45℃的温度和不大于0.3Mpa压力下先经截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜过滤，再在5-45℃的温度和不大于0.12Mpa压力下经截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜过滤，并浓缩滤液；

(11)将步骤(9)得到的滤液依次经孔径为0.8μm、0.45μm和0.22μm的聚偏二氟乙烯膜过滤除菌，然后经孔径为0.1μm的滤膜预过滤，再以200±10KPa的过滤压力经孔径为20nm的滤器过滤除病毒；

(12)将步骤(11)得到溶液与药学上可接受的辅料混合，经冻干制成冻干制剂。