CN101365467A - 凝血酶纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有降低的高分子量杂质水平的凝血酶组合物。尤其是，因子Va，朊病毒和/或病毒介质的水平也大幅降低。本发明还一般性地涉及制备具有较高纯度和较高比活性的凝血酶的方法。更具体地，本发明包括了通过大小排阻过滤从凝血酶制备物中去除高分子量杂质的步骤。在附加的实施方案中，凝血酶的制备还包括离子交换过滤的步骤。本发明的方法特别适合于凝血酶的大规模纯化。本发明还一般性地涉及含有凝血酶组合物的稳定制剂。更具体地，本发明涉及含有具有较高纯度和较高特异活性的凝血酶的稳定的、液体制剂，及其制备和应用方法。

Description

凝血酶纯化
本申请是递交日为2005年5月26日、美国专利申请11/140,374的部分继续申请，在此将其全文引用作为参考。本申请还将申请日为2006年5月24日、题为“凝血酶纯化”的部分继续美国专利申请全文引用作为参考。本发明要求递交日为2005年5月26日、美国专利申请11/140,374以及申请日为2006年5月24日、题为“凝血酶纯化”的部分继续美国专利申请的优先权。
1.发明领域
制备物本发明涉及纯化凝血酶的制备物，其基本上不含对患者产生副作用的大分子量杂质，例如因子Va，朊病毒和/或病毒介质。本发明还涉及制备基本上不含病毒介质、具有较高纯度和较高比活性的凝血酶的方法。更具体地，本发明包括含有从凝血酶制备物中排除高分子量杂质的方法。本发明还涉及具有较高纯度，较高比活性和稳定性的凝血酶制备物的制剂。
2.发明背景
凝血酶是一种蛋白水解酶，其是由于凝血酶原蛋白水解在凝血系统活化之后出现在血液中。通过催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成血凝块，并释放出纤维蛋白肽A和B，凝血酶协助血液的凝固。在血管系统失调之后，凝血酶的产生对于凝血过程而言是至关重要的。
凝血酶制备物已获得FDA的批准，可以局部施用从而作为对当出现来自于毛细血管的渗血或少量流血时的体内稳定状态的辅助措施，且可以到底小静脉。商业可获得的凝血酶的局部施用显著加速血液的凝固并显著的缩短了凝固的时间。
使用低纯度凝血酶制剂的研究表明凝血病可以在患者对暴露于低纯度，局部凝血酶制剂的应答中出现。在商业可获得的凝血酶制备物中通常存在的杂质包括因子Va，牛血清白蛋白(BSA)，以及其他高分子量蛋白。商业牛凝血酶制剂中的因子Va污染可以刺激患者产生抗牛因子Va的抗体，其可与患者自身的因子Va交叉反应，从而导致受损的止血作用。
凝血酶的凝血强度是以单位/ml进行测定的。所述样本的浓度越高，效力越大，凝血(或产生纤维蛋白原)就越快。比活性是样本的效力除以其蛋白含量的比值且以单位/毫克蛋白进行表达。
凝血酶的比活性依赖于所述凝血酶的纯度。当与具有较低纯度的制备物进行比较时，具有较高纯度的凝血酶在比活性方面表现出了增加。
在此之前，对凝血酶的纯化一般局限于使用常规的离子交换层析。美国专利5,397,704描述了牛的凝血酶制备物，其是使用一系列阴离子和阳离子交换层析制备的。
美国专利5,151,355描述了牛凝血酶制备物，其是通过将1单位的凝血酶原与低于5单位的促凝血酶原激酶在存在钙的条件下进行反应而制备的。然后向将所述凝血酶依次施加于阴离子交换琼脂糖柱和阳离子交换琼脂糖柱。
美国专利4,965,203公开了纯化牛凝血酶的方法，其中将所述凝血酶通过一系列离子交换层析柱，然后使用聚醇和缓冲液进行配制。虽然上述的凝血酶制备物被认为是具有较高的比活性，但这样的纯化方案并未提供任何有效去除高分子量杂质的手段。
美国专利申请公开2001/0033837公开了使用疏水相互作用层析，然后任选通过阳离子交换层析纯化凝血酶制备物的方法。尽管所述纯化凝血酶的方法包括疏水相互作用层析，但所述用于纯化和去除病毒的方法并不能够达到本发明所包括的病毒去除和比活性或纯度。
所以，需要能够被用于制备具有较高纯度凝血酶的方法。因此，所述纯化的凝血酶具有较低水平的高分子量杂质，例如因子Va，以及较高清除界限的病毒介质和朊病毒。
尽管具有较高纯度的凝血酶可进行更安全的使用，因为诸如因子Va和BSA的杂质得以降低或消除，但高纯度的凝血酶依然难以被配制成稳定的制剂。凝血酶越纯，其稳定性就越低且越难以被配制成稳定的制剂。因此，亟需含有具有较高纯度和较高比活性的凝血酶的稳定制剂。
3.发明内容
本发明涉及凝血酶组合物以及制备这些组合物的方法。如本说明书所述，术语制剂，组合物和制备物可以相互替换使用。本发明所涵盖的制剂，组合物和制备物包含有凝血酶，优选为具有提高纯度的凝血酶，还含有额外的赋形剂，特别是那些赋予所述制剂，组合物或制备物稳定性的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明包括了制备具有较高比活性，提高纯度且基本上不含杂质，包括病毒颗粒，因子Va和朊病毒的凝血酶的方法。如本发明所述，制备具有提高杂质的凝血酶制备物的方法包括一或多个以下步骤：大小排阻过滤，离子交换或大小排阻层析，热处理，pH调节，以及电磁辐射。在本发明中，所述凝血酶来源可以是牛或人。
在其他实施方案中，与商业可获得的制备物，例如Thrombin-JMI
Figure A200680018392D0012112518QIETU
相比，本发明的方法能够将所述制备物中的杂质降低至少50％。更优选地，与本文所述的经过纯化之前或低纯度的牛凝血酶相比，本发明的方法能够将所述凝血酶制备物中的杂质降低至少80％。如本发明的另一实施方案所述，与本文所述的纯化之前或低纯度的牛凝血酶相比，本发明的方法能够将所述凝血酶制备物的比活性提高至少1000％，1200％或1500％。
如本发明所述，大小排阻过滤步骤被用来排除分子量大于40kDa的杂质。优选地，大小排阻过滤器被用来排除分子量介于40kDa至300kDa的杂质。更优选地，所述大小排阻过滤器具有50kDa至150kDa的截流分子量。在本发明的另一实施方案中，所述大小排阻过滤器的截流分子量为50kDa。在又一实施方案中，所述大小排阻过滤器的截流分子量为100kDa。
本发明的方法还可包括向凝血酶制备物施用到更多的层析步骤，例如离子交换层析和/或大小排阻层析。
在又一实施方案中，本发明的方法包括向凝血酶制备物施加热处理。优选地，所述热处理包括将所述凝血酶在60℃保持10小时。
在又一实施方案中，本发明的方法包括将凝血酶的pH降低至约5或更低。
在又一实施方案中，本发明的方法包括向凝血酶制备物施加电磁辐射。所述电磁辐射可以是γ辐射或UV辐射。
本发明包括大规模制备具有提高纯度凝血酶制备物的方法，包括将至少15L凝血酶制备物施加于大小排阻过滤器。在优选实施方案中，本发明涉及大规模制备具有提高纯度的凝血酶制备物的方法，包括将至少15L凝血酶制备物施加于大小排阻过滤器，其中所述15L凝血酶制备物中含有约300,000,000单位的凝血酶。
本发明还涉及凝血酶组合物，在一个实施方案中，所述凝血酶组合物基本上不含杂质。在其他实施方案中，所述凝血酶组合物基本上不含分子量大于40kDa的杂质。优选地，所述凝血酶组合物基本上不含分子量为40kDa至300kDa的杂质。
在又一实施方案中，本发明的所述凝血酶组合物是基本上纯的。优选地，所述凝血酶组合物基本上不含因子Va。更优选地，因子Va的存在量低于0.4μg/1000单位凝血酶。此外，可通过因子Va活性分析，ELISA，或Western印迹测定因子Va的量。
在本发明的其他实施方案中，所述凝血酶组合物具有大于1800u/mg蛋白的比活性并基本上不含分子量大于40kDa的杂质。本发明的所述凝血酶组合物可具有介于约1800至3000u/mg蛋白的比活性。优选地，所述凝血酶组合可具有介于约2400至2500u/mg蛋白或介于约2500至2600u/mg蛋白，介于约2600至2700u/mg蛋白，介于约2700至2800u/mg蛋白，介于约2800至2900u/mg蛋白或介于约2900至3000u/mg蛋白的比活性。此外，所述凝血酶组合物还可具有大于3000u/mg蛋白的比活性。
本发明还涉及基本上不含病毒介质的凝血酶组合物。本发明的所述凝血酶组合物可基本上不含病毒介质，其中每种病毒的对数下降值大于3.5。
本发明还涉及包括具有较高纯度和较高比活性的凝血酶的稳定制剂以及制备和使用这类制剂的方法。即使所述制剂的稳定性随着凝血酶纯度的增加而降低，本发明人依然发现了包含具有较高纯度和较高比活性的凝血酶的稳定制剂。
本发明的稳定的凝血酶制剂包括凝血酶以及至少一种药物可接受的赋形剂。
本发明的稳定的制剂可包括从任意来源，包括但不限于，牛和人来源分离的凝血酶。除此之外，所述凝血酶可以是任意的凝血酶制备物或组合物，例如本发明的纯化的凝血酶组合物或目前可商业获得的
Figure A200680018392D00151
在优选实施方案中，所述凝血酶具有较高程度的纯度和较高的比活性。
除凝血酶之外，本发明所述的稳定凝血酶制剂还包括赋形剂。在某些实施方案中，适于本发明所述制剂的赋形剂包括，但不限于，甘油；聚乙二醇；盐；水溶液，例如水，酸和碱或其组合。
优选地盐包括，但不限于，氯化钠，乙酸钠，柠檬酸钠或其组合。
适合的酸和碱包括，但不限于，盐酸或氢氧化钠。优选地，本发明所述制剂具有的pH为5-9或更优选地pH为6-8。
优选地，本发明所述的稳定的凝血酶制剂包括20-40％体积的甘油，1-20％体积的聚乙二醇，0.15-0.3M浓度的氯化钠以及0.025-0.05M浓度的乙酸钠。
在本发明的优选实施方案中，本发明所述的稳定的凝血酶制剂包括纯化的凝血酶；甘油；聚乙二醇；氯化钠；乙酸钠且pH为6-8。
在某些实施方案中，本发明所述的稳定的凝血酶制剂是液体的。或者，本发明所述的稳定的凝血酶制剂可以是固体，其中，在施用之前，将所述稳定的，固体凝血酶制剂溶解或悬浮于液体中。
除此之外，本发明还涉及施用本发明所述稳定的凝血酶制剂的方法。优选地，本发明所述的稳定的凝血酶制剂可局部施用或施用于体腔的表面。
本发明还涉及包括本发明所述稳定的凝血酶制剂的药剂盒。在本发明的某些实施方案中，所述药剂盒包括稳定的凝血酶制剂；能够容纳所述凝血酶制剂的小管；以及针。
在本发明的其他实施方案中，药剂盒包括凝血酶制剂以及能够喷射所述凝血酶制剂的装置。适合的喷射装置包括，但不限于，喷嘴或喷射泵。
本发明涉及保持至少其60％原始效力达2年的稳定的凝血酶制剂。在优选实施方案中，所述制剂能够保持至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％的原始效力。本发明特别地涉及在3个月后保持至少其80％，85％，90％或95％原始效力，在6个月后能够保持至少其70％，80％，85％或90％，95％原始效力，在9个月后能够保持至少其70％，80％，85％，90％或95％原始效力，在12个月后能够保持至少其70％，80％，85％，90％或95％原始效力，以及在18个月后能够保持至少其60％，70％，80％，85％，90％或95％原始效力的制剂。本发明还涉及保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％初始标签宣称效力达两年的稳定的凝血酶制剂。本发明涉及在3个月后能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％初始标签效力，在6个月后能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％初始标签效力，在9个月后能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％初始标签效力，在12个月后能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力，在18个月后能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力的制剂。
4.附图说明
图1所示为如本发明所述方法，用来制备凝血酶制备物的全部步骤的流程图。
图2所示为在作为当前制造的(泳道4和5)与加入本发明所述纯化步骤之后(泳道7，8和9)的
Figure A200680018392D00171
以及示出了高分子量的杂质(泳道11)的大小排阻过滤滞留物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)比较图。
图3所示为制备本发明所述稳定的凝血酶制剂的方法。
5.发明详述
本发明是基于这样的发现，即可单独使用大小排阻过滤或与其他凝血酶纯化的纯化步骤组合使用，比现有技术的凝血酶纯化方法提供了更显著的益处。由于基本上去除或清除了高分子量的杂质，本发明中纯化凝血酶的方法提供了明显更纯和更安全的凝血酶。本发明的方法还提供了较高程度的病毒清除并具有一致性，可靠性且简便易用。
本发明包括向凝血酶制备物施加纯化步骤并回收所纯化的凝血酶。这些步骤包括，但不限于，层析纯化；将所述凝血酶制备物施加于大小排阻过滤器；向离子交换过滤器施加所述凝血酶制备物；降低pH；或采用电磁辐射辐射所述凝血酶制备物。虽然本发明是基于发现了大小排阻过滤的使用，但这样的纯化步骤依然能够独立或组合进行应用。
除此之外，所述方法能够应用于大规模，商业性的生产和纯化。本发明的方法能够生产大量基本上不含分子量大于40kDa，以及病毒介质的杂质的凝血酶。
本发明还包括向凝血酶中加入一种或多种赋形剂，从而得到比现有可获得的凝血酶制剂更稳定的凝血酶制剂。同样地，本发明解决了现有技术中凝血酶制剂的许多问题。不想为任意特定的理论所束缚，稳定本发明所述高度纯化的凝血酶组合物的能力可以导致一致性和有效的处理。优选地，本发明的稳定的凝血酶制剂包括具有较高纯度和比活性的凝血酶以及至少一种药物可接受的的赋形剂。本发明还包括液体的，稳定的凝血酶制剂。
5.1 凝血酶的来源
来自于任意来源的凝血酶都可以用于本发明的组合物，制剂及方法中。适合使用于本发明组合物，制备物和方法的凝血酶来源的示例包括，但不限于从牛或人来源分离的凝血酶。同样，商业来源的凝血酶，例如Thrombin 
Figure A200680018392D00181
也可用于本发明之中。
同样，任意纯度水平的凝血酶或得自任意制备物的凝血酶都可以使用。例如，如本文所述的纯化之前的凝血酶可用于本发明的组合物，制剂和方法中。此外，从天然或重组制备物中得到的凝血酶也可适用于本发明。
5.2 凝血酶的纯化
本发明包括制备由于杂质，例如因子Va，朊病毒和病毒颗粒的杂质水平较低从而具有提高的纯度，增加的比活性以及增加的安全性的凝血酶的方法。
在某些实施方案中，与
Figure A200680018392D00182
或其他纯化的凝血酶相比，本发明的方法能够将凝血酶制备物的纯度提高超过30％，超过50％，超过75％或超过90％。
另一种定量纯度的方法是通过测定凝血酶的比活性完成的。可通过本领域公知的标准分析方法，包括凝固分析和显色分析来测定凝血酶的比活性(参见，例如，Gaffhey等人，1995，Thromb Haemost74：900-903)。
在一个实施方案中，本发明的方法提供了这样的凝血酶制备物，与纯化之前的凝血酶相比，其中所述凝血酶制备物的比活性增加了至少1000％，至少1200％，至少1500％或至少1800％。本发明的凝血酶组合物具有较高的比活性；优选地本发明所述凝血酶组合物的比活性超过1800u/mg蛋白。
本发明所述的本发明的方法提供了比活性介于约1800u/mg至3000u/mg，更优选为介于约1800u/mg至2400u/mg的凝血酶制备物。在其他实施方案中，所述比活性介于约2400u/mg至2500u/mg，介于约2500u/mg至2600u/mg，或介于约2600u/mg至2700u/mg，介于约2700u/mg至2800u/mg，介于约2800u/mg至2900u/mg或介于约2900u/mg至3000u/mg蛋白。在某些实施方案中，所述凝血酶的比活性大于3000u/mg。优选地，经过大小排阻过滤之后，所述比活性从≥约1500u/mg提升至≥约2300u/mg。
使用本发明的某些方法，病毒介质和/或高分子量杂质降低至少50％，至少60％，至少75％，至少80％，至少85％。至少90％，至少95％，或至少99％。在优选实施方案中，在所述凝血酶制备物中的高分子量杂质和/或病毒颗粒杂质降低至少80％。
本发明还提供了纯化凝血酶的方法，包括排除分子量大于凝血酶的分子。本发明提供了纯化凝血酶的方法从而消除了至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％和至少99％分子量大于凝血酶的杂质。在达到消除较高分子量杂质的过程中，所希望的是达到回收至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％的凝血酶。
同样，在本发明所述方法的某些实施方案中，凝血酶的回收也大于80％，大于85％，大于90％，或大于95％。
本发明的方法包括向凝血酶制备物施加纯化步骤并回收所述纯化的凝血酶。本发明的纯化步骤包括将凝血酶制备物施加于大小排阻过滤器；层析纯化；向离子交换过滤器施加凝血酶制备物；降低pH；或采用电磁辐射辐射所述凝血酶制备物。这样的步骤可单独或组合实施。
5.2.1 大小排阻过滤和层析
如本发明的方法所述，可使用涉及基于分子量的分离技术通过排除杂质来完成对凝血酶制备物的回收和纯化。在一般情况下，可以使用涉及基于分子量来进行分离的任意方法，包括大小排阻过滤和层析。在某些实施方案中，本发明的方法使用的是大小排阻过滤，优选的情况是过滤器的孔大到足以允许凝血酶分子通过，却又小到足以截留住众多杂质，包括较大的蛋白杂质和病毒。
因为凝血酶的分子量为约40kDa，优选的情况是，在某些实施方案中，本发明的方法包括将凝血酶制备物施用于能够从所述凝血酶制备物中排除分子量超过40kDa杂质的大小排阻过滤器。在优选实施方案中，所述大小排阻过滤器能够排除分子量介于40kDa至300kDa的杂质。
因此，可使用分子量截留值，即，大小排阻限，为50，100，150，300kDa或更大的大小排阻过滤器。在一个实施方案中，所述大小排阻过滤器的分子量截留值介于40kDa至300kDa。在其他实施方案中，所述大小排阻过滤器的分子量截留值介于50kDa至300kDa。在又一实施方案中，所述大小排阻过滤器的分子量截留值介于50kDa至150kDa。在优选实施方案中，所述大小排阻过滤器的分子量截留值为50kDa。在更优选的实施方案中，所述大小排阻过滤器的分子量截留值为100kDa。这一步骤还可任选包括实施等容渗滤(diafiltration)从而使凝血酶的回收最大化。
在优选实施方案中，所述大小排阻过滤器具有分子量截留值为约100kDa的孔径。优选地，适合于本发明的大小排阻过滤器同样可以有效地降低细菌剂和内毒素。
在某些实施方案中，大小排阻过滤器是由改性的聚醚砜在高度多孔的聚烯烃支持物上制成的。同样，所使用的过滤器也可以是切向流过滤器。可用于本发明的一种过滤器示例是由PALL FILTRON公司生产的OmegaTM 100K VR。
其他可适用于本发明的大小排阻过滤器包括，但不限于，Millipore公司生产的Viresolve/70；A/G Technology公司生产的VirA/Gard 500以及由Pall公司生产的Ultipor DV20。
采用大小排阻过滤器，大分子，包括病毒杂质都被滤膜上的孔截留住了。所述滤膜可以在使用后丢弃或者，换言之，所述滤膜可重复使用。获得足够高log降低的滤膜是可以考虑被接受的，并可进行使用。每一个log降低都意味着90％的降低。还可以在所述过滤器上进行其他检测从而确保所述过滤器具有可接受的孔径范围。在本发明方法的某些实施方案中，病毒清除具有超过3.5，优选为超过4.0，更优选为超过4.5的log降低值(LRV)。在某些实施方案中，朊病毒清除具有超过3.5，优选为超过4.0，更优选为超过4.5的log降低值(LRV)。
在本发明的某些实施方案中，向大小排阻过滤器施加50ml，100ml，150ml，200ml，250ml，300ml，350ml，400ml，450ml，500ml，其倍数体积，或更多体积的初始体积。本发明还包括向大小排阻过滤器施加至少300ml凝血酶制备物的方法。
本发明还包括适用于大规模，商业化纯化凝血酶的方法，包括向大小排阻过滤器施加至少40L凝血酶制备物，优选为向大小排阻过滤器施加至少60L凝血酶制备物，最优选为向大小排阻过滤器施加至少90L的凝血酶制备物。在某些实施方案中，向所述大小排阻过滤器所施加的凝血酶制备物的体积取决于所用过滤器的表面积和/或所用过滤器的数量。在本发明的优选实施方案中，向大小排阻过滤器施加40L-60L，60L-80L，80L-100L，大于100L，或更多以及其倍数的初始体积。
本发明的某些方法特别适合于大规模的凝血酶纯化。同样地，在本发明的优选实施方案中，可向大小排阻过滤器施加15L-20L及其倍数的初始体积。在一个实施方案中，当向所述大小排阻过滤器施加15L凝血酶制备物时，所述凝血酶制备物包括300,000,000单位的凝血酶。
5.2.2 离子交换层析
无论是单独使用或与大小排阻过滤一同使用，离子交换过滤的使用都能够为凝血酶纯化提供实质性的益处。离子交换过滤提供了较高程度的病毒清除并具有一致性，可靠性且简便易用。
在某些实施方案中，本发明的方法还可进一步地包括向离子交换过滤器施加所述凝血酶。离子交换过滤是一种根据其电荷性质对溶质进行过滤的分离方法。离子交换过滤器在离子交换滤膜上含有电荷中心。当样本通过过滤器时，样本中荷电的化合物会被吸附至所述滤膜的电荷中心上。选用具有正电荷的过滤器会且其能够过滤掉来自于所述凝血酶制备物中荷电的蛋白质和病毒杂质。与所述过滤器具有相同净电荷的病毒不会与树脂结合并会在贯通过程中得以清除。
用于本发明的离子交换过滤器优选是荷正电的，而通常用于凝血酶纯化的离子交换层析树脂则是荷负电的。离子交换过滤器可有效地去除核酸。在优选实施方案中，离子交换过滤器具有季铵侧基。可与本发明一同使用的优选的离子交换过滤器是由Pall公司生产的MstangTM Q过滤器。其他可使用的离子交换过滤器是Cuno Zeta PlusVR05。
5.2.3 热处理
适当加热的实施也是可用于本发明中对凝血酶进行纯化的方法的一个适合步骤。适当加热的实施可单独使用或与大小排阻过滤或层析以及本文中所讨论的任一其他纯化步骤共同使用。可以向凝血酶施加任一类型，来自任一来源，持续任一时间长度的加热，只要病毒杂质被灭活而凝血酶还能够保持较高的比活性。
在某些实施方案中，可将凝血酶加热至40℃-100℃。在优选实施方案中，所述凝血酶被加热至约60℃。可对所述凝血酶实施任一长度或时间的热处理。例如，可对凝血酶加热1-60分钟或可对凝血酶加热1，2，3，4，5，6，7，8，9或10小时。在优选实施方案中，可使用对凝血酶进行10小时60℃的热处理。
5.2.4 pH 调节
其他可用于本发明方法的纯化步骤还可以是调节凝血酶的pH。可将凝血酶的pH调节至任一水平，只要所得的凝血酶组合物具有较低量的病毒杂质。例如，降低凝血酶的pH可有效地灭活病毒杂质。在某些实施方案中，凝血酶的pH被调节至低于约5或低于约4。然而，降低所述凝血酶的pH也会导致凝血酶活性的部分丧失。
5.2.5 电磁辐射
可用于本发明方法的又一种纯化步骤是实施γ或者电磁辐射，或UV光。对凝血酶实施的辐射可以是单独进行的或可以与本说明书所述的任一其他纯化步骤共同进行。
本发明的发明人发现电磁辐射和γ辐射是强大的且有力的病毒灭活工具。据报道，γ辐射可有效地抗多种病毒。然而，在商业可获得凝血酶的情况中，只能获得低于70％的回收率。
UV光的实施可以是单独进行的或者与本发明的其他纯化步骤共同进行的，且其可同样是有效的病毒灭活程序。然而，采用这种方法同样也会观察到凝血酶活性的某些丧失。本发明人注意到较短的暴露阶段可能会使得活性的丧失有所降低。
5.3 纯化的凝血酶制备物/制剂
本发明还涉及通过上述方法纯化的凝血酶组合物。本发明的凝血酶组合物具有提高的纯度，较高的比活性和较低的杂质水平，包括较低水平的杂质，例如，因子Va，朊病毒和病毒颗粒。
本发明的凝血酶组合物具有较高的比活性；优选地，本发明所述凝血酶组合物的比活性大于1800u/mg蛋白。本发明包括比活性介于约1800u/mg至3000u/mg，更优选为介于约1800u/mg至2400u/mg的凝血酶组合物。在其他实施方案中，所述比活性介于约2400u/mg至2500u/mg，介于约2500u/mg至2600u/mg，或介于约2600u/mg至2700u/mg，介于约2700u/mg至2800u/mg蛋白，介于约2800u/mg至2900u/mg蛋白或介于约2900u/mg至3000u/mg蛋白。在某些实施方案中，所述凝血酶具有大于3000u/mg的比活性。
同样地，本发明的所述凝血酶组合物也基本上不含高分子量的杂质，包括，因子Va，细菌介质，朊病毒和病毒介质。正如在本说明书中所使用的，“基本上不含”高分子量杂质的组合物是指该组合物含有低于约5-20％重量比，优选为低于约15％重量比，更优选为低于约10％重量比的杂质。正如在本说明书中所使用的，“基本上是纯的”组合物含有低于5％重量比的高分子量杂质，且最优选为含有低于约3％重量比的高分子量杂质。
在优选实施方案中，本发明的凝血酶组合物基本上不含分子量大于40kDa的杂质。在其他实施方案中，所述凝血酶基本上不含分子量介于40kDa-300kDa的杂质。高分子量杂质的示例包括因子Va(重链(分子量＝105kDa)以及轻链(分子量＝71kDa/74kDa))以及牛血清白蛋白(BSA；分子量＝66kDa)。
在又一个具体的实施方案中，本发明提供了基本上不含病毒颗粒杂质的凝血酶组合物。病毒颗粒杂质同样也是高分子量杂质的示例。可通过本发明方法去除的病毒包括，但不限于，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，假狂犬病毒(PRV)，脑心肌炎病毒(EMCV)，牛细小病毒(BPV)，狗细小病毒(CPV)，刺鱼病毒(SBV)，蜱媒脑炎病毒(TBEV)，马鼻病毒1(ERV-1)，人免疫缺陷病毒1(HIV-1)，甲肝病毒(HAV)，乙肝病毒(HBV)以及丙肝病毒(HCV)。可通过多种基于抗体的分析，包括ELISA以及基于核酸的分析，包括PCR以及杂交分析来测定病毒。
在具体的实施方案中，本发明提供了基本上不含因子Va的凝血酶组合物。在一些实施方案中，因子Va被降低了至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％。在本发明的某些实施方案中，在经过大小排阻过滤之后，因子Va在浓缩的样本中(在其稀释成最终制剂之前)几乎不被检测到且通常在最终制剂中也完全检测不到。
在其他实施方案中，因子Va的量被降低到低于0.4，低于0.35，低于0.3，低于0.25，低于0.2，低于0.15，低于0.1，低于0.02μg/1000单位凝血酶或任一其他现有技术检测不到的量。
优选地，可通过本领域公知的常规方法，例如，层析方法，包括凝胶电泳，因子Va活性分析以及基于抗体的分析方法来确定因子Va的不存在或降低的水平。
在优选实施方案中，本发明的凝血酶组合物具有高于1800u/mg蛋白的比活性并且基本上不含高分子量的杂质。
经过本发明方法纯化的凝血酶可被进一步配制以适于临床使用。本发明的凝血酶制剂优选地比现有可获得的凝血酶制剂更稳定。此外，在某些实施方案中，本发明所述的稳定的凝血酶制剂是液体的。
在某些实施方案中，本发明所述的稳定制剂包括：凝血酶，其中所述凝血酶基本上不含杂质；以及至少一种药物可接受的赋形剂。在这样的实施方案中，所述凝血酶是牛凝血酶。
在某些实施方案中，本发明的稳定制剂包括凝血酶，至少一种聚合物，至少一种醇，至少一种盐和将所述pH调节至所希望范围内的适量酸和/或碱。
在一个实施方案中，本发明的稳定制剂包括凝血酶，甘油，聚乙二醇，乙酸钠和氯化钠以及调节pH至5-8的盐酸或氢氧化钠或这二者。
在优选实施方案中，本发明的稳定制剂包括凝血酶，约30体积％的甘油，约10体积％的聚乙二醇，0.025-0.05M浓度的乙酸钠和0.15-0.3M浓度的氯化钠以及调节pH至6-7的盐酸或氢氧化钠或这二者。
本发明的纯化凝血酶可以在配制和/或灭菌处理之前在0-10℃保存直至48小时。在优选实施方案中，使用0.2微米无菌过滤器获得灭菌的本发明制剂。在未进行灭菌处理的条件下，本发明的制剂可在25℃保存直至2年。本发明涉及能够保持至少其60％原始效力达2年的稳定的凝血酶制剂。在优选实施方案中，所述制剂能够保持其至少65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的原始效力。本发明特别地涉及在3个月后能够保持至少其80％，85％，90％或95％原始效力，在6个月后能够保持至少其70％，80％，85％，90％或95％原始效力，在9个月后能够保持至少其70％，80％，85％，90％或95％原始效力，在12个月后能够保持至少其70％，80％，85％，90％或95％原始效力，以及在18个月后能够保持至少其60％，70％，80％，85％，90％或95％原始效力的制剂。本发明还涉及能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签所宣称效力达两年的稳定的凝血酶制剂。本发明涉及在3个月后能够保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力，在6个月后保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力，在9个月后保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力，在12个月后保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力，在18个月后保持至少其70％，75％，80％，85％，90％或95％原始标签效力的制剂。
5.3.1 赋形剂
适合的药物可接受的赋形剂包括辅助稳定本发明凝血酶制剂的任一赋形剂。适用于本发明的所述药物可接受的赋形剂可作为稀释剂，缓冲剂，稳定剂，表面活性剂，螯合剂，防腐剂发挥作用。
适合的药物可接受赋形剂包括，但不限于，水性液体，例如水，酸和碱；有机溶剂，例如醇；聚合物；盐或其组合。
适合的酸包括，但不限于，盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，甲酸，乙酸，柠檬酸以及磷酸。优选的酸是盐酸。
适合的碱包括，但不限于，氢氧化钠，氢氧化钾和氢氧化铵。优选的碱是氢氧化钠。
包含于本发明所述稳定的，液体凝血酶制剂中的酸和碱可用来调节所述稳定的，液体凝血酶制剂的pH。可将本发明所述稳定的，液体制剂的pH调节至稳定本发明所述凝血酶制剂的任意pH。在某些实施方案中，所述凝血酶制剂的pH为4-9。优选地，本发明所述凝血酶制剂的pH为5-8。更优选地，本发明所述凝血酶制剂的pH为5.5-7.7。在一个实施方案中，本发明所述凝血酶制剂的pH为6.7±0.1。
适合的醇包括，但不限于，多羟基醇，例如甘油，乙二醇，丙二醇，丁二醇，1，6-己二醇，新戊二醇，二甘醇，三甲醇基丙烷(trimethylolpropane)和季戊四醇；优选的醇是甘油。
在本发明所述稳定的，液体凝血酶制剂中的醇的量可以是0-80体积％。在某些实施方案中，醇的量，例如甘油为10-50体积％。在优选实施方案中，醇的量，例如甘油，为20-40％，25-35％或30体积％。
适合的聚合物包括，但不限于，聚乙二醇，苯乙烯-异丁烯-苯乙烯，聚氨酯，硅酮，聚酯，聚烯烃，聚异丁烯，乙烯-α烯烃共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物，卤乙烯聚合物，聚乙烯醚，聚偏二卤乙烯，聚丙烯腈，聚乙烯酮，聚乙烯芳香族化合物，聚乙烯酯，乙烯单体的共聚物，乙烯单体和烯烃的共聚物，聚酰胺，醇酸(alkyd)树脂，聚碳酸酯，聚甲醛，聚酰亚胺，聚醚，环氧树脂，聚氨酯，人造丝-三乙酸酯，纤维素，乙酸纤维素，丁酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，玻璃纸(cellophane)，硝酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素醚，羧甲基纤维素，胶原，几丁质，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚环氧乙烷共聚物(polylacticacid-polyethylene oxide copolymers)，EPDM橡胶，氟硅氧烷，多糖，磷脂或其组合。优选的聚合物是聚乙二醇。特别优选的聚合物是聚乙二醇200-400。
在本发明所述稳定的，液体凝血酶制剂中的聚合物的量可以是0-50体积％。在某些实施方案中，聚合物，例如聚乙二醇的量为1-30体积％。在优选实施方案中，聚合物，例如聚乙二醇，的量为1-20％或5-15％或10体积％。
适合的盐包括，但不限于，氯化或溴化钙，钾或钠等；乙酸钙，钾，铯或钠；柠檬酸钾，铯或钠；硝酸钾，铯或钠；甲酸钾，铯或钠。优选的盐是乙酸钠和氯化钠。
在本发明制剂中的盐的浓度可以是0-0.5M。在某些实施方案中，盐浓度可以是0.01-0.45M。在其他实施方案中，所述盐浓度可低于0.3M。在优选实施方案中，所述盐是氯化钠和乙酸钠的组合，其中氯化钠的浓度为0.15-0.3M且乙酸钠的浓度为0.025-0.05M。其他优选的氯化钠范围为0.28-0.32M。
5.4 效力检测
可使用本领域公知的分析方法对凝血酶的效力进行检测，或测定其活性。曾经这样的方法是基于对凝固时间的测定。凝固时间测定可通过使用ACL7000凝固计时器来确定。可使用标准曲线凝固时间的双对数回归对u/ml作图，将所测定的凝固时间转化成u/ml。将u/ml值乘以稀释因数可得到所述样本的实际效力。由于包括吸取技术，不同ACL机器，以及所检测样本粘度等因素的组合，分析结果会有一定程度的可变性。
5.5 药剂盒与施用
本发明还包括含有本发明所述稳定凝血酶制剂的药剂盒。所述药剂盒可包括容纳有本发明所述稳定凝血酶制剂的小管。在所述小管中，所述的稳定的凝血酶制剂应该满足以下产品说明：
Figure A200680018392D00291
在某些实施方案中，本发明的药剂盒包括稳定的
凝血酶制剂，能够容纳凝血酶制剂的小管；以及针。该药剂盒还可以包括至少一种海绵。
在其它实施方案中，本发明的药剂盒是喷射药剂盒，其中药剂盒含有稳定的凝血酶制剂和能够喷射凝血酶制剂的装置。合适的喷射装置包括喷嘴或者喷射泵以及致动装置。另外，喷射药剂盒还可以包括针。
连同喷射药剂盒，稳定的凝血酶制剂还可以含有小管。包括在喷射药剂盒中容纳稳定的、液体凝血酶制剂的小管应该满足以下产品说明：
Figure A200680018392D00301
本发明还涉及制备稳定的凝血酶制剂的方法。在某些实施方案中，制备稳定的凝血酶制剂的方法包括：(a)增加凝血酶的纯度；以及(b)向纯化的凝血酶中添加至少一种药学可接受的赋形剂。
制备本发明的稳定的制剂的方法还可以包括用酸或者碱调节pH值。
图3是描述了本发明制备稳定的凝血酶制剂的方法的流程图。在制备具有提高纯度和比活性的凝血酶组合物后，向纯化的凝血酶中添加28-33体积％的甘油，和7-11体积％的、分子量在200-600之间的聚乙二醇。添加氯化钠和乙酸钠直至(poly-lined)的容器中。在约0-15℃将磨碎的肺悬浮于稀释的氯化钠中并提取约12-72小时。将肺悬液过滤通过粗织物和/或，或者进行离心，并收集液体提取物。
在保持搅拌的条件下，向每升肺提取物中加入大约100ml含有50％氢氧化镁凝胶的悬液并彻底混合。将悬液离心，或者通过过滤器辅助手段进行过滤，并将离心液或滤液收集起来。在约0-15℃的搅拌条件下，向每升肺提取物中加入约1升的冷却饱和硫酸铵并混合约15-480分钟对所吸附的肺提取物进行分馏。通过离心，或者通过使用过滤器辅助手段进行过滤收集不溶性的浆糊。
以每升初始肺提取物对应约0.25-1L冷的稀氯化钠的量对所述浆糊进行再次溶解。在约0-15℃的搅拌条件下，向每升溶液加入约1升的冷却饱和硫酸铵，并混合约15-480分钟对所分馏的肺提取物进行再次沉淀。通过离心，或者通过使用过滤器辅助手段收集不溶性的浆糊。将第二次的浆糊再次溶解于冷的稀氯化钠溶液中并通过过滤进行澄清。
在适当的超滤系统中将促凝血酶原激酶溶液浓缩至其原始体积的约10-50％并随后通过等容渗滤去除可检测到的硫酸铵。超滤是这样一种过程，其中通过实施水压将溶质分子量远远大于溶剂的溶液与所述溶质分离开来。所述水压迫使所述溶剂通过适当的滤膜并浓缩所述溶质。
通过加入8倍或更多倍体积的0.05M NaCl实施等容渗滤或直到所述透过物穿过氯化钡检测。等容渗滤是采用连续加入溶剂通过超滤从大分子溶液中分离小分子溶质的方法。所述浓缩物可随后进一步地任选浓缩并完成超滤。可使用若干升冰冷的稀氯化钠润洗所述超滤系统并将这样的洗液加入到浓缩物中。可使用稀盐酸或稀氢氧化钠将所述浓缩物的pH调节至约7.0。将所得的促凝血酶原激酶保存于-15℃或温度更低的密封塑料容器中。
可以冷冻或冷藏的罐车方式接受柠檬酸处理的新鲜的牛血浆。如果接受到的是冷冻的血浆，则所述血浆通常是以冷冻形式保存的直至融解待用。融解的血浆保存于0-10℃的不锈钢罐中。可使用缓冲的乙酸将所述血浆的pH调节至约6.6-6.8并保持约3-30小时。在保持时间结束之时，所述血浆会变得澄清。使用氢氧化钠溶液将所述澄清的血浆调节至pH 6.9-7.2。
凝血酶原的制备：在搅拌的条件下，在约0-10℃的温度下，向每升牛血浆中加入约1.5-2.5(干重)g的离子交换树脂并混合0.5-6小时，与此同时将pH控制在约6.9-7.2。将所得的悬液过滤或离心从而收获所述树脂。在约pH 6.9-7.2的条件下用0.15-0.2摩尔的磷酸缓冲盐水彻底洗涤所述树脂并将其保存。
在约pH 6.9-7.2的条件下，使用0.5-1摩尔的磷酸缓冲盐水将凝血酶原从所洗涤的树脂上洗脱下来，过滤，将所述提取物保存并合并起来进行进一步处理。可使用的树脂包括，但不限于，DEAE-SephadexA-50，Macro-Prep DEAE Support，Macro-Prep High Q Support，Macro-Prep Q Support，UNOsphere Q离子交换，Capto Q，DEAE-Sepharose Fast Flow，Q SepharoseTM HP或其等价物。如果在超过滤前有需要的话，可将所合并的提取物进行粗过滤。用过的树脂可在后续的再生之前用酸处理并保存，并在类似的凝血酶原复合物制备过程中得以再次使用。
可在适当的超滤系统中将凝血酶原复合提取物浓缩至其原始体积的约10-50％，然后进行等容渗滤以去除不需要的盐。等容渗滤是首先通过向每升浓缩物中加入约2-5升冰冷的纯水进行的直到渗透物被去除，然后向每升浓缩物加入约2-5升冰冷的稀氯化钠直到渗透物被去除。然后对浓缩物进行进一步地任选浓缩，并完成超滤。使用若干升冰冷的稀氯化钠润洗所述超滤系统并将这样的洗液加入到所述浓缩物中。将所得的凝血酶原复合物保存在约-15℃或更低的温度的密封容器中。
将凝血酶原复合物在约35℃或更低的温度融解。通过加入含有足量氯化钙的纯水将凝血酶原复合物稀释至约1,000-5,000u/ml从而得到约0.005-0.03摩尔的终氯化钙浓度。在温和搅拌的条件下，与此同时向具有氯化钙的凝血酶原复合物中加入促凝血酶原激酶悬液。将所述pH调节至约7.3并混合约15-60分钟。然后在约15-30℃进行活化，将所述悬液冷却至约≤10℃。
凝血酶的活化与纯化：使用pH约6.6的稀柠檬酸钠缓冲液将活化的凝血酶原复合物稀释至约500-3,000u/ml。然后按照需要对所述材料进行再过滤。
通过加入稀盐酸或稀氢氧化钠将上述混合物的pH调节至约6.6。将活化的凝血酶原复合物加入被调节至pH为约6.6的阳离子交换树脂中。可使用的树脂包括，但不限于，Amberlite CG-50，Macro-Prep CMSupport，Macro-Prep High S Support，Macro-Prep S Support，UNOsphereS离子交换，SP SepharoseTM HP，Capto S树脂或其等价物。
使用pH6.6的稀柠檬酸钠洗涤柱子，然后使用约0.1-0.25摩尔的氯化钠进行洗涤从而去除应该被丢弃的低亲和性蛋白。这一步骤之后通过施加约0.5-1摩尔的氯化钠来洗脱纯化的凝血酶。将洗脱液按部分收集，并将所述部分按照进行中的分析要求进行合并。在整个过程中，未灭菌的大量体积可保存在约0-10℃直至约48小时。可通过加入进行冲洗的水，30％甘油，10％PEG和约0.15-0.3M的氯化钠将未灭菌的大量凝血酶配制成不低于约1000u/ml的浓度。使用稀盐酸或氢氧化钠将所配制凝血酶溶液的pH调节至pH为约6.7±1.0。在进行灭菌处理之前可将所配制的未灭菌的大量凝血酶保存在约0-10℃直至约48小时。
可通过将所配制的未灭菌的大量凝血酶通过无菌的，细菌保持的非纤维释放过滤器进入适合的无菌容纳罐中对其进行灭菌。所得产物是高度浓缩的具有分子量为约40kDa的α-凝血酶。样本具有≥1500u/mg蛋白的平均比活性。
此外，还使用离子交换层析纯化步骤进行了朊病毒清除的研究。所得结果说明通过凝血酶层析纯化步骤获得的朊病毒清除水平等于3.5log。
所使用的小规模柱子具有1.6cm的内径并装填了50.2cm高的树脂。所以所述柱床体积相当于约101ml。使用100ml的1M NaCl然后是100ml pH6.61的0.025M柠檬酸钠来平衡所装填的柱子。所述层析系统的流速设定为3.3ml/分钟。
掺加的(spike)样本由8ml 263K株系的瘙痒病仓鼠脑匀浆组成。将所述匀浆物超声波处理20分钟，然后过滤通过0.45，0.2和0.1μm的过滤器。在样本掺加之后，总共12ml被用于层析前的检测，留下了396ml的过柱前的掺加的样本(400+8-12ml)。
向平衡前柱子上样396ml掺加的粗凝血酶，用144ml 0.025M柠檬酸钠缓冲液进行洗脱直到洗脱液的吸收值低于0.4AU，然后用275ml0.2M NaCl洗脱直到洗脱液的吸收值低于0.2AU。然后使用0.65M NaCl洗柱子并将从吸收值达到2AU的时间开始直到其回落至2AU时间内的37ml纯化的凝血酶收集起来。
在进行朊病毒Western印迹分析之前将层析之前和之后的样本收集起来并保存在-60℃或更低的温度。结果如表1所示。
    表1
Figure A200680018392D00351
*总log10(PrPRES)＝最终滴度(log10(PrPRES/ml))+log10(样本体积(ml))
实施例2 使用大小排阻过滤进行病毒清除
用于本实施例中的滤膜是OmegaTM100K VR并且是“在赋予所完成滤膜以强度和刚性的高度多孔聚烯烃支持物上从改性的聚醚砜浇铸得来的”。理论上的分子量截留点是100kDa。只有在切向流过滤条件下才有可能通过小分子。大分子和病毒可通过大小排阻得以保留。对牛细小病毒(BPV)，一种非常小(20nm)的非包膜型病毒而言，其log降低值(LRV)被确定为超过了约3.5log。
在这一病毒清除研究中评定的凝血酶溶液是纯化前的凝血酶。所述样本通常具有大于约1500u/mg蛋白的比活性。所述蛋白浓度估计为约1.2％且盐浓度为约0.65M NaCl。这种凝血酶溶液的主要成分是具有活性的药物成分α-凝血酶，其具有约40kDa的分子量。
当选择将一组模式病毒包括于病毒清除研究时有几个方面是需要考虑的。一个方面是模式相关病毒必须具有明显的潜力能够污染初始材料。另一方面是所包括的病毒必须在模式病毒组中具有广谱的物理和化学特征，从而当病毒清除研究表现出对这些病毒具有较高的清除时，能够确保所述制备过程能够有效地清除不需要的病毒介质。
将牛细小病毒(BPV)考虑在内是相当重要的，因为这是一种能够明显污染初始材料的相关病毒，并且其极其微小，没有包膜，并对物理-化学处理极具抗性。异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及假狂犬病毒(PRV)和BPV一样也被包括在内。这一组病毒为相关病毒提供了模式病毒，并提供了广泛的物理和化学特征从而对这些病毒的清除能够说明所述制造过程也能够清除不需要的介质。这组病毒的特征如表2所示。
 表2 所选择的4种病毒的特征总结
 
病毒 基因组 包膜 科 大小(nm) 对物理化学剂的抗性
BPV DNA 无 细小病毒科 20-25 高
XMuLV RNA 有 逆转录病毒科 80-110 低
PRV DNA 有 疱疹病毒科 150-200 中等
BVDV RNA 有 黄病毒科 40-70 中等
对所考虑到的4种病毒中的每一种而言，都进行了两轮过滤：一次是在靶进料压力为8psi的条件下完成的，另一次是在靶进料压力为12psi。每一轮都是使用新的OmegaTM 100K VR滤膜进行的。
所有的轮次都是在较冷的房间进行的。每一轮次都由以5％(v/v)的四种病毒之一掺加到样本中，过滤通过0.45μm过滤器以除去任一的病毒聚合体，然后过滤通过Pall Omega 100K VR滤膜组成。在样本掺加之后，经过0.45μm过滤之后，以及经过Omega 100K VR滤膜过滤之后进行病毒检测。
凝血酶过滤由将约400ml纯化前的凝血酶过滤通过0.1ft2的Omega100K VR滤膜组成。在渗透物中收集了80％(320ml)初始凝血酶体积之后，所剩余的80ml滞留物中还含有除病毒和非凝血酶杂质之外的大量凝血酶。为了最大化凝血酶的透过率可对这80ml溶液进行连续的等容渗滤。这可以通过使用NaCl溶液以6倍所述体积(480ml)对这80ml溶液进行等容渗滤来实现。
终渗透物的体积因此是初始凝血酶样本体积的两倍。然后将这种渗透物的浓缩物通过10K VR滤膜盒变回所述体积并得到所希望水平的浓度。作为这一过滤的结果，所述终产物的纯度得到了极大的提高。例如，通过竞争性的酶联免疫吸附分析(cELISA)的测定，在终产物中所述比活性增加了超过30％而因子Va含量则降低至不可检测的水平。
通过大小排阻实现了病毒的去除(以及大分子去除)。在所考虑的4个病毒组(牛细小病毒，牛病毒性腹泻病毒，异嗜性小鼠白血病病毒和牛假狂犬病毒)中观察到了极高的log降低值。Omega处理后的凝血酶制品稳定性并未由于产物纯度的增加而被降低。
表3总结了8轮过滤的参数和条件。因为过滤前的凝血酶样本等于400ml而过滤器的表面积等于0.1ft2，所以凝血酶体积与过滤器表面积的比值为4L/ft2。病毒掺加的体积等于20ml/轮(5％v/v)。进料压力在第一轮维持在8±2psi，在第一轮维持在12±2psi。滞留物的压力在所有轮次中都为0±2psi。
    表3    8轮过滤的参数和条件的总结
Figure A200680018392D00371
对每一轮次而言，将420ml掺加的凝血酶样本过滤通过0.1ft2的OmegaTM 100K VR滤膜。当收集了340ml渗透物之后，使用6倍于所述体积的0.65M NaCl溶液对剩余的80ml滞留物溶液进行等容渗滤。因此总的渗透物体积为340+(6×80)＝820ml。这些过滤条件产生了可接受的凝血酶回收以及提高程度的凝血酶纯度。
在8psi开始的横向流速度为41-44ml/分钟。横向流过滤是这样一种操作方法，其中残留的液体在滤膜表面循环从而防止过滤材料在所述滤膜上的堆积。在12psi开始的横向流速度为54-56ml/分钟。对8psi的处理时间为236-257分钟。对12psi的处理时间为190-223分钟。对四种不同病毒的清除结果如表4所示。
   表4    病毒清除结果的总结
Figure A200680018392D00381
在对所有病毒重复轮次中所得的较高的清除值以及所得结果的相似性说明所述过滤步骤是相当有力的。除了BPV，其log降低值为3.74±0.39，以上所有病毒的平均log降低值都大于4。即使这一log降低值略为低于4log，在所使用的设定条件下这依然是很高的。
此外，使用大小排阻过滤步骤进行了朊病毒清除的研究。所得结果说明通过凝血酶过滤纯化步骤获得的朊病毒清除水平为3.6log。
掺加凝血酶样本之前的体积是400ml。
所掺加的样本由8ml 263K株系的瘙痒病仓鼠脑匀浆组成。将所述匀浆物超声波处理20分钟，然后过滤通过0.45，0.2和0.1μm过滤器。
在样本掺加之后，12ml被用于Omega过滤前的检测，留下了396ml的过滤前掺加的样本(400+8-12ml)。
所使用的过滤器是表面积为0.1ft2的Pall公司的OmegaTM100KVR滤膜。所以凝血酶体积与过滤器表面积的比值为4L/ft2。
将OmegaTM100K VR滤膜设置于所述过滤系统中并使用500ml纯水润洗。进行了使用前的完整性检测并通过了可接受的标准。然后使用100ml 0.65M NaCl以10psi的进料压力使滤膜达到正常条件。渗透物和横向流的速度，以有刻度的量筒计算，分别为约5和52ml/分钟。
开始进行初始396ml的掺加的样本的过滤。当收集了315ml过滤液(即，约80％的初始体积)时，使用总共475ml的0.65M NaCl(即，约6倍滞留物体积)对剩余的样本进行等容渗滤。在整个过滤过程中，进料压力保持在约10psi而滞留物压力为0psi。所述过滤条件是之前所示的能够产生可接受的凝血酶回收以及较高病毒清除的条件。
最终的过滤后体积是790ml且过程时间为172分钟。
在进行朊病毒Western印迹分析之前将过滤之前和之后的样本收集起来并保存在-60℃或更低的温度。结果如表5所示。
    表5
Figure A200680018392D00401
*总log10(PrPRES)＝最终滴度(log10(PrPRES/ml))+log10(样本体积(ml))
实施例3 使用离子过滤器进行病毒清除
首先使用具有10K MWCO和1ft2表面积的Pall过滤器对纯化的凝血酶进行浓缩。然后使用纯水将所浓缩的样本稀释至所希望的盐浓度。总共制备了15批次。全部批次制备的结果总结于表6和7。
 表6  各个轮次的平均回收百分率
 
轮次# 描述 回收％ BPV的Log降低
1，2 & 3 50mM NaCl，0.8％甘露醇，pH～5.5 74 ≥5.12±0.24
11，12 & 13 50mM NaCl，0.8％甘露醇，pH～7.0 76.9 NA
8，9 & 10 72mM NaCl，0.8％甘露醇，pH～7.0 90.8 NA
14，15 & 16 72mM NaCl，无甘露醇，pH～7.0 91.7 3.60±0.62
4，5 & 7 108mM NaCl，0.8％甘露醇，pH～7.0 99.8 1.25±0.55
Figure A200680018392D00411
首先将来自轮次1-3(50mM NaCl)的样本用于Mustang Q过滤器的病毒清除确证，并得到了针对于牛细小病毒(BPV)的极高的log降低值。然而，由于凝血酶回收率较低，平均仅有74％，使用了来自于轮次4，5和7(108mM NaCl)的样本重复了所述病毒清除研究，其得到了99.8％的平均凝血酶回收率但针对于BPV的log降低值却低于2。最终，使用来自轮次14，15和16(72mM NaCl以及91.7％)的样本重复了所述病毒清除研究，且所述针对于BPV的log降低值是可接受的(3.6±0.62)。
此外，还使用离子交换过滤器进行了朊病毒减少研究。所得结果表明通过凝血酶过滤纯化步骤获得的朊病毒清除水平大于3.9log。
掺加的凝血酶样本之前的体积为91ml。
掺加的样本由1.6ml 263K株系的瘙痒病仓鼠脑匀浆组成。将所述匀浆物超声波处理20分钟，然后过滤通过0.45，0.2和0.1μm过滤器。
将12ml用于Mustang Q过滤之前的检测，留下了80.6ml的过滤前掺加的样本(91+1.6-12ml)。
所使用的过滤器是表面积为0.35ml的Pall公司的Mustang Q过滤器。所以凝血酶体积与过滤器表面积的比值为230ml样本/ml过滤器。
可使用20ml 1N NaOH保持20分钟而无需滤片来对过滤器支架进行消毒。将Mustang Q过滤器放置于支架上，用20ml 1N NaOH洗涤然后用1M NaCl洗涤直到洗脱液的pH为中性为止。
然后使用25ml 72mM NaCl以约3ml/分钟的流速在对80.6ml掺加的样本进行实际的过滤之前使所述过滤器达到正常条件。
最终的过滤后体积是77ml且过程时间为49分钟。
在进行朊病毒Western印迹分析之前将离子过滤之前和之后的样本收集起来并保存在-60℃或更低的温度。结果如表8所示。
     表8
Figure A200680018392D00431
实施例4 各种条件下的大小排阻过滤
本实施例同样使用Pall Omega 100K VR过滤器进行大小排阻过滤。以8psi的进料压力进行了三个轮次并以12psi的进料压力进行了三个轮次。选择了按比例缩小的过滤器的参数从而使得体积与表面积的比值保持恒定，并确保操作是在特定的进料压力范围内进行的。
每一轮次都使用新的0.1ft2 Pall Omega 100K VR过滤器进行并且所有轮次都是在较冷的房间(≤约8℃)中进行的。所述系统中包括有流量计从而可以更好地监测过滤过程中的横向流。在进行使用之前将流量计在较冷的房间中进行校正。
表9总结了六轮过滤的条件和参数。对于8psi轮次而言，初始材料的凝血酶活性平均为22,091u/ml而对终过滤液混合物而言，其平均值为11,130u/ml。在经过6轮次等容渗滤循环之后所得的凝血酶回收百分率为平均86％。以8psi进料压力进行的轮次表明比以12psi进行的轮次具有略高的凝血酶回收率。
   表9  凝血酶过滤和回收结果的总结
 
轮次1 轮次2 轮次3 轮次4 轮次5 轮次6
靶进料压力 8 8 8 12 12 12
凝血酶体积(ml)        400 400 400 400 400 400
掺加的体积(ml)        20 20 20 NA NA NA
过滤前样本总体积(ml)  420 420 420 400 400 400
过滤前样本活性(ml)    22,696 24，177 19,399 21,559 21,559 20.747
过滤前样本总活性(u)  9,532,320 10,154,340 8,147,580 8,623,600 8,623,600 8,298,800
过滤后样本总体积(ml)  820 820 820 800 800 800
过滤后样本活性(u/ml)  10,405 13,210 9,776 8,631 9,940 8,923
过滤后样本总活性(u)  8,532,100 10,832,200 8,016,320 6,904,800 7,952,000 7,138,400
％凝血酶回收率   89.5 106.7 98.4 80.0 92 86
总处理时间 206 219 215 155 173.5 166
有一个区别在于当进料压力为12psi时，更高的横向流产生了更快的凝血酶通过，从而缩短了处理时间。
表10说明了对于8psi轮次而言，所述过滤步骤导致了凝血酶纯度或比活性具有36.4％的提高，对12psi轮次而言其提高为37.1％。所述比活性从在过滤前的样本中1688.4-1986.0凝血酶/mg蛋白增加到了过滤后样本中的2324.6-2690.1凝血酶/mg蛋白的范围。
        表10     OMEGA 100过滤前与过滤后样本的比活性
Figure A200680018392D00451
所述渗透物组分比其各自的初始凝血酶样本要清洁的多，如图2所示。通过对滞留物进行的过滤保留了在所述初始材料中观察到的几乎全部的高分子量杂质。
表11说明过滤步骤同样导致了因子Va含量的显著降低。在进行两个进料压力轮次中所得的平均降低是具有可比性的：在8psi轮次中为88.5％，在12psi轮次中为89.3％。因子V/Va是与患者在对手术暴露于局部的牛凝血酶时产生的凝血病相关的。现有的知识提示在牛凝血酶中的因子V/Va污染刺激患者产生抗牛因子Va的抗体，其能够与患者自身的因子Va交叉反应，从而导致受损的止血作用。这一过滤步骤提供了这样的益处，即在最终Thrombin-JMI
Figure A200680018392D0012112518QIETU
中基本上将因子Va的含量降低到了通过竞争性酶联免疫吸附分析(ELISA)也不能够检测到的水平。
    表11  通过ELISA测定的OMEGA 100过滤之前与过滤之后样本中因子Va的含量
Figure A200680018392D00461
实施例5 稳定的凝血酶制剂
表12所示为如本发明所述的稳定的纯化的凝血酶制剂。
  表12  稳定的凝血酶制剂
Figure A200680018392D00462
可根据图3所述的方法构建适于所述稳定的凝血酶制剂的凝血酶。通过加入进行冲洗的水，可将未灭菌的大量凝血酶组合物配制成不低于1,400单位/ml。然后加入大约30体积％的甘油。再加入约10体积％的200-400MW的聚乙二醇。加入氯化钠直到所述氯化钠的浓度为约0.15-0.3M，并加入乙酸钠直到所述乙酸钠的浓度为约0.025-0.05M。使用稀盐酸或稀氢氧化钠将所述凝血酶溶液的pH调节至6.7±0.1。
然后将所述稳定的，未灭菌的，凝血酶制剂放置于室温(23℃±2℃)进行稳定性检测，并在多个时间点上检测所述样本。将所述样本检测三次。用于分析凝血酶效力或活性的检测方法是基于凝固时间测定。用于确定凝固时间的机器是ACL 7000凝固计时器。将所述样本稀释至标准曲线范围的浓度之内并放置于机器的转子上。将人血浆也同样放置于机器的小杯上，并将血浆和稀释的凝血酶样本都在37℃进行孵育。然后将给定量的每一种血浆和稀释的凝血酶一同泵入并混合。混合之后，使光线通过所述血浆/凝血酶混合物，当凝块形成时，光线会发生散射。有一个检测器会检测所散射的光并将结果转化成凝固时间(秒)。然后使用标准曲线凝固时间对于u/ml的双对数回归将凝固时间转换成u/ml。最后，将所述u/ml值乘以稀释倍数从而获得了所述样本的实际效力。
表13所示为本发明的制剂在室温(23℃±2℃)经过6个月之后的稳定性结果。
表13  稳定的凝血酶制剂
 
样本 标签宣称 体积 初始效力 3mo. 6mo.
u/小管 ml/小管 u/ml u/ml u/ml
1 5,000 5 1,661 1,613 1,611
2 20,000 20 1,661 1,727 1,672
3 5,000 5 1,486 1,451 1,327
4 20,000 20 1,486 1,483 1,492
表14所示为配制成具有改善稳定性，未经过本发明所述纯化方法处理的凝血酶制剂。
     表14    稳定的凝血酶制剂
Figure A200680018392D00481
通过加入水进行冲洗，可将未灭菌的大量凝血酶组合物配制成不低于1,400单位/ml。然后加入大约30体积％的甘油。加入约10体积％浓度的200-400MW的聚乙二醇。加入氯化钠直到所述氯化钠的浓度为约0.15-0.3M，并加入乙酸钠直到所述乙酸钠的浓度为约0.025-0.05M。使用稀盐酸或稀氢氧化钠将所述凝血酶溶液的pH调节至6.7±0.1。然后将所述制剂放置于室温(23℃±2℃)进行稳定性检测，并以定期的时间间隔检测其效力。所述样本进行三次重复检测。
表15所示为在室温(23℃±2℃)经过24个月后的稳定性结果。
 表15  稳定的凝血酶制剂
 
样本 标签宣称 体积 初始效力 3mo. 6mo. 9mo. 12mo. 24mo. 作为24mo.   
u/小管 ml/小管   u/ml u/ml u/ml u/ml u/ml u/ml 初始效力的％
1 5,000 5 1,397 1,506 1,425 1,306 1,267 1,078 77.2
2 10,000 10 1,484 1,592 1,357 1,346 1,288 1,068 72.0
3 20,000 20 1,355 1,510 1,379 1,309 1,280 1,178 86.9
4 5,000 5 1,900 NA 1,717 1,644 1,768 1,502 79.1
5 5,000 5 1,765 NA 1,433 1,471 1,564 1,258 71.3
6 5,000 5 1,664 1,711 1,610 1,544 1,613 1,289 77.5
7 5,000 5 1,860 1,939 1,700 1,734 1,522 1,406 75.6
8 5,000 5 1,451 1,480 1,347 1,348 1,229 1,106 76.2
NA＝未测得
尽管给出了具体的实施例，这些依然仅是优选的实施方案，而且也旨在对本发明进行进一步解释和说明。其并非旨在对本发明的全部范围进行限制。
本文所引用的全部参考文献都是将其全文引用并出于全部目的用作本发明参考的，其程度就像将每一个单独的公开，专利或专利申请具体地且单独指名地全文引用作为参考以出于全部目的一样。凝血酶制剂，能够容纳凝血酶制剂的小管；以及针。该药剂盒还可以包括至少一种海绵。
在其它实施方案中，本发明的药剂盒是喷射药剂盒，其中药剂盒含有稳定的凝血酶制剂和能够喷射凝血酶制剂的装置。合适的喷射装置包括喷嘴或者喷射泵以及致动装置。另外，喷射药剂盒还可以包括针。
连同喷射药剂盒，稳定的凝血酶制剂还可以含有小管。包括在喷射药剂盒中容纳稳定的、液体凝血酶制剂的小管应该满足以下产品说明：
Figure A200680018392D00491
本发明还涉及制备稳定的凝血酶制剂的方法。在某些实施方案中，制备稳定的凝血酶制剂的方法包括：(a)增加凝血酶的纯度；以及(b)向纯化的凝血酶中添加至少一种药学可接受的赋形剂。
制备本发明的稳定的制剂的方法还可以包括用酸或者碱调节pH值。
图3是描述了本发明制备稳定的凝血酶制剂的方法的流程图。在制备具有提高纯度和比活性的凝血酶组合物后，向纯化的凝血酶中添加28-33体积％的甘油，和7-11体积％的、分子量在200-600之间的聚乙二醇。添加氯化钠和乙酸钠直至

Claims (69)

1.制备纯化的凝血酶的方法，所述方法包括：
(a)向能够排除分子量大于40kDa的杂质的大小排阻过滤器施加凝血酶制备物；以及
(b)回收所述纯化的凝血酶。
2.权利要求1的方法，其中所述凝血酶来源于牛。
3.权利要求1的方法，其中所述凝血酶来源于
Figure A200680018392C0002091016QIETU
。
4.权利要求1的方法，其中所述大小排阻过滤器能够排除分子量从40kDa至300kDa的杂质。
5.权利要求1的方法，其中所述大小排阻过滤器选自能够排除分子量为50kDa，100kDa或150kDa的杂质的过滤器。
6.权利要求1的方法，其中所述大小排阻过滤器选自能够排除分子量为50kDa的杂质的过滤器。
7.权利要求1的方法，其中所述大小排阻过滤器选自能够排除分子量为100kDa的杂质的过滤器。
8.权利要求1的方法，其中在所述回收的纯化凝血酶中的杂质降低至少50％。
9.权利要求1的方法，其中在所述回收的纯化凝血酶中的杂质降低至少80％。
10.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶的比活性增加至少1000％。
11.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶的比活性增加至少1200％。
12.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶的比活性增加至少1500％。
13.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶基本上不含杂质。
14.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶基本上不含有因子Va。
15.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶基本上不含朊病毒。
16.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶具有的朊病毒降低了至少3.5的log值。
17.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶基本上不含病毒介质。
18.权利要求1的方法，其中所述回收的纯化凝血酶基本上是纯的。
19.权利要求1的方法，还包括向离子交换过滤器施加所述回收的纯化凝血酶。
20.权利要求1的方法，还包括向层析纯化步骤施加所述回收的纯化凝血酶。
21.权利要求20的方法，其中所述层析纯化步骤包括离子交换层析柱。
22.基本上不含分子量大于40kDa的杂质的凝血酶组合物。
23.权利要求22的凝血酶组合物，其中所述凝血酶组合物基本上不含分子量介于50kDa至300kDa之间的杂质。
24.基本上不含有杂质的凝血酶组合物。
25.基本上是纯的凝血酶组合物。
26.基本上不含有因子Va的凝血酶组合物。
27.权利要求27的凝血酶组合物，其中因子Va是通过因子Va活性分析，ELISA，或Western印迹进行测定的。
28.权利要求27的凝血酶组合物，其中所述因子Va低于0.4μg/1000单位的凝血酶。
29.基本上不含病毒介质的凝血酶组合物，其中每种病毒的所述1og降低值大于3.5。
30.凝血酶比活性介于约1800至3000u/mg蛋白的凝血酶组合物。
31.权利要求30的凝血酶组合物，其中所述比活性在约1800至2400u/mg蛋白之间。
32.权利要求30的凝血酶组合物，其中所述比活性在约2400至2500u/mg蛋白之间。
33.权利要求30的凝血酶组合物，其中所述比活性在约2500至2600u/mg蛋白之间。
34.权利要求30的凝血酶组合物，其中所述比活性在约2600至2700u/mg蛋白之间。
35.权利要求28的凝血酶组合物，还包括赋形剂。
36.权利要求30的凝血酶组合物，还包括赋形剂。
37.权利要求1的方法，还包括向离子交换过滤器施加所述凝血酶制备物。
38.权利要求1的方法，还包括对所述凝血酶制备物施加热处理。
39.权利要求38的方法，其中所述热处理包括将所述凝血酶在60℃保持10小时。
40.权利要求1的方法，还包括将所述凝血酶制备物的pH降低至约5以下。
41.权利要求1的方法，还包括向所述凝血酶制备物施加电磁辐射。
42.权利要求41的方法，其中所述电磁辐射是γ辐射。
43.权利要求41的方法，其中所述电磁辐射是UV辐射。
44.权利要求1的方法，其中施加于所述大小排阻过滤器的凝血酶制备物的量为至少15L。
45.权利要求44的方法，其中所述凝血酶制备物含有至少300,000,000单位的凝血酶。
46.制备具有增加纯度的凝血酶的方法，所述方法包括：
(a)向层析纯化步骤施加所述凝血酶制备物；
(b)向大小排阻过滤器施加所述凝血酶制备物；
(c)向离子交换过滤器施加所述凝血酶制备物；以及
(d)回收纯化的凝血酶。
47.权利要求46的方法，其中所述层析纯化步骤包括离子交换层析柱或大小排阻层析柱。
48.权利要求36的制剂，其中所述制剂是液体的。
49.权利要求36的制剂，其中所述药物可接受的赋形剂是水，甘油，聚乙二醇或其组合。
50.权利要求49的制剂，其中所述甘油占20-40％的体积。
51.权利要求49的制剂，其中所述聚乙二醇占1-20％的体积。
52.权利要求49的制剂，其中所述赋形剂是氯化钠，乙酸钠，柠檬酸钠或其组合。
53.权利要求49的制剂，还包括酸或碱。
54.权利要求53的制剂，其中所述酸或碱是盐酸或氢氧化钠。
55.权利要求53的制剂，其中所述制剂的pH在5-9之间。
56.权利要求53的制剂，其中所述制剂的pH在6-8之间。
57.含有凝血酶组合物和至少一种赋形剂的稳定的液体凝血酶制剂，其中所述凝血酶组合物基本上不含杂质。
58.权利要求57的稳定的液体凝血酶制剂，其中所述制剂可在长达两年的时间内保持其初始效力的至少60％。
59.权利要求57的稳定的液体凝血酶制剂，其中所述制剂在长达两年的时间内保持其标签宣称效力的至少70％。
60.稳定的液体凝血酶制剂，其包括：
凝血酶组合物，其中所述凝血酶组合物基本上不含杂质；
甘油；
聚乙二醇；
氯化钠；
乙酸钠；且
其中所述制剂的pH在6-8之间。
61.施用权利要求57的稳定的凝血酶制剂的方法，所述方法包括局部施用所述稳定的凝血酶制剂。
62.施用权利要求57的稳定的凝血酶制剂的方法，所述方法包括：
将所述凝血酶制剂吸入注射器；
迫使所述凝血酶制剂通过所述注射器；
用所述凝血酶制剂淹没体腔的表面。
63.施用权利要求57的稳定的凝血酶制剂的方法，所述方法包括向体腔的表面喷射所述凝血酶制剂。
64.施用权利要求57的稳定的凝血酶制剂的方法，所述方法包括：
用所述凝血酶制剂浸透海绵；以及
将所述海绵施加于体腔的表面。
65.药剂盒，其包括：
权利要求57的稳定的凝血酶制剂；
能够容纳所述凝血酶制剂的小管；以及
针。
66.药剂盒，其包括：
权利要求57的稳定的凝血酶制剂；以及
能够喷射所述凝血酶制剂的装置。
67.权利要求65的药剂盒，其中所述装置是喷嘴或喷射泵。
68.稳定的液体凝血酶制剂，其包括：
凝血酶；
甘油；
聚乙二醇；
氯化钠；
乙酸钠；且
其中所述制剂的pH在6-8之间。
69.权利要求69的稳定的液体凝血酶制剂，其中所述制剂在长达两年的时间内保持其初始效力的至少60％。
70.权利要求69的稳定的液体凝血酶配方，其中其中所述配方可在长达两年的时间内保持其初始标签宣称效力的至少70％。
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