CN105979960A - 包含酶原的一组分纤维蛋白胶 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种单组分封闭剂制剂(例如为液体形式)、它的制备方法和用途。该制剂包括纤维蛋白原；至少包括因子II(FII)和因子X(FX)的维生素K依赖性凝结酶原。

Description

包含酶原的一组分纤维蛋白胶

技术领域

本文提供一种单一组分封闭剂制剂(例如为液体形式)、它的制备方法和它的使用方法。

技术领域

纤维蛋白封闭剂也称为纤维蛋白胶，已在临床中使用了数十年(参见例如，Tabélé等人，J Pharm Pharmaceut Sci 2012,15:124–140；Dickneite G等人，Thrombosis Res2003,112:73–82)。通常，纤维蛋白封闭剂由两种液体组分组成，包含纤维蛋白原的组分和包含凝血酶的组分，此类组分由于它们固有的不稳定性被冷冻储存。有时纤维蛋白封闭剂产品由两种冷冻干燥的组分组成，所以需要就在使用之前重构以及通过连接的注射器或其它双筒递送装置进行递送。冷冻干燥的制剂通常是稳定的，但是纤维蛋白原组分难以重构。

纤维蛋白封闭剂凝块通过涉及纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反应形成。凝血酶通过酶促作用将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，速率由凝血酶的浓度确定。因子XIII作为血液凝固系统的酶，使纤维蛋白凝块交联并且稳定。此过程绕过了正常凝固的大多数步骤，并且模拟其最终阶段。一些制造商将抗蛋白溶解剂添加到纤维蛋白胶制剂中(例如，如WO93/05822中所述)或特异性除去纤溶酶原以使纤维蛋白溶解停止或延迟(例如，如美国专利5,792,835和7,125,569中所述)。

凝血酶组分含有作为丝氨酸蛋白酶的凝血酶，并且可来自人或动物(例如，牛或猪)来源或重组产生。纤维蛋白原组分可来自人或动物来源或重组产生。在将两种组分溶液混合之后，凝血酶裂解纤维蛋白原，因此使纤维蛋白原生成纤维蛋白聚合物/封闭剂。

凝血酶显示出对纤维蛋白原的高特异性并且裂解纤维蛋白原分子中的限定序列，但是在非常高的浓度下，凝血酶可发生自动蛋白溶解。凝血酶的自动蛋白溶解特性可导致纤维蛋白封闭剂的凝血酶组分的活性减小和不稳定性。

背景技术包括美国专利5,219,328；5,318,524；8,367,802；6,500,427；5,750,657；6,262,236；6,268,483；和美国专利申请公布2013/0149292。

发明内容

本文提供单一组分稳定的封闭剂制剂、制造方法和使用方法，从而消除了涉及制造、制备和/或使用已知封闭剂制剂的繁琐的步骤。

在一个方面，本文提供一种封闭剂制剂，其包含有效量的纤维蛋白原、至少包括因子II(FII)和因子X(FX)的维生素K依赖性凝结酶原和至少一种维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂；其中该制剂不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

在另一个方面，本文提供一种不含钙的封闭剂制剂，其包含纤维蛋白原和至少包括因子II和因子X的维生素K依赖性凝结酶原。

针对纤维蛋白原、维生素K依赖性凝结酶原和可逆抑制剂的术语“有效量”为如此，即实际上很少或没有过早的活化(例如凝固、凝结和/或从酶原向活性酶的转化)发生，然而制剂在稀释、中和、阻断和/或除去可逆抑制剂之后自发地凝固并且形成封闭剂。例如，自发的凝固和封闭剂形成可通过出血表面接触、在小分子交换之后和/或添加活化剂例如游离钙而发生。

在一些实施方案中，制剂还包含因子V(FV)。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原还包括因子IX(FIX)。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原还包括因子VII(FVII)。

在一些实施方案中，因子X、因子VII和/或因子IX至少部分地为它们的活性形式。

在一些实施方案中，制剂为液体形式。在一些实施方案中，制剂包含药学上可接受的载体。液体制剂表现出延长的稳定性并且在选自由约2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃和8℃组成的组的环境温度下保持稳定至少14天。在一些实施方案中，液体制剂在约2℃至8℃的温度下保持稳定约30天、35天、45天、60天和多至90天或更长时间。“环境温度”为保存封闭剂制剂的周围的温度。

在一些实施方案中，液体制剂在约2℃和高至室温的范围内的环境温度下稳定约或至少7天。

在某些实施方案中，液体制剂在室温下稳定约30天。

“室温”通常是指约20℃至25℃的温度。

液体制剂可为水性液体制剂。

稳定性可通过在制剂中观察到最小限度的自发凝结或不存在自发凝结来确定，例如制剂在不存在活化剂诸如游离钙时不示出或具有自发凝结，并且在暴露于钙时保持它的凝结活性水平。制剂的凝结活性水平或形成封闭剂的能力可体外和/或体内确定。稳定性还可通过在即可上架(shelf-ready)的水性制剂中测量并观察到存在最小限度的纤维蛋白形成或不存在纤维蛋白形成来确定。

纤维蛋白聚合或凝结可例如通过在倾斜表面上测量迁移长度(或下落试验模型)或通过本领域中已知的任何其它方法来测量。充分聚合可通过液体制剂在倒置之后的流动停止来评价。迅速聚合可使用Stat4凝结分析仪Stago Diagnostics或类似的测凝计测量。

术语“活化剂”是指可引发、促进和/或加速酶原转化成活性酶的试剂。本文的术语“活化剂”可与术语“引发剂”互换使用。

在一个实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原的来源为凝血酶原-前转化素-斯图亚特因子-抗血友病因子B(Prothrombin-Proconvertin-Stuart Factor-AntihemophilicFactor B；PPSB)和/或三因子或四因子凝血酶原复合物浓缩物(PCC)。

在一些实施方案中，PPSB包括因子II、VII、IX和X。

在一些实施方案中，PCC包括因子II、IX和X(三因子PCC)并且可还包括因子VII(四因子PCC)。

在各种实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原为至少包括FII和FX的维生素K依赖性凝结酶原的浓缩物，此类浓缩物相比于这些酶原在血浆中的浓度被浓缩约2-50倍，如所归一化至因子II。浓缩物可被浓缩约5倍至约40倍、约10倍或约20倍。

在各种实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原为PPSB浓缩物或浓缩的至少包括FII、FIX和FX的维生素K依赖性凝结酶原，此类浓缩物相比于这些酶原在血浆中的浓度被浓缩约2-50倍，如所归一化至因子II。PPSB浓缩物可被浓缩约5倍至约40倍、约10倍或约20倍。

在一些实施方案中，纤维蛋白原以约1mg/ml至2mg/ml、1mg/ml至110mg/ml、10mg/ml至110mg/ml诸如约40mg/ml至70mg/ml的有效量存在于制剂中。

在一个实施方案中，活性组分：纤维蛋白原、维生素K依赖性凝结酶原和至少一种维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂的比率为如此，即实际上很少或没有过早的活化(例如凝固、凝结和/或从酶原向活性酶的转化)发生，然而制剂在稀释、除去可逆抑制剂、阻断和/或中和抑制剂之后，例如通过与出血表面接触和/或在小分子交换之后和/或添加活化剂例如游离钙，而自发地凝固并形成封闭剂。

“维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂”为有效地防止或减少过早的活化(例如凝固、凝结和/或从酶原向活性酶的转化)的试剂。

在一些实施方案中，制剂不含添加的凝血酶。因此，不需要凝血酶抑制剂，并且制剂不含添加的不可逆凝血酶抑制剂或基本上不含不可逆凝血酶抑制剂。不可逆凝血酶抑制剂包含这样的一组分子，此类分子共价地或利用非常高亲和力(例如以皮摩尔水平)结合凝血酶，例如水蛭素，和/或破坏凝血酶上的官能团或使凝血酶失活。例如，水蛭素和抗凝血酶III在本文被视为此类不可逆凝血酶抑制剂的示例。在一些实施方案中，制剂不含水蛭素。在一个实施方案中，制剂不含抗凝血酶III。

结合术语“不含添加的凝血酶”和“不含添加的不可逆凝血酶抑制剂”的术语“不含添加的”意指制剂未补充有凝血酶或不可逆凝血酶抑制剂。然而应当指出的是，制剂可包含低含量的凝血酶(例如小于1IU/ml的制剂)和/或最初存在于制剂中的不可逆凝血酶抑制剂(例如小于5μM)和/或在制剂中自发形成的凝血酶。

制剂包括至少一种维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂。此类抑制剂为可大体上防止引发和/或延迟酶原转化成活性酶的试剂。抑制剂可选自肝素、钙螯合剂、可逆丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂、以及此类抑制剂的组合。

通常，可逆抑制剂涉及对蛋白质活性不具有永久性作用的低亲和力抑制剂。因此，通常稀释将除去抑制作用。

至少一种维生素K依赖性凝结酶原可逆抑制剂可为肝素。抑制活性酶生成的维生素K依赖性凝结酶原可逆抑制剂可为钙螯合剂，例如柠檬酸根离子、EDTA、EGTA、草酸盐、或此类钙螯合剂的组合。

在一些实施方案中，钙螯合剂为例如由柠檬酸钠提供的柠檬酸根离子。制剂可包括约1mM至约50mM的柠檬酸钠或约5mM至约25mM的柠檬酸钠。在一些实施方案中，钙螯合剂为EDTA和/或EGTA。制剂可包括约0.1mM至约2.5mM的EDTA和/或EGTA。在一些实施方案中，钙螯合剂为草酸盐。在一些实施方案中，制剂包括柠檬酸根离子、草酸盐和EDTA和/或EGTA的组合，例如EDTA和由柠檬酸钠提供的柠檬酸根离子。在一些实施方案中，制剂包含约0.1mM至约2.5mM的EDTA和/或EGTA。

在一些实施方案中，至少一种维生素K依赖性凝结酶原可逆抑制剂为丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂，例如精氨酸、赖氨酸、苯甲脒、或此类丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂的组合。制剂可包括例如以约0.1％至约5％(w/v)的量的精氨酸、约0.5％至约4％(w/v)的精氨酸、或约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％(w/v)的精氨酸。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原(U)与纤维蛋白原(mg可凝结蛋白质)的比率为约0.01至约1.0，如所归一化至因子IX或因子II，维生素K依赖性凝结酶原包括PPSB、至少包括FII、FIX和FX的维生素K依赖性凝结酶原或PCC。在一些实施方案中，比率为约0.05至约0.2或约0.1至约0.2。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原(U)与纤维蛋白原(mg可凝结蛋白质)的比率为约0.01至约1.0，如所归一化至因子II，维生素K依赖性凝结酶原包括PPSB、至少包括FII和FX的维生素K依赖性凝结酶原或PCC。在一些实施方案中，比率为约0.05至约0.2或约0.1至约0.2。

制剂优选为无菌的并且不含病原体，例如通过巴氏灭菌和/或过滤。

上文所公开的制剂可用于例如止血、愈合、和/或外科，包括但不限于移植物固定、创伤愈合和吻合部位的封闭。制剂还可用于整形外科，例如腹壁整形术；皮肤和内部器官移植物固定；组织愈合；灼伤治疗；和/或减弱创伤出血。此外，制剂可用于例如在颅或脊椎外科中的硬脑膜封闭。

因此，在一个方面，提供一种向受治疗者的表面提供止血治疗、移植物固定、创伤愈合和/或吻合的方法，该方法包括向该表面施用根据本发明的制剂。该方法包括但不限于腹壁整形术；组织愈合；灼伤治疗；和硬脑膜封闭。受治疗者可为人受治疗者。

在另一个方面，提供一种根据本发明的制剂，该制剂用于愈合、止血和/或外科。用途包括但不限于移植物固定；创伤愈合；吻合；腹壁整形术；组织愈合；灼伤治疗；和硬脑膜封闭。

在另一个方面，本文提供一种用于在表面处制备封闭剂的方法，该方法包括：

a)提供根据本发明的制剂；以及

b)在促进纤维蛋白在表面处聚合的条件下将制剂施用至表面。

表面可为受治疗者的出血或未出血表面。表面还可为例如体表、外部或内部身体器官、血管或移植组织或器官。

在一些实施方案中，以上方法中所述的条件涉及将制剂直接施用到手治疗者的出血或未出血表面。

公开了若干活化条件。例如，可将PPSB和纤维蛋白原的混合物直接施用到出血部位上，在这种情况下，抑制剂被稀释并且浓缩的酶原和纤维蛋白原起作用以迅速导致止血。

在一些实施方案中，条件涉及(i)除去、稀释、阻断和/或中和至少一种维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂，和/或(ii)添加至少一种维生素K依赖性凝结酶原的小分子活化剂。

小分子活化剂可为磷脂或阳离子，例如钙阳离子或其它二价阳离子，诸如镁、铁或锌，或它们的组合。在一些实施方案中，阳离子为由CaCl₂提供的钙阳离子。

在一些实施方案中，小分子活化剂为磷脂，诸如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或磷脂酰乙醇胺。

小分子活化剂或可逆抑制剂具有多至1千道尔顿的分子量。

在各种实施方案中，除去或稀释至少一种维生素K依赖性凝结酶原的抑制剂的步骤通过在施用到受治疗者的表面之前或期间使制剂通过小分子交换装置，例如柱，来进行。

通常，小分子交换为将一组小分子用另一组置换。通常，柱中的树脂用最终制剂中所需的小分子和/或促进和/或加速酶原转化成活性酶的小分子预平衡。树脂珠粒通常为多孔的，孔在待置换的那些分子的分子量的范围内。在一个实施方案中，使包含酶原和纤维蛋白原的液体制剂通过装填有多孔树脂的柱。溶液中的酶原和纤维蛋白原将太大以至于不能进入树脂的孔并且将快速地通过柱。不受机制的束缚，溶液或制剂中的小分子，例如可逆抑制剂，将沿一条更曲折的路径行进，因为它们能够进入并再离开树脂的孔，因此大大减缓了它们通过树脂床的迁移速率。那些使树脂预平衡的小分子享有显著领先的优点，并由此与蛋白质(酶原和纤维蛋白原)一起离开树脂。因此，缓冲盐和其它小分子在这个步骤中得以交换。

在一些实施方案中，至少一种维生素K依赖性凝结酶原抑制剂在受治疗者的出血或未出血创伤或内部或外部器官的表面处被稀释。受治疗者可为人患者。小分子交换装置包括例如水、盐水、CaCl₂或其它二价阳离子，和/或磷脂。

在一些实施方案中，添加小分子活化剂的步骤通过在施用到表面之前或期间使制剂通过包括小分子活化剂的小分子交换装置来进行。

在另一个实施方案中，小分子被手动添加。在一些实施方案中，小分子活化剂选自磷脂和二价阳离子，诸如钙和铁阳离子。小分子交换装置可含有例如含钙阳离子的缓冲液。

在治疗方法、治疗用途和/或形成/制备/制造封闭剂的方法的一些实施方案中，制剂中的维生素K依赖性凝结酶原至少包括因子II、因子X并可还包括因子VII和/或因子IX。维生素K依赖性凝结酶原的来源可为例如凝血酶原-前转化素-斯图亚特因子-抗血友病因子B(PPSB)和/或凝血酶原复合物浓缩物(PCC)。在一些实施方案中，PPSB包括因子II、VII、IX和X。PCC可包括因子II和X并可任选地还包括因子IX、因子V和/或因子VII。在一个实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原来源为PPSB浓缩物，相比于血浆中的酶原浓度被浓缩约2-50倍，如所归一化至因子IX和/或因子II。PPSB浓缩物可被浓缩约4倍至40倍、约5倍至40倍、约10倍或约20倍。

在治疗方法、治疗用途和/或形成/制备/制造封闭剂的方法的一些实施方案中，制剂包括药学上可接受的载体。在一些实施方案中，制剂为液体制剂。

在方法的优选实施方案中，液体制剂在约2℃至8℃的环境温度下保持稳定至少14天。在一些实施方案中，液体制剂在约2℃至8℃的环境温度下保持稳定至少30天、45天、60天、多至90天或更长时间。

在一些实施方案中，液体制剂在约2℃和高至室温的范围内的环境温度下稳定约或至少7天。

在某些实施方案中，液体制剂在室温下稳定约30天。

在一些实施方案中，制剂不含添加的凝血酶并且基本上不含不可逆凝血酶抑制剂，诸如水蛭素。优选地，制剂不含添加的抗凝血酶III或基本上不含作为不可逆凝血酶抑制剂的抗凝血酶III。

至少一种维生素K依赖性凝结酶原的抑制剂选自肝素(不存在添加的抗凝血酶III时)、钙螯合剂、可逆丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂、以及此类抑制剂的组合。维生素K依赖性凝结酶原抑制剂可为肝素。维生素K依赖性凝结酶原抑制剂可为钙螯合剂，例如柠檬酸根离子、草酸盐、EDTA、EGTA、或此类钙螯合剂的组合。在一些实施方案中，钙螯合剂为例如由柠檬酸钠提供的柠檬酸根离子。制剂可包括约1mM至约50mM的柠檬酸钠或约5mM至约25mM的柠檬酸钠。

在一些实施方案中，钙螯合剂为EDTA和/或EGTA。制剂可包括约0.1mM至约2.5mM的EDTA和/或EGTA。在一些实施方案中，钙螯合剂为草酸盐。制剂可包括柠檬酸根离子和EDTA和/或EGTA的组合，例如柠檬酸钠和EDTA。

在治疗方法、治疗用途和/或形成/制备/制造封闭剂的方法的一些实施方案中，制剂中至少一种维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂为丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂，例如精氨酸、赖胺酸、苯甲脒、或此类可逆丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂的组合。制剂可包括以约0.1％至约5％(w/v)的量的精氨酸、约0.5％至约4％或约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％的精氨酸。

在治疗方法、治疗用途和/或形成/制备/制造封闭剂的方法的一些实施方案中，制剂中PPSB、维生素K依赖性凝结酶原或PCC(U)与纤维蛋白原(mg可凝结蛋白质)的比率为约0.01至约1.0，如所归一化至因子IX和/或因子II。在一些实施方案中，比率为约0.05至约0.2或约0.1至约0.2。

还提供一种容器，其包含本文所公开的制剂。在一些实施方案中，容器为安瓿、小瓶、试管或注射器等等。制剂可为液体或固体。

在各种实施方案中，提供一种含有本发明的制剂的注射器或施用器，该注射器或施用器附接到小分子交换装置。装置包括维生素K依赖性凝结酶原的小分子活化剂。小分子活化剂可为例如磷脂或二价阳离子，诸如钙阳离子和/或铁阳离子。小分子交换装置可含有例如含钙阳离子的缓冲液。

在另一个方面，提供一种试剂盒，其包含诸如安瓿、小瓶或注射器的容器，该容器包括上文所公开的制剂；任选地，试剂盒包括小分子交换装置和/或使用说明。试剂盒可包括至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如安瓿、小瓶、注射器和试管。容器可由例如玻璃、金属或塑料制成。

在一些实施方案中，小分子交换装置为凝胶过滤柱，例如供重力流和/或离心使用的约0.5ml至约5ml的一次性脱盐柱。装置可包括溶剂，例如水或盐水，和/或可包括至少一种维生素K依赖性凝结酶原的小分子活化剂，此类分子为例如CaCl₂。装置还可为任何构造的任何可商购获得的凝胶过滤装置。

本文还公开一种制造根据本发明的封闭剂制剂的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供纤维蛋白原组分；

b)提供包含维生素K依赖性凝结酶原的组分，维生素K依赖性凝结酶原至少包括FII、FX和任选地FIX和/或FVII；

c)提供包含至少一种维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂的组分；以及

d)掺和a)至c)的组分；其中掺和的组分不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

组分可以任何组合的形式提供，例如纤维蛋白原组分可与包含可逆抑制剂的组分组合；纤维蛋白原组分可与维生素K依赖性凝结酶原组分组合；并且/或者维生素K依赖性凝结酶原可与可逆抑制剂组合。

术语“掺和”意指以任何次序、任何组合和/或亚组合的形式混合组分。

在一些实施方案中，至少一种组分包含FV。在另一个实施方案中，包含FV的附加组分与组分a)至c)掺和。

在一些实施方案中，至少一种组分以液体形式提供，从而得到液体制剂。

液体制剂可通过包括诸如冻干的干燥步骤来干燥。

在一个实施方案中，制造方法还包括干燥步骤，从而得到干燥制剂。

还提供一种可通过制造根据本发明的封闭剂制剂的方法获得的封闭剂制剂。

在另一个方面，本发明提供一种封闭剂制剂，其包含纤维蛋白原；至少包括因子II、因子IX和因子X的维生素K依赖性凝结酶原；和至少一种维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂，其中制剂不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。在另一个方面，本发明提供一种用于在表面制备封闭剂的方法，该方法包括：提供上文所公开的制剂；以及在促进纤维蛋白在表面聚合的条件下将制剂施用到表面。

在某些实施方案中，促进纤维蛋白聚合的条件包括通过使制剂在施用到受治疗者的表面之前或期间通过小分子交换装置来除去、中和、阻断和/或稀释至少一种维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂。在一些实施方案中，至少一种维生素K依赖性凝结酶原抑制剂在受治疗者的出血或未出血创伤或内部或外部器官的表面处被稀释。受治疗者可为人患者。小分子交换装置包括例如水、盐水、CaCl₂或其它二价阳离子和/或磷脂。

在各种实施方案中，除去、阻断、中和或稀释至少一种维生素K依赖性凝结酶原的抑制剂是通过将制剂直接施用到受治疗者身体部分的表面来进行。例如，表面可为血管或出血组织或器官。

在另一个方面，本发明提供一种不含钙的封闭剂制剂。此类制剂可通过捕集初始存在于一种组分中的所有钙，例如通过使用诸如EDTA或EGTA的螯合剂捕集钙，以及例如通过使用尺寸排阻过滤器除去所形成的钙-螯合剂复合物来获得。

因此，本文提供一种例如为液体形式的不含钙的封闭剂制剂，其包含纤维蛋白原；和至少包括因子II、因子X和任选地因子IX的维生素K依赖性凝结酶原。

术语“不含钙的”意指含有小于1.25mmol/L的制剂。在一个实施方案中，制剂还不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

在一些实施方案中，此类不含钙的制剂不含螯合剂。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原还包括因子VII。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原为PPSB、PPSB血浆级分或PCC。

在一些实施方案中，维生素K依赖性凝结酶原为PPSB血浆级分或PCC。

在一些实施方案中，制剂不含添加的凝血酶。

在一些实施方案中，不可逆凝血酶抑制剂选自由以下项组成的组：水蛭素、小分子凝血酶抑制剂和抗凝血酶III。

本文提到的可逆和不可逆抑制剂可为合成的或天然的。

维生素K依赖性凝结酶原可为浓缩物，相比于血浆中的维生素K依赖性凝结酶原浓度被浓缩约2-50倍，如所归一化至因子IX和/或因子II，例如PPSB的凝血酶原复合物浓缩物(PCC)。在一些实施方案中，PCC为三因子PCC或四因子PCC。PPSB或PCC(U)与纤维蛋白原(mg可凝结蛋白质)的比率为约0.01至约1.0，如所归一化至因子IX和/或因子II。

制剂可还包含至少一种维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂，其中至少一种维生素K依赖性酶原的抑制剂选自由以下项组成的组：肝素(不存在添加的抗凝血酶III时)、丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂、以及维生素K依赖性凝结酶原的此类抑制剂的组合。

在一些实施方案中，至少一种维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂为丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂选自由以下项组成的组：精氨酸、赖氨酸、苯甲脒、以及此类丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂的组合。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂为精氨酸。

制剂可用于止血、封闭、组织粘合、移植物固定、创伤愈合或吻合。

还提供一种用于在表面制备封闭剂的方法，该方法包括：提供不含钙的液体制剂以及在促进纤维蛋白在表面聚合的条件下将制剂施用到表面。

在一些实施方案中，表面为血管或内部或外部身体器官。

在一些实施方案中，条件包括添加维生素K依赖性凝结酶原的小分子活化剂，例如钙阳离子，从而致使纤维蛋白聚合。

在各种实施方案中，添加小分子活化剂是通过使制剂在施用到受治疗者的表面之前或期间通过小分子交换装置来进行。小分子交换装置包括例如水、盐水、CaCl₂或其它二价阳离子和/或磷脂。

根据本发明的制剂可保存在例如安瓿、试管、小瓶或注射器的容器中。

还提供一种试剂盒，包括根据本发明的制剂或容器、小分子交换装置；和任选地使用说明。

还提供一种制造不含钙的封闭剂制剂的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供纤维蛋白原组分；

b)提供包含维生素K依赖性凝结酶原的组分，维生素K依赖性凝结酶原至少包括FII、FX和任选地FIX和/或FVII；

c)任选地提供至少一种维生素K依赖性凝结酶原的抑制剂；

d)掺和a)和b)或a)至c)的组分。

在一个实施方案中，组分a)至c)中的每一种不含不可逆凝血酶抑制剂。

在一些实施方案中，至少一种组分以液体形式提供，从而得到液体制剂。在一些实施方案中，制剂经过干燥。

在另一个方面，提供一种向受治疗者的表面提供止血治疗；移植物固定、创伤愈合和/或吻合的方法，该方法包括向表面施用不含钙的封闭剂制剂，制剂包含有效量的纤维蛋白原；和至少包括FII、FX的维生素K依赖性凝结酶原，以及任选地至少一种维生素K依赖性凝结酶原和/或因子IX和/或因子VII的抑制剂；其中制剂不含不可逆凝血酶抑制剂。

封闭剂制剂可用于治疗，但不限于腹壁整形术；组织愈合；灼伤治疗；和硬脑膜封闭、止血；移植物固定；创伤愈合；吻合。表面可为出血或未出血表面。

本发明提供一种在有需要的受治疗者中愈合和/或减少失血的方法，该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的根据本发明的制剂。

术语“治疗有效量”是指预防、改善和/或治疗疾病、病症或病状所需的剂量。有效剂量可根据受治疗者的年龄和体重、疾病或病状、它的严重性和本领域技术人员可认识到的其它因素而变化。

在另一个方面，提供一种不含钙的封闭剂制剂，其包含有效量的纤维蛋白原；和至少包括FII、FX的维生素K依赖性凝结酶原，以及任选地至少一种维生素K依赖性凝结酶原和/或FIX的可逆抑制剂；其中制剂不含不可逆凝血酶抑制剂，用于止血；移植物固定；创伤愈合；吻合。用途包括但不限于腹壁整形术；组织愈合；灼伤治疗；和硬脑膜封闭。

本文所公开的制剂中维生素K依赖性凝结酶原可还包括因子IX和/或因子VII。

本文所公开的制剂可还包含因子V。

纤维蛋白原可由初始血液组合物制备。血液组合物可为全血或血液级分，即全血制品，诸如血浆。纤维蛋白原可为自体的、人来源(包括汇集血浆)或非人来源。还可能的是，纤维蛋白原通过重组方法来制备或可被化学改性。

在本发明的一个实施方案中，纤维蛋白原溶液包含作为来源于血浆的蛋白质溶液的生物活性组分(BAC)，纤维蛋白原溶液可还包含纤维蛋白溶解剂诸如氨甲环酸和/或稳定剂，诸如精氨酸、赖氨酸、它们药学上可接受的盐、或它们的混合物。BAC可来源于冷析出物，尤其是浓缩的冷析出物。

术语“冷析出物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4℃的温度下)解冻，导致形成含有纤维蛋白原和因子XIII的析出物时，可获得冷析出物。析出物可例如通过离心来收集并溶解于合适的缓冲液中，诸如含有120mM的氯化钠、10mM的柠檬酸三钠、120mM的甘氨酸、95mM的盐酸精氨酸的缓冲液。BAC的溶液可包含附加因子，诸如像因子VIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等，例如US6,121,232和WO9833533中所述。BAC的组合物可包含稳定剂，诸如氨甲环酸和盐酸精氨酸。BAC的溶液中氨甲环酸的量可为约80mg/ml至约110mg/ml。

在另一个实施方案中，例如5μg/ml或更低的纤溶酶原，例如使用如US 7,125,569、EP 1,390,485和WO02095019中所述的方法，将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低至等于或低于15μg/ml。在另一个实施方案中，当将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低时，组合物不含有氨甲环酸或抑肽酶。

纤维蛋白原溶液可为含有BAC2组分(来自)或任何其它纤维蛋白原的溶液，诸如经纯化的重组纤维蛋白原或从人血浆产生的冷析出物。

在参阅以下详细的具体实施方式和附图后，本发明的这些和其它方面和实施方案将变得显而易见。

附图说明

图1示出PPSB/BAC2(BAC2作为纤维蛋白原的来源)液体制剂在将它施用到涂布有组织因子和钙的一块真皮(来源于牛皮)上之后的纤维蛋白凝结。凝块形成通过监测制剂的胶凝和制剂停止流动的事实来确定。凝血酶的形成(左边培养皿，箭头)通过在施用到经过涂布的真皮之后30秒凝块的着色(将生色凝血酶底物添加到样品中)来观察。图示出施用之后3分钟的凝块。利用包含盐水和BAC2的液体溶液，未观察到凝结或颜色(右边培养皿)。

图2A为示出将递增百分比的以10X浓度(10IU因子II/ml)所制备的PPSB添加到BAC2(纤维蛋白原)对凝结时间的影响的图。图2B为示出改变因子II和BAC2的比率对凝结时间的影响的图。

图3示出以不同比率的包括以10X浓度(10IU因子II/ml)所制备的PPSB和BAC2的制剂相比于包括血浆和BAC2的制剂的凝结时间。

图4A示出通过使制剂通过市售的用缺乏CaCl₂的缓冲液预平衡的柱来经受小分子交换的PPSB-纤维蛋白原液体制剂。即使在若干天之后也未发生凝结。

图4B示出通过使制剂通过市售的用包括40mM的CaCl₂的缓冲液预平衡的柱来经受小分子交换的PPSB-纤维蛋白原液体制剂。在交换之后，纤维蛋白凝块在12-24分钟内自发形成。

图5示出PPSB-BAC2制剂中递增的钙浓度(8-40mM)对凝块形成速率的影响。

图6示出在4℃或23℃下具有或不具有肝素的PPSB:纤维蛋白原液体制剂的凝结时间。

具体实施方式

在一个方面，本发明涉及一种封闭剂制剂，其包含纤维蛋白原；至少包括因子II和因子X的维生素K依赖性凝结酶原；和至少一种维生素K依赖性凝结酶原的可逆抑制剂，其中制剂不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

本发明部分地基于以下发现，即包含凝血酶原(例如包括因子II、IX、X和VII的PPSB)和纤维蛋白原(例如BAC2)的单一制剂可用作生物封闭剂、是稳定的并且表现出长储存寿命，如通过制剂例如在长时间储存之后形成凝块的能力所确定。稳定性可通过在制剂中观察到最小限度的自发凝结或不存在自发凝结来确定，例如制剂在不存在诸如游离钙的活化剂时不示出或具有自发凝结，并且在暴露于活化剂时具有可接受的凝结活性水平。

据发现，在2-8℃下储存PPSB:纤维蛋白原制剂多至28天或多至90天得到在CaCl₂添加时具有快的凝结时间的稳定制剂。不受理论束缚，在2-8℃下储存之后，虽然受精氨酸和柠檬酸盐的抑制，但是可发生因子X、VII和/或IX酶原向活性构象的转化，从而缩短了(在添加钙之后)活化凝血酶的生成所需的时间，并且因此缩短了凝块形成所需的时间。据发现，当2-8℃储存的制剂包含0.125IU/mL肝素时，这种快速凝结被防止。

据发现，在RT下储存PPSB:纤维蛋白原制剂多至28天得到在CaCl₂添加时具有大体上不变的凝结时间的稳定制剂。

在一个实施方案中，制剂包含为它们活性形式的因子X、VII和/或IX。

据发现，快的凝结时间在存在CaCl₂和组织因子两者时获得。

在另一个方面，本发明涉及一种不含钙的制剂并且包括纤维蛋白原和至少包括因子II和因子X的维生素K依赖性凝结酶原。

在一些实施方案中，制剂还包含因子IX和/或因子VII。

本发明部分地基于以下发现，即包含凝血酶原和纤维蛋白原的单一制剂可用作生物封闭剂、是稳定的并且表现出长储存寿命，如通过制剂形成凝块的能力所确定。稳定性可通过在制剂中观察到最小限度的自发凝结或不存在自发凝结来确定，例如制剂在不存在诸如游离钙的活化剂时不示出或具有自发凝结，并且在暴露于活化剂时具有可接受的凝结活性水平。

术语“稳定的”和“稳定性”当指代液体混合物时大体上意指在制剂接触活化剂之前和/或在除去、中和、阻断和/或稀释可逆抑制剂之前，制剂中不存在纤维蛋白聚合/凝结。

制剂的凝结活性水平或形成封闭剂的能力可体外和/或体内确定。稳定性还可通过在即可上架的水性制剂中测量和/或观察到存在最小限度的纤维蛋白形成或不存在纤维蛋白形成来确定。

凝结可例如通过在倾斜表面上测量迁移长度(或下落试验模型)或通过本领域中已知的任何其它方法来测量。充分凝结可通过液体制剂例如在倒置时的流动停止来评价。迅速聚合可使用Stat4凝结分析仪Stago Diagnostics或等同的测凝计测量。

可接受的凝结活性水平意指例如制剂在以下情形中形成凝块的能力：在钙添加之后30分钟或更少时间内，以及在钙和组织因子添加之后5分钟内；和/或体内在例如在钙添加和/或与组织因子(例如，内源性组织因子)接触之后5分钟内。

在一个实施方案中，制剂形成凝块的能力的范围为在含有组织因子的出血表面上在30秒和120秒之间，并且在未出血表面上在60秒和600秒之间。

作为凝血酶的非活性前体的凝血酶原不显示蛋白溶解活性，直到酶的活性形式通过凝血酶原被因子Xa(活化的因子X)蛋白溶解裂解而生成。当需要时，凝血酶原可活化成凝血酶以将纤维蛋白原转化成纤维蛋白并且伴随纤维蛋白聚合。与凝血酶和纤维蛋白原相反，凝血酶原和纤维蛋白原一起在溶液中是稳定的。

在一个实施方案中，凝血酶原(因子II)连同因子X被包括在本文所公开的制剂中，从而实现制剂的活化。因子VII和因子IX被任选地包括。不受理论束缚，凝血酶原的存在和伴随的凝血酶的不存在提供了纤维蛋白原向纤维蛋白的动力学转化可受到良好控制的制剂。纤维蛋白封闭剂可因此用于经典封闭剂无效的适应症中，例如移植物固定。内源性活化的酶原可促进凝血酶原在创伤部位向凝血酶的转化。

在一个实施方案中，非活性酶前体(也称为酶原)的混合物称之为PPSB。

在一些实施方案中，PPSB的浓缩物为凝血酶原复合物浓缩物(PCC)。PCC可为具有FII、FIX和FX的三因子PCC(3F-PCC)或还包括因子VII的四因子PCC(4F-PCC)。

本文公开一种纤维蛋白封闭剂，其中形成纤维蛋白所需的所有组分都存在于单一制剂中，该单一制剂可从单一注射器进行施用，从而改善了易用性和便利性。

除非上下文中明确地指出，否则本文所用的不定冠词“一个(a)”和“一个(an)”意为“至少一个”或“一个或多个”。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、以及它们的语法变体应被视为指定所述特征、步骤或组分，但不排除添加一种或多种另外特征、步骤、组分或它们的组。

当数值前面为术语“约”时，术语“约”旨在指示+/-10％。

“凝血酶”或“凝血酶多肽”为哺乳动物丝氨酸蛋白酶，此类酶为血液凝固级联的部分并且将纤维蛋白原转化成组装成不溶解的纤维蛋白链的纤维蛋白单体，以及催化其它凝固相关的反应。在人中，凝血酶原由F2基因编码，并且所得多肽在凝固级联中被蛋白溶解裂解以形成凝血酶。凝血酶尤其用作若干止血产品中的活性组分。例如，纤维蛋白封闭剂通常包含纤维蛋白原组分和凝血酶组分。当两种组分混合时(例如当施用到出血创伤时)，凝血酶裂解纤维蛋白原并且纤维蛋白聚合物形成。

凝血酶为丝氨酸蛋白酶，此类酶由作为酶原前体的凝血酶原(因子II)被另一种丝氨酸蛋白酶(因子Xa)裂解产生。人凝血酶为由通过二硫键接合的两个多肽链构成的295个氨基酸的蛋白质。

本领域认识到各种凝血酶抑制剂。不可逆凝血酶抑制剂包含共价结合凝血酶或利用非常高亲和力结合凝血酶的一组分子和/或破坏凝血酶上的官能团或使凝血酶失活的一组分子。例如，水蛭素和抗凝血酶III在本文被视为此类不可逆凝血酶抑制剂。凝血酶与抗凝血酶III结合，使得凝血酶不从复合物释放出来。如本文所用，利用高亲和力(亚微摩尔)结合凝血酶的凝血酶抑制剂被认为是不可逆的。一种此类示例为水蛭素，水蛭素在皮摩尔范围内结合凝血酶。

在一些实施方案中，本文所公开的制剂不含添加的凝血酶并且不含凝血酶抑制剂。维生素K依赖性凝结酶原可提供为例如PPSB或PCC。20倍PPC浓缩物的示例为(Octapharma,Vienna)。PPC的非限制性示例包括等等。

对于长期储存，将制剂等分到无菌小瓶、安瓿或其它容器中，例如注射器或其它施用器，然后将它们封闭。在一个实施方案中，使用允许利用注射器穿过封闭件移除制剂的容器。根据药学或医疗装置领域的标准操作标记容器。使用时，封闭剂制剂可根据单个患者的需要并且根据出血的严重性直接从容器使用。制剂可施用到出血组织以实现止血。

本文所公开的液体制剂的优点在于，它在约2℃至8℃的环境温度下保持稳定至少14天、30天、45天、60天或多至90天，或在约2℃和高至室温的范围内的环境温度下保持稳定至少7天，并且在室温下保持稳定约30天。

制剂的稳定性是通过试验制剂在(i)除去、稀释、中和和/或阻断至少一种维生素K依赖性凝结酶原的抑制剂和/或(ii)添加维生素K依赖性凝结酶原的小分子活化剂时形成封闭剂的能力进行评价。

根据本发明的试剂可以是冷冻的或冻干的。

尤其是，本发明制剂的优点是多方面的并且可以是以下中的至少一个：储存寿命长，例如，如本文所定义是稳定的；纤维蛋白生成动力学的良好控制，例如实际上没有过早的聚合；不需要凝血酶的纯化，从而减少了与制造相关联的花费；和/或易于使用并且便于制备；即主治医生需要的组分较少并且不需要组装。

术语“药学上可接受的载体”是指适于人或其它动物使用的任何稀释剂或媒介物。例如，“药学上可接受的载体或稀释剂”是指与制剂中的成分相容并且适用于与人和动物的组织接触，而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其它并发症、与合理的利益/风险比率相称的试剂、化合物、材料、组合物、稀释剂。适合与本文所公开的制剂一起使用的药学上可接受的载体包括液体、半固体和固体材料。

“表面”为人们期望形成封闭剂或胶的位置或方位。表面取决于封闭剂的使用。封闭剂可用于例如止血、组织固定、移植物固定、创伤愈合和吻合。本文所公开的制剂、方法和试剂盒可在内部或在外部用于组织和器官移植物固定、封闭外科创伤、包括提供止血的血管外科和吻合，诸如动脉、胃肠和气管吻合。

表面可以是可裸眼视力可见的皮肤的外表面以及为生物体内部解剖结构一部分的体内部分的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、头皮、胸部、背部、耳朵、颈、手、肘、臀、膝盖的皮肤以及其它皮肤部位。体内部分的示例包括但不限于暴露于外部环境和内部器官的体腔或解剖学开口，诸如鼻孔；唇；生殖器区域，包括子宫、阴道和卵巢；肺；肛门；脾；肝；和心肌。表面可为出血或未出血部位。表面还可为身体之外的工作表面。

如本文所用的术语“受治疗者”包括哺乳类动物，包括人。在一些实施方案中，受治疗者为外科患者或受伤患者。

虽然下列实施例说明了本发明的某些实施方案，但它们不应被理解为限制本发明的范围，而应理解为有助于完善本发明的描述。

实施例

实施例1：制备包含维生素K依赖性凝结酶原和纤维蛋白原的单一组分封闭剂制 剂。

如本领域中所述标准地产生作为维生素K依赖性凝结酶原的来源的PPSB(Production of plasma proteins for therapeutic use.Joseph Bertolini,NeilGoss,John Curling.2013Wiley Press)。

简而言之，通过将冷冻耗尽的人血浆填塞在DEAE阴离子交换柱上并用还包括10mM的柠檬酸钠(NaCitrate)的浓缩盐溶液(0.25M的NaCl)洗脱产生浓缩的PPSB。PPSB相比于血浆被浓缩了4-16倍之间，如通过凝血酶原(因子II)浓度所确定。

混合物包含通常与阴离子交换柱结合的所有维生素K依赖性凝结酶原(诸如FVII、FIX、蛋白质C和蛋白质S，以及FX)、它们相关联的共酶原(FV和FVIII)和共洗脱的任何其它蛋白质。

维生素K依赖性凝结酶原抑制剂(例如NaCitrate、EDTA)用于螯合钙离子并防止包含FII、FV和FX的任何凝血酶原复合物的过早活化或任何其它Ca²⁺依赖性过程，诸如因子X酶(Tenase)复合物(FVIII和FIX)活化或FXIII活化。

将10倍PPSB浓缩物添加到纤维蛋白原溶液中，混合物包含浓度在3-4％之间的可凝结蛋白质(7％纤维蛋白原用PPSB 1:1稀释)。实施例中所用的纤维蛋白原溶液为BAC2(包含来自纤维蛋白封闭剂的组分的纤维蛋白原)。在FIX和纤维蛋白原之间的最终比率为0.14U/mg(即0.14个单位(U)FIX每毫克纤维蛋白原)。此混合物示出在2°-8℃下稳定至少三个月而不示出任何过早的纤维蛋白凝块形成。

实施例2：使用单一组分封闭剂制剂的凝块形成。

为了评价单一组分封闭剂制剂形成凝块的能力，通过使用一块涂布有一层PT(凝血酶原时间)试剂的真皮(牛皮)得到模拟出血部位，该试剂含有组织因子(DiagnosticaStago STA Neoplastin CI Plus，Cat#00606)和约15-25mM的钙。

将包含等体积的PPSB和BAC2的液体溶液(如实施例1中所制备)施用到涂布组织因子的真皮，并且通过PT测定评价凝块形成速率，PT测定为测量通常在添加组织因子和钙之后形成凝块需要多长时间的试验。

存在于BAC2中的精氨酸对凝血酶活性具有抑制作用，但是它不足以完全抑制通过组织因子途径(从凝血酶原)生成的凝血酶或使它失活。通常，存在于BAC2和PPSB中的NaCitrate通过螯合钙来抑制活性酶的生成。然而，PT试剂含有的钙的含量足以克服NaCitrate抑制作用。

在将液体溶液施用到经过涂布的真皮上之后30秒初始观察到凝结，并且凝块在约1分钟和30秒之后完全为固体。作为对照，将包含等体积的BAC2和盐水的溶液施用到经过涂布的真皮并且评价凝块形成。在不存在PPSB时，在观察周期期间(超过30分钟)没有凝块形成。

为了进一步评估液体封闭剂制剂(PPSB/BAC2)的酶促特性，将生色凝血酶底物[H-D-苯丙氨酰基-L-哌可基(pipecolyl)-L-精氨酸-对硝基苯胺二盐酸盐，S-2238TMChromogenix]添加到两个样品(PPSB/BAC2和BAC2/盐水)中。PPSB/BAC2样品(图1中左边培养皿)由于凝血酶生成和生色底物的裂解而变成黄色。然而，BAC2/盐水样品(右边培养皿)未变成黄色，指示样品中没有凝血酶生成。

图1示出在培养三分钟之后PPSB/BAC2凝块的着色(左边)。这种着色在施用30秒之后就已经明显。在利用BAC2/盐水样品没有观察到颜色(右边)。

实施例3：酶原(PPSB)与纤维蛋白原比率对凝结时间的影响。

在此实验中，使用具有70mg/mL浓度纤维蛋白原的BAC2和PPSB，两者均如上文所述。存在于PPSB中的因子IX和凝血酶原(因子II)的量超过存在于血浆中的量大约10倍，即约9.8IU/ml的因子IX和10IU/mL的因子II。将PPSB和BAC2以不同比率混合，参见图2A，并且通过PT测定使用凝固分析仪(Diagnostica Stago Start4)测量凝结时间。通过添加包含与因子VII结合的钙和组织因子的Neoplastin PT试剂，从而引发外源性凝固途径来诱导凝结。将100μL的Neoplastin PT试剂(在37℃下保持充分混合)与50μL的试验样品(分别是BAC2和PPSB以不同体积比例如90:10、80:20、70:30等混合)组合。将试验样品在37℃下培养60秒，之后在分析仪的培养孔中进行测定。纤维蛋白原的浓度可根据BAC2和PPSB的体积比改变，然而在任何情况下，纤维蛋白原都过量地存在于样品中(即使是用PPSB 20:1稀释)，并且因此不受理论束缚，速率限制性因素为酶活化速率。

图2A-2B和表1示出不同制剂的凝结时间。图2A示出随存在于BAC2中的PPSB的变化的凝结，并且图2B和表1示出随因子II与纤维蛋白原的比率(U/mg)的变化的凝结。通常，因子II用于表达可商购获得的产品中PPSB的活性。存在于PPSB中的因子IX和凝血酶原的量超过存在于血浆中的量大约10倍，即10IU/mL的因子II。

表1：具有不同FII与纤维蛋白原比率(U/mg)的PPSB:BAC2溶液的凝结时间(以秒 计)。

图2A和表1中的结果示出，递增的PPSB体积(如通过因子II所归一化)相比于纤维蛋白原(BAC2)体积减小了混合物的凝结时间。当50％的PPSB在BAC中时，凝结时间为约17.5秒，并且在较高量的PPSB的情况下轻微减小。

实施例4：用血浆取代PPSB的影响。

本发明实验检查在制剂中使用血浆代替PPSB的影响。

以下列体积比制备包含血浆/BAC2和PPSB/BAC2的制剂：1-50％PPSB+50％BAC2；2-20％PPSB+80％BAC2；3-20％血浆+80％BAC2；和4-50％血浆+50％BAC2。如实施例1中制备PPSB(相比于血浆10X浓缩的FIX、FII)。

如上文实施例3中，利用组织因子(TF)和钙诱导凝结。

图3的结果示出，使用等体积百分比的制剂(1-4和2-3)，利用PPSB/BAC2制剂(1和2)所获得的凝结时间相比于血浆/BAC2制剂(分别是3和4)快。

这些结果展示，富含维生素K依赖性凝结酶原的PPSB和纤维蛋白原可用于加速凝块形成。

实施例5：使用小分子交换柱的纤维蛋白凝块形成。

如下制备包含PPSB和BAC2的制剂：如实施例1中制备PPSB并以1:1体积比与BAC2混合，最终产生大约3.5％(w/v)的可凝结蛋白质[初始BAC2为70mg/ml(或7％的可凝结蛋白质，主要为纤维蛋白原)]和相比于血浆浓缩了大约5倍的PPSB(大约0.14个国际单位(IU)的因子II每毫克纤维蛋白原)。制剂还包括1-2mM的EDTA、10mM的NaCitrate、1％(w/v)的盐酸精氨酸以及甘氨酸和乙酸盐缓冲液(pH 7.0；缓冲液包含1％(w/v)的甘氨酸和20mM的乙酸盐)。

使制剂通过可商购获得的缓冲液交换旋转柱(一次性PD-10脱盐柱，产品代码：17-0851-01，GE Healthcare)，此缓冲液交换旋转柱用CaCl₂溶液(40-50mM)或用水、含有2％(w/v)的精氨酸(但没有CaCl₂)的1％(w/v)甘氨酸缓冲液预平衡，并且将流过制剂收集于管中。

通过倒置含有经过缓冲液交换的制剂的管评价凝结。

结果示出，通过用CaCl2预平衡的柱的制剂在小于30分钟内自发凝结(图4B)，然而通过缺乏CaCl2的缓冲液的制剂即使在数天之后也不凝结(图4A)。

实施例6：CaCl ₂ 浓度对纤维蛋白凝块形成速率的影响。

以下实施例探究将不同浓度的CaCl₂添加到单一组分封闭剂制剂中对凝块形成速率的影响。

将10倍富集的PPSB(10IU FII/ml):BAC2制剂(1:1，如实施例1中制备，并且不具有EDTA)与PT试剂(组织因子和磷脂的混合物并且缺乏钙)混合。将递增浓度的CaCl₂补充到混合物中，并且测量凝结时间。

结果见于图5中。以约8mM至约30mM的钙观察到迅速凝结(<20秒，如使用Stat4凝结分析仪Stago Diagnostics所测量)。

实施例7：CaCl ₂ 对凝块形成的影响。

已发现，在将钙添加到稳定的制剂中之后凝块形成。在此实验中，未添加PT试剂(即未添加组织因子或磷脂)。10倍富集的PPSB(相比于血浆)与BAC2 1:1混合的实验示出，不存在组织因子时通过添加10mM的钙可实现在5-10分钟之间的凝结时间。

实施例8：评价PPSB:BAC2制剂在2-8℃下的稳定性。

在此实施例中，在2-8℃的温度下评估含有PPSB和纤维蛋白原的单一组分纤维蛋白封闭剂制剂的稳定性。

为此，在2-8℃下将PPSB-BAC2制剂(比率为0.14U FII/mg纤维蛋白原)培养不同的时间点(多至90天)，并且试验制剂在30分钟内形成凝块的能力。

通过使制剂经受PD-10预填充柱(Sephadex^TM G-25，GE Healthcare 17-0851-01)引发凝块形成。将柱用5ml含有50mM的CaCl₂(Sigma)和20mM的NaAcetate pH 7.00(Sigma)的缓冲液以重力模式进行平衡。将附加的5ml的CaCl₂施加于柱，并且在20C下以1000g将柱离心2分钟。柱用于完全除去以2.5mM的浓度存在于制剂中的小分子抑制剂，包括EDTA。

在37℃水浴中使预培养的PPSB-BAC2升温10分钟，施加于柱，在20C下以1000g将柱离心2分钟(施加于柱的制剂体积参见表2)并且收集柱流过溶液。

在收集后，在收集的材料中通过目视观察着色的变化(从澄清到不透明)评价凝块起始/胶凝的时间。同样，通过倒置之后收集的材料流动停止评价完全凝结的时间。

凝块起始和完全凝结时间的结果呈现于以下表2中。

表2：在2-8℃下培养不同时间段的制剂的凝块起始和完全凝结时间。

完全胶凝的时间总是小于或等于25分钟。不受理论的束缚，虽然受精氨酸和柠檬酸盐抑制，但是通过少量PPSB酶原向活性构象的缓慢转化，发生所需时间的些许缩短，因此缩短了生成活化凝血酶所需的时间。结果指示，制剂在2-8℃的温度下稳定至少多至90天。

实施例9：制剂的体内评价的动物模型。

大鼠肾止血模型为试验所试验的制剂实现止血的能力的常见模型(Raccuia JS等人,Am J Surg.1992.163(2):234-8.Comparative efficacy of topical hemostaticagents in a rat kidney model)。

简而言之，将肾从腹膜侧切开，并且围绕它放置垫片以吸收任何出血。将夹具置于供应肾的血管上，并且进行横向切割穿过肾。施用所试验的制剂，并且移除夹具。评价一小时周期内的出血，之后称重出血的总量。随后，将制剂擦除，并使出血恢复并且定量为低、中或高(以评价出血潜能仍然存在)。将所有大鼠以300IU肝素/kg动物重量输注以使出血模型更具有挑战性。

将一只称重406克(g)的白化大鼠麻痹并使用最终浓度为5IU/mlPPSB:3.5％纤维蛋白原的PPSB:BAC2制剂经受大鼠肾出血模型。将经典两组分市售纤维蛋白封闭剂用作参考。

结果：

将PPSB:BAC2制剂与CaCl₂混合(制剂中最终浓度为25mM；将CaCl₂手动地添加到制剂中)并在室温下培养15分钟，之后施用到肾表面。施用之后不久凝块在表面上形成，并且38分钟之后出血完全停止。在一小时周期内模型的总失血为5.9g。

使用经典两组分市售纤维蛋白封闭剂导致中等凝块形成，并且总失血在0-10.3g范围内(在15个动物中)。在没有培养的情况下将市售纤维蛋白封闭剂直接施用到肾表面上。

因此，本文所公开的多合一基于PPSB的纤维蛋白封闭剂制剂具有良好的止血潜能。

实施例10：评价在RT和2-8℃下具有或不具有肝素的PPSB:BAC2制剂的稳定性。

在此实施例中，评估含有PPSB和纤维蛋白原的单一组分纤维蛋白封闭剂制剂的稳定性。

如实施例1中所述制备PPSB。将BAC2(生物活性组分2)用作纤维蛋白原组分，其含有大约100mg/mL的总蛋白质，包括70mg/mL的可凝结纤维蛋白原、20mg/mL的精氨酸、10mM的柠檬酸和赋形剂，包括甘氨酸和氯化钠)。将PPSB与BAC2等体积组合以产生单一组分纤维蛋白封闭剂制剂。

将单一组分纤维蛋白封闭剂制剂的样品等分并在室温(20-25℃)下或在冰箱中(2-8℃)储存。

对于第二组样品，将0.25IU/mL的未分级的肝素添加到PPSB中，导致单一组分纤维蛋白封闭剂制剂中肝素最终浓度为0.125IU/mL。

使用标准凝血酶原时间(PT)测定在28天周期内在各种时间点评价稳定性。为了进行PT测定，将50μL的升温至37℃的样品与100μL的由组织因子和10mM的钙组成的PT试剂(Diagnostica Stago STA Neoplastin CI Plus)组合。Diagnostica Stago STart4凝固分析仪用于测定凝块形成速率。结果示于图6中。结果示出，在第6天，在任何温度下储存、具有/不具有肝素的所有制剂的凝结时间相当于基线凝结时间值。冷藏的不具有肝素的制剂示出在第18天凝结时间减少，并且在第28天样品由于凝结因子的活化而胶化。对于储存于冰箱中具有添加的肝素的制剂或储存于室温的制剂，在28天稳定性研究期间未观察到凝结时间的趋势。

虽然本文已描述了各种实施方案，但是可以对那些实施方案实施多种修改和变型。另外，凡是公开了用于某些组分的材料的，均可使用其它材料。上述具体实施方式和下述权利要求旨在涵盖所有这样的修改和变型。

以引用方式全文或部分地并入本文的任何专利、公布或其它公开材料均仅在所并入的材料不与本公开所述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的范围内并入本文。因此，并且在必要的程度下，本文明确阐述的公开内容取代以引用方式并入本文的任何冲突材料。

本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。

节段标题在本文用于易于理解说明书并且不应理解为必要限制性的。

Claims (50)

1.一种封闭剂制剂，所述封闭剂制剂包含纤维蛋白原；至少包括因子II和因子X的维生素K依赖性凝结酶原；和至少一种所述维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂，其中所述制剂不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂为液体形式并且包含药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1或2所述的制剂，其中所述制剂还包含因子V。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述维生素K依赖性凝结酶原还包括因子VII。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，其中所述维生素K依赖性凝结酶原还包括因子IX。

6.根据权利要求5所述的制剂，其中因子X、因子VII和/或因子IX至少部分地为它们的活性形式。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的制剂，其中所述可逆抑制剂选自由以下项组成的组：肝素、钙螯合剂、丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂、以及它们的组合。

8.根据权利要求7所述的制剂，其中所述液体制剂在约2℃至8℃的环境温度下保持稳定至少14天。

9.根据权利要求2至6中任一项所述的制剂，其中所述液体制剂在约2℃和高至室温的环境温度下保持稳定至少7天。

10.根据权利要求9所述的制剂，其中所述液体制剂在室温下稳定约30天。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的制剂，所述制剂不含添加的凝血酶。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述不可逆凝血酶抑制剂为水蛭素。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的制剂，其中所述不可逆凝血酶抑制剂为抗凝血酶III。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的制剂，其中所述维生素K依赖性凝结酶原提供为浓缩物，相比于它们在血浆中的浓度被浓缩约2-50倍，如所归一化至因子II。

15.根据权利要求14所述的制剂，其中所述维生素K依赖性凝结酶原浓缩物为凝血酶原复合物浓缩物（PCC）。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的制剂，其中所述维生素K依赖性凝结酶原（U）与纤维蛋白原（mg可凝结蛋白质）的比率为约0.01至约1.0，如所归一化至因子II。

17.根据权利要求7至16中任一项所述的制剂，其中所述可逆抑制剂为钙螯合剂。

18.根据权利要求17所述的制剂，其中所述钙螯合剂选自由以下项组成的组：柠檬酸根离子、草酸盐、EDTA、EGTA、以及此类钙螯合剂的组合。

19.根据权利要求18所述的制剂，其中所述钙螯合剂为柠檬酸根离子。

20.根据权利要求19所述的制剂，其中所述柠檬酸根离子由柠檬酸钠提供。

21.根据权利要求20所述的制剂，所述制剂包含约1mM至约50mM的柠檬酸钠。

22.根据权利要求21所述的制剂，所述制剂包含约5mM至约25mM的柠檬酸钠。

23.根据权利要求18至22中任一项所述的制剂，所述制剂包含约0.1mM至约2.5mM的EDTA和/或EGTA。

24.根据权利要求7所述的制剂，其中所述可逆抑制剂为丝氨酸蛋白酶活性位点抑制剂。

25.根据权利要求24所述的制剂，其中所述可逆抑制剂为精氨酸。

26.根据权利要求25所述的制剂，所述制剂包含约0.1%至约5%（w/v）的精氨酸。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的制剂，所述制剂用于止血、愈合和/或外科。

28.一种用于在表面制备封闭剂的方法，所述方法包括：提供权利要求1至26中任一项所述的制剂；以及在促进纤维蛋白在所述表面聚合的条件下将所述制剂施用到所述表面。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述表面为受治疗者的出血或未出血表面。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述条件包括（i）除去、中和、阻断和/或稀释所述可逆抑制剂，和/或（ii）添加至少一种所述维生素K依赖性凝结酶原的小分子活化剂。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述小分子活化剂为二价阳离子。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述二价阳离子为钙阳离子。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述钙阳离子由CaCl₂提供。

34.一种容器，所述容器包含权利要求1至26中任一项所述的制剂。

35.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求34所述的容器和任选地使用说明。

36.一种制造封闭剂制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 提供纤维蛋白原组分；

b) 提供包含维生素K依赖性凝结酶原的组分，所述维生素K依赖性凝结酶原至少包括因子II和因子X；

c) 提供包含至少一种所述维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂的组分；以及

d) 掺和组分a)至c)；

其中所述掺和的组分不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

37.根据权利要求36所述的方法，所述方法进一步掺和因子V。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述维生素K依赖性凝结酶原还包括因子VII。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述维生素K依赖性凝结酶原还包括因子IX。

40.根据权利要求36至39中任一项所述的方法，其中所述纤维蛋白原和所述可逆抑制剂以同一组分提供。

41.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中至少一种所述组分以液体形式提供，从而得到液体制剂。

42.一种制剂，所述制剂能够根据权利要求36至41中任一项获得。

43.一种在有需要的受治疗者中愈合和/或减少失血的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的根据权利要求1至26或42中任一项所述的制剂。

44.一种封闭剂制剂，所述封闭剂制剂包含纤维蛋白原；至少包括因子II、因子IX和因子X的维生素K依赖性凝结酶原；和至少一种所述维生素K依赖性凝结酶原的至少一种可逆抑制剂，其中所述制剂不含添加的不可逆凝血酶抑制剂。

45.一种不含钙的封闭剂制剂，所述不含钙的封闭剂制剂包含纤维蛋白原和至少包括因子II和因子X的维生素K依赖性凝结酶原。

46.一种用于在表面制备封闭剂的方法，所述方法包括：提供权利要求44或45所述的制剂；以及在促进纤维蛋白在所述表面聚合的条件下将所述制剂施用到所述表面。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述条件包括添加钙阳离子。

48.一种容器，所述容器包含权利要求44或45所述的制剂。

49. 一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求48所述的容器；和任选地使用说明。

50.一种制造不含钙的封闭剂制剂的方法，所述方法包括

a) 提供纤维蛋白原组分；

b) 提供包含维生素K依赖性凝结酶原的组分，所述维生素K依赖性凝结酶原至少包括因子II和因子X；以及

c) 掺和a)和b)的组分。