CN112011527A - 一种凝血酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，所述凝血酶原激活剂选自重组脂化组织因子，或重组脂化组织因子和钙离子。所述方法还包括在激活凝血酶原之前，制备包含凝血酶原的溶液。所述方法还包括对包含凝血酶的溶液进行纯化和进一步处理，得到凝血酶成品。本发明的制备方法采用重组脂化组织因子为激活剂，与兔脑粉相比，可显著提供凝血酶产品的安全性，降低生产成本；与大豆磷脂和蛋黄磷脂相比较，明显提升凝血酶比活性，非常适合现代大规模工业生产。

Description

一种凝血酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种凝血酶的制备方法。
背景技术
凝血酶是一种重要的细胞外丝氨酸蛋白酶，其由两条肽链组成，以二硫键相连，是机体凝血系统中的重要组成部分。凝血酶为凝血因子IIa，可直接作用于纤维蛋白原，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，从而使血液快速凝固，填塞出血点，达到止血的目的。
凝血酶是由凝血酶原的激活产生的，即需要凝血酶原激活物(激活剂)的存在，才可以将血液中的凝血酶原激活，形成凝血酶。在外源性凝血过程中，血液中的凝血因子VII与凝血因子III结合，在钙离子的作用下，激活凝血因子X转变为凝血因子Xa；凝血因子Xa与凝血因子V、血小板3因子(PF3)及钙离子形成凝血酶原复合物，凝血酶原复合物作用于凝血酶原，产生凝血酶。目前常用的凝血酶原激活物(激活剂)主要为氯化钙、枸橼酸钠、大豆磷脂或蛋黄磷脂、组织因子(促凝血酶原激酶)等。组织因子(TF)是一种由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，分子量约为47kDa，其多来源于脑、胎盘或肺组织，常见的来源包括兔脑粉。
CN201810585957.5公开了一种冻干人凝血酶的制备工艺，其在得到人凝血酶原后，加入氯化钙溶液，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂作为激活剂对人凝血酶原激活，得到人凝血酶粗溶液。但凝血酶的激活过程中使用大豆磷脂或蛋黄磷脂的激活效果较差。
CN201510638083.1公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其中向兔脑粉中加入生理盐水，再加入凝血酶原溶液和CaCl2进行酶原激活，得凝血酶粗酶液，超滤脱盐并浓缩，进行病毒灭活，所得粗酶液过层析柱，洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶。与大豆磷脂或蛋黄磷脂相比，兔脑粉的激活效果更好，但兔脑粉为外源性物质，容易引入病毒和过敏反应原，在生产过程中需要额外对兔脑粉进行病毒灭活，这增加了生产步骤且提高了生产成本。
CN201811040796.8公开了一种猪凝血酶的制备方法，包括：1)血浆的制备、2)S/D法病毒灭活、3)凝血酶原粗品制备、4)凝血酶激活液制备、5)凝血酶纯化、6)超滤脱盐和7)纳米膜除病毒。该方法也需要额外的除病毒步骤，同样增加了生产步骤且提高了生产成本。
因此，急需解决的问题是寻找一种操作简便且成本低廉的制备凝血酶的新方法。
发明内容
本发明克服了现有技术中存在的不足之处，提供了一种新的凝血酶的制备方法。该方法采用重组脂化组织因子为激活剂，与兔脑粉相比，可显著提升凝血酶产品的安全性，降低生产成本；与大豆磷脂和蛋黄磷脂相比，可明显提高凝血酶产品的比活，非常适合现代大规模工业生产。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一方面，本发明提供了一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，其中所述凝血酶激活剂为重组脂化组织因子。
在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子在溶液中的终浓度为0.05mg/L至2.5mg/L，优选为0.1mg/L至0.5mg/L。
优选地，上述凝血酶的制备方法包括向包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子和钙离子以激活凝血酶原。其中，所述钙离子可以以氯化钙或碳酸钙的形式加入。
优选地，所述钙离子在溶液中的终浓度为0.05mol/L至0.14mol/L，优选为0.05mol/L至0.1mol/L，最优选为0.07mol/L。
优选地，所述钙离子在加入重组脂化组织因子激活凝血酶原之后加入。
在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子与钙离子在溶液中的终浓度之比为1:0.03至1:1.4(mg:mol)，优选为1:0.14至1:1(mg:mol)，最优选为1:0.14至1:0.7(mg:mol)。
在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子激活凝血酶原的时间为2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min；所述钙离子激活凝血酶原的时间为10-22min，优选为12-20min，最优选为15-18min。
在上述制备方法中，所述激活凝血酶原的温度为32～38℃，优选为33～35℃，最优选为35℃。
在上述制备方法中，所述重组脂化组织因子选自重组动物脂化组织因子和/或重组人脂化组织因子；优选地，所述重组脂化动物组织因子为重组脂化兔组织因子。其中，重组脂化人组织因子是由重组人组织因子脂化制备得到的。重组人组织因子是通过人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组获得的，分子量为27.4kDa，具有生物活性，其脂化后具有更强的凝血活性。
根据本发明的凝血酶的制备方法，所述包含凝血酶原的溶液的制备方法包括以下步骤：在新鲜血液中加入抗凝剂，离心，过滤，得到血浆；在血浆中加入吸附剂，先用0.2M氯化钠水溶液和3g/L的柠檬酸三钠水溶液分别进行洗涤，再用2M氯化钠水溶液和3g/L的柠檬酸三钠水溶液分别进行洗脱，保留洗脱液，最后用分子量7000的透析袋对洗脱液进行透析，得到包含凝血酶原的溶液；其中，所述新鲜血液可以选自人或动物的新鲜血液，优选为新鲜猪血；所述抗凝剂可以为柠檬酸三钠溶液或EDTA溶液，优选为20-40g/L的柠檬酸三钠溶液；所述吸附剂可以是阴离子交换树脂，优选为DEAE-sephadex-A50离子交换树脂。
根据本发明的一个实施方案，所述凝血酶的制备方法包括向32～38℃，优选为33～35℃的包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子，搅拌2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min，然后置于0～15℃下0.5-2.0小时。
根据本发明的一个优选实施方案，所述凝血酶的制备方法包括向32～38℃，优选为33～35℃的包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子，搅拌2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min，之后加入钙离子，混合后在32～38℃，优选为33～35℃下搅拌10-22min，优选为12-20min，最优选为15-18min，然后置于0～15℃下0.5-2.0小时。
优选地，本发明所述的凝血酶的制备方法还包括对所述包含凝血酶的溶液进行纯化。
进一步优选地，所述纯化包括用酸将所述包含凝血酶的溶液调节至pH5.0-6.0，优选为pH 5.4，第一次离心后收集上清液；然后用碱将上清液调节至pH 6.0-7.0，第二次离心后收集上清液。
进一步优选地，所述酸为盐酸、草酸或醋酸中的一种或多种，优选为醋酸。
进一步优选地，所述碱为碳酸钠、氨水或碳酸氢钠中的一种或多种，优选为碳酸氢钠。
优选地，本发明所述凝血酶的制备方法还包括对纯化的包含凝血酶的溶液进行病毒灭活和冻干，得到凝血酶成品。
根据本发明的一个具体实施方案，所述凝血酶的制备方法包括：
1.在新鲜血液中加入抗凝剂，离心，过滤，得到血浆；在血浆中加入吸附剂，先用0.2M氯化钠水溶液和3g/L柠檬酸三钠水溶液分别进行洗涤，再用2M氯化钠水溶液和3g/L柠檬酸三钠水溶液分别进行洗脱，最后用分子量为7000的透析袋对洗脱液进行透析，得到包含凝血酶原的溶液；
2.将包含凝血酶原的溶液在水浴中加热至32～38℃，优选为33～35℃，加入重组脂化组织因子，搅拌，静置，得到包含凝血酶的溶液；
3.用酸将包含凝血酶的溶液调节至pH 5-6，第一次离心后收集上清液；然后用碱将上清液调节至pH 6-7，第二次离心后收集上清液，得到纯化的包含凝血酶的溶液；
4.对纯化的包含凝血酶的溶液进行病毒灭活和冻干，得到凝血酶成品。
另一方面，本发明提供了上述制备方法制备的凝血酶。
再一方面，本发明提供了上述制备方法制备的凝血酶在制备止血药物中的用途。例如，本发明的制备方法制备的凝血酶可以与明胶绵组合用于外科止血用途。根据本发明的一个实施方案，用灭菌的氯化钠注射液将所述凝血酶溶解成50-200单位/ml的用于喷雾的溶液或用所述凝血酶干粉喷洒于创面可进行局部止血。所述凝血酶可以单独用于小血管或毛细血管的渗血，例如肝素化患者穿刺部位的渗血的局部止血，也可以与明胶绵组合用于外科止血。
与现有技术相比，本发明提供的制备方法具有以下有益效果：
1.重组脂化组织因子纯度较高(≥90％)，能够充分激活凝血酶原，从而明显提高凝血酶产品效价，提高血浆的利用率。
2.不引入动物源，降低引入病毒的风险。
3.比用兔脑粉激活凝血酶原的工艺简单，完全可以实现大规模工业生产。
4.重组脂化人组织因子是利用基因片段通过发酵工程制备的，避免了外源物质的引入，降低了引入病毒的风险，并且不存在个体差异性，极大降低了临床过敏反应的发生率。
5.本发明还对所述制备方法中涉及的重组脂化组织因子加入量、钙离子加入量、重组脂化组织因子激活时间、钙离子激活时间以及激活温度、酸化pH值等条件进行了优化筛选，从而显著地提高了所制备的凝血酶产品的效价、活力和总效价，更有利于凝血酶产品的现代大规模工业生产。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是根据本发明的实施方案的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，以下实施例只是描述性的，不意味着将本发明局限于这些具体实施例。本领域技术人员应该意识到，本发明涵盖了权利要求书范围内可能包括的所有改进方案、备选方案和等效方案。
实施例1凝血酶原的制备
1.取新鲜猪血，加入38g/L的柠檬酸三钠水溶液抗凝，利用离心机在12000r/min转速下离心，过滤，得到血浆；
2.向血浆中加入吸附剂DEAE-sephadex-A50离子交换树脂，用0.2M氯化钠水溶液和3g/L柠檬酸三钠水溶液洗涤，用2M氯化钠水溶液和3g/L柠檬酸三钠水溶液洗脱，最后用分子量为7000的透析袋对洗脱液进行透析，得到凝血酶原透析液。
实施例2重组脂化组织因子激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至37℃，加入购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/mL的重组脂化人组织因子溶液1mL，控制溶液温度为37℃，搅拌10min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 6，置于1℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 6.5，置于6℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
重复检测三次，得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为822U/mL、833U/mL、819U/mL。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉的活力为8单位/mg。按每升猪血可制得除杂后的凝血酶上清液46ml计算，1L离心猪血浆可制备的凝血酶总效价为38000U。
实施例3重组脂化组织因子激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至37℃，加入购自上海冠东生物科技有限公司的浓度为0.1mg/mL的重组脂化兔组织因子溶液1mL，控制溶液温度为37℃，搅拌10min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 6，置于1℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 6.5，置于6℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
重复检测三次，得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为770U/mL、750U/mL、761U/mL。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉的活力为7单位/mg。按每升猪血可制得除杂后的凝血酶上清液46ml计算，1L离心猪血浆可制备的凝血酶总效价为35000U。
实施例4氯化钙+重组脂化组织因子激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至36℃，加入购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液0.5mL，搅拌8min后，加入70ml浓度为1mol/L的氯化钙水溶液，控制溶液温度为36℃，搅拌20min，过滤，置于6℃冰柜内静置1.5h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 6，置于6℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
重复检测三次，得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为1110U/mL、1130U/mL、1105U/mL。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为10单位。
实施例5氯化钙+重组脂化组织因子激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至36℃，加入购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液1mL，搅拌4min后，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70mL，控制溶液温度为36℃，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
重复检测三次，得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为2430U/mL、2470U/mL、2415U/mL。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为20单位。
实施例6氯化钙+重组脂化组织因子激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至36℃，加入购自上海冠东生物科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化兔组织因子溶液0.5mL，搅拌8min后，加入70ml浓度为1mol/L的氯化钙水溶液，控制溶液温度为36℃，搅拌20min，过滤，置于6℃冰柜内静置1.5h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 6，置于6℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
重复检测三次，得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为2390U/mL、2382U/mL、2380U/mL。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为20单位。
实施例7对重组脂化组织因子加入量的研究
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入一定量的购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液，搅拌5min后，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70mL，控制溶液温度为35℃，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5.4，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
检测得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价和活力，重组脂化人组织因子和氯化钙的量，以及得到的结果列于下表1中。
表1
Figure BDA0002648078260000081
可以看出，重组脂化人组织因子的加入量对实验结果的影响较大。当加入0.2和0.3ml时，产物的效价、活力和总效价均较低；当加入0.5ml时，产物的效价、活力和总效价提高；当加入1ml时，产物的效价、活力和总效价明显提高；随着加入量的继续增加，产物的效价、活力和总效价仍有小幅度的提高，但是提高不明显。由于重组脂化人组织因子价格昂贵，因此出于成本考虑，选择加入5ml作为最优的方案。
实施例8对钙离子加入量的研究
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入1mL购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液，搅拌5min后，加入一定量的浓度为1mol/L的氯化钙水溶液，控制溶液温度为35℃，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5.4，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
检测得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价和活力，重组脂化人组织因子和氯化钙的量，以及得到的结果列于下表2中。
表2
Figure BDA0002648078260000091
可以看出，钙离子的加入量对实验结果的影响较大。当加入20ml时，产物的效价、活力和总效价均较低；当加入50ml时，产物的效价、活力和总效价提高；当加入70ml时，产物的效价、活力和总效价最高；但随着加入量的继续增加，产物的效价、活力和总效价反而逐渐降低。说明钙离子的量过低或过高均不能得到理想的效价和活力。
实施例9对重组脂化组织因子激活时间的研究
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入1mL购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液，搅拌一段时间后，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70ml，控制溶液温度为35℃，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5.4，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
检测得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价和活力，重组脂化人组织因子和氯化钙的量，以及得到的结果列于下表3中。
表3
Figure BDA0002648078260000101
可以看出，重组脂化组织因子的激活时间对实验结果的影响较大。过短的激活时间不能得到理想的效价和活力。当激活时间为2-15min时能够得到理想的效价和活力，当激活时间为5-8min时实验结果最佳，激活时间延长，效价和活力反而有降低的趋势。
实施例10对钙离子激活时间的研究
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入1mL购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液，搅拌5min后，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70ml，控制溶液温度为35℃，搅拌一段时间，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5.4，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
检测得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价和活力，重组脂化人组织因子和氯化钙的量，以及得到的结果列于下表4中。
表4
Figure BDA0002648078260000111
可以看出，钙离子的激活时间对实验结果的影响较大。过短的激活时间不能得到理想的效价和活力。当激活时间为10-20min时能够得到最理想的效价和活力，当激活时间为15-18min时实验结果最佳，激活时间延长，效价和活力反而有降低的趋势。
实施例11对激活温度的研究
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至一定温度，加入1mL购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液，搅拌5min后，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70ml，控制溶液温度，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 5.4，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
检测得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价和活力，重组脂化人组织因子和氯化钙的量，以及得到的结果列于下表5中。
表5
Figure BDA0002648078260000121
可以看出，激活温度对实验结果的影响较大。当激活温度为29℃时，产物的效价、活力和总效价均较低；当激活温度升高至32℃时，产物的效价、活力和总效价提高；当激活温度升高至33到35℃时，产物的效价、活力和总效价最高；但随着激活温度继续升高，产物的效价、活力和总效价明显降低。
实施例12对酸化pH值的研究
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入1mL购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组脂化人组织因子溶液，搅拌5min后，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70ml，控制溶液温度为35℃，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至一定pH值，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
检测得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价和活力，重组脂化人组织因子和氯化钙的量，以及得到的结果列于下表6中。
表6
Figure BDA0002648078260000131
可以看出，pH值对实验结果的影响很大。当pH较高和较低时，产物的效价、活力和总效价均非常低，甚至得不到凝血酶；当pH值为5.0-6.0时，产物的效价、活力和总效价提高；当pH为5.4时实验结果最佳。
对比例1氯化钙激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至34℃，加入浓度为1mol/L的氯化钙水溶液70ml，控制溶液温度为35℃，搅拌15min，过滤，置于4℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 6.0，置于2℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为425U/ML。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为4单位。按每升猪血可制得除杂后的凝血酶上清液46ml计算，1L离心猪血浆可制备的凝血酶总效价为19000U。
对比例2兔脑粉激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至37℃，加入兔脑粉1.6g，控制溶液温度为37℃，搅拌15min，过滤，置于10℃冰柜内静置1.0h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 6，置于2℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 7，置于4℃冰柜内静置40min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为721U/ML。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为7单位。按每升猪血可制得除杂后的凝血酶上清液46ml计算，1L离心猪血浆可制备的凝血酶总效价为33000U。
对比例3兔脑粉+氯化钙激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入兔脑粉1.6g，搅拌10min后加入1mol/L氯化钙溶液50ml，控制溶液温度为35℃，搅拌20min，过滤，置于5℃冰柜内静置1.5h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 4，置于2℃冰柜内静置20min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 5，置于10℃冰柜内静置150min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为1300U/ML。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为11单位。按每升猪血可制得除杂后的凝血酶上清液46ml计算，1L离心猪血浆可制备的凝血酶总效价为56000U。
对比例4大豆磷脂和蛋黄卵磷脂+氯化钙激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入购自沈阳天峰生物制药有限公司的大豆磷脂和蛋黄卵磷脂2g，搅拌5min后加入1mol/L氯化钙水溶液20mL，控制溶液温度为35℃，搅拌25min，过滤，置于10℃冰柜内静置1.5h，得到包含凝血酶的溶液。
将包含凝血酶的溶液用醋酸调节至pH 4，置于2℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 5，置于10℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
得到的纯化的包含凝血酶的溶液效价为470U/ml。对所述凝血酶溶液进行病毒灭活，冻干，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为4单位。按每升猪血可制得除杂后的凝血酶上清液46ml计算，1L离心猪血浆可制备的凝血酶总效价为22000U。
对比例5重组组织因子激活凝血酶原
将实施例1中制备的凝血酶原透析液1000mL加入不锈钢容器中，在水浴中加热至35℃，加入1ml购自北京博尔西科技有限公司的浓度为0.1mg/ml的重组组织因子溶液，搅拌5min后加入1mol/L氯化钙水溶液20mL，控制溶液温度为35℃，搅拌25min，过滤，置于10℃冰柜内静置1.5h。
将静置后的溶液用醋酸调节至pH 4，置于2℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液；将所述上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH 5，置于10℃冰柜内静置30min，离心后沉淀弃去，收集上清液。
经检测，未得到凝血酶。
结果与分析
1.使用兔脑粉和氯化钙为激活剂制得凝血酶冻干粉。兔脑粉为外源引入物质，且不同批次间差异较大，且激活效果不稳定。
2.仅使用1mol/L的钙离子为激活剂，得到的凝血酶冻干粉1mg的活力为4单位，其激活效果较差，无大规模工业生产的可行性。
3.向凝血酶原溶液中加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，搅拌后再加入1mol/L氯化钙溶液，得到凝血酶的效价为470U/mL，凝血酶冻干粉1mg的活力为4单位。
4.以氯化钙为激活剂，要求滤液中Ca2+的浓度最终为0.02～0.15mol/L。根据对比例1可以计算，每升离心猪血可制备的凝血酶总效价为19000U，根据同样方法计算本发明的实施方案可制备的凝血酶总效价最高为110000U以上，远高于以氯化钙为激活剂得到的凝血酶总效价。
结论
本发明采用重组脂化组织因子为激活剂，激活效果高，不引入外源性病毒，无需对激活剂进行病毒灭活，降低生产成本，重组脂化组织因子利用发酵工程进行生产，不存在个体差异性，减小批次间产品差异，生产工艺更加稳定，产品的安全性更高，得到产品的效价最高达2400U/mL以上。
尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

Claims (14)

1.一种凝血酶的制备方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入凝血酶原激活剂以激活凝血酶原，得到包含凝血酶的溶液，其中所述凝血酶原激活剂为重组脂化组织因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子在溶液中的终浓度为0.05mg/L至2.5mg/L，优选为0.1mg/L至0.5mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括向包含凝血酶原的溶液中加入重组脂化组织因子和钙离子以激活凝血酶原；
优选地，所述钙离子以氯化钙或碳酸钙的形式加入；
优选地，所述钙离子在溶液中的终浓度为0.05mol/L至0.14mol/L，优选为0.05mol/L至0.1mol/L，最优选为0.07mol/L；
优选地，所述钙离子在加入重组脂化组织因子激活凝血酶原之后加入。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子与钙离子在溶液中的终浓度之比为1:0.03至1:1.4(mg:mol)，优选为1:0.14至1:1(mg:mol)，最优选为1:0.14至1:0.7(mg:mol)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子激活凝血酶原的时间为2-15min，优选为5-12min，最优选为5-8min；所述钙离子激活凝血酶原的时间为10-22min，优选为12-20min，最优选为15-18min。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述激活凝血酶原的温度为32～38℃，优选为33～35℃，最优选为35℃。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组脂化组织因子选自重组动物脂化组织因子和/或重组人脂化组织因子；优选地，所述重组脂化动物组织因子为重组脂化兔组织因子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含凝血酶原的溶液的制备方法包括以下步骤：在新鲜血液中加入抗凝剂，离心，过滤，得到血浆；在血浆中加入吸附剂，先用0.2M氯化钠水溶液和3g/L的柠檬酸三钠水溶液分别进行洗涤，再用2M氯化钠水溶液和3g/L的柠檬酸三钠水溶液分别进行洗脱，保留洗脱液，最后用分子量7000的透析袋对洗脱液进行透析，得到包含凝血酶原的溶液；
优选地，所述新鲜血液选自人或动物的新鲜血液，优选为新鲜猪血；
优选地，所述抗凝剂为柠檬酸三钠溶液或EDTA溶液，优选为20-40g/L的柠檬酸三钠溶液；
优选地，所述吸附剂为阴离子交换树脂，优选为DEAE-sephadex-A50离子交换树脂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述包含凝血酶的溶液进行纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述纯化包括用酸将所述包含凝血酶的溶液调节至pH 5.0-6.0，优选为pH 5.4，第一次离心后收集上清液；然后用碱将上清液调节至pH 6.0-7.0，第二次离心后收集上清液；
优选地，所述酸为盐酸、草酸或醋酸中的一种或多种，优选为醋酸；
优选地，所述碱为碳酸钠、氨水或碳酸氢钠中的一种或多种，优选为碳酸氢钠。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对纯化的包含凝血酶的溶液进行病毒灭活和冻干，得到凝血酶成品。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法制备的凝血酶。
13.根据权利要求12所述的凝血酶在制备止血药物中的用途。
14.根据权利要求12所述的凝血酶与明胶绵组合用于外科止血中的用途。
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