CN111729126B - 一种基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料及其制备方法，目的是止血时间短，止血效果好；止血材料主要成分及其以质量单位份计的配方是：壳聚糖100份、人重组组织因子0.1毫份‑0.2毫份、磷脂0.04份‑0.06份、海藻糖0.1份‑0.2份、CaCl2 0.04份‑0.08份；制备方法是先制备人重组组织因子和磷脂高压成乳化液，再按每克羧甲基壳聚糖中加0.02毫升的乳化液配制羧甲基壳聚糖与人重组组织因子混合物；在‑40℃至‑80℃下预冻5‑10小时后进行真空冷冻干燥；在环境温度15‑20℃，湿度30%的条件下，研磨过100目筛成粉，即为外用快速止血材料。

Description

一种基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种止血组合物，是一种外用的快速的止血材料。
背景技术
血液是流动在人的血管和心脏中的一种红色不透明的粘稠液体，具有运输、防御及调节渗透压、酸碱平衡和人体温度的生理功能，是维持生命的重要物质。成年人的总血量占体重的8%左右，约为4000～5000毫升，当发生外伤出血，血管破裂时，短时间内丢失总血量的1/3以上，就会表现为脸色苍白，出冷汗，血压下降，脉搏细弱等，甚至发生休克，导致死亡等。因此，快速的止血和凝血，是心、脑、肾等重要脏器的供血保证，生命的保障。各种创伤一般都会有出血，是来自血管内的压力使血液流出。在微量出血时，常可自行凝固止血，这是人体自身具有止血凝血的生理功能。在受伤出血时，血管断裂端会自行收缩，减少失血，释放外源凝血系统的启动蛋白组织因子，激活血液中的凝血因子，生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块，防止血液丢失。但是，在大量出血时，就需要采取一定方式处理，快速让血液停止向外流动，这个过程也叫止血。止血是由血管壁、血小板和凝血因子三者的相互作用的结果。血管受损破裂后，①血管收缩，管腔变狭，使损伤部位的血流减慢。②血管损伤部位粘附的血小板被激活，发生聚集反应，形成血小板止血栓。③损伤的血管壁释放出组织因子，直接激活血液凝固系统，形成凝血块，加快血小板凝聚到伤口的边缘，并互相缠结，使血液快速凝固。因此，止血材料都是依据血管壁、血小板和凝血因子这三者来开发和应用的。目前，常用的止血材料主要有：① 通过物理或化学作用短时间提高伤口附近的血液凝血因子的浓度，比如沸石、高岭土、氯酸盐、明胶、海藻酸盐等，能够快速吸收血液中的水分，提高局部凝血因子浓度；②通过直接激活或参与凝血系统，比如壳聚糖聚集红细胞和血小板、氧化纤维素络合铁离子成血块、凝血酶、凝血因子、短肽类等启动凝血系统；③通过强粘着进行物理封闭血管，比如丙烯酸酯类、PEG等合成高分子，能够形成粘性很强的胶体，封堵血管。现在市场上常用的止血材料中，如明胶，无抗原性易吸收，快速吸水膨胀激活血小板，形成血凝块，但存在动物源性和组织炎性的问题；沸石能够快速吸水，提高凝血因子浓度，促进凝血，但因吸收水分放出大量的热，伤口局部温度会超过90摄氏度，导致皮肤灼伤，影响伤口愈合；壳聚糖作为新一代止血药，具有良好的生物相容性，可以生物降解，无排斥反应，它的分子直接将创面上的血小板和红细胞聚集在一起，促进血液凝固，但单纯使用壳聚糖的止血效果还是有限的。为此，良好的止血材料应该具有快速止血、无动物源性、较好的生物相容性、无毒等特点。
发明内容
本发明目的是为克服上述已有技术的不足，提供了一种在壳聚糖的基础上定量添加人重组组织因子，具有止血时间短、止血效果好的基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料及其制备方法。
本发明中的止血材料由人重组组织因子、壳聚糖、磷脂、钙组成。组织因子是一个由263 个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，其中219 个氨基酸残基位于细胞膜外，23个氨基酸残基则穿过细胞膜，21个氨基酸残基位于细胞质内。正常情况,组织因子位于血管壁外膜细胞，包绕血管的成纤维细胞，肝、脾、肾等器官的纤维囊，及皮肤外层的表皮细胞、肾小球上皮细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、胃肠道壁等，而在血管中膜或内膜层却很稀少。因此在正常情况下组织因子不存在于循环血液中或不与循环血液接触,只有当血管壁的完整性遭到破坏时组织因子才暴露于循环血液，通过激活凝固级联反应快速发挥止血作用。人重组组织因子是包含人组织因子胞外部分和跨膜部分的重组蛋白，含有243个氨基酸残基，是经过基因工程菌发酵、表达、纯化等工艺过程制备、无动物来源的基因工程产品，具有天然全长组织因子的凝血活性。在血管壁受损、组织损伤的情况下，人重组组织因子能够特异性地结合凝血因子VII ，形成凝血因子VII/VIIa结合复合物，迅速激活凝血因子Ⅹ，产生凝血酶，进而催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白并聚合成纤维蛋白血块。因此，人重组组织因子作为一种新型的基因工程产品，在较少用量的情况下，可快速激活凝血反应，又避免动物来源，是一种理想的止血材料。
壳聚糖为天然多糖，是一种带有正电荷、游离氨基和游离羟基的碱性聚氨基葡萄糖，白色粉末，无臭，无味，具有可降解、生物相容性好的特点，如Celox和Hem Con作为第三代止血辅料已经应用。这些产品不依赖正常的凝血因子而独立发挥作用，带正电荷的产品颗粒与带负电荷的血小板、红细胞交叉结合，形成血凝块。这个过程是物理作用，没有凝血因子的参与，激活凝固级联反应较慢，时间较长。本发明的壳聚糖是指羧甲基壳聚糖，是一种水溶性壳聚糖衍生物，脱乙酰度大于90%。
本发明利用组织因子的启动凝血功能，快速激活凝血酶，结合壳聚糖集聚血小板和红细胞的物理作用，制备一种止血材料，实现快速凝血。
本发明止血材料的配比是：壳聚糖100克（份）、人重组组织因子0.1毫克（份）-0.2毫克（份）、磷脂0.04克（份）-0.06克（份）、海藻糖0.1克（份）-0.2克（份）、CaCl2为0.04克（份）-0.08克（份）；通过特定的工艺制备而成。
制备方法如下：
（1）制备人重组组织因子乳化液：
以磷脂和水相融为一体形成乳浊液这个过程称之为乳化，采用高压均质与滤膜挤出法，即可制造出所需粒径大小均一，结构稳定的微粒。利用这种方法制成的乳化液中可将微粒大小控制到100-200纳米范围。
称取磷脂2克-3克、海藻糖5克-10克、CaCl2为2克-4克、人重组组织因子0.005克-0.01克，加水至100毫升，充分搅拌，混合均匀；采用高压均质机加挤出器系统乳化，操作温度为10℃-20℃，压力400bar-800bar均质，挤出器加200纳米滤膜挤出，反复8-10次，形成结构均一、性能稳定的脂滴微粒，该溶液为乳浊液，即人重组组织因子乳化液，其中脂滴粒径大小在100-200纳米之间。
其中磷脂为：磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的混合物，两种磷脂混合比例是磷脂酰胆碱为60%-80%，磷脂酰丝氨酸为20%-40%。
（2）配制混合物：首先配制质量百分比浓度为20%的羧甲基壳聚糖水溶液，即称取20克羧甲基壳聚糖，加入至100毫升水中，搅拌；缓慢添加步骤（1）制备的乳化液，充分搅拌均匀，控制温度15℃-20℃，获得混合物；其中羧甲基壳聚糖与乳化液的比例为:每克羧甲基壳聚糖中加0.02毫升的乳化液；每克复合物中实际人重组组织因子的量为1-2微克；
（3）干燥：将步骤2的混合物在-40℃至-80℃下预冻5-10小时，之后进行真空冷冻干燥，控制真空度0.01bar以下，冻干物料温度-40至15℃，干燥时间24-48小时。
（4）研磨：将步骤（3）的冻干物在环境温度15-20℃，湿度25-30%的条件下，研磨过筛（100目）成粉，即为本发明的外用快速止血材料。
所述磷脂为磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的混合物，两种磷脂混合比例是磷脂酰胆碱为60%-80%，磷脂酰丝氨酸为20%-40%。
所述人重组组织因子是按照中国专利“人重组组织因子的构建表达、纯化方法及其应用”（专利号200510012414.7）制得；由太原博奥特生物技术有限公司生产。
本发明提供了一种新型的快速止血材料及其制备方法，主要适用于皮肤外伤出血，用于局部出血部位，可直接使用或者通过载体材料使用，如纱布。
本发明采用了凝血因子和壳聚糖的定量组合，利用人重组组织因子启动凝血的功能和壳聚糖的促凝作用，由羧甲基壳聚糖聚焦血小板和红细胞的物理作用和人重组组织因子快速激活凝血系统的生化作用共同实现，克服单纯使用壳聚糖凝血时间较长的不足；与现有的壳聚糖类止血材料相比，止血时间短、止血效果良好，具有稳定快速的止血效果，能够保证伤口的快速止血。
附图说明
图1为通过纳米粒度测定仪测定的乳化液中脂滴粒径大小分布图；
图2为本发明止血材料体外全血凝固时间试验效果图；
图3为本发明止血材料家兔耳缘静脉止血试验效果图。
图1是采用纳米粒度分析仪测量的乳化液中脂滴微粒尺寸。测量时，将乳化液用水溶液液稀释100倍，取1ml样品加入比色皿中，放入机器内检测，重复三次，取平均值确定脂滴颗粒的大小，图中为实施例2乳化液中脂滴微粒的分布图，结果表明脂滴微粒直径为155nm左右，呈结构均一、性能稳定的纳米微粒。
具体实施方式
实施例1：本发明一种基于壳聚糖和组织因子组合止血材料的制备方法是：
（1）称取磷脂酰胆碱1.2g，磷脂酰丝氨酸0.8g，5g海藻糖，2.5g氯化钙， 0.005g人重组组织因子蛋白，用水配制成混和溶液100ml，充分混匀，用高压均质机加挤出器进行乳化，操作压力600bar，温度10℃-20℃，高压均质，加200纳米的滤膜挤出，反复10次，形成乳浊液，即为人重组组织因子乳化液，其中脂滴微粒的平均粒径大小为100-200纳米之间。
（2）称取5000克羧甲基壳聚糖，加入25升水中，将步骤1的乳化液100ml缓慢加入，充分搅拌混匀，控制温度15℃-20℃。
（3）干燥：将步骤2的混合物在-80℃下予冻5小时，然后装入冷冻干燥箱中冷冻干燥，控制真空度0.01bar以下，冻干物料温度-40℃至15℃，干燥时间48小时。
（4）将步骤3的冻干物在温度15℃-20℃，湿度30%以下，研磨过100目筛成粉，即为止血材料。
实施例2：一种基于壳聚糖和组织因子组合止血材料的制备方法是：
（1）称取磷脂酰胆碱2.1g，磷脂酰丝氨酸0.9g，7.5g海藻糖，3g氯化钙， 0.005g人重组组织因子蛋白，用水配制成混和溶液100ml，充分混匀，用高压均质机加挤出器进行乳化，在温度10-20C°压力600bar下高压均质，挤出器加200纳米滤膜挤出，反复10次，形成乳浊液，即为人重组组织因子乳化液。其中脂滴微粒的平均粒径大小为155纳米左右。
（2）称取5000克羧甲基壳聚糖，加入25升水中，将步骤1的乳化液100ml缓慢加入，充分搅拌混匀，控制温度15℃-20℃。
（3）干燥：将步骤2的混合物在-80℃下予冻10小时，然后装入冷冻干燥箱中冷冻干燥，控制真空度0.01bar以下，冻干物料温度-40℃至15℃，干燥时间48小时。
（4）制备止血材料：将步骤3的冻干物在温度15℃-20℃，湿度30%以下，研磨过100目筛成粉，即为止血材料。
实施例3：一种基于壳聚糖和组织因子组合止血材料的制备方法是：
（1）称取磷脂酰胆碱2.1g，磷脂酰丝氨酸0.9g，7.5g海藻糖，3g氯化钙， 0.01g人重组组织因子蛋白，用水配制成混和溶液100ml，充分混匀，用高压均质机加挤出器进行乳化，在操作温度10-20C°压力650bar条件下高压均质，挤出器加200纳米滤膜挤出，反复8次，形成乳浊液，即为人重组组织因子乳化液。其中脂滴微粒的平均粒径大小为100-200纳米之间。
（2）称取5000克羧甲基壳聚糖，加入25升水中，将步骤1的乳化液100ml缓慢加入，充分搅拌混匀，控制温度15℃-20℃。
（3）干燥：将步骤2的混合物在-80℃下予冻10小时，然后装入冷冻干燥箱中冷冻干燥，控制真空度0.01bar以下，冻干物料温度-40℃至15℃，干燥时间24小时。
（4）制备止血材料：将步骤3的冻干物在温度15℃-20℃，湿度30%以下，研磨过100目筛成粉，即为止血材料。
针对上述实施例1-3所制备的止血材料进行体外全血凝固时间测试：
1、止血材料：实施例1、实施例2、实施例3制备的止血材料分别取0.01g,0.02g,0.05g,0.1g,0.2g涂撒在9cm2包扎布上，用于观察止血现象。
2、采血：用5ml注射器抽取兔子静脉血液4ml，按照9:1加入0.109M柠檬酸钠抗凝剂，备用。
3、凝血实验：分别取0.5ml血滴加于上述止血布上，记录凝血时间并观察血凝现象。
4、凝血结果：止血材料0.05g以上时，凝血时间短，凝血现象明显（参见表1、图2）。
表1.本发明止血材料体外全血凝固时间测试结果一栏表
Figure 653301DEST_PATH_IMAGE002
利用实施例2制备的止血材料进行家兔耳缘静脉止血试验测试：
1、止血材料：实施例2制备的止血材料，分别取0.05g,0.1g涂撒在9cm2包扎布上，同时涂撒0.1g羧甲基壳聚糖于包扎布上，用于观察止血现象。
2、用手术刀在兔子耳部静脉处切开静脉血管，制造出血创面。
3、用涂覆止血材料的包扎布分别进行按压止血，记录凝血状态及止血时间。
4、止血结果：本发明止血材料止血时间短，具有良好的止血效果（参见表2、图3）。
表2. 本发明止血材料家兔耳缘静脉止血测试结果一栏表
组别 止血材料用量（g） 出血量（ml） 止血时间（s） 现象
（1） 羧甲基壳聚糖0.01 2.5 450 形成止血凝固形态差，一触碰会再次出血
（2） 实施例2止血材料0.005 1 120 一次凝固效果好，无二次出血
（3） 实施例2止血材料0.01 1 110 一次凝固效果好，无二次出血

Claims (5)

1.一种基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料制备方法，其特征是：
（1）制备乳化液：称取磷脂2克-3克、海藻糖5克-10克、CaCl2为2克-4克、人重组组织因子0.005克-0.01克，加水至100毫升，充分搅拌，混合均匀；采用高压均质机加挤出器系统乳化，操作温度为10℃-20℃，压力400bar-800bar均质，挤出器加200nm滤膜挤出，反复8-10次，形成结构均一的脂滴乳浊液，即为所需的乳化液；脂滴的粒径大小在100-200纳米之间；人重组组织因子是按照专利号2005100124147、名称为“人重组组织因子的构建表达、纯化方法及其应用”的中国专利制得；
（2）配制混合物：首先配制质量百分比浓度为20%的羧甲基壳聚糖水溶液，即称取20克羧甲基壳聚糖，加于100毫升水中搅拌；之后缓慢添加步骤（1）制备的乳化液，充分搅拌均匀，控制温度15℃-20℃，获得混合物；羧甲基壳聚糖与乳化液的比例为:每克羧甲基壳聚糖中加0.02毫升的乳化液；
（3）干燥：将上述混合物在-40℃至-80℃下预冻5-10小时，之后进行真空冷冻干燥，控制真空度0.01bar以下，冻干物料温度-40至15℃，干燥时间24-48小时；
（4）研磨：将上述冻干物在环境温度15-20℃，湿度25-30%的条件下，研磨过筛成粉状的外用止血材料。
2.如权利要求1所述基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料制备方法，其特征是所述磷脂为磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的混合物，两种磷脂混合质量比例是磷脂酰胆碱为60%-80%，磷脂酰丝氨酸为20%-40%。
3.如权利要求1所述基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料制备方法，其特征是每克混合物中人重组组织因子含量为1-2微克。
4.如权利要求1所述基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料制备方法，其特征是最后将冻干物研磨过100目筛成粉状止血材料。
5.一种如权利要求1-4任一制备方法所得到的基于壳聚糖和组织因子组合的止血材料，其特征是其主要成分及其以质量单位份计的配方是：壳聚糖100份、人重组组织因子0.1毫份-0.2毫份、磷脂0.04份-0.06份、海藻糖0.1份-0.2份、CaCl2 为0.04份-0.08份。
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