ES2197981T3 - Procedimiento de preparacion de un adhesivo biologico capaz de coagular por simple adicion de iones calcio. - Google Patents

Abstract

AL PONER EN CONTACTO UN PLASMA SANGUINEO CON UN ACTIVADOR DE LA FASE DE CONTACTO DE LA COAGULACION SANGUINEA, ANTES DE LA PREPARACION DE UN PEGAMENTO BIOLOGICO A BASE DE FIBRINOGENO O DURANTE ELLA, SE OBTIENE UN PEGAMENTO BIOLOGICO PREACTIVADO QUE NO COAGULA ESPONTANEAMENTE, PERO QUE PUEDE COAGULAR EN MENOS DE 5 MINUTOS POR SIMPLE INCORPORACION DE IONES CALCIO, SIN NECESIDAD DE AÑADIR TROMBINA. APLICACION EN EL TERRENO QUIRURGICO.

Description

Procedimiento de preparación de un adhesivo biológico capaz de coagular por simple adición de iones calcio.

La invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de un adhesivo biológico capaz de coagular por simple adición de iones calcio.

Se sabe que los concentrados de proteínas que contienen, entre otros, fibrinógeno y factor XIII pueden coagular por adición de trombina, dando lugar a una red de fibrina, y son utilizados como materiales adhesivos. Más precisamente, bajo el efecto de la trombina, el fibrinógeno se transforma en monómero de fibrina. Los monómeros de fibrina se unen para formar polímeros de fibrina. Bajo la acción del factor XIII activado por la trombina, en presencia de iones calcio, las cadenas de fibrina son reticuladas. Así, la adición de trombina, seguida de la aplicación de la mezcla resultante, provoca una coagulación por formación de fibrina sobre las partes a unir, según un mecanismo que reproduce la fase final de la coagulación sanguínea. Los concentrados de fibrinógeno constituyen, por tanto, al coagular, un material adhesivo que permite, principalmente, juntar y mantener unidos los tejidos vivos mientras se ejerce una acción hemostática; véase, por ejemplo, la patente de Francia 2448900. Tales materiales adhesivos se denominan habitualmente ``adhesivos biológicos'' o ``adhesivos de fibrina'', y se utilizan en cirugía, especialmente para prevenir o detener las hemorragias, reemplazar los hilos de suturas o reforzarlas, mantener en su sitio los injertos, por ejemplo, los injertos dérmicos, aproximar los tejidos que hayan sufrido una resección, por ejemplo, en cirugía del pulmón o del tubo digestivo, e incluso para unir piezas de prótesis, etc.

Para utilizar los adhesivos biológicos, conviene disponer de trombina, que se prepara a partir de mezclas de plasmas sanguíneos, humanos o animales. Los productos homólogos, es decir, los productos de origen humano para los que el donante y el receptor son diferentes, presentan un riesgo de contaminación del receptor por agentes patógenos del donante. Este riesgo puede reducirse mediante la selección de los donantes y la búsqueda de la presencia en el donante de marcadores de agentes patógenos, o incluso mediante tratamientos físico-químicos orientados a destruir o disminuir la virulencia de los productos preparados. Sin embargo, no puede haber ninguna certeza en cuanto a la inocuidad de los productos homólogos.

Los productos preparados a partir de tejidos animales presentan igualmente riesgos relacionados con la existencia de agentes patógenos transmisibles al hombre, y también riesgos de inmunización y, como consecuencia, de reacciones anafilácticas.

Los riesgos más altos mencionados serían evitados si se utilizaran únicamente productos autólogos, es decir, productos preparados únicamente a partir de una muestra tomada en el futuro receptor.

El principio de la transfusión autóloga es conocido y está ampliamente difundido, estando comprendido en lo concerniente a la preparación de adhesivos a base de fibrinógeno. Sin embargo, los adhesivos denominados ``autólogos'' no lo son en realidad más que en lo que concierne a la solución de fibrinógeno. En efecto, la solución de trombina se obtiene a partir de plasmas homólogos o heterólogos, pero no de forma autóloga; véase, particularmente, CEDERHOLM-WILLIAMS, Lancet 344, 336-337 (1994).

En la solicitud de patente PCT WO94/07548, se describe un adhesivo biológico enriquecido en factores plaquetarios, que es capaz de coagular sin adición de trombina, mediante la adición al adhesivo recalcificado de un activador de la fase contacto de la coagulación sanguínea, como caolín. Sin embargo, en esta solicitud de patente, el activador de la fase contacto es incorporado en el momento de emplear el adhesivo, lo que se traduce en la puesta en marcha de la activación aleatoria y dificultosa, dado que el concentrado de fibrinógeno constituye en producto muy viscoso, de difícil manipulación. Esto resulta en que el tiempo de coagulación no es fácil de manejar. Por otro lado, la coagulación progresa al mismo tiempo que la activación, y resulta difícil separar el activador del adhesivo activado.

Ahora se ha descubierto que es posible obtener un adhesivo biológico coagulable por simple adición de iones calcio, sin adición de un activador de la fase contacto en el momento de usar el adhesivo, y sin adición de trombina o protrombina antes del uso o en el momento de uso. Se ha descubierto que, en efecto, es posible preactivar el plasma que sirve para la preparación del adhesivo biológico, antes de realizar las operaciones para la obtención del concentrado de fibrinógeno que contiene los factores de coagulación, y esto sin que se observe una coagulación en el transcurso de la preparación del adhesivo.

Se ha descubierto en particular que es suficiente con preactivar el plasma con un activador de la fase contacto de la coagulación, durante un tiempo suficiente para activar parcialmente la precalicreína en calicreína, y el plasma así tratado permite obtener a continuación, sin coagulación espontánea, un adhesivo biológico capaz de coagular de forma relativamente rápida, por simple recalcificación, sin la adición de trombina.

La patente de Estados Unidos 4.427.650 describe un adhesivo de fibrina en forma de polvo que contiene una mezcla de fibrinógeno y trombina y/o protrombina. Tal adhesivo no está sometido a ninguna medida de activación y no contiene por tanto factores de coagulación activados no dependientes de iones calcio.

El documento WO91/09641 describe un adhesivo de fibrina que contiene fibrinógeno y trombina añadida. Este adhesivo está preparado de forma que la actividad de la trombina esté inhibida. Según un modo de realización particular, este adhesivo está exento de iones calcio, siendo éstos añadidos únicamente en el momento de uso. Sin embargo, tal adhesivo que contiene trombina añadida, coagula espontáneamente, incluso sin la adición de iones calcio, al cabo de 90 segundos aproximadamente. Mediante la adición de iones calcio, éste coagula en menos de 2 segundos. En otros modos de realización, se retrasa la coagulación del adhesivo mediante la acidificación a un pH inferior a 5,5, lo que inhibe la actividad de la trombina, y se utiliza en el momento de usar los medios que permiten aumentar el pH, para anular el efecto de la inhibición. Según otro modo de realización, se añade al adhesivo, a oscuras, un inhibidor de trombina fotosensible que se desactiva con la luz. Tal adhesivo, cualesquiera que sean sus modos de realización, no contiene factores de coagulación activados no dependientes de iones calcio.

El adhesivo obtenido según la invención es, por el contrario, un adhesivo estable que, en forma de solución acuosa, no coagula espontáneamente a temperatura ambiente, incluso con luz, y que es capaz de coagular mediante la simple adición de iones calcio sin modificar el pH. Éste contiene factores de coagulación activados no dependientes de iones calcio.

El adhesivo biológico obtenido según la invención es un adhesivo preactivado que contiene fibrinógeno y, al menos, un factor de coagulación activado, cuya activación no depende de los iones calcio. Éste es estable en solución acuosa, es decir, la solución no coagula de forma espontánea durante al menos una hora a una temperatura de 20ºC, y es capaz de coagular en menos de 5 minutos mediante la simple adición de iones calcio, sin ponerlo en contacto con un activador.

Así, el adhesivo biológico obtenido según la invención es capaz de coagular sin la adición de trombina ni de protrombina.

Éste adhesivo puede presentarse en forma de una solución acuosa. También puede presentarse en forma de un liofilizado a partir del cual se puede reconstituir una solución acuosa en el momento de uso.

Los mecanismos de la coagulación sanguínea son esencialmente conocidos. Particularmente, se dice que uno de los mecanismos de activación inicial de la coagulación puede ser fácilmente reproducido in vitro poniendo en contacto el plasma con un activador, que puede ser un sólido insoluble con una superficie cargada negativamente, como por ejemplo el cristal o el caolín, o un activador soluble en estado disuelto. Esta activación inicial resulta de la interacción entre numerosas proteínas plasmáticas: factor XII, factor XI, precalicreína y cininógeno de alto peso molecular (KHPM); véase, por ejemplo, WACHTFOGEL y col., Trombosis Research, 72, 1-21 (1993). Al contacto con la superficie activadora, la conformación espacial del factor XII experimenta una modificación. Entonces el factor XII se vuelve capaz de activar la precalicreína en calicreína, y esta reacción está amplificada por el KHPM. La calicreína así formada actúa sobre el factor XII y lo transforma en factor XII activado (o factor XIIa). El factor XIIa posee la propiedad de activar el factor XI.

Estas reacciones que implican al factor XII, a la precalicreína, al KHPM y al factor XI se conocen como ``reacciones del sistema contacto'', y los factores de coagulación implicados se conocen como ``factores del sistema contacto'' o ``factores contacto''.

La fase de coagulación durante la cual se producen las reacciones del sistema contacto se conoce como ``fase contacto''.

Los mecanismos que conducen a la coagulación también implican: la activación del factor IX por el factor XIa, lo que requiere la presencia de iones calcio; la activación del factor X mediante la acción de un complejo formado por los factores IXa, VIIIa y F3P (factor 3 plaquetar), en presencia de iones calcio; la activación de protrombina en trombina bajo la influencia de un complejo de los factores Xa, Va y F3P, en presencia de iones calcio. La trombina permite la transformación del fibrinógeno en fibrina llamada ``soluble'', y permite igualmente, en presencia de iones calcio, la activación del factor XIII. El factor XIII activado permite la transformación de la fibrina soluble en fibrina insoluble, que forma el coágulo sanguíneo.

Se sabe que otra vía de coagulación, llamada vía extrínseca, implica la activación del factor VII por acción de la tromboplastina tisular. El factor VII activado es capaz de activar sobre todo al factor X, y también al factor IX. Además, se sabe que el factor XII activado es capaz de activar el factor VII. Así, la activación del factor VII puede resultar de la activación de la fase contacto.

La invención se apoya principalmente en el descubrimiento de que activando parcialmente los factores del sistema contacto, por ejemplo, en el plasma de partida, y en todo caso antes de la obtención del concentrado de fibrinógeno que constituye el adhesivo, se puede obtener finalmente un adhesivo biológico capaz de coagular rápidamente, por simple adición de iones calcio, sin añadir trombina ni protrombina. Se ha constatado que tal activación parcial realizada en un estado precoz no entraña una coagulación prematura, espontánea, entonces las operaciones consecutivas de obtención del concentrado de fibrinógeno forman el adhesivo biológico. Más precisamente, se ha descubierto que es suficiente poner el plasma en contacto con el activador en una cantidad y durante un tiempo suficientes para que el plasma contenga al menos 15, y en particular al menos 20, unidades de calicreína por litro. El adhesivo biológico obtenido con dicho plasma preactivado es entonces capaz de coagular en menos de 5 minutos, sin adición de un activador y sin adición de trombina ni protrombina, por simple recalcificación.

La unidad de calicreína utilizada aquí se define de la forma siguiente: es la cantidad capaz de hidrolizar una solución 0,52 mM de D-Prolil-L-Fenilalanin-L-Arginina-p-nitro-anilida en solución tampón veronal-acetato sódico de pH 7,35, a 37ºC, a la velocidad inicial de 1 \mumol/min.

El adhesivo biológico obtenido según la invención se caracteriza principalmente porque contiene al menos un factor de coagulación activado, cuya activación no depende de los iones calcio, elegido entre el factor XIIa, el factor XIa, el factor VIIa y la calicreína. Estos factores activados pueden ser detectados y/o dosificados por ejemplo según los siguientes métodos:

Factor XIIa (igualmente conocido como ``activador de precalicreína''): Pharmacopeé européene, 1994, capítulo V, 2.1 11;

Factor VIIa: método de MORRISEY y col., Blood, Vol. 81, págs. 734-744 (1993) se puede utilizar especialmente el estuche de dosificación comercial Staclot VIIa-rTF, Diagnostica Stago Ref. 00281;

Factor XIa: método cronométrico de GYÖNGYÖSSY-ISSA MIC y col., Vox Sang., Vol. 70, págs. 76-85 (1996); o el método cromogénico de SCOTT C.F. y COLMAN R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, Vol. 89, págs. 11189-11193 (1992);

Calicreína: véase la parte experimental a continuación.

La estabilidad del adhesivo biológico obtenido según la invención, confirmada por la ausencia de coagulación espontánea a temperatura ambiente, muestra que está prácticamente exento de trombina. El adhesivo biológico obtenido según la invención está además prácticamente exento de fibrina, como lo confirma su escaso contenido en fibrinopéptido A (en general, como resultado del procedimiento de la invención, menos de 0,5% en peso de fibrinógeno presente en el plasma de partida ha sido separado con formación de fibrinopéptido A; véase la parte experimental a continuación). En cambio, este adhesivo biológico contiene, en la forma no activada, los factores de coagulación cuya activación depende de los iones calcio. En particular, contiene por tanto, aparte de la protrombina, los factores XIII, X, V y FP3. Generalmente, contiene además los factores VIII y IX, que son necesarios en la coagulación en ausencia de factor VII activado.

La invención tiene por tanto por objeto un procedimiento de preparación de un adhesivo biológico tal como el definido anteriormente. Este procedimiento comprende las etapas consistentes en: a) obtener un plasma sanguíneo que contenga un agente capaz de complejar los iones calcio, b) obtener a partir de dicho plasma, según los métodos conocidos, un adhesivo biológico a base de fibrinógeno y de factores de coagulación, y c) si se desea, someter el adhesivo biológico obtenido a una liofilización, y en el que antes o durante la etapa b), se pone en contacto dicho plasma con un activador de la fase contacto.

Por supuesto, se puede determinar de una vez por todas las condiciones de cantidad y duración de la aplicación del activador que permiten obtener una concentración de al menos 15 unidades de calicreína, o, más simplemente, que permite obtener un adhesivo biológico conforme a la invención, es decir, capaz de coagular en menos de 5 minutos por simple adición de iones calcio. No hay por tanto necesidad de dosificar la calicreína cada vez que se realiza el procedimiento.

La etapa de puesta en contacto del plasma con el activador se realiza preferentemente a una temperatura inferior a 10ºC. Se opera, por ejemplo, a una temperatura de 1 a 8ºC y en particular, a 4ºC aproximadamente.

Cuando el activador es insoluble, se puede, si se desea, separar el plasma preactivado del activador. Para ello, tras un tiempo de contacto suficiente, se separa y elimina el activador, por ejemplo mediante filtración. El tiempo de contacto suficiente para obtener una transformación al menos parcial de precalicreína en calicreína depende evidentemente de la naturaleza del activador, y de la cantidad de activador. Ese tiempo puede determinarse en cada caso mediante pruebas de simple rutina; véase, por ejemplo, la parte experimental a continuación.

Los agentes capaces de complejar los iones calcio son conocidos. Se trata, por ejemplo, de sales del ácido cítrico, como el citrato sódico, o de un agente quelatante como el EDTA (por ejemplo, una sal sódica de EDTA).

El plasma de partida puede contener también una sal soluble de zinc, como el sulfato o el acetato, de forma que se obtenga, por ejemplo, una concentración en iones zinc que puede oscilar entre 10^{-4}M y 10^{-2}M aproximadamente. Se sabe que los iones zinc actúan como aceleradores de las reacciones del sistema contacto.

El contacto entre el plasma y el activador puede realizarse, en el caso de un activador sólido insoluble, en un recipiente apropiado. El activador se introduce en el recipiente, antes o después de la introducción del plasma. El activador puede estar fijado a la pared interna del recipiente. Por ejemplo, la pared interna puede revestirse con el activador. Cuando el activador no está fijado a la pared interna del recipiente, conviene prever una etapa en la que se separa, tras un tiempo de contacto suficiente, el activador y el plasma activado. Para ello, por ejemplo, el recipiente puede estar provisto, interiormente o exteriormente, de un filtro que permita dejar pasar el plasma mientras que retiene el activador, de forma que se separan el plasma activado del activador después de la etapa de puesta en contacto.

Según otro modo de realización, se efectúa dicha puesta en contacto haciendo circular dicho plasma por una columna que contiene el activador. Se puede, por ejemplo, hacer circular dicho plasma por la columna hasta un orificio de salida, estando dicho orificio de salido provisto de un filtro que permita retener el activador. Entonces se recoge, tras un tiempo de contacto suficiente, el plasma activado, mientras que el filtro retiene el activador.

Cuando la obtención del adhesivo biológico incluye una etapa consistente en la concentración del plasma, por ejemplo, con ayuda de una membrana que deje pasar el agua y los constituyentes de bajo peso molecular, pero que retenga las proteínas, se puede poner en contacto el plasma con el activador durante esa etapa de concentración. Si el activador es un sólido insoluble, habrá que separarlo después, por ejemplo, mediante filtración, del plasma concentrado o parcialmente concentrado.

Los activadores de la fase contacto de la coagulación son bien conocidos. Se trata fundamentalmente de productos sólidos cuya superficie está cargada negativamente, como el cristal, el caolín, la celita, el óxido de zinc, el carbonato de zinc, etc.

Se puede igualmente utilizar activadores solubles como por ejemplo el sulfato de dextrano y el ácido elágico.

Igualmente se ha descubierto que otros productos, como el carbonato cálcico (aragonito o calcita) son capaces de activar el sistema contacto. Se puede por tanto utilizar un activador constituido esencialmente por aragonito, por ejemplo, en forma de partículas de coral. Se puede utilizar, por ejemplo, partículas que tengan unas dimensiones de 0,3-2 mm.

Se ha constatado que la activación por el carbonato cálcico aumenta ligeramente la concentración de calcio del plasma, pero de una forma lo suficientemente débil para no provocar la coagulación prematura en la preparación del adhesivo biológico.

Se puede además utilizar activadores solubles inmovilizados sobre soportes sólidos mediante las técnicas habituales, por ejemplo, por covalencia o por afinidad. Dichos soportes sobre los cuales son inmovilizados los activadores solubles son asimilables a los activadores insolubles, y son utilizados como tales.

Los activadores utilizados en el procedimiento de la invención no deben ni retener en una proporción notable (en el caso de un activador sólido), ni inhibir los factores de coagulación cuya activación dependa de los iones calcio y que son necesarios en la serie de las reacciones que conducen a la formación de fibrina y a la coagulación de la misma. Los factores que son necesarios en esta serie de reacciones son esencialmente, aparte de la protrombina, los factores V, VIII, IX, X, FP3 y XIII.

De hecho, la selección de los activadores que convienen puede realizarse fácilmente mediante pruebas rutinarias: un activador es conveniente si permite obtener un adhesivo biológico conforme a la definición descrita anteriormente, es decir, una adhesivo biológico estable y que coagule en menos de 5 minutos por simple adición de iones calcio.

Se ha constatado que la preactivación de la fase contacto de la coagulación sólo activa un poco las plaquetas: menos de 10% de las plaquetas son activadas. Se puede por tanto utilizar como producto de partida bien un plasma sin plaquetas o pobre en plaquetas, o bien un plasma que contiene plaquetas o rico en plaquetas.

Se ha descubierto además que el plasminógeno no se activa en plasmina de forma significativa ni en el momento de la activación de la fase contacto, ni en el transcurso de las operaciones consecutivas de preparación del adhesivo biológico, así, y contrariamente a lo que se podía temer, no hay riesgo de una ruptura prematura de la unión debido a la actividad fibrinolítica de la plasmina.

En la presente solicitud, se designa mediante la expresión ``adhesivo biológico'' una solución acuosa obtenida mediante fraccionamiento o concentración de plasma sanguíneo para concentrar el fibrinógeno conservando los factores de coagulación necesarios, que se han mencionados anteriormente, y eliminando eventualmente al menos una parte de las otras proteínas plasmáticas dado que no se desea cargar excesivamente el adhesivo biológico con proteínas tales como la albúmina. El plasma sanguíneo contiene de 2 a 4 g/l de fribrinógeno y de 50 a 60 g/l de albúmina. Un adhesivo biológico obtenido según la invención puede contener, por ejemplo, al menos 10 g/l, y en particular al menos 30 g/l de fibrinógeno. Preferiblemente contiene menos de 50 g/l de albúmina, especialmente menos de 35 g/l, y en particular menos de 30 g/l.

El adhesivo biológico obtenido según la invención puede contener diversos ingredientes secundarios añadidos, tales como agentes incrementadores de la viscosidad o colorantes que permiten controlar visualmente la aplicación.

En el procedimiento de la invención, la obtención propiamente dicha del adhesivo biológico, es decir, la obtención de un concentrado de fibrinógeno que contiene los factores de coagulación se realiza principalmente mediante cualquier método de fraccionamiento conocido, en particular mediante precipitación fraccionada según los métodos conocidos con la ayuda de un agente precipitante, como por ejemplo, etanol o polietilenglicol. Bien entendido, para cada agente precipitante susceptible de ser utilizado, conviene verificar previamente que los factores de coagulación necesarios se encuentran en las mismas fracciones que el fibrinógeno. Para ello, es suficiente en la práctica con verificar que el concentrado de fibrinógeno obtenido es capaz de coagular en menos de 5 minutos por simple adición de iones calcio, lo que no requiere más que pruebas rutinarias.

Otro método conocido consiste en preparar un crioprecipitado. Para ello, se congela el plasma, por ejemplo, a una temperatura inferior o igual a -20ºC, después se descongela el producto congelado obtenido, por ejemplo, a una temperatura de 0 a 5ºC, y en particular de 2 a 4ºC. Se obtiene así un líquido plasmático y un producto insoluble llamado crioprecipitado, que está constituido esencialmente por fibrinógeno y diversos factores de coagulación. Este crioprecipitado puede separarse mediante centrifugación, e incluso por filtración; véase, por ejemplo, el documento FR-2.718.033.

Otro método conocido consiste en concentrar el plasma con la ayuda de una membrana que deje pasar el agua y los constituyentes de baja masa molecular, mientras que retiene las proteínas.

La invención concierne igualmente a un dispositivo para la puesta en marcha del procedimiento descrito anteriormente, en el caso en el que el activador sea un sólido insoluble.

En un modo de realización, no limitante, este dispositivo se caracteriza principalmente porque comprende un primer recipiente destinado a recibir el plasma antes y/o durante la activación, un segundo recipiente destinado a recibir el plasma después de la activación, los medios para transferir de forma estéril el plasma desde el primer recipiente hasta el segundo recipiente, los medios para poner en contacto el plasma con un activador de la fase contacto y, si se desea, los medios para separar el plasma activado y el activador, de forma que el plasma que se recoge en el segundo recipiente este exento de activador.

Según un modo de realización particular, los citados medios de puesta en contacto comprenden un tubo en el que está confinado el activador, y los citados medios para transferir comprenden por un lado un conducto que comunica un orificio de salida del primer contenedor a uno de los extremos del tubo, y por otro lado, un conducto que comunica un orificio de entrada del segundo recipiente con el otro extremo de dicho tubo, de forma que el plasma esté en contacto con el activador dentro del tubo mientras circula entre el primer recipiente y el segundo recipiente.

Según un segundo modo de realización, los medios para poner en contacto el plasma con el activador y para separar el plasma activado y el activador comprenden un compartimento en el que está confinado el activador, estando este compartimento situado en el interior del primer recipiente. El compartimento incluye una pared permeable a los líquidos, que permite a la vez el contacto con el activador y con el plasma que queda en el primer recipiente, y la separación del plasma y del activador cuando se hace pasar el plasma preactivado al segundo recipiente.

En otro modo de realización, los medios de puesta en contacto del plasma con el activador comprenden, en el interior del primer recipiente, una pared a la que esta fijado, por ejemplo, mediante revestimiento, el activador, y en este caso no hay forma de prever los medios para separar el plasma activado y el activador.

La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de utilización del adhesivo biológico como el definido anteriormente. Dicho procedimiento se caracteriza porque se añade a dicho adhesivo una solución acuosa que contiene iones calcio, sin añadir trombina. Se puede aplicar a continuación el adhesivo de la forma conocida sobre el punto operatorio o sobre la herida que se desea tratar.

Los iones calcio se añaden al adhesivo biológico principalmente en forma de una solución acuosa, por ejemplo, una solución acuosa de cloruro cálcico. La cantidad de iones calcio añadida es una cantidad suficiente para que el producto obtenido contenga iones calcio ``libres'', es decir, no quelatados por el agente complejante. Esta operación se denomina ``recalcificación''. La cantidad de iones calcio libres debe ser una cantidad suficiente para permitir la coagulación del adhesivo biológico en plazos suficientemente cortos. Esta cantidad puede determinarse previamente mediante simples pruebas rutinarias.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención.

Ejemplo 1

El plasma sanguíneo citratado utilizado como producto de partida es un plasma rico en plaquetas, obtenido mediante centrifugación de sangre total a 2.200xg durante 6 minutos. Este plasma contiene citrato sódico (17 mM).

Se añaden 2 cm^{3} de una solución 0,1 M de sulfato de zinc en 270 cm^{3} de dicho plasma refrigerado a 4ºC. Se hace circular el plasma por una columna de poli (cloruro de vinilo) que contiene 10 cm^{3} de gránulos de coral de granulometría 630-1.000 \mum (INOTEB, ST-GONNERY, FRANCIA). Las dimensiones de la columna son las siguientes: diámetro: 1,4 cm; altura: 14 cm.

La columna está dispuesta verticalmente, estando unido su orificio superior por un conducto a una bolsa que contiene el plasma sanguíneo con sulfato de zinc añadido. Dicha bolsa esta situada debajo de la columna y el plasma circula hacia la salida por gravedad. El extremo inferior de la columna incluye un filtro permanente para retener las partículas de coral. Este extremo inferior está ligado por un conducto a una bolsa flexible que permite recoger el plasma preactivado.

La duración del tránsito a través de la columna de la totalidad del plasma es de 45 minutos.

La calicreína se dosifica en el plasma de la forma siguiente: en un pocillo de una placa de microtitulación se introducen 50 microlitros de tampón veronal-acetato sódico de pH 7,35 (Diagnostica Stago, Ref. 360), y se añaden bien 50 microlitros de una solución patrón de calicreína (CHROMOGENIX, SUECIA, Ref. 820845) o bien 50 microlitros de la muestra a dosificar. Se lleva a 37ºC y se añaden 100 microlitros de una solución 1,04 mM de sustrato S-2302 (CHROMOGENIX, Ref.820340) precalentado a 37ºC. Se mide la variación de densidad óptica durante un minuto a 405 nm y se deduce la actividad de la calicreína comparando ésta variación de la densidad óptica con la observada para la calicreína patrón.

El contenido de calicreína del plasma después de atravesar los gránulos de coral es de 20 unidades por litro.

El plasma se congela a continuación a -30ºC, después se descongela durante 24 horas en un recinto a +4ºC. Se centrifuga el plasma obtenido (2.000xg). El residuo de la centrifugación, es decir, el crioprecipitado, se recoge y se calienta a 37ºC.

El tiempo de coagulación del producto obtenido (crioprecipitado) se determina mediante tromboelastografía, con ayuda del parámetro ``r+k'': véase, por ejemplo, MALLETT S.V. y COX D.J.A., British Journal of Anaesthesia, 69:307-313 (1992). Para ello se introduce en la cuba del tromboelastógrafo (HELLIGE) 175 \mul de crioprecipitado a 37ºC. Se añade a 37ºC 175 \mul de una solución acuosa 36 mM de cloruro cálcico. El aparato registra automáticamente el trazado de tromboelastografía. Se mide sobre el trazado el valor del parámetro ``r+k''. Dado que el papel sobre el que se registra el trazado se desplaza a una velocidad de 2 mm por minuto, el tiempo de coagulación en minutos es igual a la mitad de la longitud ``r+k'' expresada en mm.

El tiempo de coagulación encontrado es de 2 minutos.

El crioprecipitado puede también conservarse mediante congelación, y después descongelarse en el momento de la utilización.

Un crioprecipitado preparado como se indica anteriormente, sea recientemente obtenido o sea conservado mediante congelación y después descongelado, es estable durante muchas horas a una temperatura de 20ºC: no se observa coagulación espontánea alguna.

El crioprecipitado obtenido también puede conservarse mediante liofilización.

Ejemplo 2

Se opera como en el ejemplo 1, con la excepción de que los gránulos de coral se reemplazan por 14 g de bolas de cristal de diámetro 200-300 \mum (SIGMA, Ref. G. 1277, L'ISLE D'ABEAU, FRANCE). La duración del tránsito del plasma a través de la columna de bolas de cristal es de 30 minutos. El contenido en calicreína del plasma después del tránsito a través de las bolas de cristal es de 19 unidades por litro.

El tiempo de coagulación del crioprecipitado, determinado mediante tromboelastografía, es de 3 minutos.

Ejemplo 3

Se opera de forma similar a la descrita en el ejemplo 1, reemplazando los gránulos de coral por polvo de caolín (SIGMA, Ref. K. 7375). Se han realizado diversos ensayos utilizando como producto de partida bien un plasma rico en plaquetas (PRP) o bien un plasma pobre en plaquetas (PPP).

Los PRP y los PPP se han obtenido como se indica a continuación.

El PRP se obtiene mediante centrifugación a 2.200xg durante 6 minutos de sangre de una muestra.

El PPP se obtiene mediante centrifugación a 2.500xg durante 15 minutos.

Para los crioprecipitados obtenidos a partir de PRP, el tiempo de coagulación es de 100\pm30 segundos (media de cuatro ensayos).

Para los crioprecipitados obtenidos a partir de PPP, el tiempo de coagulación es de 190\pm35 segundos (media de tres ensayos).

Ejemplo 4

Se opera de forma análoga a la descrita en el ejemplo 1, sobre diversas muestras de plasma rico en plaquetas.

\newpage

Los resultados se resumen en la tabla siguiente.

TABLA 1

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{Muestra
nº }\+ Calicreína  \+ Tiempo de \\\multicolumn{2}{|c|}{}\+
(unidades/litro)  \+ coagulación (min) \\\hline   \+ (a)  \+ 2,9 \+
\\  1  \+ (b)  \+ 19,7 \+ \\   \+ (c)  \+  \+ 3,25 \\\hline   \+ (a)
 \+ 3,6 \+ \\  2  \+ (b)  \+ 32,3 \+ \\   \+ (c)  \+  \+ 2,75
\\\hline   \+ (a)  \+ 4,5 \+ \\  3  \+ (b)  \+ 44,3 \+ \\   \+ (c) 
\+  \+ 3 \\\hline\multicolumn{4}{|l|}{(a) plasma de
partida}\\\multicolumn{4}{|l|}{(b) plasma activado (después de pasar
por el activador)}\\\multicolumn{4}{|l|}{(c)
crioprecipitado}\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

En los ensayos siguientes (muestras nº 4 a 9) se determina además el número de plaquetas en el plasma de partida, y se ha dosificado la plasmina en los diversos estados del procedimiento. Los resultados se resumen en la tabla 2.

TABLA 2

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{Muestra
nº }\+ Plaquetas  \+ Calicreína  \+ Plasmina*  \+ Tiempo de
\\\multicolumn{2}{|c|}{}\+ (miles  \+ (unidades/litro)  \+  \+
coagulación \\\multicolumn{2}{|c|}{}\+ por mm ^{3} )  \+  \+  \+
(min) \\\hline  4  \+ (a)  \+ 37  \+ 31  \+ 0 \+ \\   \+ (b)  \+  \+
67,7  \+ 0,33 \+ \\   \+ (c)  \+  \+  \+ 0,20  \+ 2,25 \\\hline  5 
\+ (a)  \+ 368  \+ 7,1  \+ 0 \+ \\   \+ (b)  \+  \+ 67,5  \+ 0,35 \+
\\   \+ (c)  \+  \+  \+ 0,31  \+ 4 \\\hline  6  \+ (a)  \+ 23  \+
3,3  \+ 0 \+ \\   \+ (b)  \+  \+ 34,8  \+ 0,20 \+ \\   \+ (c)  \+ 
\+  \+ 0  \+ 2,5 \\\hline  7  \+ (a)  \+ 33  \+ 5,5  \+ 0 \+ \\   \+
(b)  \+  \+ 29,8  \+ 0,41 \+ \\   \+ (c)  \+  \+  \+ 0,22  \+ 2,5
\\\hline  8  \+ (a)  \+ 421  \+ 7,9  \+ 0 \+ \\   \+ (b)  \+  \+
97,6  \+ 0,42 \+ \\   \+ (c)  \+  \+  \+ 0,10  \+ 2,5 \\\hline  9 
\+ (a)  \+ 261  \+ 5,6  \+ 0 \+ \\   \+ (b)  \+  \+ 29,8  \+ 0,20 \+
\\   \+ (c)  \+  \+  \+ 0,51  \+ 2,5
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

* % de plasminógeno transformado en plasmina

El significado de (a), (b), (c) es el indicado al final de la Tabla 1 anterior.

Se constata que el plasminógeno no está activado en plasmina de forma significativa, ni en el momento de la activación del sistema contacto, ni el transcurso de la preparación del crioprecipitado.

Estudio de la liberación de fibrinopéptido A

Se sabe que el fibrinógeno es un dímero en el que la molécula monómera contiene tres cadenas A\alpha, B\beta y \gamma (la masa molecular total de este monómero es del orden de 170.000). Bajo la acción de la trombina, ésta molécula es parcialmente hidrolizada, con liberación de fibrinopéptido A (fp A) y de fibrinopéptido B (fp B), a razón de una molécula de fp A y una molécula de fp B por molécula de monómero. Las moléculas así liberadas de los fp A y fp B constituyen los monómeros de fibrina que se asocian entre sí mediante puentes de hidrógeno y forman la fibrina insoluble. El adhesivo biológico de la invención está prácticamente exento de fibrina, como muestra la dosificación de los fp A, por ejemplo, con ayuda de un kit de dosificación Asserachrom® (STAGO).

Contenido en fibrinógeno del adhesivo biológico: 50 g/l (media de 5 preparaciones).

Contenido en fp A: 365 ng/ml (media de 5 preparaciones).

El contenido en fp A del plasma es del orden de 0 a 2,3 ng/ml, y el de un concentrado plaquetar estándar es del orden de 14 ng/ml (Bode y Miller, Vox Sanguinis 51, 192-196, 1986).

Siendo la masa molecular de fp A del orden de 1.500, se puede calcular fácilmente que la proporción ponderada de fibrinógeno que ha sido hidrolizado con liberación de fp A es del orden de 0,08%. Esto prueba que el adhesivo biológico de la invención esta prácticamente exento de fibrina, y por tanto también de trombina.

Ejemplo 5

Se opera como en el ejemplo 1, modificando el tiempo de contacto con el activador, y se dosifica cada vez el contenido en calicreína del plasma tras la activación. Se constata que el contenido calicreína aumenta con la duración del contacto con el activador. A continuación se prepara un crioprecipitado con cada plasma estudiado y después se miden los tiempos de coagulación obtenidos después de la recalcificación. Los resultados se resumen en la figura 1 anexa que representa el tiempo de coagulación del crioprecipitado en función del contenido en calicreína del plasma correspondiente después de la activación. Se observa que el tiempo de coagulación es inferior a 5 minutos, mientras que el contenido en calicreína es al menos igual a 20 UI/l aproximadamente. Una activación más importante (gracias a una duración mayor del contacto con el activador) conduce a un aumento en el contenido en calicreína del plasma, pero no influye sobre el tiempo de coagulación.

Claims (21)

1. Procedimiento de preparación de un adhesivo biológico que, en solución acuosa, no coagula de forma espontánea durante al menos una hora a una temperatura de 20ºC, y que es capaz de coagular en menos de 5 minutos por simple adición de iones calcio, que comprende las etapas consistentes en: a) obtener un plasma sanguíneo que contenga un agente capaz de complejar los iones calcio, b) obtener a partir de dicho plasma, según los métodos conocidos, un adhesivo biológico a base de fibrinógeno y de factores de coagulación, y c) si se desea, someter el adhesivo biológico obtenido a una liofilización,

en el que, antes o durante la etapa b), se pone en contacto dicho plasma con un activador de la fase contacto.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el agente capaz de complejar los iones calcio es el citrato sódico.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la duración del contacto con el activador es una duración suficiente para que el plasma tenga un contenido en calicreína de al menos 15 unidades por litro, representando dicha unidad la cantidad de calicreína capaz de hidrolizar una solución 0,52 mM de D-Prolil-L-Fenilalanin-L-Arginina-p-nitro-anilida en solución tampón veronal-acetato sódico de pH 7,35, a 37ºC, a la velocidad inicial de 1 \mumol/min.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho activador es un activador sólido insoluble.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho activador sólido se elige entre caolín, cristal, celita, carbonato cálcico, coral, óxido de zinc y carbonato de zinc.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque dicho activador contiene una activador soluble insolubilizado sobre un soporte sólido.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque, después de un tiempo de contacto suficiente, se separa y elimina el activador.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque se pone en contacto el plasma con el activador en un recipiente provisto de un filtro que permite dejar pasar el plasma mientras que retiene el activador, de forma que separa el plasma activado del activador después de la etapa de puesta en contacto.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque se realiza dicha puesta en contacto haciendo circular dicho plasma por una columna que contiene el activador.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se hace circular dicho plasma por la columna hasta un orificio de salida, estando dicho orificio de salida provisto de un filtro que permite retener el activador.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque se pone en contacto el plasma y el activador en un recipiente que tenga una pared interna sobre la cual está fijado el activador.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho activador es un activador soluble.

13. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 12, caracterizado porque dicho activador soluble se elige entre sulfato de dextrano y ácido elágico.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la etapa b) comprende la preparación de un crioprecipitado según los métodos conocidos, constituyendo el precipitado así obtenido dicho adhesivo.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la etapa b) se realiza mediante precipitación fraccionada.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque se realiza dicha precipitación fraccionada con la ayuda de una agente precipitante elegido entre etanol y polietilenglicol.

17. Dispositivo para la puesta en marcha del procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende un primer recipiente destinado a recibir el plasma antes y/o durante la activación, un segundo recipiente destinado a recibir el plasma después de la activación, los medios para transferir de forma estéril el plasma desde el primer recipiente hasta el segundo recipiente, los medios para poner en contacto el plasma con un activador de la fase contacto y, si se desea, los medios para separar el plasma activado y el activador de forma que el plasma que se recoge en el segundo recipiente esté exento de activador.

18. Dispositivo según la reivindicación 17, caracterizado porque dichos medios de puesta en contacto comprenden un tubo en el que está confinado el activador, y dichos medios de transferencia comprenden por un lado, un conducto que une un orificio de salida del primer recipiente a uno de los extremos del tubo y, por otro lado, un conducto que une un orificio de entrada del segundo recipiente al otro extremo de dicho tubo, de forma que el plasma esté en contacto con el activador dentro del tubo mientras circula entre en primer recipiente y el segundo recipiente.

19. Dispositivo según la reivindicación 17, caracterizado porque dichos medios de puesta en contacto con el activador comprenden, en el interior del primer recipiente, una pared sobre la cual está fijado el activador.

20. Dispositivo según la reivindicación 17, caracterizado porque dichos medios para poner en contacto el plasma con el activador y para separar el plasma activado y el activador comprenden un compartimento en el que está confinado el activador, estando dicho compartimento situado en el interior del primer recipiente y comprendiendo una pared permeable a los líquidos.

21. Procedimiento de utilización del adhesivo biológico obtenido según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se añade a dicho adhesivo una solución acuosa que contiene iones calcio, sin añadir trombina.