CN113117138A - 负载组织因子及二氧化硅的胶原蛋白水凝胶止血敷料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以胶原蛋白为支撑载体制备生产包埋有组织因子和二氧化硅的伤口止血敷料的方法，包括以下步骤：(1)将携带有组织因子基因的质粒转入细菌细胞中，在细菌中表达后，将蛋白从细菌中提纯，得到纯化后的组织因子。(2)将磷脂在超声的条件下形成囊泡后加入提纯的组织因子与生物珠之后充分振荡，使组织因子与磷脂囊泡形成结合体。(3)将提纯后的胶原蛋白配制成不同浓度的胶原蛋白溶液。(4)将嵌有组织因子的磷脂囊泡溶液分别和不同浓度的胶原蛋白溶液混合，然后加入二氧化硅粉末，将三者直接混合通过pH调节使胶原蛋白混合溶液交联形成水凝胶。在胶原蛋白水凝胶中加入具有凝血作用的组织因子和二氧化硅颗粒，胶原蛋白本身具有凝血效果，再加上组织因子和二氧化硅使得制备的伤口止血敷料具有高效的止血能力、良好的生物相容性、极低的细胞毒性、生物可降解性，特别是在伤口管理中不再仅仅依靠材料本身止血特性进行被动止血；该敷料结构骨架是胶原蛋白水凝胶体系，因此具有一定的机械强度，并且敷料具有一定的柔韧性，可以更好的贴附在伤口表面。

Description

负载组织因子及二氧化硅的胶原蛋白水凝胶止血敷料
技术领域
本发明涉及一种由胶原蛋白水凝胶作为结构骨架，并将具有生物活性的组织因子及二氧化硅包埋在水凝胶中从而构建的一种伤口止血敷料。
背景技术
目前出血失控是临床、交通事故和战争中造成死亡的主要原因，出血风险的管理在医学许多方面具有重要的意义。我们体内存在一个复杂且可调控的止血系统，其中组织因子(TF)作为最有力的凝血触发剂在启动凝血级联反应中具有重要的作用。在血管损伤的地方，细胞膜上的TF分子与血液接触，可以选择性地结合并激活一种可溶性血浆酶原(因子VII)，进而激活凝血级联反应外源性途径，最终导致凝血酶生成，然后由聚合纤维蛋白和活化血小板在出血位置生成不溶性血栓，从而达到止血的效果。
当前已经开发了基于不同种类生物聚合物的止血材料和技术，包括绷带，止血带，粉末，凝胶，胶水，喷雾剂等形式。止血材料形式多样但都具有一定的劣势，大部分敷料通过无生物活性的物质进行被动止血。如，专利CN110180016A公开了一种快速止血敷料；专利CN110522945A公开了一种医用生物凝胶止血敷料；专利CN110975001A公开了一种壳聚糖-纤维素复合止血海绵；专利CN107296976A公开了一种医疗用多功能止血敷料。如上止血敷料能够起到止血、杀菌、促进创伤处愈合的功效，一定程度上满足不同愈合阶段对敷料性能的要求，但是发挥止血功能时缺乏主动积极的作用，因此为了使止血敷料在未来的应用中扮演更加积极主动的角色，将具有生物活性的组织因子和二氧化硅包埋到胶原蛋白中形成一种止血敷料。
组织因子通过重构为合适的脂质体以获得充分的促凝血活性。通过模仿和利用生理凝血机制，磷脂化TF(整合有TF的脂质体)具有成为止血应用中有效的生物活性成分的潜力。然而，当在体内应用时，重要的是控制流血部位的磷脂化组织因子颗粒的作用，以避免凝血酶和血纤蛋白的全身性过度生成。通过将TF掺入止血敷料生物聚合物中实现控制TF颗粒的递送或释放，从而可能提高其使用中的安全性和有效性，并且聚合物的存在还可以增加敷料与组织界面的物理键合和能量耗散，从而产生更大的破裂压力。
在伤口敷料的设计中必须考虑的重要因素是其减少污染，高效止血，维持适宜的伤口生理环境和生物相容性。胶原蛋白的生物相容性，低毒性，可负担性，生物可降解性以及温和的胶凝条件，使其在许多生物医学应用中十分具有实用性和潜力。胶原蛋白通过维持血管壁的完整性和稳定性来介导必要的止血作用。当血管壁受损时，胶原蛋白与血小板受体结合，进一步激活血小板粘附和聚集，从而启动凝血途径。胶原蛋白可以促进血小板的产生和粘附，并介导血小板的完全活化。胶原蛋白是天然的聚合物水凝胶，具有良好的生物相容性，生物降解性和弱抗原性。二氧化硅可以作为凝血因子和血小板的吸附表面，可以加快血栓的形成，进而加速凝血过程。通过多组分的协同作用，构建具有高效止血能力、生物可降解性、具有一定机械强度的止血敷料、具有高效止血能力和成本廉价的敷料符合止血敷料未来发展的趋势。
发明内容
本发明的目的在于构建一种具有生物活性的伤口止血敷料，该敷料是将具有生物活性的TF和二氧化硅颗粒包埋在胶原蛋白水凝胶中。本发明提供了一种由所述止血敷料为伤口止血的方法。
为了实现上述技术方案，本发明涉及的负载组织因子及二氧化硅的胶原蛋白水凝胶止血敷料的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将携带有组织因子基因的质粒转入细菌细胞中，在细菌中表达提纯，得到纯化后的组织因子。
(2)将磷脂超声后加入步骤(1)得到的组织因子和生物珠之后充分振荡，使组织因子与磷脂囊泡形成结合体。
(3)将提纯后的胶原蛋白配制成不同浓度的胶原蛋白溶液。
(4)将嵌有组织因子的磷脂囊泡溶液分别和不同浓度的胶原蛋白溶液混合，然后加入二氧化硅粉末，将三者直接混合通过pH调节使胶原蛋白混合溶液交联形成水凝胶。
本发明涉及的胶原蛋白为从罗非鱼皮中提取的Ⅰ型胶原蛋白，但不限于这一种。
本发明涉及的步骤(1)中质粒用的是pET-22b,pET-28a,细菌用的是大肠杆菌，但不限于这几种。
本发明涉及的步骤(2)中磷脂囊泡用的是DOPC和DOPS，但不限于这几种。
本发明涉及的步骤(3)中交联方法是胶原蛋白通过调节pH交联的方法，但不限于这一种。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)材料成本低，制备方法简单，使用操作容易；(2)制备的止血敷料生物相容性好，无细胞毒性，生物可降解性；(3)胶原蛋白水凝胶的网格结构可以实现对组织因子和二氧化硅的控制释放；(4)组织因子具有生物活性，在止血管理中发挥重要的作用，将组织因子加入到胶原蛋白水凝胶中，使该材料在伤口处理时扮演更加积极主动的角色。
附图说明：
附图1为本发明涉及的实施例1负载组织因子与二氧化硅的胶原蛋白体系的制备；
附图2为本发明涉及的实施例1胶原蛋白红外光谱图；
附图3为本发明涉及的实施例1组织因子-脂质体释放动力学；
附图4为本发明涉及的实施例1凝胶流变力学图；
附图5为本发明涉及的实施例1组织因子-脂质体的活性表征；
附图6为本发明涉及的实施例1凝胶体外凝血效果。
发明的具体实施方式
下面通过具体实施例和说明书附图对本发明做进一步说明。
实施例1：
(1)组织因子的表达与纯化
将携带有组织因子基因的质粒(pET-22b)转化到细菌细胞中。将细胞放在含有氨苄青霉素的培养基中，在37℃下生长到A600达到0.6-0.8。之后将培养物移至25℃并用异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷诱导过夜。将培养物离心得到沉淀后用Triton X-100试剂悬浮。然后用French压力机裂解并离心后，将上清液收集到新的试管中。接下来，在吐温80的存在下，通过Ni-亲和色谱从上清液中纯化表达组织因子。
(2)组织因子整合脂质体的制备
将DOPC和DOPS的混合物在玻璃瓶中干燥后，溶解在含有脱氧胆酸盐和组织因子的Tris-HCl中。在室温下，将样品与生物珠搅拌90min，然后再添加部分生物珠去除洗涤剂(用于溶解组织因子的脱氧胆酸盐和吐温80)。收集脂质化的组织因子(或称为组织因子-脂质体)的上清液，并保存。在脱氧胆酸盐和组织因子混合时加入羧基荧光素钠染料，使染料被包裹在脂质体中。
(3)负载组织因子与二氧化硅的胶原蛋白体系的制备
配置终浓度为0.1％的胶原蛋白溶液，加入10mg纳米二氧化硅粉末。将混合物的pH调节至中性(7.4±0.2)。将pH为7.4的胶原蛋白和二氧化硅溶液中加入制备好的TF-脂质体(CTF＝9nM)并搅拌均匀，将混合物放在30℃下自聚集24h，获得负载组织因子和二氧化硅的胶原蛋白水凝胶样品如附图1所示。其中TF-脂质体中需提前用CF分子进行标记，使CF分子包裹到TF-脂质体的内腔中。
(4)红外光谱分析
将冻干的胶原蛋白样品分别与干燥的KBr以约1:100(m/m)的比例混合，在干燥条件下彻底研磨，使用手动压片机将混合均匀的样品压制成片，为保证足够的透光率，压片后样品应薄而透明。以KBr片作为背景，使用傅里叶变换红外光谱仪对样品进行扫描，扫描范围4000-400cm-1，分辨率2cm-1。如附图2所示，胶原蛋白的特性符合Ⅰ型胶原的特征。
(5)TF-脂质体的释放动力学
将含有组织因子和二氧化硅的胶原蛋白水凝胶放入装有模拟体液的烧杯中。使用水浴将系统的温度保持在37℃。在不同的时间点取出等份的模拟体液。在514nm(λex＝495nm)处记录从谁凝胶中释放的组织因子-脂质体的荧光强度。每次测量后，将等份试样放回烧杯中，使其总体积不变。将与胶原蛋白中装载的相同量的组织因子-脂质体直接溶解在相同体积的模拟体液中，作为完全释放时荧光强度的对照，释放分数计算为等份试样的荧光值除以参考值的荧光值。如附图3所示，随着时间的变化，组织因子-脂质体从凝胶中的释放逐渐增加最后达到平台期，释放量约为总量的90％。
(6)流变力学行为
使用Thermo Scientific Haake MARS III模块化流变仪(Thermo FisherScientific)分析负载组织因子和二氧化硅的胶原蛋白水凝胶的流变行为。通过振荡应变扫描试验确定线性粘弹性区域，在该粘弹性区域测量凝胶的力学特性，如附图4所示，水凝胶G’与G”的数值不随频率而改变，一直保持平稳，并且两者之间存在大约一个数量级的关系，可以表明该体系具有典型的水凝胶特性。
(7)促凝活性表征、
利用人组织因子显色活性测定试剂盒测定胶原蛋白体系释放的TF-脂质体的促凝活性，并与新制备的TF-脂质体进行比较。在测量之前，试剂盒中的所有试剂被带到室温，先配制70μL的实验混合液(Assay Diluent 50μL,FVII 10μL,FX 10μL)，混合液与10μL的TF样品混匀，37℃孵育30m。然后向含有TF样品的混合液中加入20μL FX底物，每5min记录一次405nm的吸光度，此变化与TF活性成正比。如附图5所示，在405nm处的吸收随时间的变化而持续增长，表明组织因子-脂质体从凝胶中释放，仍具有较好的活性，可以促使凝血级联反应的发生。
(8)体外凝血
体外凝血实验所用血液为商业柠檬酸全血(来自新西兰大耳兔的心脏)，需要将血液重新钙化后才能使用。凝血试验前，将是否负载组织因子和二氧化硅的胶原蛋白体系和血液分别在37℃下孵育10min。将浓度为25mM的CaCl2溶液加入到全血中，达到最终钙离子浓度为8.3mM，将水凝胶分别与重新钙化的血液按体积比1:1混合后放入2mL离心管中，离心管置于37℃下孵育。孵育阶段中每隔10s将离心管微微倾斜一次，检查离心管中的混合物是否凝固。如附图6所示，该体系展现了良好的止血能力，与对照实验相比大约缩短了三倍的凝血时间。
实施例2：
本实施例与实施例1除步骤(3)中胶原蛋白为0.3％，其他步骤均相同。
实施例3：
本实施例与实施例1除步骤(3)中胶原蛋白为0.5％，其他步骤均相同。
测试表明实施例2与实施例3制备的凝负载组织因子和二氧化硅的胶原蛋白水凝胶体系的TF-脂质体释放速率、流变力学与体外凝血时间同实施例1有一定差异之外，其他性能均与实施例1接近。

Claims (13)

1.一种由负载组织因子及二氧化硅的胶原蛋白体系构建的止血敷料的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将携带有组织因子基因的质粒转入细菌细胞中，在细菌中表达提纯，得到纯化后的组织因子。
(2)将磷脂超声后加入步骤(1)得到的组织因子和生物珠之后充分振荡，使组织因子与磷脂囊泡形成结合体。
(3)将提纯后的胶原蛋白配制成不同浓度的胶原蛋白溶液。
(4)将嵌有组织因子的磷脂囊泡溶液分别和不同浓度的胶原蛋白溶液混合，然后加入二氧化硅粉末，将三者直接混合通过pH调节使胶原蛋白混合溶液交联形成水凝胶。
2.根据权利要求1所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，质粒为pET-22b,pET-28a中的一种,细菌为大肠杆菌感受态细胞C41、BL21和DH5α中的一种，但不仅限于这几种。
3.根据权利要求2所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，磷脂为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和甘油磷脂酸(PA)中的一种或多种，但不仅限于这几种。
4.根据权利要求3所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，胶原蛋白为胶原蛋白家族中的间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原中的一种或多种，但不仅限于这几种。
5.根据权利要求4所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，间质胶原为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白中的一种或多种,但不仅限于这几种。
6.根据权利要求5所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将组织因子基因嵌入质粒pET-28a中，将载有组织因子基因的质粒转化到感受态细胞BL21中。
7.根据权利要求6所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，超声温度在0～80℃，超声时间为20～60分钟，生物珠的加入量为0.35～0.5g。
8.根据权利要求7所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，超声温度60℃，超声时间为30min，生物珠的加入量为0.4g，所述的具体过程为：将步骤(2)中得到的囊泡与组织因子混合，加入0.05g生物珠，摇床振荡90min，再加入0.35g生物珠振荡90min后，将溶液吸出得到组织因子-磷脂囊泡结合体。
9.根据权利要求7或8所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，胶原蛋白溶液的浓度为0.1％～2.5％。
10.根据权利要求9所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，胶原蛋白浓度为0.1％、0.3％、0.5％。
11.根据权利要求9或10所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，二氧化硅质量在0.1～10mg。
12.根据权利要求11所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，二氧化硅质量在5mg。
13.根据权利要求1-12任意项所述的由胶原蛋白和二氧化硅体系构建止血敷料的制备方法，其特征在于，该止血敷料可用于需要止血的环境，伤口处生理环境。
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