CN106119232A - 凝血酶的纯化工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了凝血酶的纯化工艺，包括纳米过滤，纳米过滤前，进行膜包洗滤，去除分子量大于200KD的杂蛋白。本发明通过膜包洗滤可以去除凝血酶溶液中的大分子蛋白质，避免大分子物质堵塞纳米膜孔道，另外膜包过滤条件温和，不会导致凝血酶活力降低，达到去除非脂包膜病毒的目的。

Description

凝血酶的纯化工艺
技术领域
本发明生物制品生产技术领域，尤其涉及一种凝血酶的纯化工艺。
背景技术
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。临床上，凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器初学的止血。用于外伤、手术、口腔、耳鼻喉、泌尿、烧伤、骨科等出血的凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使转变为纤维蛋白，加速血液的凝固而止血。
凝血酶的制备通常是经过一系列工序获得凝血酶原的粗品，然后用特定方式进行激活，使凝血酶原转变为凝血酶，再对凝血酶进行纯化，经超滤、浓缩获得凝血酶液，按所需规格进行无菌分装，然后进行冻干、最后获得冻干粉成品。
CN105039295A公开了一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，包括：首先用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原，后洗脱、过滤得到凝血酶原溶液；再用CaCl2溶液激活凝血酶原，得到凝血酶溶液；然后对凝血酶溶液进行S/D病毒灭活处理；用阳离子柱进行层析，得到纯化的凝血酶溶液；将凝血酶溶液进行超滤、透析、浓缩，得到效价符合产品规格要求的凝血酶溶液；然后用20nm滤芯进行除病毒过滤；后按所需规格进行分装；然后冻干；将冻干粉进行干热病毒灭活处理获得人凝血酶成品。
CN103160486A公开了一种猪凝血酶的制备方法，包括：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该方法将洗脱的凝血酶原液超滤后直接进行纳米过滤，由于纳米膜的孔径很小，容易堵塞纳米膜。
发明内容
本发明提供了一种凝血酶的纯化工艺，解决了传统工艺中酶液直接进行纳米过滤，容易造成纳米膜孔道堵塞的问题。
凝血酶的纯化工艺，包括纳米过滤，纳米过滤前，进行膜包洗滤，去除分子量大于200KD的杂蛋白。
所述膜包洗滤是指将经过前处理的凝血酶溶液和缓冲溶液通过膜包过滤装置，收集滤出液，缓冲溶液即是滤洗液，膜包截留大分子物质，凝血酶分子量小于200KD，通过膜包，在滤出液中。
膜包洗滤的条件影响凝血酶的得率，优选的，膜包洗滤的条件为：切向流速1-5mL/min·m2，过膜压力20-30psi，洗滤5-10倍。
所述膜包洗滤采用的洗滤溶液是pH值6.0-8.0为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液是常见的缓冲溶液，配置方便。
所述膜包浓缩就是将滤出液通过第二个膜包过滤装置，去除滤出液，收集浓缩液。因洗滤后凝血酶溶液体积扩大几十倍，增加了纳米过滤的负荷因此，减少纳米过滤时间，降低纳米膜负荷，膜包洗滤后进行膜包浓缩，去除分子量小于20KD的杂蛋白，当然也包括洗滤溶液和水。
膜包浓缩的条件影响其中杂质的含量，优选的，膜包浓缩的条件为：切向流速1-5mL/min·m2，过膜压力35-45psi，浓缩5-10倍。
因采用缓冲液洗滤，最后浓缩液中同样含有缓冲液，为去除缓冲液，膜包浓缩后采用纯水洗滤，使得浓缩液中只含有水和凝血酶。
优选，洗滤7倍以上，进一步去除小分子物质，彻底用纯水替换缓冲液。
本发明所述纳米过滤的对象是指凝血酶溶液，凝血酶溶液一般是血液通过离心分离、凝胶吸附、超滤、除菌等操作制成。
优选，所述纯化工艺包括依次进行的如下步骤：
(1)将血液离心分离，获得血浆和血清；
(2)凝胶吸附，洗脱获得凝血酶原液；
(3)将凝血酶原激活转化成为凝血酶，获得凝血酶液粗品；
(4)过滤；
(5)S/D法灭活病毒；
(6)膜包过滤；
(7)纳米过滤。
更优选的，S/D灭活病毒后用深层滤板澄清，以去除大分子的沉淀物。
本发明通过膜包洗滤可以去除凝血酶溶液中的大分子蛋白质，避免大分子物质堵塞纳米膜孔道，另外膜包过滤条件温和，不会导致凝血酶活力降低，达到去除非脂包膜病毒的目的。
附图说明
图1为本发明膜包过滤系统的结构示意图。
图2为本发明膜包夹具的结构示意图。
具体实施方式
实施例1
(1)取猪血，加入抗凝剂，离心分离，获得血浆和血清；抗凝剂选用柠檬酸钠，血浆与抗凝剂的重量比为200∶1。
(2)利用离子交换树脂吸附血浆中的凝血酶原，洗脱获得凝血酶原溶液；具体可以参见CN105039295A公开的方法。_
(3)在洗脱液中按1％的比例加入兔脑磷脂粉末，在室温下静置10h，使凝血酶原激活转化为凝血酶，过滤收集得到凝血酶液粗品。
(4)对凝血酶粗品进行过滤，主要是为了除去酶溶液中的大分子物质以及细菌，但无法去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒等。
(5)在最后的滤液中添加磷酸三丁脂，添加量为滤液重量的0.5％，然后加入吐温-80，加入量为滤液重量的1％，在常温下搅拌10h，能够有效灭活脂包膜病毒。
以上均为现有凝血酶分离纯化的常规操作，本发明的改进主要在于纳米膜过滤之前采用膜包过滤，因酶溶液含有部分杂蛋白，会导致纳米膜堵塞。另外，常规过滤会导致凝血酶活力降低，影响最终得率。
如图1所示，一种凝血酶洗滤浓缩系统，包括膜包洗滤单元A和膜包浓缩单元B和中间储存罐C，膜包洗滤单元内的膜包孔径大于膜包浓缩单元内的膜包孔径。膜包洗滤单元A和膜包浓缩单元B的结构相同，以膜包洗滤单元A为例进行说明：
如图1和图2所示，膜包洗滤单元A包括固定夹具以及固定在固定夹具内的一个或多个切向流膜包201。固定夹具包括底板203以及压板204。底板203为与膜包形状类似的正方形或者长方形结构，其上设有四个定位柱205，分别布置在底板203的四个角处，定位柱为四个保证压板对膜包提供更加均匀的压力，实现对膜包的均匀定位。压板204滑动的穿设在定位柱205上，压板204上对应的设有供定位柱205穿过的通孔。定位柱205顶部设有外螺纹206以及与外螺纹206配合的用于固定压板204的定位螺母207；压板204与底板203之间形成固定切向流膜包201的工作间隙。
底板203上设有与膜包进出料口结构对应的孔道结构，该孔道结构包括设置在底板203内部且相互独立的大颗粒进出料循环通道208和小颗粒出料通道209(图1中看不到，所以采用虚线表示)，大颗粒进出料循环通道208和小颗粒出料通道209分别为两组，且相互平行设置。图1中左右两个大颗粒进出料循环通道208，一个用于进料(或者回料)，一个用来出料，两个通道同时通过管路与凝血酶料液储存罐相连，进行循环过滤，直至凝血酶料液储存罐内的凝血酶全部过滤出去。底板203顶面分别设有与大颗粒进出料循环通道208导通的大颗粒进出料口210，用于与底板上设置的膜包的过滤通道的导通。底板203顶面分别设有与小颗粒出料通道209导通的小颗粒出料口211。
(6)经过S/D法灭活的酶溶液先通过深层滤板澄清，取上清液，再通过上述过滤浓缩系统，首先通过膜包洗滤单元A，洗滤溶液采用pH值为7的磷酸盐缓冲液，洗滤倍数为7倍，切向流速3mL/min·m2，过膜压力25psi，洗滤后可以将酶溶液中分子量大于200KD的杂蛋白去除，但酶溶液体积增加了7倍，而且含有大量的磷酸盐缓冲液，不利于后续的纳米过滤。
经过洗滤的酶溶液又通过膜包浓缩单元B，浓缩倍数同样为7倍，切向流速为3mL/min·m2，过膜压力为40psi，可以去除酶溶液中分子量小于20KD的小分子杂蛋白，因酶溶液含有Tris-HCl缓冲液，继续用纯水进行滤洗，最终酶溶液只含有水和凝血酶，体积浓缩到原体积。
(7)将通过膜包过滤的浓缩液通过纳米过滤装置，纳米膜孔径为20nm，过膜压力为3bar，以去除非脂膜病毒。
(8)将滤液冷冻干燥，获得凝血酶冻干粉。
实施例2
膜包洗滤采用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，洗滤倍数为9倍，洗滤切向流速5mL/min·m2，过膜压力30psi；膜包浓缩的切向流速为5mL/min·m2，过膜压力为45psi，浓缩9倍。纳米膜孔径20nm，过膜压力5bar。其余同实施例1。
对比例1
凝血酶溶液用柱层析纯化代替膜包过滤，其余同实施例1。
对比例：用柱层析方法纯化后，进行纳米膜过滤
一、柱层析纯化
试验方法层析柱：168ml SP填料。平衡液：20mM pH6.5磷酸盐缓冲液。第一步洗脱液：0.15M NaCl，20mM pH6.5磷酸盐缓冲液。第二步洗脱液：1M NaCl，100mM pH7.5磷酸盐缓冲液。试验分3次，进样量分别为600ml，800ml，1000ml，分别接流穿液和每步洗脱液测定体积及效价，测定原样效价为2050U/ml。
试验结果：
1、效价收率若是按(第二步洗脱效价/总收集效价)计算：进样越多，收率逐渐递减。应选择15ml进样量，收率在94.7％。
2、效价收率若是按(第二步洗脱效价/进样效价)计算：进样15ml的收率超过100％，推测可能是进样量的误差导致。而进样20ml的收率数据异常，可能是因为操作过程温度及时间控制不当，导致有明显效价损失。
二、纳米膜过滤
将上述SP层析柱进样600ml，第二步洗脱得到的200ml洗脱液过先通过纳米膜过滤，纳米膜孔径20nm，过膜压力5bar，滤出14分钟16.2ml时过滤基本停止，考虑纳米膜堵塞，收率8％。
过滤时间（min) 1 2 3 4 5 6 7
过滤体积ml 2.0 3.5 4.9 6.1 7.5 9 10.3
过滤时间（min) 8 9 10 11 12 13 14
过滤体积ml 11.6 12.9 13.8 14.7 15.4 16.0 16.2
检测凝血酶纯化前、膜包过滤前、膜包过滤后、纳米膜过滤后的效价，具体如下表所示：
通过比对可以发现，膜包过滤条件发生变化，不会对纳米过滤的膜通量以及凝血酶收率很大影响，而采用传统的柱层析纯化，纳米过滤膜通量和凝血酶收率大幅度下降。

Claims (9)

1.凝血酶的纯化工艺，包括纳米膜过滤，其特征在于，纳米膜过滤前，进行膜包洗滤，去除分子量大于200KD的杂蛋白。
2.如权利要求1所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，膜包洗滤的条件为：切向流速1-5mL/min·m2，过膜压力20-30psi，洗滤5-10倍。
3.如权利要求1所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，所述膜包洗滤采用的洗滤溶液是pH值为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，膜包洗滤后进行膜包浓缩，去除分子量小于20KD的杂蛋白。
5.如权利要求4所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，膜包浓缩的条件为：切向流速1-5mL/min·m2，过膜压力35-45psi，浓缩5-10倍。
6.如权利要求4所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，膜包浓缩后采用纯水洗滤。
7.如权利要求6所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，洗滤5倍以上。
8.如权利要求1所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：
(1)将血液离心分离，获得血浆和血清；
(2)凝胶吸附，洗脱获得凝血酶原液；
(3)将凝血酶原激活转化成为凝血酶，获得凝血酶液粗品；
(4)过滤；
(5)S/D法灭活病毒；
(6)膜包过滤；
(7)纳米过滤。
9.如权利要求8所述的凝血酶的纯化工艺，其特征在于，S/D灭活病毒后用深层滤板澄清。
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