CN1599616A - 贮存稳定的人纤维蛋白原溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供稳定贮存即用型、生物相容的人纤维蛋白原的方法，尽管该纤维蛋白原浓度高，但它能以液体的形式获得，且能长期快速、简单地制成组织胶粘剂的制剂。本发明也提供由该方法制得的无菌的、贮存稳定的纤维蛋白原水溶液产品，其中纤维蛋白原长期保持即用型的液态形式，它不自发凝结(即，在不存在激活剂如凝血酶/Ca++的情况下形成凝块)且保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并与之充分混合时能快速形成纤维蛋白凝块的能力)。

Description

贮存稳定的人纤维蛋白原溶液
发明领域
本发明主要涉及贮存稳定的、浓缩人纤维蛋白原制剂，及其用于防止失血、促进伤口愈合和许多其它的治疗性和非治疗性应用的使用方法。
相关申请参考
本申请要求2001年10月3日提交的美国临时申请No.60/326,962的优先权，这里全文引入。
发明背景
纤维蛋白原是一种血浆蛋白，它在哺乳动物体内血凝的最后阶段起着重要的作用从而保持止血和防止失血。人体内凝块的形成，即，血液凝固，是以复杂级联方式进行的，在血凝的最后步骤中单体形式的纤维蛋白原在钙离子存在的情况下与凝血酶和激活因子VIII反应，形成了包括交联纤维蛋白聚合体的纤维蛋白凝块。
血浆蛋白中浓度为2-4克/升的纤维蛋白原单体，由三对经二硫键相连的多肽链构成。这些链称之为(Aα)2和(Bβ)2(分别表示α链、β链的两个小的氨基末端肽)以及γ2。凝血酶从纤维蛋白原切割纤维蛋白肽A形成化合物纤维蛋白I，随后切割纤维蛋白肽B形成最终的化合物纤维蛋白II。该切割只是略微地将纤维蛋白原的分子量从340,000道尔顿减少至334,000，但该过程却暴露出重要的形成汇聚且交联的纤维蛋白凝块的聚合反应位点。参见Jackson，Ann.Rev.Biochem 49：765-811(1980)；Furie等，Cell 53：505-518(1988)。
近来，已开发出含有纤维蛋白原、凝血酶和其它成分的生物胶粘剂，这类生物胶粘剂模拟自然凝血过程的最后阶鼠，因而形成纤维蛋白凝块。对所谓的纤维蛋白密闭剂或组织密闭剂、生物密闭剂、纤维蛋白胶或组织胶、生物胶粘剂等(这里合称为“纤维蛋白密闭剂”)这类物质的试验表明抗张强度与最终的纤维蛋白原浓度有正比关系(日本专利未审公开申请，Kokai No.Sho 61-293443)。因此，获得浓缩的纤维蛋白原对于制备常规的纤维蛋白密闭剂是很重要的。
以纤维蛋白原为基础的组织胶粘剂是已知的，例如美国专利No.6,117,425(MacPhee等)。除纤维蛋白原和因子XIII外，这类制剂也可含有其它的蛋白，如纤连蛋白、白蛋白以及任选地含有抗生素、生长因子等。所需的催化(凝血酶介导的)活性可源于它所应用的宿主组织(伤口的表面)，或在应用的过程中以含凝血酶和Ca++离子的溶液或粉末形式加入组织胶粘剂中。这类纤维蛋白密闭剂已用于人或动物组织或器官部分的无缝和/或有缝粘合、用于伤口闭合、止血和促进伤口愈合、用于包埋假体装置、及用于许多其它的治疗或非治疗性应用。
纤维蛋白密闭剂的纤维蛋白原成分来源于收集的人血浆，通常作为人的因子VIII制备过程中的废弃产物。纤维蛋白原能由人血浆通过冷沉淀而浓缩，或用各种试剂例如聚乙二醇、乙醚、乙醇、硫酸铵或甘氨酸通过已知的方法沉淀而浓缩。例如Brennan在Blood Reviews 5：240-244(1991)中、Gibble等在Transfusion 30：741-747(1990)中、Matras在J.Oral Maxillofac.Surg.43：605-611(1985)中、Lerner等在J.Surg.Res.48：165-181(1990)中对纤维蛋白密闭剂进行了综述。
从制备的角度看，按照美国专利No.5,290,552的描述，早期的外科胶粘剂制剂必须包含高含量的纤维蛋白原(约8-10％)，极难由其制备冻干物。这类冷沉淀物相对不稳定且要求在使用前一直贮存在-20℃以下。改进冷沉淀物稳定性的配方包括添加血纤蛋白溶酶原激活剂的抑制剂或白蛋白。
在足够高的纤维蛋白原的浓度下，该制剂在伤口愈合过程中能提供有效的止血性能、对伤口和/或组织区域良好的密闭粘附性、高强度的粘附和/或伤口密闭性以及胶粘剂的完全可再吸收能力。对于最佳的粘附作用，要求即用型组织胶粘剂溶液中纤维蛋白原的浓度为约15-60mg/ml(MacPhee，personalcommunication，1995)。
组织胶粘剂或以深度冷冻溶液的形式出售，或以冻干物的形式出售。这是因为已知液体溶液中高浓度的纤维蛋白原是极不稳定的(http：www.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm/)，即它会自发凝固。因此，市售的冻干的和/或深度冷冻的纤维蛋白原浓缩物，如Tissucol，目前必须在应用前液化，即慢慢融解(“熔化”)或由冻干的形式重构。然而，两种液化过程都很费事并在产品使用前要耽误很长的时间，这会使受伤的病人处于生命受到威胁的状态。
深度冷冻浓缩物的“液化温度”，例如制剂由冷冻的固态变为液态时的温度，要求溶液的温度缓慢上升—通常达到至少25℃，更常见的是37℃以上，同时要求剧烈搅拌或振荡多至30-60分钟(http：//www.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm/)。因此，现有技术中纤维蛋白原制剂的重构要求使用水浴或其它加热装置(典型的是在37℃)，以尽可能在最短的时间内将深度冷冻物质变成即用型纤维蛋白原溶液。然而，因为产品需要必要的双层包装以便例如在整个困难、繁琐的解冻过程中保持产品的无菌状态，所以典型地使得热交换更加困难。例如，预填充、即用型、无菌一次性注射器中的深度冷冻的纤维蛋白密闭剂制剂必须以塑料膜双层密封以保持无菌。
由深度冷冻的固态转变为液态不是突然发生的，而是经历升高温度的步骤，经历胶状的和粘性的过渡状态。根据至少一种试验，当倾斜试管形成水平的液体水平面时，即样品流动时不会突然形成可见的突起时样品才称为“液态”。因此，现有技术中在贮备的纤维蛋白原制剂使用前，测试产品以确定其什么时候达到均匀的“液体”即用型状态需要增加额外的耗费时间的步骤。而且，一定程度的操作者误差的不确定性和可能性也会显然影响纤维蛋白原产品的有用性和有效性。
配制冻干的纤维蛋白原需要花费的时间也造成使用前要耽搁相当长的时间，这成为当前以纤维蛋白原为基础的止血剂应用中的实际问题。所以，已经进行了许多努力试图改善冻干的纤维蛋白原制剂的溶解性。例如，制造者需要使用加入到装蛋白的小瓶中的磁性搅拌子，以便加热时提供显著的振荡。这样，溶解时间比得不到充分混合的同样产品短，但也仍然需要30-60分钟的配制时间以仅仅得到即用型的纤维蛋白原。
通常，病毒失活方法的使用使现有技术中的纤维蛋白原制剂的溶解性进一步降低。这些方法优选以对冻干材料进行热处理的方式实施，例如按照EP0159311的方法。
已知冻干物的重构能通过加入某些添加剂得到改善。例如，EP-0345246描述了一种冻干的纤维蛋白原制剂，它除含纤维蛋白原外还至少含一种生物学上可接受的添加剂(表面活性剂)。表面活性剂加入的结果是溶剂对冻干物的湿润性得到改善，因而一定温度下的溶解速率随之改善，但纤维蛋白原本身的溶解度不会改变。因此，这类制剂的重构也必须在高于25℃通常37℃的环境温度下进行。
为克服在使用前必须重构或液化冻干的或深度冷冻的纤维蛋白原产品，尤其是浓缩制剂的这一缺陷，已经介绍了某些在室温下能溶解的纤维蛋白原制剂。然而，现有技术的这类产品具有细胞毒性(Beriplast.Biocol，Bolheal HG-4)。
美国专利No.5,962,405提供了一种贮存稳定的、冻干的或深度冷冻的液体纤维蛋白原制剂，它能重构或液化成即用型纤维蛋白原和/或组织胶粘剂溶液，——优选不用额外的方式如加热和/或搅拌装置来产生即用型组织胶粘剂溶液，其中纤维蛋白原的浓度至少为70mg/ml。然而，该制剂包含纤维蛋白原和至少一种能改善制剂的溶解性、和/或降低其液化温度和降低即用型组织胶粘剂溶液室温下粘度的其它物质。用于增加溶解度的物质选自下列物质中的一种或多种：苯、吡啶、哌啶、嘧啶、吗啉、吡咯、咪唑、吡唑、呋喃、噻唑、嘌呤化合物或维生素、核碱基、核苷或核苷酸，按0.03-1.4毫摩尔/克纤维蛋白原的比例加入，虽然推荐使用相对更高的增溶物质/纤维蛋白原比例。也可存在其它的蛋白、佐剂和添加剂。然而，与以前要求37℃的加温条件相反，因为其液化的温度降低，该‘405专利声称深度冷冻的纤维蛋白原浓缩溶液在20-23℃(室温)的环境温度下液化是有利的。不过，该方法仍然要求在深度冷冻的条件下(温度维持在-25℃至-15℃以下)贮存，且制剂的液化还要花费15分钟。
关于解决组织密闭剂制剂中纤维蛋白原溶液早期凝固问题的另一种方法，美国专利No.5985315提供了一种包含至少一种活化的凝固因子和纤维蛋白原的稳定的生物预活化的生物胶粘剂，其中凝固因子的活化不依赖于钙离子。该预活化的胶粘剂在水溶液中是稳定的，即，溶液在20℃的温度下在至少一小时内不会自发凝固；但简单地加入钙离子能使其在约5分钟内凝固。不需要加入另外的活化剂。因而，所得到的生物胶粘剂既不需要加入凝血酶也不需要加入凝血酶原就能凝固。然而不幸的是，这样慢的凝固时间使该纤维蛋白密闭剂不适于用于任何类型的流血的或搏动的伤口。
因此，从医疗的观点看，快速获得即用型、生物学的、组织胶粘剂是重要的，尤其在外科的紧急情况下。此外，为了在制备即用型纤维蛋白原密闭剂溶液时使助理人员的负担减至最小，也要求尽可能地减少操作。纤维蛋白密闭剂制剂要求贮存的纤维蛋白原成分，但目前纤维蛋白原只能以冻干物、深度冷冻的浓缩液或以含其它成分的混合物的形式获得，这些其它成分可能对以纤维蛋白原为基础的组织胶粘剂有负面效力或对患者的安全使用有不利影响。因此，需要一种贮存稳定的、即用型人纤维蛋白原溶液，虽然它浓度高，但能以液体的形式获得，且能快速、简单地制成用于患者的组织胶粘剂制剂。
发明概要
本发明包括稳定贮存即用型、生物相容性人纤维蛋白原的方法，虽然浓度高，但仍能以液体的形式获得，且能快速、简易地加工成组织胶粘剂制剂。本发明也提供使用该方法制得的无菌的、贮存稳定的纤维蛋白原的含水产品，其中纤维蛋白原保持即用的液体形式，它不自发凝结(即，甚至在无激活剂如凝血酶/Ca++的存在下形成凝块)，且能保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并与之剧烈混合时能快速形成纤维蛋白凝块的能力)。所述贮备的、浓缩的、即用型的生物相容性人纤维蛋白原完全溶解，溶液为水溶液，且其稳定性是pH和温度依赖性的。
本发明的方法提供稳定的、浓缩的、即用型、生物相容性的人纤维蛋白原溶液，该溶液在初始制备后至少一天到一年或多年的贮存期内能保持其稳定性。该产品能被冷冻、解冻、再冷冻和再解冻而不影响组合物的凝结性质。
按照优选的方法，本发明提供即用型纤维蛋白原溶液，该溶液是新鲜制备的、或从血浆中新鲜分离和纯化的，或为上述其中一种的冷冻制剂，该溶液在室温或冷藏(约4℃)以及pH6.32-8.04的条件下无菌保存于适宜的容器中。能保持稳定性至少一年或多年。本发明还进一步提供按本发明的方法保存的即用型、无菌的、稳定的纤维蛋白原水溶液。
根据本发明的另一优选方法，将蛋白酶抑制剂加入上述即用型纤维蛋白原溶液中以增加其贮存的稳定性。在某些实施方案中也可将其它的添加剂或成分加入上述贮备稳定的、即用型纤维蛋白原溶液中以增加所得的纤维蛋白原在随后的应用或由其生产的产品或材料中的效力。本发明进一步提供接这类供选择的方法保存的即用型、无菌的、稳定的纤维蛋白原水溶液。
这样制备和贮存的即用型、人纤维蛋白原的浓溶液可以被中和和使用，而在配制生物组织胶粘剂或密闭剂(包括即溶的纤维蛋白密闭剂制剂)时不需要额外的步骤或程序，并可用于其它药物或化妆品方面的用途，包括例如伤口愈合、凝血、纤维蛋白原血症、阻止手术或手术后的后遗症、包埋人工血管、或注输，也用于体内或体外其它的辅助或非辅助的治疗或非治疗性应用。
本发明的其它目的、优点和新的特点将在说明书、实施例和后面的附图中部分地阐明，并且部分内容对本领域的技术人员来说是显而易见的或通过本发明的实践是可以获知的。
本发明优选实施方案的描述
本发明提供稳定贮存即用型人纤维蛋白原的方法，虽然浓度高但仍能以液体的形式获得，且能快速和简单地制成组织胶粘剂制剂。本发明也提供使用该方法制得的贮存稳定的纤维蛋白原水溶液产品。
本发明即用型纤维蛋白原水溶液是贮存稳定的，当贮存一段时间后仍能以液态的形式保持稳定，不自发凝结(即，甚至在无激活剂如凝血酶/Ca++的存在下形成凝块)，且保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并与之剧烈混合时能快速形成纤维蛋白凝块的能力)。所公开的方法阐明了人纤维蛋白原以即用型水溶液贮存相当长的时间保持活性和稳定性(贮存稳定)的条件。
本文中所述贮存稳定的人纤维蛋白原溶液的“活性”是指蛋白的“生物活性”“生物活性”是指已知的与人纤维蛋白原或其亚群(subset)相关的一种或多种体内和/或体外的活性，例如上面所述的快速形成纤维蛋白凝块的能力。评估生物活性的方法为本领域技术人员已知的方法。
本文中，假如没有进行其它的定义，所有的科学和技术术语均为本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
本发明的贮存方法可适用于任何的人纤维蛋白原制剂，无论它是从血浆中分离和纯化的还是重组制备的，无论是新鲜分离的还是由冻干或深度冷冻的制剂新鲜配制的。不管纤维蛋白原制剂被冻干或深度冷冻的时间有多长，只要这种新鲜制备的纤维蛋白原溶液具有与由血浆中分离和纯化的纤维蛋白原对照样品相等的生物活性且在溶液中没有被诱导自发凝结，均可应用本发明的方法。
本发明优选的实施方案适用于制备过程中的纤维蛋白原粗产品，或适用于具有大于90％的蛋白纯度和含大于95％的可凝结蛋白的最终的纤维蛋白原浓缩制剂，或适用于介于两者之间任何浓度的纤维蛋白原。例如，在随后的实施例中，纤维蛋白原制剂具有53％的蛋白纯度和95％的可凝结蛋白，而在发明人采用非人纤维蛋白原所做的其它实施例(没有给出数据)中，制剂具有61％的蛋白纯度和97％的可凝结蛋白。不过，本发明的方法对两者均适用。
在本发明一个优选的实施方案中，将贮存方法应用到浓缩的人纤维蛋白原制剂中。本发明的贮存稳定的纤维蛋白原制剂尽管是高度浓缩的，但仍能溶于水溶液中，使纤维蛋白原尤其适用于制备补充性或非补充性即用型生物组织胶粘剂。当其用于制备即用型组织胶粘剂制剂时，纤维蛋白原理想的贮存浓度为10-85mg/ml，更优选的浓度为15-75mg/ml，更优选的浓度为30-70mg/ml，最优选的浓度为40-65mg/ml。
而且，本发明贮存稳定的水溶液中纤维蛋白原或含纤维蛋白原的蛋白的浓度范围通常为2-10w/v％，优选4-7w/v％。通过蛋白吸收测定法在280nm处测定纤维蛋白原的浓度(用14作为1％的纤维蛋白原溶液的消光系数)。
本发明贮存稳定的纤维蛋白原完全溶解在水溶液中，即，以水为基础的溶液。制剂的最佳温度和pH可根据本发明获得，或由本领域的普通技术人员用已知的方法快速测定。然而，水基凝胶也能用于本发明中，只要该物质能使其中的纤维蛋白原完全溶解，且只要制剂具有足够的流动性能允许快速制备按本发明公开方法贮存后的即用型生物组织胶粘剂或其它应用。本发明的关键是纤维蛋白原溶液以即用型的液体形式贮存；它既不以冻干的制剂贮存，也不以深度冷冻的状态贮存。
在本发明一个优选的实施方案中，新鲜的纤维蛋白原溶液为自由流动的液体，虽然其粘度典型地比水大，但它能很容易地沿倒立的试管流动。具有生物活性(即，存在凝血酶和Ca离子时凝结)的贮存后样品本质上具有与新鲜的样品同样的物理特性。当制备并使用组织胶粘剂时，这类凝结产生由活性纤维蛋白原形成的可控凝块。为了便于讨论，这类凝块在本文中简称“纤维蛋白凝块”以使这一过程区别“自发凝块”，其中后者可在不稳定的纤维蛋白原浓溶液中发生，甚至在没有凝血酶或其它激活剂存在时发生。
然而，本文使用该术语仅仅是为了将贮存的纤维蛋白原溶液期望的用途与自发凝块区分开，在期望的用途中当等量的纤维蛋白原与凝血酶/Ca++剧烈混合时纤维蛋白凝块的快速形成能迅速证明稳定贮存的纤维蛋白原溶液的活性，而自发凝块是现有技术中纤维蛋白原溶液不稳定性的标志。在已知的现有技术中，新鲜制备的人纤维蛋白原水溶液是极不稳定的且在贮存时倾向于自发形成凝块，这一事实使得用先前认识到的方法以即用型液体形式贮存纤维蛋白原即使一天或两天也不现实。
“自发凝结”被认为是人纤维蛋白原水溶液制剂的粘度增加(没有暴露在激活剂如凝血酶和Ca离子中)，导致混合时可见的移动性(流动性)降低。该过程是不可逆的，使得纤维蛋白原在如制备纤维蛋白密闭剂时毫无用处。在现有技术中新鲜制备的纤维蛋白原的水溶液通常在低于1天的时间内，常只在几个小时或更短的时间内发生自发凝结。这种不稳定性使得纤维蛋白原用现有的方法以即用型形式贮存的时间完全不可预测，因而不可靠。
在本发明一个优选的实施方案中，贮存稳定的纤维蛋白原贮存在聚合物、塑料或以塑料为基础的容器中，虽然更优选的塑料容器是聚丙烯。不用玻璃贮存纤维蛋白原或血小板，因为玻璃能促进自发凝结的形成。
加入凝血酶和钙离子并剧烈搅拌也不结块的即用型人纤维蛋白原的贮存溶液，称为“凝血酶不敏感”。这类凝血酶不敏感的制剂保持流体的形式(具有与水相似的粘度)。然而，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)对这类凝血酶不敏感的制剂样品的分析显示，纤维蛋白原蛋白不可逆地降解为小分子量的片段。因而这类制剂不再含有活性的纤维蛋白原，它不是本发明的主题。
将凝血酶/Ca++加入到即用型纤维蛋白原溶液中后，可观察到粘度的迅速增加和液体的流动性下降，称之为“凝胶”。在凝胶状态下，纤维蛋白原溶液不再自由流动，但搅动能迫使其流动。虽然这种测定具有主观性，但其估计误差只有±2秒。
“凝块”是纤维蛋白原溶液的突然固化形成的，此后搅动也不能使液体从固化的物质中流出。这种不流动的物质通常变成肉眼可观察到的不透明白色并具有粘塑性。例如，典型的生理或非生理的纤维蛋白凝块的电子扫描显微(SEM)照片由Redl等发表在Medizinische Welt 36：769-76(1985)中。凝块通常粘附在试管壁上，在固体表面上急剧轻敲试管也不能使其移走。这样的测量方法与凝胶的形成相比受主观性影响小，且估计的不确定性对于快速凝固的样品(8-12秒)只有±1秒，虽然对于凝结较慢的样品(＞100秒)可能略高些。
溶液的贮存温度没有特别严格的限制，只要其中所含的纤维蛋白原保持稳定即可(即，既不失活也不自发凝结)。本发明纤维蛋白原溶液优选的贮存温度范围为1至25℃，更优选约4至约23℃。冷藏时，最佳温度为约4℃±1℃。当在室温贮存时，理想的温度范围为约20至25℃，更优选约22至24℃，最优选约23℃±1℃。
为评估冷冻后凝块形成的效力，在试验前将纤维蛋白原溶液的样品也进行冷冻和解冻，研究表明一个或多个冷冻/融解循环似乎不会对人纤维蛋白原溶液的凝结能力产生负面影响，即使在冷冻前在4℃下贮存了5个月。同时，这些数据充分表明很容易配制保存期限为至少一年的纤维蛋白原液体产品，假如液态纤维蛋白原制备初期就冷冻，可能还会增加几年的保存期。
贮存期间优选将纤维蛋白原水溶液的pH值调节为约pH5-8，更优选pH6.2-7.5。具体的纤维蛋白原溶液贮存的最佳pH值部分地依赖于该物质的贮存温度，这一点显示在实施例所附的表中。然而，从本发明提供的信息看，知道决定因素是其中所含的蛋白质是否保持稳定(即，既不失活也不自发凝结)，本领域普通技术人员能够根据计划的贮存温度和条件选择最佳的纤维蛋白原溶液的pH值。
例如，即用型人纤维蛋白原在室温(约23℃)贮存(不含蛋白酶抑制剂)的理想pH为6.3-7.1，优选的pH约为6.32，以保持贮存后的制剂被中和和暴露于凝血酶/Ca++中时快速形成凝块的能力。当即用型人纤维蛋白原(不含蛋白酶抑制剂)在冷藏温度(约4℃)贮存时，理想pH为6.32-8.0，优选约pH6.3-7.5以保持贮存后的制剂在被中和和暴露于凝血酶/Ca++中时快速形成凝块的能力(参见表1)。
贮存稳定的人纤维蛋白原溶液的pH由其中的缓冲液决定。例如，在后面的实施例中，在以下的一种0.1M缓冲液中新鲜制备人纤维蛋白原溶液(40mg蛋白/mL)：组氨酸，pH为6.0或7.2；三羟甲基氨基甲烷，pH为8.16；甘氨酸，pH为9.3；或碳酸盐，pH为9.1或9.9。
在本发明一个优选的实施方案中，在组氨酸缓冲液中制备贮存稳定的人纤维蛋白原溶液，虽然已经认识到的、本领域技术中已知的生理上可接受的其它缓冲液也可以用于制备贮存稳定的纤维蛋白原，只要所得的纤维蛋白原溶液的pH维持在上述规定范围内，这样能维持其活性但又不自发凝结。
目前市售的纤维蛋白原含有在分离和纯化过程中使用的盐。正如实施例中提到的，其包括柠檬酸钠和氯化纳，但纯化过程中残留盐的存在似乎不会影响所得制剂的贮存稳定性。既然本发明的目的是生产贮存稳定的、即用型人纤维蛋白原溶液，它能保持与新鲜制备的人纤维蛋白原溶液相当的特性，所以纤维蛋白原的纯化过程对两者的影响是相同的。不过，高浓度的柠檬酸盐和/或钠可能影响贮存后的纤维蛋白原制剂的凝结。因此，即使鉴定到的盐或其它螯合剂存在于新鲜制备的溶液中，本发明的方法也是有效的，并且只要在贮存期间保持其活性和不被盐或螯合剂诱导自发凝结，该贮存稳定的制剂将保持与新鲜制备的溶液相当的特性和活性。
后面的实施例中，将叠氮化钠(0.025％)作为抗微生物剂加入每份样品中。虽然该抗微生物剂从某种程度上可能诱导自发凝结，但它似乎还没有表现出这种效果。在本发明优选的一个实施方案中，没有加入抗微生物剂，而用已知的技术保持无菌。然而，在另一实施方案中，根据例子中给出的程度加入了抗微生物剂以避免纤维蛋白原溶液在长时间的贮存期间受到微生物污染。任何已知的、生理学上的抗微生物剂对本发明来说都是可接受的，只要在整个贮存期间能保持纤维蛋白原溶液的活性，不诱导自发凝结，且该试剂不会对人的应用有相反的作用。
本发明贮存稳定的人纤维蛋白原溶液可以补充下列物质，并可用作这类物质的载体媒介：生长因子、药物或其它化合物或其混合物，只要上面提到的在整个贮存期间能保持纤维蛋白原溶液的活性且不诱导自发凝结。例如，当即用型纤维蛋白原用于制备纤维蛋白密闭剂或组织胶粘剂制剂时，可向纤维蛋白原制剂中补充生长因子以加速、促进、或改善伤口的愈合、组织的再生。这样的补充制剂也可以含有其它的成分，例如药物、抗体、抗凝剂和其它化合物：(1)用于增强、刺激或介导生长因子或其它添加剂或成分的生物活性的化合物；(2)用于降低补充有生长因子的人纤维蛋白原或纤维蛋白密闭剂或组织胶粘剂中一种或多种添加剂或成分的活性的化合物，其中该活性会抑制或破坏制剂中的生长因子；(3)能从制剂中长期运输添加剂或成分的化合物，所述制剂例如由本发明纤维蛋白原溶液制得的纤维蛋白密闭剂或组织胶粘剂；(4)具有其它期望性质的化合物。所考虑的添加剂或补充剂还包括它们的任何突变体、衍生物、缩截物或其它由其修饰的形式、或其亚群，它们具有与它们所衍生自的化合物或组合物相似的生物活性。
一种以上的添加剂或成分可以同时添加或补充到本发明贮存稳定的纤维蛋白原溶液中。虽然纤维蛋白原溶液中这样的添加剂或成分的浓度随其目的而变化，但其浓度必须足以使这些化合物和/或组合物完成其预期的或所述的目的。添加的这类补充剂的量可以由本领域普通技术人员凭经验决定，通过试验多种浓度而选择对预期的目的和应用部位有效的量。例如，也可加入染料、示踪物、标示物等，以检查加入了纤维蛋白原的材料随后的运输。
本发明一个优选的实施方案中，在贮存前将有效量的蛋白酶抑制剂(PI)，比如但不限于抑酶肽(例如，5μg/mL的终浓度)或PPACK(例如，25μM的终浓度)加入到贮存的人纤维蛋白原水溶液中。其它蛋白酶抑制剂(PI)为本领域已知，也可代替实施例中公开的抑酶肽和PPACK。值得注意的是，所用的抑酶肽是市售的Tisseal产品。蛋白酶抑制剂的“有效量”是指能抑制纤维蛋白原样品蛋白水解的PI量。此量将根据所用的PI或PI的组合而变化，但很容易由本领域普通技术人员确定。然而，虽然在PI存在时所贮存的纤维蛋白原溶液可长时间保持稳定，但已经知道PI的效力会随时间而衰减。
例如，虽然向贮存稳定的人纤维蛋白原中加入PI抑制了在约4℃长期贮存的蛋白中形成不期望的自发凝块，但PI的加入似乎不会因为残留的抑制剂活性而对产生快速的纤维蛋白原/凝血酶产物(纤维蛋白凝块)有影响。该产品在最低的pH值贮存7天后不用测试。然而，在室温(约23℃)pH6.3-7.0保存至少149天后的贮存稳定的人纤维蛋白原溶液样品中可以观察到测试样品中纤维蛋白原/凝血酶凝块迅速形成。
如表1和表2中显示的，“抑制”的含义等同于“阻止”，即PI最初在本发明公开的条件下是有活性的(即，凝结被抑制/阻止)，但接着其活性衰减，随后其抑制活性逐渐消失并最终停止。纤维蛋白原溶液中PI活性的衰减速率依赖于pH和温度。
本发明随后的实施例通过连续的观察和试验表明本发明的纤维蛋白原溶液在优选的条件下(有活性且不自发凝结)，贮存在室温(约23℃)或冷藏温度(约4℃)，在pH6.3-8.0时能保持稳定至少97天，在pH6.3时能保持稳定至少149天。在存在蛋白酶抑制剂时，尽管没有进行更长时间的试验，人纤维蛋白原制剂贮存在约23℃时能保持贮存稳定至少22天。因此，本发明优选实施方案中的人纤维蛋白原溶液在室温下不管是否存在PI都能保持稳定多年。
从已证实的至少149天的稳定性看，与已知的深度冷冻的或冻干的没有显著失去活性(即，在混合时仍迅速形成纤维蛋白原/凝血酶纤维蛋白凝块)的蛋白浓缩制剂相比，表明该产品在极长的时间内甚至在纤维蛋白原产品最初贮存后的几年仍是稳定的。因此，“长期贮存”是指即用型人纤维蛋白原溶液在本申请公开的条件下没有显著失去活性地贮存至少3天，优选至少3周，更优选至少13周，更优选至少149天，更优选至少1年，最优选多于1年。此外，该术语除以即用型形式贮存外还包括冷冻贮存的时间，这使产品的贮存期额外增加了几年。
本发明的制剂是“人”纤维蛋白原，但本发明的方法也适用于稳定贮存源自其它物种的即用型纤维蛋白原的水溶液，最优选的是其它哺乳动物。另一方面，哺乳动物中使用贮存的人纤维蛋白原似乎没有出现物种相容性的问题。例如，人纤维蛋白原在以水溶液的形式贮存后可以用来制备，如生物相容的可用于任何哺乳动物物种的组织胶粘剂制剂。然而，可以理解本发明的人纤维蛋白原制剂的有利应用还是将其即用型制剂用于人类受试者。
作为血浆蛋白，纤维蛋白原通常伴有被血液传播性病原体(如那些可能污染人血浆蛋白的病原体，尤其是肝炎病毒或HIV)污染的危险。因此，本领域的技术人员很容易制备纤维蛋白原以除去可能的感染物。通常实现该目的的技术包括但不限于超滤、巴氏灭菌(加热)、溶剂去污剂处理、放射照射和紫外线处理。尽管通过高温加热或蒸汽的方法使病毒失活对于生物活性的蛋白溶液(包括本发明的纤维蛋白原溶液)是不实际的，但纳米过滤对于本发明的人纤维蛋白原溶液置入无菌贮存容器之前是一种可选择的处理方法。
不过，虽然纤维蛋白原对热不稳定因而在常规的液体加热过程中易失活，但已开发出加热纤维蛋白原使任何潜在的污染病毒，如肝炎病毒或HIV失活，而不使纤维蛋白原本身失活的技术。美国专利No.5,116,950(Miyano等，1992年5月26日发表)提供了加热纤维蛋白原的方法，该方法包括在至少一种糖、氨基酸和镁盐存在下加热含纤维蛋白原的水溶液，直到使可能污染所述纤维蛋白原的病毒失活。
在本发明一个优选的实施方案中，如有需要，这种加热过的纤维蛋白原的水溶液可以用常规的方法如透析、灭菌或过滤进一步纯化和处理。也能通过本领域已知的方法运用多种洗涤步骤除去稳定性的添加剂。
本发明的纤维蛋白原溶液理想地适于在暴露于激活剂溶液中时形成一种生理纤维蛋白结构并迅速形成纤维蛋白凝块。这可以通过将贮存的纤维蛋白原溶液与等体积的凝血酶/CaCl2溶液(包含，如2.5单位凝血酶/mg纤维蛋白原(100单位/ml)和过量于柠檬酸盐和可加入到溶液中的其它螯合剂3-6mM的CaCl2)混合得到证实，这一点在随后的实施例中阐明。如果所得的凝块显示出生理的纤维蛋白结构，当凝血酶在生理条件下(即，在离子强度约为0.15和pH约为中性的条件下)作用于新鲜制备或新鲜分离和纯化的人纤维蛋白原而形成凝块时，凝块将显示出典型的、立体支化的原纤维结构。
纤维蛋白原和凝血酶的浓度决定凝块形成的时间、凝块的强度、凝块的粘着性和其止血作用。
而且，根据本发明的纤维蛋白原制剂和/或其所要加入的基于纤维蛋白原的组织胶粘剂在用作组织胶粘剂时没有细胞毒性，即，它是“生物相容的”，这意味着它能被细胞很好地耐受、允许细胞的良好生长并为伤口的良好愈合提供理想的先决条件。这已经通过用等体积的半等渗或等渗的氯化纳溶液稀释组织胶粘剂并加入到成纤维细胞生长培养基中得到证实。没有检测到对成纤维细胞的破坏作用(参见Redl等，1985)。
因此，以能满足组织胶粘剂所有要求的方式制备本发明的贮存稳定、即用型人纤维蛋白原溶液，即具有生物相容性、病毒安全性和高粘附强度，并且它具有可由即用型人纤维蛋白原产品快速和简单配制的优点。可以任何已知的方式应用由本发明贮存稳定的人纤维蛋白原制备的组织胶粘剂，用于使用生物学制备的、补充或非补充的组织胶粘剂如药物或化妆品方面的用途，包括用于输液如抗生素、抗肿瘤药、麻醉剂等的输送；用于伤口愈合、凝血和纤维蛋白原血症；用于抑制手术或手术后后遗症；用于包埋假肢；用于可敷性伤口封闭和用于安全持续的止血，即封闭流体和/或空气泄漏等，以及病人身上的类似用途。
本发明进一步用实施例加以描述。然而，这些实施例的目的是作为示范性的例子提供给本领域的技术人员，而不是将本发明限于这些实施例。而且，不能认为这些实施例限定了所附权利要求的范围。因此，绝不能认为本发明限于下面的实施例，但可以认为本发明包括了任何和所有根据本发明的教导来说是显而易见的变化。
实施例
为了评估本发明的纤维蛋白原溶液的贮存稳定性，在包含不同的缓冲液(pH值)、温度和添加剂如蛋白酶抑制剂的一定范围的贮存条件下对纤维蛋白原溶液的稳定性、溶解性和凝结活性进行了评估。牛纤维蛋白原、牛凝血酶、抑酶肽、缓冲溶液、氯化钙、氢氧化钠和盐酸购自Sigma Chemical公司，St.Louis，MO。PPACK由Calbiochem，San Diego，CA提供。人纤维蛋白原经检验含有53％的蛋白(95％是可凝结的)和47％的盐。
标准研究等级的纤维蛋白原包含分离和纯化过程中使用的盐。它包括柠檬酸钠和氯化纳。因而，例如，40mg/ml的纤维蛋白原溶液除含纤维蛋白原外还含有54mM柠檬酸钠和419mM氯化钠。此外，叠氮化钠(0.025％)作为抗微生物剂加入到每份样品中。
以下列方式完成凝结分析，基本与Kasper，Proc.Symposium on RecentAdvances in Hemophilia Care，Los Angeles，CA，1989年4月13-15日(in Liss，New York，1990)所述方法一致。将等份量(100μl)的每一纤维蛋白原样品加入到4ml的聚丙烯试管中。每份样品用0.1M的氢氧化钠、0.2M的组氨酸缓冲液(pH6.0)或0.1M的盐酸中和(pH7.0-7.3)(用较大的体积在初始研究阶段测定)。凝血酶按200单位/ml与1M氯化钙一起配制(其中钙比纤维蛋白原制剂中的柠檬酸纳过量3-6mM)。然后将凝血酶制剂用0.1M的组氨酸缓冲液(pH7.2)稀释至凝血酶的终浓度为100单位/ml(25单位的凝血酶/mg纤维蛋白原)。所有的样品均在室温下检测(23±2℃)。
将100μl的凝血酶加入到纤维蛋白原样品(100μl)中，并将混合物剧烈混合，记录所发生反应的时间来对凝结进行测量。记尿溶液变为粘性胶体(液体混合时突然变慢)和变为固体凝块的时间(混合时所有液体流动停止的时间点)。固体凝块形成的时间通常是胶体形成时间的两倍。
为评估纤维蛋白原水溶液长时间的贮存能力，在以下条件贮存149天(超过21周)对人纤维蛋白原溶液的稳定性、溶解性和凝结活性进行评估：一定范围内的5个pH值(pH6.30-pH9.8)、含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)、室温(约23℃)和冷藏温度(约4℃)。在贮存的第1天在以下的一种0.1M缓冲液中新鲜制备双份的人纤维蛋白原溶液(40mg蛋白/ml)：组氨酸：pH6.0或7.2；三羟甲基氨基甲烷：pH8.16；甘氨酸：pH9.3；或碳酸盐：pH9.1或9.9。在贮存前将蛋白酶抑制剂：PPACK(最终浓度为25μM)和抑肽酶(最终浓度为5μg/ml)加入到该双份溶液的一半溶液中。
为评估凝结能力，将样品按前述预定的方案中和，然后按上面描述的方法测试。
表1和表2显示了所给条件下人纤维蛋白原的凝结测试结果。
表1.不含蛋白酶抑制剂的人纤维蛋白原在23℃和4℃贮存的凝结时间
 贮存期(天)   温度(℃)                       凝结时间(秒)
 pH6.32   pH7.13   pH8.04   pH8.79   pH9.43
   4     23    10     10     11     12     120
    4    10     10     9     10     凝结
   7     23    10     10     9     11     240
    4    10     9     8     9     12
   22     23    10     8     10   ＞300    ＞300
    4    10     8     9     NT     NT
   97     23    30    ＞300   ＞300   ＞300    ＞300
    4    18     10     10     11    ＞300
   149     23    NT    ＞300    ＞300     NT     NT
    4    15     135     30   ＞300    ＞300
NT＝没有测试。“凝结”是指未加入凝血酶时的自发凝结。
表2.含蛋白酶抑制剂的人纤维蛋白原在23℃和4℃贮存的凝结时间
 贮存期(天)   温度(℃)                      凝结时间(秒)
 pH6.32   pH7.13   pH8.04   pH8.79    pH9.43
   4     23     20     30    100     50     130
    4   ＞300   ＞300    360     120     120
   7     23     20     25    60     30     240
    4   ＞300   ＞300    150     150     70
   22     23     25     11    18     30   ＞300
    4     NT     65    60     NT     NT
   97     23     NT     16   ＞300   ＞300   ＞300
    4     18     16.5    45     30     180
  149     23     NT     40   ＞300     NT     NT
    4     NT     30    30     NT   ＞300
NT＝没有测试。
所有在室温下贮存的人纤维蛋白原样品都是清澈的且不含自发凝块。冷藏的人纤维蛋白原样品(约4℃)也是清澈的并不含自发凝块(除在测试的最高pH值的某个时间点有一无关的响应)。
然而，在室温下贮存97天后，只有在pH6.32的人纤维蛋白原样品保持了凝结能力。通过比较，在约4℃，pH6.32、pH7.13和pH8.04贮存97天后的人纤维蛋白原还能结块(9-11秒，相当于新鲜制备的对照品)。
在更深入的分析中，在pH约7.1于4℃下保存整一年的稳定贮存的人纤维蛋白原样品仍保持可溶性且完全能凝结(用凝血酶激活)。根据前述和我们的其它数据(没有给出)，表明纤维蛋白原液体制剂在pH约6.3时将进一步增加产品的稳定性。
在存在PI时，室温下，只有pH7.13的人纤维蛋白原样品凝结(pH6.32的样品已经蒸发，不能被测试)。约4℃存在PI时，所有的人纤维蛋白原样品保持凝结能力，但速度慢。结块的能力减弱可能是由于纤维蛋白原溶液中PI残留的能力抑制了加入的凝血酶。然而，由于PI成分也随时间而衰减，含PI(PPACK或抑酶肽)的样品在约23℃或约4℃下贮存后评估的结果显示出pH的依赖性。
凝结能力的减弱似乎是由于纤维蛋白原溶液中PI残留的能力抑制了加入的凝血酶。因此，在约4℃的短期贮存(4-22天)基本上抑制了凝血酶依赖性的凝结，即，加入凝血酶后样品不凝结，因为凝血酶的活性被溶液中残留的PI抑制剂所抑制。然而，因为PI成分随时间而衰减，其活性也随之下降。在较长时间(22-149天)的贮存后，PI的活性已经衰减，因而允许加入凝血酶以引发纤维蛋白原样品凝结。再者，该反应是pH依赖性的。
可得出这样的结论：在pH范围为6.32-8.04且不含蛋白酶抑制剂的情况下，冷藏(约4℃)贮存至少149天后，人纤维蛋白原在水溶液中还能完全溶解并保持凝结的能力。如果在加入凝血酶之前该贮存稳定的制剂保存在(4℃)下，在pH7.13-8.04条件下贮存至少149天后，活性的(可凝结的)人纤维蛋白原也能得到恢复。
前面说明书中引用的各专利、专利申请和专利公开的内容在此全文引入作为参考。
有关某些优选的实施方案前面的说明书已作了描述，作为示范还阐明了许多详细的内容，在本领域技术人员看来，似乎可以对本发明进行多种修改并运用其它的实施方案，本文中某些具体的细节可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行相当大的变化，这些修改、等同的变化和额外的实施方案也落入在所附权利要求的保护范围内。

Claims (29)

1.贮存稳定的、浓缩的、即用型、生物相容的人纤维蛋白原溶液，其中纤维蛋白原溶液的稳定性是pH和温度依赖性的。
2.权利要求1的纤维蛋白原溶液，其中纤维蛋白原是完全溶解的、且溶液为水溶液。
3.权利要求1或2之一的纤维蛋白原溶液，其中保持稳定性的贮存期可从初始制备后的至少1天到一年或多年。
4.权利要求1-3之一的纤维蛋白原溶液，其中纤维蛋白原溶液包括选自组氨酸、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸或碳酸盐的控制pH的缓冲液。
5.权利要求1-4之一的纤维蛋白原溶液，其中将溶液缓冲至pH6.53-8.04、贮存温度维持在约4℃的冷藏温度。
6.权利要求1-5之一的纤维蛋白原溶液，其中贮存的缓冲液为组氨酸。
7.权利要求1-6之一的纤维蛋白原溶液，其中稳定性保持至少约7天。
8.权利要求1-6之一的纤维蛋白原溶液，其中稳定性保持至少22天。
9.权利要求1-6之一的纤维蛋白原溶液，其中稳定性保持至少97天。
10.权利要求1-6之一的纤维蛋白原溶液，其中稳定性保持至少149天。
11.权利要求1-6之一的纤维蛋白原溶液，其中稳定性保持至少一年。
12.权利要求1-4之一的纤维蛋白原溶液，其中将溶液缓冲至pH6.3-8.04、贮存温度维持在室温。
13.权利要求12所述的纤维蛋白原溶液，其中贮存的稳定性维持至少22天。
14.权利要求12所述的纤维蛋白原溶液，其中贮存的pH值维持在约pH6.3至少97天。
15.以即用型、水溶液形式稳定贮存人纤维蛋白原的方法，包括：
在无菌的条件下，制备新鲜制得的纤维蛋白原溶液或从血浆中新鲜分离和纯化纤维蛋白原溶液或由冷冻的纤维蛋白原制剂配制纤维蛋白原溶液；和
在冷藏温度下贮存纤维蛋白原溶液，
其中纤维蛋白原溶液保持在液态、pH6.32-8.04和能维持纤维蛋白原的生物相容性和生物活性的条件下。
16.权利要求15所述的纤维蛋白原溶液，进一步包括在初始制备后至少1天到一年或多年的贮存期内保持稳定。
17.权利要求15-16之一的方法，其中冷藏温度维持在约4℃。
18.权利要求15-17之一的方法，其中稳定性保持至少7天。
19.权利要求15-17之一的方法，其中稳定性保持至少22天。
20.权利要求15-17之一的方法，其中稳定性保持至少97天。
21.权利要求15-17之一的方法，其中稳定性保持至少149天。
22.权利要求15-17之一的方法，其中稳定性保持至少一年。
23.权利要求15-22之一的方法，其中纤维蛋白原制剂在制成稳定的、即用型纤维蛋白原水溶液之前被冷冻、然后解冻并再冷冻至少一次。
24.以即用型、水溶液形式稳定贮存人纤维蛋白原的方法，包括：
在无菌的条件下，制备新鲜制得的纤维蛋白原溶液或从血浆中新鲜分离和纯化纤维蛋白原溶液或由冷冻的纤维蛋白原制剂配制维蛋白原溶液；和
在室温、pH6.32-8.04和能维持纤维蛋白原的生物相容性和生物活性的条件下贮存纤维蛋白原溶液，
25.权利要求24所述的纤维蛋白原溶液，进一步包括在初始制备后至少1天到一年或多年的贮存期内保持稳定。
26.权利要求24-25之一的方法，其中温度维持在约23℃。
27.权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少7天。
28.权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少22天。
29.权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少97天。
权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少一年。
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