WO2018106099A1 - Método para la producción de mebranas de celulosa bacteriana, útil en aplicaciones biomédicas - Google Patents

Método para la producción de mebranas de celulosa bacteriana, útil en aplicaciones biomédicas Download PDF

Info

Publication number
WO2018106099A1
WO2018106099A1 PCT/MX2017/000120 MX2017000120W WO2018106099A1 WO 2018106099 A1 WO2018106099 A1 WO 2018106099A1 MX 2017000120 W MX2017000120 W MX 2017000120W WO 2018106099 A1 WO2018106099 A1 WO 2018106099A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacterial cellulose
product
biomedical applications
membranes
mango
Prior art date
Application number
PCT/MX2017/000120
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Inés JIMÉNEZ PALOMAR
Mayra Elizabeth GARCÍA SÁNCHEZ
Yolanda GONZÁLEZ GARCÍA
Jorge Ramón ROBLEDO ORTIZ
Original Assignee
Inmateriis S.A. De C.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inmateriis S.A. De C.V. filed Critical Inmateriis S.A. De C.V.
Publication of WO2018106099A1 publication Critical patent/WO2018106099A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/28—Polysaccharides or their derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08L1/02—Cellulose; Modified cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/02—Acetobacter

Definitions

  • the present invention relates to the technical fields of Biotechnology and Medicine, since it provides a method for the production of bacterial cellulose membranes, from microorganisms of the genus Komagataeibacter, a bacterial cellulose membrane obtained by said method; the use of said membrane obtained in wound healing processes; and a product comprising the membrane in question, useful in biomedical applications, such as in the treatment of wound healing in an animal, including a human.
  • Cellulose is the most abundant biological molecule on earth [1,2]. Its linear structure is formed by 2000 to 14000 units of ⁇ - (1, 4) glucose linked together by hydrogen bridge type links. It is a biopolymer that has regions with high order (crystalline), and others where the degree of order is low (amorphous) [3,4].
  • CB cellulose of bacterial origin
  • CB is synthesized by different microorganisms, being one of its most efficient producers the bacterium Gluconacetobacter xylinus [5], now known as Komagataeibacter xylinus.
  • This bacterium forms CB films as a flotation mechanism in the liquid / air interface, where it obtains the oxygen necessary for its growth.
  • the film is also a physical barrier that protects the bacteria from UV radiation and toxic compounds, likewise increases its ability to colonize substrates and allows it to retain moisture [6]. Due to its high degree of crystallinity, purity, cross-linked conformation, biodegradability and Biocompatibility, this polymer is attractive in various applications, especially in the medical area [1,2].
  • Patent document CN102925514 discloses the use of biological cellulose fermentation in a fruit medium, the fermentation medium contains by weight 50-90% mango juice, the sugar content of mango juice is 10% or plus.
  • Mango is a typical tropical fruit, with a sugar content of up to 12-20%, 5.56% protein, 16.1% fat, 67.29% carbohydrates, contains vitamins A, B, C and the like.
  • As a sugar carrier it predominantly has fructose and sucrose. It can be seen that in the fermentation of bio-cellulose by bacteria production it is an excellent source of coal. More than that, the content of vitamins and other inorganic elements in the fruit can be used by fermentation to produce bacterial bio-cellulose, it is possible to improve the efficiency of fermentation.
  • the degree of biocompatibility and characteristics of bacterial cellulose place it as an excellent material for biomedical applications, ranging from scaffolding for the regeneration of cartilage and skin grafts, to bone implant material [7].
  • CB The biocompatibility of CB has been extensively studied and reported [8], however, there are few commercial applications that currently exist.
  • Biofill® to cover wounds
  • Gengiflex® material used to make dental implants.
  • biomedical applications in development phase such as temporary skin substitute with antimicrobial activity (mixing with silver nanoparticles) for the treatment of wounds, burns, ulcers and abrasions in the epidermis; vascular implants for microsurgery [9]; tissue engineering support as it facilitates the anchoring and proliferation of the cells that will make up the new tissue [7]; Composite with hydroxyapatite for bone tissue replacement [9] and with polyvinyl alcohol (PVA), for corneal implants; enzyme and other immobilization biomolecules; controlled drug release systems, among others [1,2].
  • PVA polyvinyl alcohol
  • CB can be combined with materials such as chitosan, poly-ethylene glycol (PEG) and gelatin for its potential application as a dressing [13].
  • Patent document CN103861146 describes a biological bacterial cellulose patch and its manufacturing method.
  • the biological patch comprises a bacterial cellulose film, called CB film, where the degree of polymerization of the bacterial cellulose ranges is from 2000 to 20,000, the crystalline form of the cellulose crystal is type I, the crystallization index is 50 to 95 %, and in cell parameters, a is equal to 0.815 nm, b is equal to 1.025 nm, c is equal to 0.832 nm, and beta is equal to 85 degrees.
  • the biological patch of Bacterial cellulose has excellent mechanical properties, better biological fitness, better anti-adhesive property and antimicrobial property in the enterocoelia environment, and appropriate area can be conveniently obtained.
  • patent document CN202699408 U details a medical dressing of bacterial cellulose.
  • Said dressing comprises a bacterial cellulose coating, in which the bacterial cellulose coating is a massive body or a body in the form of scales, and the thickness of the massive body or the body in the form of scales is between 0.5 and 8 mm.
  • the medical dressing of bacterial cellulose can be manufactured as a dry garment or a wet dressing according to the differences in the varieties of trauma.
  • the bacterial cellulose medical dressing is reasonable in structure, strong in water retention capacity, good in moisturizing function and light in weight, and can be used without weighing pressure sensation.
  • Such dressing is good in fair clothing, it does not break or fragment, it can be adhered with adhesive tapes and other fasteners for use, and it is convenient to use.
  • diabetes mellitus is one of the most prevalent chronic diseases in the world; until 2010, it was estimated that 285 million adults suffered from this disease, projected that by 2030 the figure would reach 439 million [14,15].
  • Diabetes is a metabolic disorder characterized by high levels of glucose in the bloodstream and by changes in the metabolism of carbohydrates, proteins and proteins caused by alterations in insulin secretion [16].
  • diabetes Among the various problems presented by patients with diabetes is the risk of obesity [17], coronary heart disease, stroke [18-20], diabetic nephropathy [21], diabetic foot ulcers (UPD), among others, responsible for the high mortality rates observed in diabetic patients.
  • Wound healing is a complex process that involves simultaneous action of blood cells, an extracellular matrix and parenchymal cells. This process can be divided into several phases: homeostasis / coagulation, inflammation, proliferation (granular tissue formation), reepithelialization and skin remodeling [22,23].
  • Diabetic neuropathy and peripheral vascular disease are the main factors involved in UPD. These two factors can act alone or in combination with other conditions such as microvascular disease, biomechanical abnormalities, limited mobility of joints, generating a greater susceptibility to infection [25,26].
  • cellulose and its derivatives can stimulate healing through the release and maintenance of therapeutic factors, such as the migration and proliferation of dermal fibroblasts and the inhibition of bacterial growth in wounds [31-33] .
  • cellulose-based materials have been possible to increase the biocompatibility of cellulose-based materials by combining them with other polymers such as collagen.
  • Another example of commercial cellulose-based dressings is AquaceKB ) Hydrofiber WoundDressing (ConvaTec, USA), an antimicrobial carboxymethyl cellulose derivative that can absorb wound fluids and create a gel to maintain a moist environment.
  • the intrinsic characteristics of CB make it an excellent product useful for helping in the healing of lesions in an animal, which could be applied in many ways.
  • the CB could be applied in a composite material, such as composites, dressings, bandages, adhesive tapes, adhesive fabrics, among others.
  • Dressings can be designed for the initial stages of wound healing, during which the absorption of fluids and the application of anti-inflammatory medications are particularly beneficial.
  • Dressings with antimicrobial antimicrobial agents with substances derived from platelets and with the patient's own stem cells are materials that can reduce the risk of infection and improve the cicatrization.
  • many of the materials currently used do not represent a practical option, since the application of these compounds is very expensive, difficult to regulate and control.
  • More recent research focuses on the development of more efficient and less expensive biocompatible and biodegradable functionalized dressings that can offer important wound healing factors such as UPD [17].
  • CB is a biotechnological compound with high added value, which due to its high purity, biodegradability and biocompatibility is an ideal raw material for biomedical applications.
  • CB could be used to facilitate cell diffusion and proliferation as well as for tissue generation [35].
  • the present invention aims at a method for the production of bacterial cellulose (CB) membranes, from microorganisms of the genus Acetobacter, reclassified as Gluconacetobacter and currently known as Komagataeibacter, more specifically the species Acetobacter xylinum, reclassified as Gluconacetobacter xylinus and currently known as Komagataeibacter xylinus.
  • CB bacterial cellulose
  • the method for the production of bacterial cellulose comprises: inoculating a pre-inoculum of a microorganism of the genus Komagataeibacter xylinus strain DSMZ 2004, in a culture medium containing: reducing sugars derived from Mangifera indica mango, and extract of yeast as a source of nitrogen; then incubated at 30 ° C, for 15 days; then purify the obtained bacterial cellulose membrane, washing it with distilled water at a stirring of 3,200 rpm, then immersing it in a 0.1 M NaOH solution, keeping it at 90 ° C for 30 min; and finally, washing the bacterial cellulose membrane with distilled water until the pH of the wash water is 7.
  • An embodiment of the method of the present invention is when the pre-inoculum and culture medium ratio is 1: 20; or more preferably, when the pre-inoculum of the microorganism of the strain DSMZ 2004 is in an amount of 1 mL and the culture medium in an amount of 20 ml_.
  • a further variant of the method in question is when the culture medium contains 25 g / L of reducing sugars from mango (2 g / L glucose, 6 g / L fructose, 12 g / L sucrose) and 10 g / L of yeast extract; where the reducing sugars from mango, have a pH of 6.5.
  • a further variant of the method in question is that it can optionally comprise dehydration of bacterial cellulose membranes, to a humidity of at least 3%; then proceed to grind these membranes, to turn them into dust.
  • drying of the membranes can be by any means, for example, drying in a vacuum oven at 60 ° C and 0.8 MPa, and the other is lyophilized at -45 ° C and 0.8 Mpa.
  • grinding can also be carried in any conventional manner, for example as in a ball mill (RETSCH MM 400) using a frequency 30 1 / s and a time of 2 min, to turn the membranes into a dust presentation.
  • a further object of the present invention is a bacterial cellulose (CB) menbrane obtained in accordance with the method of the present invention.
  • said cellulose membrane can have many uses. For example, in biomedical applications the membrane can be used wet as dressings for the healing and coating of skin wounds; on the other hand, said membrane can be dehydrated and ground to form bio-composites in conjunction with a polymer matrix.
  • a further object of the present invention is a product useful in biomedical applications, wherein said product comprises at least one wet bacterial cellulose membrane; and / or dehydrated and ground cellulose membrane.
  • the product useful in biomedical applications can be: dressings, composites, biocomposites, bandages, fabrics and / or adhesive tapes, among others.
  • said product useful in biomedical applications can be used to aid in the treatment of wound healing, ulcers, burns, sores, etc., of an animal patient, including the human, and more specifically in a diabetic patient.
  • a preferred embodiment of the product useful in biomedical applications is that said product is a biocomposite, which in turn comprises 1% of bacterial cellulose powder membrane.
  • the product useful in biomedical applications according to the present invention can be applied in a large number of traumas or wounds of an animal patient, including the human, specifically patients with diabetes problems. Some of those traumas or wounds can be, to name a few examples, scars, ulcers, wounds, sores, and all of that injury that requires scarring.
  • a further object of the present invention is the use of bacterial cellulose obtained by the method described in the present invention, for the preparation of a product useful in biomedical applications. Examples
  • a strain of Acetobacter xylinum, reclassified as Gluconacetobacter xylinus, and currently known as Komagataeibacter xylinus) was used, which was deposited with the accession number DSMZ 2004.
  • the strain was propagated in a conventional Hestrim-Schramm (H-S) medium. In most cases, the minimum time for the correct spread of the strain was two weeks, until the required amount was obtained.
  • H-S Hestrim-Schramm
  • H-S medium 50 mL was used and stirred for 24 h. From them 100 microL were taken, which were deposited in vials with 1 mL of conventional HS medium, incubated for 48 h, at a temperature of 30 ° C and frozen in a 50% glycerol solution, at a temperature of - 30 ° C
  • Figure 1 shows the concentration of the reducing sugars present in the mango.
  • mango pulp had a higher content of reducing sugars, so it was the raw material used for the production of the culture medium to be used.
  • Example 3 Preparation of the suitable culture medium, for the production of bacterial cellulose (CB) membranes.
  • CB bacterial cellulose
  • 6 different culture media were prepared using Mangifera indica mango pulp with an initial concentration of 25 g / L of reducing sugars and the addition of different nitrogen sources was evaluated (5: 5 g / L peptone plus yeast extract, 10 g / L peptone, 10 g / L yeast extract, 2.4 g / L urea, 5.3 g / L ammonium sulfate and without a nitrogen source).
  • the initial pH of all media was adjusted to 6.5 and they were sterilized prior to inoculation with Komagataeibacter xylinus.
  • media with a mixture of sucrose, fructose and glucose were used in the proportion found in the mango (12 g / L sucrose, 6 g / L fructose, 2 g / L glucose, 5 g / L peptone, and 5 g / L yeast extract). The experiments were carried out in triplicate.
  • Static culture was carried out in 100 mL containers (10 cm in diameter) with 20 mL of culture medium inoculated with 1 mL of pre-inoculum (HS medium) of K. xylinus, incubating at 30 ° C for 15 days , at the end of which the production of CB membranes and the consumption of sugars were quantified.
  • HS medium pre-inoculum
  • bacterial cellulose membranes were obtained after 15 days of static incubation at 30 ° C in a culture medium containing 25 g / L of reducing sugars from mango (60% sucrose, 30% fructose and 10% glucose) at pH 6.5 and 10 g / L yeast extract as nitrogen source
  • the yield of the product with respect to substrate consumption (Yp / s) was 0.3565 g of bacterial cellulose per gram of sugar consumed during fermentation.
  • the obtained CB was washed with distilled water by stirring it with a vortex at 3200 rpm, then immersing it in a 0.1 M NaOH solution, keeping at 90 ° C for 30 minutes.
  • the membranes obtained were weighed, after purification (wet weight), subsequently frozen at a temperature of -30 ° C, and were lyophilized at -45 ° C and 0.8 MPa to dehydrate them at a humidity of 3%, and returned to weigh (dry weight), the result of this measurement was the net amount obtained from CB.
  • Example 5 Biocompatibility of composites produced by additive manufacturing using bacterial cellulose membrane as reinforcement.
  • Dehydrated cellulose membranes were used, obtained from the culture medium with mango as a carbon source, which were ground in a ball mill (RETSCH MM 400) using a frequency 30 1 / s and a time of 2 min. which membranes turn to dust
  • the biocomposites used in this test were obtained by bioprinting and are formed by polycaprolactone (PCL) PM 14000 to 10000 from Sigma Aldrich and 1% bacterial cellulose membrane (CB) powder.
  • PCL polycaprolactone
  • CB bacterial cellulose membrane
  • Alamar Blue is a water-soluble dye that has been used for a long time for in vivo quantification of viability of different cell types [37,38].
  • AB Alamar Blue
  • the reagent When the reagent is added to the cell culture, it generates an oxide-reduction reaction in which AB enters the cytosol, accepting electrons from NADPH, FADH, FMNH, NADH and cytochromes. This reaction is responsible for the change in the color of the culture medium, which ranges from indigo blue to fluorescent pink, which can be easily measured by colorimetry or flourometric reading [39].
  • the assay was carried out using mouse fibroblasts (3T3 cells) seeded on the biocomposite with a density of 40 thousand cells per sample.
  • Graph 2 shows the results of cell culture assays 1, 3 and 7 for the PCL / CB biocomposites and PCL scaffolds.
  • Kirdponpattara Suchata, Khamkeaw, Arnon, Sanchavanakit, Neeracha, Pavasant, Prasit, Phisalaphong, Muenduen. (2015). Structural modification and characterization of bacterial cellulose-alginate composite scaffolds for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 132: 146-155.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

Un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana, el cual comprende: inocular un pre-inóculo de un microorganismo de Komagataeibacter xylinus cepa DSMZ 2004, en un medio de cultivo que contiene azúcares reductores de mango Mangifera indica, y extracto de levadura; incubar a 30º C, durante 15 días; purificar las membranas de celulosa bacteriana obtenida, lavándolas con agua destilada a 3,200 rpm, para después sumergirlas en una solución de NaOH 0.1 M, y manteniéndolas a 90º C por 30 min; y lavar las membranas con agua destilada hasta que el pH del agua de lavado es 7. Una membrana de celulosa bacteriana, obtenida con el método de la presente invención, la cual puede ser útil en aplicaciones biomédicas; y un producto útil en aplicaciones biomédicas, que a su vez comprende, la membrana de celulosa bacteriana de conformidad con la invención en cuestión.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE MEMBRANAS DE CELULOSA BACTERIANA, ÚTIL EN APLICACIONES BIOMÉDICAS
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con los campos técnicos de la Biotecnología y Medicina, ya que proporciona un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana, a partir de microorganismos del género Komagataeibacter, una membrana de celulosa bacteriana obtenida por dicho método; el uso de dicha membrana obtenida en procesos de cicatrización de heridas; y un producto que comprende a la membrana en cuestión, útil en aplicaciones biomédicas, tales como en el tratamiento de cicatrización de heridas en un animal, incluyendo a un humano. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La celulosa es la molécula biológica más abundante en la tierra [1,2]. Su estructura lineal está formada por 2000 a 14000 unidades de β-(1 ,4) glucosa unidas entre sí por enlaces tipo puente de hidrógeno. Es un biopolímero que posee regiones con alto ordenamiento (cristalinas), y otras donde el grado de ordenamiento es bajo (amorfas) [3,4].
Recientemente la celulosa de origen bacteriano (CB) ha tomado gran importancia y despertado el interés en su producción y uso para el desarrollo de productos de alto valor agregado [1]. La CB es sintetizada por diferentes microorganismos, siendo uno de sus productores más eficientes la bacteria Gluconacetobacter xylinus [5], ahora conocida como Komagataeibacter xylinus. Esta bacteria forma películas de CB como mecanismo de flotación en la interface líquido/aire, donde obtiene el oxigeno necesario para su crecimiento. La película es también una barrera física que protege a la bacteria de la radiación UV y de compuestos tóxicos, de igual manera, aumenta su capacidad de colonizar sustratos y le permite retener humedad [6]. Debido a su alto grado de cristalinidad, pureza, conformación reticulada, biodegradabilidad y biocompatibilidad, este polímero es atractivo en diversas aplicaciones, especialmente en el área médica [1,2].
El documento de patente CN102925514 divulga el uso de la fermentación de celulosa biológica en un medio frutal, el medio de fermentación contiene en peso un 50-90 % de zumo de mango, el contenido de azúcar del jugo de mango es de un 10 % o más. El mango es una típica fruta tropical, con un contenido de azúcar de hasta el 12-20 %, 5.56 % de proteínas, 16.1% de grasa, hidratos de carbono 67.29 %, contiene vitaminas A, B, C y similares. Como portador de azúcar, predominantemente tiene fructosa y sacarosa. Se puede apreciar que en la fermentación de bio-celulosa por producción de bacteria es una excelente fuente de carbón. Más que eso, el contenido de vitaminas y otros elementos inorgánicos en la fruta pueden ser utilizados por la fermentación para producción de bio-celulosa bacteriana, es posible mejorar la eficiencia de la fermentación.
El grado de biocompatibilidad y características de la celulosa bacteriana la sitúan como un excelente material para aplicaciones biomédicas, que van desde andamios para la regeneración de cartílago e injertos de piel, hasta material para implantes óseos [7].
La biocompatibilidad de la CB ha sido ampliamente estudiada y reportada [8], sin embargo, son pocas las aplicaciones a nivel comercial que existen actualmente. Entre los productos que actualmente se comercializan se pueden encontrar el Biofill® para cubrir heridas, y Gengiflex®, material utilizado para elaborar implantes dentales. Existen otras aplicaciones biomédicas en fase de desarrollo, tales como sustituto temporal de la piel con actividad antimicrobiana (mezclando con nanopartículas de plata) para el tratamiento de heridas, quemaduras, úlceras y abrasiones en la epidermis; implantes vasculares para microcirugía [9]; soporte en ingeniería de tejidos pues facilita el anclaje y proliferación de las células que conformarán el tejido nuevo [7]; composito con hidroxiapatita para el remplazo de tejido óseo [9] y con alcohol polivinílico (PVA), para implantes de córnea; inmovilización de enzimas y otras biomoléculas; sistemas de liberación controlada de medicamentos, entre otros [1,2].
Aplicaciones de la celulosa bacteriana en el área biomédica
A principios de 1980, la compañía Johnson & Johnson realizó por primera vez investigaciones exploratorias sobre el uso de la CB para el cuidado de heridas de la piel (patentes US4655758 y US4588400). Desde ese momento, la empresa brasileña Biofill® Industries, ha investigado las propiedades de la CB y comenzó la comercialización de productos específicos para el tratamiento de padecimientos cutáneos [10,11]. En Brasil, las membranas purificadas de CB fueron desarrolladas y comercializadas como piel artificial para el vendaje de heridas [10]. Bioprocess®, XCell® y Biofill® son productos de aplicación tópica que se han comercializado desde hace tiempo para cicatrización de heridas [10, 12], demostrando significativas ventajas con respecto a los apósitos convencionales en términos de retención de exudado de la herida, reducción del dolor, mejora de reepitelización y tiempos de curación y reducción de las tasas de infección. Además, facilita la inspección de la herida debido a su semitransparencia y reduce las cicatrices al término del tratamiento [10-12].
Además, se ha estudiado que la CB puede combinarse con materiales como quitosana, poli-etilenglicol (PEG) y gelatina para su potencial de aplicación como aposito [13].
El documento de patente CN103861146 describe un parche de celulosa bacteriana biológica y su método de fabricación. El parche biológico comprende una película de celulosa bacteriana, llamada película CB, donde el grado de polimerización de los rangos de celulosa bacteriana son de 2000 a 20000, la forma cristalina del cristal de celulosa es tipo I, el índice de cristalización es 50 a 95 %, y en parámetros de la célula, a es igual a 0.815 nm, b es igual a 1.025 nm, c es igual a 0.832 nm, y beta es igual a 85 grados. El parche biológico de celulosa bacteriana, tiene excelentes propiedades mecánicas, mejor aptitud biológica, mejor propiedad anti-adhesiva y propiedad antimicrobiana en el entorno enterocoelia, y área apropiada se puede obtener convenientemente. Por su parte el documento de patente CN202699408 U detalla un apósito médico de celulosa bacteriana. Dicho apósito comprende un recubrimiento de celulosa bacteriana, en el que el recubrimiento de celulosa bacteriana es un cuerpo masivo o un cuerpo en forma de escamas, y el espesor del cuerpo masivo o el cuerpo en forma de escamas está entre 0.5 y 8 mm. El apósito médico de celulosa bacteriana, puede ser fabricado como una vestidura seca o un apósito húmedo de acuerdo con las diferencias de las variedades del trauma. El apósito médico de celulosa bacteriana, es razonable en estructura, fuerte en la capacidad de retención de agua, buena en la función hidratante y ligero en peso, y puede ser utilizado sin ponderar sensación de presión. Dicho apósito es bueno en vestiduras justas, no se rompe o fragmenta, se puede adherir con cintas adhesivas y otras piezas de fijación para su uso, y es cómodo de usar.
Actualmente, la diabetes mellitus es una de las enfermedades crónicas de mayor prevalencia en el mundo; hasta el 2010, se estimaba que 285 millones de adultos padecían esta enfermedad, proyectándose que para el 2030 la cifra alcanzaría los 439 millones [14,15].
La diabetes es un trastorno metabólico que se caracteriza por altos niveles de glucosa en el torrente sanguíneo y por los cambios en el metabolismo de carbohidratos, Ifpidos y proteínas causados por alteraciones en la secreción de insulina [16]. Entre los diversos problemas que presentan los pacientes con diabetes está el riesgo de padecer obesidad [17], enfermedades cardio- coronarias, accidentes cerebrovasculares [18-20], nefropatía diabética [21], úlceras de pie diabético (UPD), entre otras, responsables de las altas tasas de mortalidad observadas en los pacientes diabéticos. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que involucra acción simultánea de células sanguíneas, una matriz extracelular y células parenquimales. Este proceso se puede dividir en varias fases: homeostasis/coagulación, inflamación, proliferación (formación de tejido granular), reepitelización y remodelación cutánea [22,23]. Regularmente, este proceso se presenta de forma lineal, pero el proceso de curación en los pacientes diabéticos suele estancarse en una o más etapas, convirtiendo incluso heridas comunes en heridas crónicas [24]. La neuropatía diabética y enfermedad vascular periférica son los principales factores involucrados en las UPD. Estos dos factores pueden actuar solos o en combinación con otras condiciones tales como la enfermedad microvascular, anomalías biomecánicas, movilidad limitada de articulaciones, generando una mayor susceptibilidad a la infección [25,26].
Esta neuropatía crónica afecta aproximadamente al 15 % del total de la población diabética, generando altos gastos médicos y afectando de manera significativa su calidad de vida [27]. Una vez que una UPD se desarrolla, es difícil detener la progresión de la herida, lo que puede conducir a la amputación. Existen investigaciones que demuestran que más del 85 % de las amputaciones del pie en pacientes diabéticos son causados por UPD [28].
Se ha estudiado que para mejorar los procesos de curación de las UPD, las heridas deben cubrirse con biomateriales que protejan de una posible infección y eviten la disección de la herida proporcionando un ambiente húmedo que facilite la cicatrización. En el caso de los apósitos funcionalizados, estos deben presentar una liberación prolongada y eficaz de las sustancias bioactivas aplicadas y una alta resistencia a la degradación durante el proceso de curación [29].
Terapia de regeneración para la piel Tradicionalmente, los materiales utilizados para la reparación de tejido de la piel deben ser absorbentes y permeables a los fluidos. Por ejemplo, las gasas son un material de vendaje tradicional, pero éstas pueden adherirse a la superficie de la herida e inducir trauma al término del tratamiento. Es por esto que el interés por la CB ha aumentado de forma constante debido a su potencial aplicación en la medicina y la industria cosmética [30].
Diversas investigaciones han demostrado que la celulosa y sus derivados pueden estimular la cicatrización a través de la liberación y el mantenimiento de factores terapéuticos, tales como la migración y proliferación de fibroblastos dérmicos y la inhibición del crecimiento de bacterias en las heridas [31-33].
Además, se ha logrado incrementar la biocompatibilidad de los materiales a base de celulosa mediante su combinación con otros polímeros tales como colágeno. Otro ejemplo de apósitos comerciales a base de celulosa es AquaceKB) Hydrofiber WoundDressing (ConvaTec, EE.UU.), derivado antimicrobiano de carboximetil-celulosa que puede absorber fluidos de la herida y crear un gel para mantener un ambiente húmedo. Como se ha mencionado con anterioridad, las características intrínsecas de la CB, la convierten en un excelente producto útil para la ayuda en la cicatrización de lesiones en un animal, la cual pudiera ser aplicada de muchas manera. Por ejemplo, la CB pudiera ser aplicada en un material compuesto, tales como materiales compósitos, apósitos, vendas, cintas adhesivas, telas adhesivas, entre otros.
Los apósitos pueden ser diseñados para las etapas iniciales de la curación de heridas, durante la cual la absorción de fluidos y la aplicación de medicamentos anti-inflamatorios son particularmente benéficos.
Los apósitos con agentes antimicóticos antimicrobianos, con sustancias derivadas de las plaquetas y con las propias células madre del paciente son materiales que pueden disminuir el riesgo de infección y mejoran la cicatrización. Sin embargo, muchos de los materiales utilizados actualmente no representan una opción práctica, ya que la aplicación de estos compuestos es muy costosa, difícil de regular y controlar. Las investigaciones más recientes se centran en el desarrollo de apósitos funcionalizados biocompatibles y biodegradables más eficientes y menos costosos que pueden ofrecer importantes factores de curación para heridas como las UPD [17]. La CB es un compuesto biotecnológico de alto valor agregado, que debido a su alta pureza, biodegradabilidad y biocompatibilidad es una materia prima ideal para aplicaciones biomédicas.
Debido a sus características biológicas, la CB podría ser utilizada para facilitar la difusión y proliferación celular así como para la generación de tejido [35]. La alta resistencia mecánica de las membranas en estado húmedo y su capacidad de hidratación y permeabilidad de líquidos y gases, además de la nula o baja irritación que causa a la piel, convierten a las membranas de CB en un material útil en el cuidado y regeneración de heridas cutáneas [34] y superior al autoinjerto en pacientes con daño severo de la piel [7].
A nivel mundial, se está trabajando en varios métodos de modificación tanto en la obtención como para mejorar las propiedades de la CB para su uso en la piel, los huesos y la reparación del tejido conectivo. En conjunto, se puede suponer que a futuro el éxito de la producción en masa de CB, finalmente conducirá a que se convierta en un biomaterial de vital importancia para su uso en una amplia variedad de productos de consumo, dispositivos médicos y especialmente en la reparación de tejidos de la piel [36]. A pesar de que en el mundo se comercializan diversos productos a partir de CB para la curación de heridas, en México no se ha llevado a cabo una investigación que permita el desarrollo de esta tecnología para contribuir a mejorar la atención y calidad de vida de los pacientes que requieren de regenración de sus tejidos, específicamente los pacientes diabéticos.
Es por ello que se ha desarrollado un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana CB, a partir de bacterias de Komagataeibacter xylinus cepa DSMZ 2004, donde las membranas obtenidas pueden ser útiles en distintas aplicaciones biomédicas, ya sea sola o combinada con otras sustancias. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Análisis por HPLC de azúcares reductores presentes en el mango
Mangifera indica.
Figura 2. Viabilidad celular en andamies de PCL y biocompositos de PCL/CB a
1, 3 y 7 días.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los detalles característicos de la presente invención se muestran claramente en la descripción, figuras y ejemplos, que se acompañan en la presente solicitud de patente de invención, los cuales se incluyen con la finalidad de ilustrar algunas de las realizaciones preferentes de la invención en cuestión, por lo que no deben ser considerados como una limitante para dicha invención. En primera instancia, la presente invención tiene como objeto un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana (CB), a partir de microorganismos del género Acetobacter, reclasificado como Gluconacetobacter y actualmente conocido como Komagataeibacter, más específicamente la especie Acetobacter xylinum, reclasificada como Gluconacetobacter xylinus y actualmente conocida como Komagataeibacter xylinus. Por lo que en este caso, durante la presente descripción, nos referiremos a los géneros Acetobacter, y a la especie Gluconacetobacter xylinus, como Komagataeibacter y Komagataeibacter xylinus, respectivamente, debido a que estas últimas denominaciones son los nombres científicos actuales de los microorganismo utilizados en esta invención.
El método para la producción de celulosa bacteriana, de la presente invención, comprende: inocular un pre-inóculo de un microorganismo del género Komagataeibacter xylinus cepa DSMZ 2004, en un medio de cultivo que contiene: azúcares reductores provenientes del mango Mangifera indica, y extracto de levadura como fuente de nitrógeno; después se incuba a 30 °C, durante 15 días; para después purificar la membrana de celulosa bacteriana obtenida, lavándola con agua destilada a una agitación de 3,200 rpm, para después sumergirla en una solución de NaOH 0.1 M, manteniéndola a 90 °C por 30 min; y finalmente, lavar la membrana de celulosa bacteriana con agua destilada hasta que el pH del agua de lavado es 7. Una modalidad del método de la presente invención, es cuando la relación pre- inóculo y medio de cultivo, es de 1 :20; o más preferentemente, cuando el pre- inóculo del microorganismo de la cepa DSMZ 2004 está en una cantidad de 1 mL y el medio de cultivo en una cantidad de 20 ml_. Una variante más del método en cuestión, es cuando el medio de cultivo contiene 25 g/L de azúcares reductores provenientes del mango (2 g/L glucosa, 6 g/L fructosa, 12 g/L sacarosa) y 10 g/L de extracto de levadura; donde los azúcares reductores provenientes del mango, tienen un pH de 6.5. Una variante más del método en cuestión, es que puede comprender opcionalmente la deshidratación de las membranas de celulosa bacteriana, hasta una humedad de, al menos, un 3 %; para después proceder a moler a dichas membranas, para convertirlas en polvo. Donde el secado de las membranas puede ser por cualquier via, por ejemplo, el secado en horno de vacío a 60 °C y 0.8 MPa, y el otro es liofilizado a -45°C y 0.8 Mpa. Mientras que la molienda también puede llevarse de cualquier manera convencional, por ejemplo como en un molino de bolas (RETSCH MM 400) utilizando una frecuencia 30 1/s y un tiempo de 2 min, para convertir a las membranas en una presentación de polvo.
Un objeto más de la presente invención es una menbrana de celulosa bacteriana (CB) obtenida de conformidad con el método de la presente invención. Donde dicha membrana de celulosa puede tener muchos usos. Por ejemplo, en aplicaciones biomédicas la membrana puede utilizarse en húmedo como apósitos para la curación y recubrimiento de heridas de la piel; por otro lado, dicha membrana puede ser deshidratada y molerse para formar bio- compositos en conjunto con una matriz polimérica.
Por lo tanto, un objeto más de la presente invención es un producto útil en aplicaciones biomédicas, donde dicho producto comprende, al menos, una membrana de celulosa bacteriana en húmedo; y/o membrana de celulosa deshidratada y molida.
Por lo tanto, el producto útil en aplicaciones biomédicas, puede ser: apósitos, compósitos, biocompósitos, vendas, telas y/o cintas adhesivas, entre otros. Donde dicho producto útil en aplicaciones biomédicas puede usarse para ayudar en el tratamiento de cicatrización de heridas, úlceras, quemaduras, llagas, etc., de un paciente animal, incluyendo al humano, y más específicamente en un paciente diabético.
Una modalidad preferente, del producto útil en aplicaciones biomédicas, es que dicho producto sea un biocomposito, el cual a su vez comprenda un 1 % de membrana de celulosa bacteriana en polvo.
El producto útil en aplicaciones biomédicas de acuerdo con la presente invención, puede ser aplicado en una gran cantidad de traumas o heridas de un paciente animal, incluyendo al humano, específicamente pacientes con problemas de diabetes. Algunos de esos traumas o heridas pueden ser, por citar algunos ejemplos, cicatrices, úlceras, heridas, llagas, y toda a quella lesión que requiera de cicatrización. Un objeto más de la presente invención es el uso de la celulosa bacteriana obtenida por el método descrito en la presente invención, para la preparación de un producto útil en aplicaciones biomédicas. Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran el desarrollo y los resultados obtenidos de algunas realizaciones de la presente invención, los cuales, no deben ser considerados como una limitante en el alcance de la presente invención. Estos ensayo se realizaron en el Departamento de Madera, Celulosa y Papel, del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías, de la Universidad de Guadalajara.
Ejemplo 1. Propagación de la cepa Komagataeibacter xylinus.
Se utilizó una cepa de Acetobacter xylinum, reclasificada como Gluconacetobacter xylinus, y actualmente conocida como Komagataeibacter xylinus), la cual fue depositada con el número de acceso DSMZ 2004. La cepa se propagó en un medio Hestrim-Schramm (H-S) convencional. En la mayoría de los casos, el tiempo mínimo para la correcta propagación de la cepa fue de dos semanas, hasta obtener la cantidad requerida.
Para los pre-inóculos se utilizaron 50 mL de medio H-S que se agitaron durante 24 h. De ellos se tomaron 100 microL, los cuales se depositaron en viales con 1 mL de medio H-S convencional, se incubaron durante 48 h, a una temperatura de 30 °C y se congelaron en una solución de glicerol 50%, a una temperatura de -30 °C.
Ejemplo 2. Determinación de la mejor fuente de azúcares, a partir de mango
Mangifera indica.
Para conocer cual era la parte más rica en azúcares reductores del mango Mangifera indica, se sometió a un análisis por HPLC, la pulpa sola del mango y la mezcla de pulpa más fibra de mango. En la figura 1 se gráfico la concentración de los azúcares reductores presentes en el mango. Como se muestra en dicha figura 1, la pulpa de mango tuvo un mayor contenido de azúcares reductores, por lo que fue la materia prima utilizada para la producción del medio de cultivo a utilizar.
Ejemplo 3. Preparación del medio de cultivo idóneo, para la producción de membranas de celulosa bacteriana (CB). Para determinar cual era el medio de cultivo idóneo, se prepararon 6 diferentes medios de cultivo utilizando la pulpa del mango Mangifera indica con una concentración inicial de 25 g/L de azúcares reductores y se evaluó la adición de distintas fuentes de nitrógeno (5:5 g/L de peptona más extracto de levadura, 10 g/L peptona, 10 g/L extracto de levadura, 2.4 g/L urea, 5.3 g/L sulfato de amonio y sin fuente de nitrógeno). El pH inicial de todos los medios se ajustó a 6.5 y fueron esterilizados previos a su inoculación con Komagataeibacter xylinus. Como control se utilizaron medios con mezcla de sacarosa, fructosa y glucosa en la proporción que se encuentran en el mango (12 g/L de sacarosa, 6 g/L de fructosa, 2 g/L de glucosa, 5 g/L peptona, y 5 g/L de extracto de levadura). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
Ejemplo 4. Producción de membranas de celulosa bacteriana, a partir de
Komagataeibacter xylinus. El cultivo estático se llevó a cabo en recipientes de 100 mL (10 cm de diámetro) con 20 mL de medio de cultivo inoculados con 1 mL de pre-inóculo (medio HS) de K. xylinus, incubándose a 30 °C durante 15 días, al término de los cuales se cuantificó la producción de membranas CB y el consumo de azúcares. De esta manera se obtuvieron membranas de celulosa bacteriana después de 15 días de incubación estática a 30 °C en un medio de cultivo que contiene 25 g/L de azúcares reductores provenientes del mango (60 % de sacarosa, 30 % de fructosa y 10 % de glucosa) a pH 6.5 y 10 g/L de extracto de levadura como fuente de nitrógeno. El rendimiento del producto con respecto al consumo de sustrato (Yp/s) fue de 0.3565 g de celulosa bacteriana por cada gramo de azúcar consumido durante la fermentación. Para purificación, la CB obtenida se lavó con agua destilada agitándola con un vortex a 3200 rmp, para después sumergirla en una solución de NaOH 0.1 M, manteniendo a 90 °C por 30 minutos. Posteriormente se lavó con agua destilada hasta que el pH del agua de lavado fue 7. Para la cuantificación de membrana CB producida, se pesaron las membranas obtenidas, luego de la purificación (peso húmedo), posteriormente se congelaron a una temperatura de -30 °C, y se liofilizaron a -45 °C y 0.8 MPa para deshidratarlas a una humedad de un 3%, y volverse a pesar (peso seco), el resultado de esta medición fue la cantidad neta obtenida de CB.
Ejemplo 5. Biocompatibilidad de compositos producidos mediante manufactura aditiva utilizando membrana de celulosa bacteriana como refuerzo.
Se utilizaron membranas de celulosa deshidratadas, obtenidas a partir del medio de cultivo con mango como fuente de carbono, las cuales se molieron en un molino de bolas (RETSCH MM 400) utilizando una frecuencia 30 1/s y un tiempo de 2 min, con lo cual las membranas se convierten en polvo.
Los biocompositos utilizados en este ensayo se obtuvieron por bioimpresión y están formados por policaprolactona (PCL) PM 14000 a 10000 de Sigma Aldrich y 1 % de membrana de celulosa bacteriana (CB) en polvo.
La viabilidad celular se probó utilizando la técnica Alamar Blue, que cuantifíca la actividad metabólica en el andamio. Alamar Blue (AB) es un colorante soluble en agua que ha sido utilizado durante muchos tiempo para la cuantificación in vibro de viabilidad de distintos tipos de células [37,38]. Cuando el reactivo se agrega al cultivo celular, genera una reacción de óxido-reducción en la cual el AB entra en el citosol, aceptando electrones provenientes del NADPH, FADH, FMNH, NADH y de los citocromos. Esta reacción es responsable del cambio en el color del medio de cultivo, que va del azul índigo al rosa fluorescente, el cual puede ser medido fácilmente por colorimetría o lectura por flourométrica [39].
El ensayo se llevó a cabo utilizando fibroblastos de ratón (3T3 cells) sembradas sobre el biocomposito con una densidad de 40 mil células por muestra.
En la gráfica 2 se muestran los resultados de los ensayos 1 , 3 y 7 de cultivo celular para los biocompositos PCL/CB y los andamios de PCL.
Como se muestra en dicha figura 2, existe un incremento significativo en la actividad metabólica para los biocompositos PCL/CB con respecto a las muestras de PCL puro, incluso desde el primer día. Se sugiere que este cambio se deba al incremento en la hidrofilidad del biocomposito dado por la CB, promoviendo una mayor adherencia y desdoblamiento de proteínas y con ello, mayor adhesión celular.
BIBLIOGRAFÍA
[1] Chavez-Pacheco JL; Martinez-Yee S; Contreras-Zentella M; Escamilla- Marván E. (2004). Celulosa Bacteriana en Gluconacetobacter xylinus: Biosíntesis y aplicaciones. D.R. TIP Revista especializada en Ciencias Quimico-Biologicas. Vol. 7:18-25.
[2] Joñas R; Farah L. (1998). Production and applications of microbial cellulose.
Polymer Degradation and Stability. Vol. 59: 101 - 106.
[3] Akerholm M; Salmón L. (2002). Dynamic FT-IR Spectroscopy for carbohydrate analysis of wood pulps. Journal of Pulp and Paper Science. Vol. 7: 245 - 249.
[4] Akerholm M; Hinterstoisser MB; Salmón L. (2004). Characterization of the crystalline structure of cellulose using static and dynamic FT-IR spectroscopy. Carbohydrate Research. Vol. 3: 569-578. [5] Yamada Y; Yukphan P; Lan Vu HT; Muramatsu Y; Ochaikul D; Tanasupawat S; Nakagawa Y. (2012). Description of Komagataeibacter gen. nov., with proposals of new combinations (Acetobacteraceae). Journal of General and Applied Microbiology. Vol. 58:397-404
[6] Jung J; Park J; Chang H. (2005). Bacterial cellulose production by Gluconacetobacter hansenii in an agitated culture without living non- cellulose producing cells. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 3: 347 - 354.
[7] Petersen N; Gatenholm P. (2011). Bacterial cellulose-based materials and medical devices: current state and perspectives. Applied Microbiology Biotechnology. Vol. 91:1277-1286.
[8] Helenius G; Báckdahl H; Bodin A; Nannmark U; Gatenholm P; Risberg B.
(2006) In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Material Research. Vol. 76A: 431-438.
[9] Esguerra M; Fink H; Laschke MW; Delbro D; Jeppsson A; Gatenholm P;
Menger MG; Risberg B. (2010). Intravital fluorescent microscopio evaluation of bacterial cellulose as scaffold for vascular grafts. Journal of Biomedical Material Research. Vol. 93A: 140-149.
[10] Fontana JD, Desouza AM, Fontana CK, Torriani IL, Moreschi JC, Gallotti BJ, Desouza SJ, Narcisco GP, Bichara JA, Farah LF (1990) Acetobacter cellulose pellicle as a temporary skin substitute. Appl Biochem Biotechnol 24-25:253-264. doi: 10.1007/ BF02920250
[11] Czaja W, Krystynowicz A, Bielecki S, Brown RM (2006) Microbial cellulose— the natural power to heal wounds. Biomaterials 27:145-151.
[12] Czaja WK, Young DJ, Kawecki M, Browm RM (2007) The future prospecte of microbial cellulose in biomedical applications. Biomacromolecules
[13] Ougiya H, Watanabe K, Morinaga Y, Yoshinaga F (1997) Emulsión effect of bacterial cellulose. Biosci Biotech Biochem 61 : 1541-1545.
[14] Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. (2010) Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract; 87:4- 14. [15] Whiting DR, Guariguata L, Weil C, Shaw J. (2011) IDF Diabetes Atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract;84:311-21.
[16] Ahmed I, Glodstein B. Diabetes mellitus. (2006) Clin Dermatol;24:237-46.
[5]
[17] Moura, L. I. F., Días, A. M. A., Carvalho, E., & De Sousa, H. C. (2013).
Recent advances on the develpment of wound dressing for diabetic fbot ulcer treatment - A review. Acta Biomaterialia, 9(7), 7093-7114.
[18] Kyaw Tun, T., McGowan, A., Phelan, N., Correia, N., Boran, G., O'Connor, A. L, Gibney, J. (2016). Obesity and Insulin Resistance Are the Main Determinants of Postprandial Lipoprotein Dysmetabolism in Polycystic Ovary Syndrome. International joumal of endocrinology.
[19] Srikanth S, Deedwania P. (2011) Primary and secondary prevention strategy for cardiovascular disease in diabetes mellitus. Cardiovasc Clin;29:47-70.
[21] Giménez M, López JJ, Castell C, Conget I. (2012) Hypoglycaemia and cardiovascular disease in Type 1 Diabetes. Results from the Catalán National Public Health registry on insulin pump therapy. Diabetes Res Clin Pract;96:e23-5.
[22] Enoch S, Leaper DJ. (2008) Basic science of wound healing.
Surgery;26:31-7.
[23] Li J, Chen J, Kirsner R. (2007) Pathophysiology of acute wound healing.
Clin Dermatol;25:9-18.
[24] Falanga V. (2005) Wound healing and its impairment in the diabetic foot.
Lancet;366: 1736-43
[25] Rathur HM, Bloulton AJM. (2005) Recent advances in the diagnosis and management of diabetic neuropathy. J Bone Joint Surg;87:1605-10.
[26] Snyder BJ, Waldman BJ. (2009) Venous thromboembolism prophylaxis and wound healing in patients undergoing major orthopedic surgery. Adv Skin Wound Care ;22:311-5
[27] Brem H, Tomic-Canic M. (2007) Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes. J Clin Invest; 117:1219-22. [28] Snyder BJ, Waldman BJ. (2009) Venous thromboembolism prophylaxis and wound healing in patients undergoing major orthopedic surgery. Adv Skin
Wound Care;22:311-5
[29] Jannesari M, Varshosaz J, Morshed M, Zamani M. (2011) Composite poly(vinyl alcohol)/poly(vinyl acétate) electrospun nanofibrous mats as a novel wound dressing matrix fbr controlled reléase of drugs. Int J
Nanomed ¡6:993-1003.
[30] Hornung, M., Biener, R., & Schmauder, H. P. (2009). Dynamic modelling of bacterial cellulose formation. Engineering in Life Sciences, 9(4), 342-347.
[31] Jung K, Kim Y, Kim H, Jin H. (2009). Antimicrobial properties of hydrated cellulose membranes with silver nanoparticles. J Biomater Sci Polym
Ed;20:311-24.
[32] Seráfica G, Mormino R, Oster GA, Lentz KE, Koehler KP. (2010) Microbial cellulose wound dressing for treating chronic, wounds. US7704523 B2.
[33] Cullen MB, Silcock DW, Boyle C. (2010) Wound dressing comprising oxidized cellulose and human recombinat collagen. Patent US 20107833790 B2.
[34] Keshk, S. M. A. S. (2014). Bacterial Cellulose Production and its Industrial Applications, 4(2).
[35] Kirdponpattara, Suchata, Khamkeaw, Arnon, Sanchavanakit, Neeracha, Pavasant, Prasit, Phisalaphong, Muenduen. (2015). Structural modification and characterization of bacterial cellulose-alginate composite scaffolds for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 132:146-155.
[36] Lina Fu, Jin Zhanga, Guang Yang (2013). Present status and applications of bacterial cellulose-based materials for skin tissue repair. Carbohydrate Polymers 92:1432-1442
[37] Ahmed, S. A., Gogal, R. M , & Walsh, J. E. (1994). A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an altemative to [3H] thymidine incorporation assay. Joumal of immunological methods, 170(2), 211 -224.
[38] Fields, R. D., & Lancaster, M. V. (1993). Dual-attribute continuous monitoring of cell proliferation/cytotoxicity. American biotechnology laboratory, 11(A), 48. [39] Al-Nasiry, S., Geusens, N., Hanssens, M., Luyten, C, & Pijnenborg, R. (2007). The use of Alamar Blue assay for quantitative analysis of viability, migration and invasión of choriocarcinoma cells. Human reproduction, 22(5), 1304-1309.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para la producción de membranas de celulosa bacteriana, el cual comprende: i) inocular un pre-inóculo de un microorganismo del género Komagataeibacter xylinus cepa DSMZ 2004, en un medio de cultivo que contiene: azúcares reductores provenientes del mango Mangifera indica, y extracto de levadura como fuente de nitrógeno; ii) incubar a 30 °C, durante 15 días;
iii) purificar las membranas de celulosa bacteriana obtenida, lavándolas con agua destilada a una agitación de 3,200 rpm, para después sumergirlas en una solución de NaOH 0.1 M, y manteniéndolas a 90 °C por 30 min; y
iv) lavar las membranas de celulosa bacteriana con agua destilada hasta que el pH del agua de lavado es 7.
2. El método de la reivindicación anterior, donde la relación pre-inóculo y medio de cultivo, es 1 :20.
3. El método según la reivindicación anterior, donde el pre-inóculo del microorganismo de la cepa DSMZ 2004 está en una cantidad de 1 ml_ y el medio de cultivo en una cantidad de 20 ml_.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el medio de cultivo contiene 25 g/L de azúcares reductores provenientes del mango (60 % de sacarosa, 30 % de fructosa y 10 % de glucosa) y 10 g/L de extracto de levadura. 5. El método de conformidad con la reivindiación precedente, donde los azúcares reductores provenientes del mango, tienen un pH de 6.
5.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende opcionalmente: deshidratar las membranas de celulosa bacteriana, hasta una humedad de, al menos, un 3 %; y
moler las membranas de celulosa deshidratadas, para convertirlas en polvo.
7. Una membrana de celulosa bacteriana, caracterizada porque es obtenida con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. La membrana de la reivindicación anterior, útil en aplicaciones biomédicas.
9. Un producto útil en aplicaciones biomédicas, caracterizado porque comprende, al menos, una membrana de celulosa bacteriana de conformidad con la reivindicación anterior.
El producto de la reivindicación precedente, donde la membrana de celulosa bacteriana está en un estado húmedo.
11. El producto según la reivindicación 9, donde la membrana de celulosa bacteriana está en un estado de polvo.
12. El producto de la reivindicación 8, donde dicho producto se selecciona del siguiente grupo: apósitos, compósitos, biocompósitos, vendas adhesivas, telas adhesivas, y/o cintas adhesivas.
13. El producto de acuerdo con la reivindicación anterior, donde el producto es un biocompósito.
14. El producto según las reivindicaciones 11 y 13, donde la membrana de celulosa bacteriana, en polvo, está en una cantidad de 1 %.
15. El producto según la reivindicación 9, donde las aplicaciones biomédicas se refieren a la cicatrización de heridas, úlceras, quemaduras, y/o llagas, de un paciente animal.
16. El producto de acuerdo con la reivindicacación anterior, donde el paciente animal, es un paciente humano.
17. El producto tal y como se reclama en la reivindicación precedente, donde el paciente humano, es un paciente diabético.
18. El uso de membranas de celulosa bacteriana, de conformidad con la reivindicación 7, para la preparación de un producto útil en aplicaciones biomédicas.
19. El uso de la reivindiación anterior, donde el producto útil en aplicaciones biomédicas, se selecciona del siguiente grupo: apósitos, compósitos, biocompósitos, vendas adhesivas, telas adhesivas, y/o cintas adhesivas.
20. El uso según la reivindicación 16, donde la aplicación biomédica se refiere a la cicatrización de heridas, úlceras, quemaduras, y/o llagas, de un paciente animal.
21. El uso de acuerdo con la reivindicacación anterior, donde el paciente animal es un paciente humano.
22. El uso tal y como se reclama en la reivindicación precedente, donde el paciente humano, un paciente diabético.
PCT/MX2017/000120 2016-12-08 2017-10-20 Método para la producción de mebranas de celulosa bacteriana, útil en aplicaciones biomédicas WO2018106099A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MXMX/A/2016/016227 2016-12-08
MX2016016227A MX2016016227A (es) 2016-12-08 2016-12-08 Método para la producción de membranas de celulosa bacteriana, útil en aplicaciones biomédicas.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018106099A1 true WO2018106099A1 (es) 2018-06-14

Family

ID=62492064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/MX2017/000120 WO2018106099A1 (es) 2016-12-08 2017-10-20 Método para la producción de mebranas de celulosa bacteriana, útil en aplicaciones biomédicas

Country Status (2)

Country Link
MX (1) MX2016016227A (es)
WO (1) WO2018106099A1 (es)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111068103A (zh) * 2020-02-06 2020-04-28 牡丹江医学院 一种手术伤口用长效抑菌凝胶敷料及其制备方法
CN109136140B (zh) * 2018-09-08 2021-06-01 佛山市森昂生物科技有限公司 一种生物基凝固胶
WO2023053145A1 (en) * 2021-10-01 2023-04-06 Council Of Scientific And Industrial Research An Indian Registered Body Incorporated Under The Regn. Of Soc. Act (Act Xxi Of 1860) A composition for anti-bacterial bio-cellulosic patches useful for transdermal drug delivery and a process for the preparation thereof
WO2024063737A1 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Atatürk Üni̇versi̇tesi̇ Rektörlüğü Bi̇li̇msel Araştirma Projeleri̇ ( Bap ) Koordi̇nasyon Bi̇ri̇mi̇ Production and use of bacterial cellulose in pure form or by impregnation of various agents and produced in spherical form for bone regeneration, alone and in combination with various graft materials

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925514A (zh) * 2012-11-23 2013-02-13 海南椰国食品有限公司 芒果在生物纤维素发酵培养基中的用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925514A (zh) * 2012-11-23 2013-02-13 海南椰国食品有限公司 芒果在生物纤维素发酵培养基中的用途

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBU ET AL.: "Morphology and thermal stability of bacterial cellulose/collagen composites", CENTRAL EUROPEAN JOURNAL OF CHEMISTRY, vol. 12, no. 9, 2014, pages 968 - 975, XP055510532 *
ASHJARAN, A. ET AL.: "Overview of bio nanofabric from bacterial cellulose", JOURNAL OF TEXTILE INSTITUTE, vol. 104, no. 2, 2013, pages 121 - 131, XP055418981 *
FAN ET AL.: "Production of nano bacterial cellulose from beverage industrial waste of citrus peel and pomace using Komagataeibacter xylinus", CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 151, 2016, pages 1068 - 1072, XP029661926 *
FU, L. ET AL.: "Present status and applications of bacterial cellulose based materials for skin tissue repair", CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 92, 2013, pages 1432 - 1442, XP028972948 *
GARCIA-SANCHEZ, M.E. ET AL.: "Bacterial cellulose produced by Gluconacetobacter xylinus culture using complex carbon sources for biomedical applications", MRS ADVANCES, 2016, pages 2563 - 2565, XP055510534 *
GONZALEZ-GARCIA, Y. ET AL.: "Bacterial cellulose production by Komagataeibacter xylinus using a culture medium based on mango waste supplemented with different nitrogen sources", J. CHEM. ENG. PROCESS. TECHNOL., vol. 8, no. 4, 2017, pages 79, XP055510535 *
KESHK, S.M: "Bacterial cellulose production and its industrial applications", JOURNAL OF BIOPROCESSING AND BIOTECHNIQUES, vol. 4, no. 2, 2014, pages 1 - 10, XP055409709 *
KUROSUMI A. ET AL.: "Utilization of various fruit juices as carbon source for production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum NBRC 13693", CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 76, no. 2, 2009, pages 333 - 335, XP025913434 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136140B (zh) * 2018-09-08 2021-06-01 佛山市森昂生物科技有限公司 一种生物基凝固胶
CN111068103A (zh) * 2020-02-06 2020-04-28 牡丹江医学院 一种手术伤口用长效抑菌凝胶敷料及其制备方法
CN111068103B (zh) * 2020-02-06 2020-12-18 牡丹江医学院 一种手术伤口用长效抑菌凝胶敷料及其制备方法
WO2023053145A1 (en) * 2021-10-01 2023-04-06 Council Of Scientific And Industrial Research An Indian Registered Body Incorporated Under The Regn. Of Soc. Act (Act Xxi Of 1860) A composition for anti-bacterial bio-cellulosic patches useful for transdermal drug delivery and a process for the preparation thereof
WO2024063737A1 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Atatürk Üni̇versi̇tesi̇ Rektörlüğü Bi̇li̇msel Araştirma Projeleri̇ ( Bap ) Koordi̇nasyon Bi̇ri̇mi̇ Production and use of bacterial cellulose in pure form or by impregnation of various agents and produced in spherical form for bone regeneration, alone and in combination with various graft materials

Also Published As

Publication number Publication date
MX2016016227A (es) 2018-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. A composite hydrogel of chitosan/heparin/poly (γ-glutamic acid) loaded with superoxide dismutase for wound healing
Lei et al. Optimization of human-like collagen composite polysaccharide hydrogel dressing preparation using response surface for burn repair
WO2018106099A1 (es) Método para la producción de mebranas de celulosa bacteriana, útil en aplicaciones biomédicas
Hu et al. In vitro biodegradability and mechanical properties of bioabsorbable bacterial cellulose incorporating cellulases
Lin et al. Effects of different extracellular matrices and growth factor immobilization on biodegradability and biocompatibility of macroporous bacterial cellulose
ES2373676T3 (es) Vendajes para heridas que comprenden celulosa oxidada y colágeno recombinante humano.
CN1167366C (zh) 壳聚糖、胶原和海藻酸钙复合海绵生物敷料及其制备工艺
Wang et al. In vitro biodegradability of bacterial cellulose by cellulase in simulated body fluid and compatibility in vivo
CN102357259A (zh) 一种生物蛋白海绵及其制备方法
Hu et al. In-situ formable dextran/chitosan-based hydrogels functionalized with collagen and EGF for diabetic wounds healing
US20100172889A1 (en) Degradable biomolecule compositions
Petzold et al. Alginate as a versatile polymer matrix with biomedical and food applications
CN104857552A (zh) 一种止血贴及其制备方法
CN105797203A (zh) 海藻酸纤维基胶原海绵敷料及其制备方法
CN103083112B (zh) 一种具备疏密结构的细菌纤维素皮肤修复材料及其制备方法
CN103083136B (zh) 一种三明治结构的细菌纤维素液体吸收性材料及其制备方法
Yang et al. Copper ion/gallic acid MOFs-laden adhesive pomelo peel sponge effectively treats biofilm-infected skin wounds and improves healing quality
Aleemardani et al. A hydrogel–fiber–hydrogel composite scaffold based on silk fibroin with the dual‐delivery of oxygen and quercetin
Thomas A review of the physical, biological and clinical properties of a bacterial cellulose wound
CN100384485C (zh) 处理慢性创伤的微生物纤维素创伤敷料
CN110623792A (zh) 一种医学敷料及其制备方法
CN103394113B (zh) 一种创可贴
CN110464876A (zh) 一种负载生长因子细菌纤维素/生物陶瓷复合膜
CN113842492A (zh) 一种负载积雪草提取物的水凝胶/非织造材料复合敷料
TWI792730B (zh) 綠梔子素交聯聚乙烯醇/明膠/竹炭奈米顆粒複合材料及其製備方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17879285

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17879285

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1