-
Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebers,
dessen Koagulation durch Zugabe von Calciumionen erfolgt
-
Gegenstand der Erfindung ist ein
Verfahren zur Herstellung eines biologischen Klebstoffs, der in
der Lage ist, durch einfache Zugabe von Calciumionen zu gerinnen.
-
Es ist bekannt, dass Konzentrate
von Proteinen, die vor allem Fibrinogen und den Faktor XIII enthalten,
durch Zugabe von Thrombin unter Erzeugung einer Fibrinnetzstruktur
gerinnen und als Klebstoffinaterialien verwendet werden. Genauer
gesagt wird Fibrinogen unter der Wirkung von Thrombin in monomeres
Fibrin übergeführt. Die
Fibrin-Monomere fügen
sich unter Bildung von Fibrin-Polymeren zusammen. Durch die Wirkung
des Faktors XIII, der durch Thrombin aktiviert wird, werden die
Fibrinketten in Gegenwart von Calciumionen vernetzt. Somit bewirkt
die Zugabe von Thrombin nach dem Aufbringen des resultierenden Gemisches durch
Bildung von Fibrin auf den zu verklebenden Teilen eine Gerinnung
nach einem Mechanismus, der der Endphase der Blutgerinnung entspricht.
Demnach bilden die Fibrinogen-Konzentrate bei Gerinnung ein Klebstoffmaterial,
das insbesondere das Verbindung und den Zusammenhalt von lebenden
Geweben gestattet, während
eine hämostatische
Wirkung ausgeübt
wird; siehe beispielsweise die Patentschrift-FR-2448900. Solche
Klebstoffmaterialien werden im Allgemeinen als "biologische Klebstoffe" oder "Fibrinklebstoffe" bezeichnet und in
der Chirurgie eingesetzt, insbesondere zur Prävention oder zum Stillen von
Blutungen, zum Ersetzen von chirurgischen Nähten oder zu ihrer Verstärkung, Befestigen
von Transplantaten, beispielsweise Hauttransplantaten, an Ort und
Stelle, Zusammensetzen von Geweben, an denen eine Resektion durchgeführt wurde, beispielsweise
bei einem chirurgischen Eingriff an der unge oder am Verdauungstrakt,
oder zum Verkleben von Prothesenteilen etc.
-
Bei der Verwendung biologischer Klebstoffe
ist es zweckmäßig, dass
Thrombin, das aus Gemischen von menschlichen oder tierischen Blutplasmen
hergestellt worden ist, zur Verfügung
steht. Homologe Produkte, d. h. Produkte menschlichen Ursprungs,
mit unterschiedlichem Spender und Empfänger, bergen das Risiko einer
Kontamination des Empfängers
durch pathogene Agentien des Spenders. Dieses Risiko kann durch
Auswahl der Spender und Nachweis von beim Spender vorhandenen Markern
pathogener Agentien oder physikalisch chemische Behandlungen zur
Zerstörung
oder Verminderung der Virulenz der hergestellten Produkte reduziert
werden. Dennoch kann im Hinblick auf die Unschädlichkeit homologer Produkte
keine Sicherheit bestehen.
-
Die aus tierischen Geweben hergestellten
Produkte zeigen zudem Risiken, die mit der Existenz pathogener Agentien,
die auf den Menschen übertragbar
sind, zusammenhängen,
und auch Risiken einer Immunisierung und folglich von anaphylaktischen
Reaktionen.
-
Die vorstehend erwähnten Risiken
werden vermieden, wenn ausschließlich autologe Produkte verwendet
werden, d. h. Produkte, die ausschließlich ausgehend von einer am
zukünftigen
Empfänger
im Voraus durchgeführten
Entnahme hergestellt werden.
-
Das Prinzip der autologen Transfusion,
worin die Belange der Herstellung von Klebstoffen auf Fibrinogenbasis
eingeschlossen sind, ist bekannt und weit verbreitet. Insbesondere
sind die Klebstoffe, die als "autolog" bezeichnet werden,
es in Wirklichkeit nur im Hinblick auf die Fibrinogen-Lösung. In
Wirklichkeit wird die Thrombin-Lösung
ausgehend von homologen oder heterologen Plasmen, allerdings nicht
auf autologe Weise, gewonnen; siehe insbesondere CEDERHOLM-WILLIAMS,
Lancet 344, 336–337
(1994).
-
In der Patentschrift PCT WO947548
wurde ein mit Thrombozytenfaktoren angereicherter biologischer Klebstoff
beschrieben, der ohne Zugabe von Thrombin durch Zugabe eines Aktivators
für die
Kontaktphase der Blutgerinnung, wie Kaolin, zu dem rekalzifizierten
Klebstoff zu gerinnen vermag. Insbesondere wird in dieser Patentschrift
der Aktivator der Kontaktphase während
der Verwendung des Klebstoffs eingearbeitet, was die Durchführung der
Aktivierung zufällig
und schwierig macht, da das Fibrinogenkonzentrat ein sehr viskoses Produkt
von schwieriger Handhabung bildet. Daraus folgt, dass die Gerinnungsdauer
nicht leicht zu steuern ist. Da die Gerinnung gleichzeitig mit der
Aktivierung abläuft,
ist zudem die Abtrennung des Aktivators von dem aktivierten Klebstoff
schwierig.
-
Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist,
einen biologischen Klebstoff, der durch einfache Zugabe von Calciumionen,
ohne Zugabe eines Aktivators der Kontaktphase, während des Gebrauchs des Klebstoffs und
ohne Zugabe von Thrombin oder Prothrombin vor oder während des
Gebrauch zu gewinnen. Tatsächlich wurde
festgestellt, dass die Voraktivierung des Plasmas, das der Herstellung
des biologischen Klebstoffs dient, vor der Durchführung der Verfahrensweisen
zur Gewinnung des Fibrinogenkonzentrats, das die Gerinnungsfaktoren
enthält,
möglich
ist, und zwar ohne dass während
der Herstellung des Klebstoffs eine Gerinnung beobachtet wird.
-
Insbesondere wurde festgestellt,
dass die Voraktivierung des Plasmas mit einem Aktivator der Kontaktphase
der Gerinnung für
eine Zeit ausreicht, die zur teilweisen Aktivierung des Präkallikreins
zu Kallikrein ausreicht, und dass sich durch das so behandelte Plasma
anschließend,
ohne spontane Gerinnung, ein biologischer Klebstoff gewinnen läßt, der
zur schnellen Gerinnung durch einfache Rekalzifizierung, ohne Zugabe von
Thrombin, der Lage ist.
-
Die Patentschrift US-4 427 650 beschreibt
einen Fibrinklebstoff in Form von Pulver, der ein Gemisch von Fibrinogen
und Thrombin und/oder Prothrombin enthält. Ein solcher Klebstoff wird
keinerlei Aktivierung unterzogen und enthält demnach keine aktivierten,
von Calciumionen unabhängigen
Gerinnungsfaktoren.
-
Das Dokument WO91/09641 beschreibt
einen Fibrinklebstoff der Fibrinogen und zugefügtes Thrombin enthält. Dieser
Klebstoff wird so hergestellt, dass die Aktivität des Thrombins gehemmt ist.
In einer bestimmten Ausführungsform
ist dieser Klebstoff frei von Calciumionen, wobei diese erst bei
Gebrauch zugesetzt werden. Dennoch gerinnt ein solcher Klebstoff,
der das zugefügte
Thrombin enthält,
spontan, auch ohne Zugabe von Calciumionen, nach etwa 90 s. Durch
Zugabe von Calciumionen gerinnt er in weniger als 2 s. In weiteren
Ausführungsformen
wird die Gerinnung des Klebstoffs durch sein Ansäuern auf einen pH-Wert unter
5,5, was die Aktivität
des Thrombins hemmt, verzögert,
und bei Gebrauch werden Mittel eingesetzt, durch die sich der pH-Wert
anheben lässt,
um die inhibitorische Wirkung aufzuheben. Bei einer weiteren Ausführungsform
wird dem Klebstoff, geschützt
vor Licht, ein lichtempfindlicher Thrombin-Inhibitor zugesetzt,
der im Licht desaktiviert wird. Ein solcher Klebstoff enthält, gleich
welche Ausführungsformen,
keine aktivierten, von Calciumionen unabhängigen Gerinnungsfaktoren.
-
Im Gegensatz dazu ist der erfindungsgemäß gewonnene
Klebstoff ist ein stabiler Klebstoff, der in Form von wässriger
Lösung
bei Umgebungstemperatur, sogar im Licht, nicht spontan gerinnt und
der durch einfache Zugabe von Calciumionen ohne Änderung des pH zu gerinnen
vermag. Er enthält
aktivierte Gerinnungsfaktoren, die nicht von Calciumionen abhängen.
-
Der erfindungsgemäß gewonnene biologische Klebstoff
ist ein voraktivierter Klebstoff, der Fibrinogen und mindestens
einen aktivierten Gerinnungsfaktor enthält, dessen Aktivierung nicht
von Calciumionen abhängt.
Er ist in wässriger
Lösung
stabil, d. h. dass die Lösung
bis zu 1 h bei einer Temperatur von 20°C nicht spontan gerinnt und
er kannin weniger als 5 min durch einfache Zugabe von Calciumionen
ohne in Kontakt Bringen mit einem Aktivator gerinnen.
-
Demnach vermag der erfindungsgemäß gewonnene
Klebstoff ohne Zugabe von Thrombin und Prothrombin zu gerinnen.
-
Dieser Klebstoff kann in Form einer
wässriger
Form vorliegen. Er kann auch in Form eines Lyophilisats, aus dem
bei Gebrauch wieder eine wässrige
Lösung
hergestellt werden kann, vorliegen.
-
Die Mechanismen der Blutgerinnung
sind im wesentlichen bekannt. Insbesondere ist bekannt, dass einer
der Mechanismen der Erstaktivierung der Gerinnung leicht in vitro
reproduziert werden kann, indem das Plasma mit einem Aktivator in
gelöstem
Zustand in Kontakt gebracht wird, der ein unlöslicher Feststoff mit negativ
geladener Oberfläche,
wie beispielsweise Glas oder Kaolin, oder ein löslicher Aktivator sein kann.
Diese Erstaktivierung beruht auf der Wechselwirkung zwischen mehreren
Plasmaproteinen: Faktor XII, Faktor XI, Präkallikrein und hochmolekularem
Kininogen (KHPM); siehe beispielsweise WACHTFOGEL et al., Thrombosis
Research, 72, 1–21
(1993). Bei Kontakt der Aktivatoroberfläche erfährt die räumliche Konformation von Faktor
XII eine Modifikation. Somit wird der Faktor XII in die Lage versetzt,
das Präkallikrein
zu Kallikrein zu aktivieren, wobei diese Reaktion durch KHPM verstärkt wird.
Das so gebildete Kallikrein wirkt auf den Faktor XII und wandelt
ihn in den aktiven Faktor XII (oder Faktor XIIa) um. Faktor XIIa
besitzt die Eigenschaft der Aktivierung von Faktor XI.
-
Diese Reaktionen, an denen der Faktor
XII, Präkallikrein,
KHPM und Faktor XI beteiligt sind, werden "Reaktionen des Kontaktsystems" genannt, und die
beteiligten Gerinnungsfaktoren werden "Faktoren des Kontaktsystems" oder "Kontaktfaktoren" genannt.
-
Die Phase der Gerinnung, während der
die Reaktionen des Kontaktsystems ablaufen, wird "Kontaktphase" genannt.
-
Die Mechanismen, die die Gerinnung
auslösen,
umfassen weiterhin: die Aktivierung des Faktors IX durch den Faktor
XIa, wobei diese Aktivierung das Vorliegen von Calciumionen erfordert;
die Aktivierung von Faktor X durch die Wirkung eines Komplexes,
der von den Faktoren IXa, VIIIa und F3P (Thrombozytenfaktor 3) gebildet
wird, in Gegenwart von Calciumionen; die Aktivierung von Prothrombin
zu Thrombin unter dem Einfluss eines Komplexes der Faktoren Xa,
Va und F3P in Gegenwart von Calciumionen. Thrombin erlaubt die Umwandlung
von Fibrinogen in Fibrin, das als "löslich" bezeichnet wird,
und gestattet auch in Gegenwart von Calciumionen die Aktivierung
von Faktor XIII. Der aktivierte Faktor XIII erlaubt die Umwandlung
des löslichen Fibrins
zu unlöslichem
Fibrin, das das Blutgerinnsel bildet.
-
Es ist bekannt, dass ein weiterer
Weg der Gerinnung, der extrinsischer Weg genannt wird, die Aktivierung
von Faktor VII durch die Wirkung von Gewebe-Thromboplastin umfasst.
Der aktivierte Faktor VII ist insbesondere zur Aktivierung von Faktor
X und auch von Faktor IX in der Lage. Ferner ist bekannt, dass der
aktivierte Faktor XII den Faktor VII zu aktivieren vermag. Somit
kann die Aktivierung des Faktors VII von der Aktivierung der Kontaktphase
herrühren.
-
Die Erfindung beruht insbesondere
auf der Entdeckung der Tatsache, dass durch partielle Aktivierung der
Faktoren des Kontaktsystems, beispielsweise im Ausgangsplasma, und
in jedem Fall vor Gewinnung des Fibrinogenkonzentrats, das den Klebstoff
bildet, schließlich
ein biologischer Klebstoff gewonnen werden kann, der durch einfache
Zugabe von Calciumionen ohne Zugabe von Thrombin und Prothrombin
zur schnellen Gerinnung in der Lage ist. Es wurde festgestellt,
das eine solche partielle Aktivierung, die zu einem frühen Stadium
erfolgt, während
der folgenden Verfahrensschritte zur Gewinnung des Fibrinogenkonzentrats,
das den biologischen Klebstoff bildet, nicht zu einer vorzeitigen,
spontanen Gerinnung führt.
Genauer wurde festgestellt, dass es ausreicht, das Plasma mit dem
Aktivator in einer Menge und während
einer Zeit in Kontakt zu bringen, die ausreichen, damit das Plasma
mindestens 15, insbesondere mindestens 20 Kallikrein-Einheiten pro
Liter enthält.
Der mit einem solchen voraktivierten Plasma gewonnene biologische
Klebstoff vermag demnach ohne Zugabe eines Aktivators und ohne Zugabe
von Thrombin und Prothrombin durch einfache Rekalzifizierung in weniger
als 5 min zu gerinnen.
-
Die hier verwendete Kallikrein-Einheit
ist folgendermaßen
definiert: es ist die Menge, die eine 0,52 mM Lösung von D-Prolyl-L-Phenylalanyl-L-Arginin-p-nitroanilid
in Verona/Natrium acetat-Pufferlösung
von pH 7,35 bei 37°C
mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 1 μmol/min zu hydrolysieren vermag.
-
Der erfindungsgemäß gewonnene biologische Klebstoff
ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens einen
aktiven Gerinnungsfaktor enthält,
dessen Aktivierung nicht von Calciumionen abhängt, der aus Faktor XIIa, Faktor
XIa, Faktor VIIa und Kallikrein ausgewählt ist. Diese aktiven Faktoren
können
beispielsweise nach den folgenden Verfahren nachgewiesen und/oder
abgemessen werden:
-
Faktor XIIa (auch "Präkallikrein-Aktivator" genannt): europäisches Arzneibuch,
1994, Kapitel V, 2.1.11;
-
Faktor VIIa (Verfahren von MORRISSEY
et al., Blood, Bd. 81, SS. 734–744
(1993), es kann insbesondere das handelsübliche Dosierungskit Staclot
VIIa-rTF, Diagnostica Stago Ref. 00281 verwendet werden;
-
Faktor XIa: chronometrisches Verfahren
von GYÖNGYÖSSI-ISSA
MIC et al., Vox Sang., Bd. 70, SS. 76–85 (1996); oder das chromogene
Verfahren von SCOTT C.F. und COLMAN R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Bd. 89, SS.11189–11193
(1992);
-
Kallikrein : siehe experimenteller
Teil, nachstehend.
-
Die Stabilität des erfindungsgemäß gewonnenen
biologischen Klebstoffs, die durch das Fehlen einer spontanen Gerinnung
bei Umgebungstemperatur bestätigt
wurde, zeigt, dass er praktisch von Thrombin frei ist. Der erfindungsgemäß gewonnene
biologische Klebstoff ist ferner praktisch frei von Fibrin, wie
es sein geringer Gehalt an Fibrinopeptid A bestätigt (im allgemeinen wurden
im Hinblick auf das erfindungsgemäße Verfahren weniger als 0,5
Gew.-% im Ausgangsplasma vorhandenes Fibrinogen unter Bildung von
Fibrinopeptid A gespalten; siehe experimenteller Teil nachstehend).
Dafür enthält dieser
biologische Klebstoff in der nicht aktiven Form Gerinnungsfaktoren,
deren Aktivierung von Calciumionen abhängt. Er enthält demnach
außer Prothrombin
insbesondere die Faktoren XIII, X, V und FP3. In der Regel enthält er ferner
die Faktoren VIII und IX, die zur Gerinnung in Abwesenheit von aktivem
Faktor VII notwendig sind.
-
Somit ist der Gegenstand der Erfindung
in einem Verfahren zur Herstellung eines biologischen Klebstoffs,
wie vorstehend definiert. Dies ist ein Verfahren, das die folgenden
Schritte umfasst: a) Gewinnung eines Blutplasmas, das ein Agens
zur Komplexierung von Calciumionen enthält, b) Gewinnung eines biologischen Klebstoffs
auf der Basis von Fibrinogen und von Gerinnungsfaktoren nach bekannten
Verfahren ausgehend von dem Plasma und c) gegebenenfalls Gefriertrocknen
des gewonnenen biologischen Klebstoffs, wobei das Plasma vor oder
während
Schritt b) mit einem Aktivator der Kontaktphase in Kontakt gebracht
wird.
-
Selbstverständlich kann man einmalig alle
Bedingungen der Anwendungsmenge und dauer des Aktivators bestimmen,
die es ermöglichen,
eine Konzentration von mindestens 15 Kallikrein-Einheiten zu gewinnen, oder einfacher,
die es ermöglichen,
einen biologischen erfindungsgemäßen Klebstoff
zu gewinnen, d. h. der während
höchstens
5 min durch einfache Zugabe von Calciumionen zu gerinnen vermag.
Es besteht demnach keine Notwendigkeit dafür, Kallikrein jeweils bei der
Durchführung
des Verfahrens zu dosieren.
-
Der Schritt des in Kontakt Bringens
des Plasmas mit dem Aktivator wird vorzugsweise bei einer Temperatur
unter 10°C
durchgeführt.
Beispielsweise wird bei einer Temperatur von 1 bis 8°C und insbesondere
bei etwa 4°C
gearbeitet.
-
Wenn der Aktivator unlöslich ist,
kann das voraktivierte Plasma gegebenenfalls vom Aktivator abgetrennt
werden. Hierzu wird nach einer ausreichenden Kontaktdauer der Aktivator,
beispielsweise durch Filtration, abgetrennt und beseitigt. Die Kontaktdauer,
die ausreicht, um mindestens teilweise eine Umwandlung von Präkallikrein
in Kallikrein zu erhalten, hängt
offenbar von der Natur und Menge des Aktivators ab. Diese Zeitdauer
kann jeweils durch einfache Routineexperimente bestimmt werden;
siehe beispielsweise Experimenteller Teil, nachstehend.
-
Die Agentien, die die Calciumionen
zu komplexieren vermögen,
sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um Citronensäuresalze,
wie Natriumcitrat, oder um einen Chelatbildner, wie ein EDTA-Salz
(beispielsweise ein Natrium-EDTA-Salz).
-
Das Ausgangsplasma kann auch ein
lösliches
Zinksalz, wie Sulfat oder Acetat, enthalten, so, dass beispielsweise
eine Konzentration an Zinkionen erhalten wird, die von 10–4 M
bis etwa 10–2 M
reichen kann. Es ist bekannt, dass Zinkionen als Beschleuniger der
Reaktionen des Kontaktsystems wirken.
-
Der Kontakt zwischen Plasma und Aktivator
kann im Falle eines festen unlöslichen
Aktivators in einem entsprechenden Behälter durchgeführt werden.
Der Aktivator wird vor oder nach Einbringen des Plasmas in den Behälter eingebracht.
Der Aktivator kann auf der Innenwand des Behälters fixiert sein. Beispielsweise kann
die Innenwand mit Aktivator verkleidet sein. Wenn der Aktivator
nicht auf der Innenwand des Behälters fixiert
ist, ist es zweckmäßig, einen
Schritt vorzusehen, in dem nach einer ausreichenden Kontaktzeit
Aktivator und aktiviertes Plasma getrennt werden. Dafür kann der
Behälter
zum Beispiel innen oder außen
mit einem Filter ausgestattet sein, der den Durchtritt des Plasmas
unter Zurückhalten
des Aktivators erlaubt, so dass nach dem Schritt des in Kontakt
Bringens das aktivierte Plasma von dem Aktivator abgetrennt wird.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform
wird das in Kontakt Bringen durchgeführt, indem man das Plasma über eine
Säule,
die den Aktivator enthält
fließen
läßt. Man
kann beispielsweise das Plasma in der Säule bis zu einer Ausgangsöffnung fliessen
lassen, wobei die Ausgangsöffnung
mit einem Filter ausgestattet ist, der das Zurückhalten des Aktivators erlaubt.
Somit wird nach einer ausreichenden Kontaktdauer aktiviertes Plasma
gewonnen, während
der Filter den Aktivator zurückhält.
-
Wenn die Gewinnung des biologischen
Klebstoffs einen Schritt enthält,
der in der Aufkonzentrierung des Plasmas besteht, beispielsweise
mit Hilfe einer Membran, die Wasser und niedermolekulare Bestandteile passieren
lässt,
die jedoch die Proteine zurückhält, kann
das Plasma mit dem Aktivator während
dieses Aufkonzentrierungsschrittes in Kontakt gebracht werden. Wenn
der Aktivator ein unlöslicher
Feststoff ist, muss er anschließend
von dem konzentrierten oder teilweise konzentrierten Plasma, beispielsweise
durch Filtration, abgetrennt werden.
-
Die Aktivatoren der Kontaktphase
der Gerinnung sind gut bekannt. Insbesondere handelt es sich um feste
Produkte, deren Oberfläche
negativ geladen ist, wie Glas, Kaolin, Celite, Zinkoxid, Zinkcarbonat,
etc.
-
Auch lösliche Aktivatoren, wie beispielsweise
Dextransulfat und Ellagsäure,
können
eingesetzt werden.
-
Zudem wurde entdeckt, dass weitere
Produkte, wie Calciumcarbonat (Aragonit oder Calcit), das Kontaktsystem
zu aktivieren vermögen.
Demnach kann ein Aktivator verwendet werden, der im wesentlichen
aus Aragonit, beispielsweise in Form von Korallenpartikeln, aufgebaut
ist. Es können
beispielsweise Teilchen mit Dimensionen von 0,3–2 mm verwendet werden.
-
Es wurde festgestellt, dass die Aktivierung
durch Calciumcarbonat die Konzentration des Plasmas an Calcium leicht
erhöht,
allerdings so schwach, dass keine vorzeitige Gerinnung während der
Herstellung des biologischen Klebstoffs hervorgerufen wird.
-
Ferner können lösliche, auf festen Trägern immobilisierte
Aktivatoren mit gebräuchlichen
Techniken, beispielsweise durch Kovalenz oder durch Affinität, verwendet
werden. Solche Träger,
auf denen lösliche
Aktivatoren immobilisiert sind, gleichen unlöslichen Aktivatoren und werden
wie diese verwendet.
-
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Aktivatoren dürfen
die Gerinnungsfaktoren, deren Aktivierung von Calciumionen abhängt und
die für
die Abfolge von Reaktionen notwendig sind, die zur Bildung von Fibrin
und zu dessen Gerinnung führen,
weder zu einem nennenswerten Anteil (im Falle eines festen Aktivators)
zurückhalten
noch hemmen. Die Faktoren, die für
diese Abfolge von Reaktionen notwendig sind, sind im wesentlichen
neben Prothrombin die Faktoren V, VIII, IX, X, FP3 und XIII.
-
In der Tat kann die Wahl der Aktivatoren,
die zweckmäßig sind,
leicht durch Routineexperimente durchgeführt werden: ein Aktivator ist
zweckmäßig, wenn
sich durch ihn ein biologischer Klebstoff gewinnen lässt, der
mit der vorstehend gegebenen Definition im Einklang steht, d. h.
ein biologischer Klebstoff, der stabil ist und der durch einfach
Zugabe von Calciumionen in weniger als 5 min gerinnt.
-
Es wurde festgestellt, dass die Voraktivierung
der Kontaktphase der Gerinnung nur sehr wenige Thrombozyten aktiviert:
weniger als 10% der Thrombozyten werden aktiviert. Demnach kann
als Ausgangsprodukt entweder ein Plasma ohne Thrombozyten oder ein
thrombozytenarmes Plasma oder ein Plasma, das Thrombozyten enthält oder
das reich ist an Thrombozyten, verwendet werden.
-
Zudem wurde entdeckt, dass das Plasminogen
weder während
der Aktivierung der Kontaktphase noch während der darauffolgenden Verfahrensschritte
der Herstellung des biologischen Klebstoffs nennenswert zu Plasmin
aktiviert wird. Demnach und im Gegensatz zu dem, was befürchten werden
könnte,
besteht kein Risiko eines vorzeitigen Auflösens der Klebung aufgrund der
fibrinolytischen Aktivität
von Plasmin.
-
In der vorliegenden Anmeldung bezeichnet
der Begriff "biologischer
Klebstoff" eine
wässrige
Lösung, die
durch Fraktionierung oder Konzentrierung des Blutplasmas auf eine
Weise gewonnen wird, dass das Fibrinogen unter Konservierung der
vorstehend erwähnten,
notwendigen Gerinnungsfaktoren und gegebenenfalls unter Beseitigung
von mindestens einem Teil der weiteren Plasmaproteine, wenn keine übermäßige Beladung des
biologischen Klebstoffs mit Proteinen, wie Albumin, gewünscht ist,
konzentriert wird. Das Blutplasma enthält 2 bis 4 g/l Fibrinogen und
50 bis 60 d/l Albumin. Ein erfindungsgemäß gewonnener biologischer Klebstoff kann
beispielsweise mindestens 10 d/l und insbesondere mindestens 30
d/l Fibrinogen enthalten. Vorzugsweise enthält er mindestens 50 d/l Albumin,
insbesondere mindestens 35 d/l und insbesondere mindestens 30 d/l.
-
Der erfindungsgemäß gewonnene biologische Klebstoff
kann verschiedene zugesetzte sekundäre Bestandteile enthalten,
wie Mittel, die die Viskosität
erhöhen,
oder Färbemittel,
durch die sich die Anwendung visuell kontrollieren lässt.
-
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird genauer gesagt die Gewinnung des biologischen Klebstoffs, d.
h. die Gewinnung eines Konzentrats von Fibrinogen, das Gerinnungsfaktoren
enthält,
insbesondere durch jedes bekannte Fraktionierungsverfahren, insbesondere
durch fraktionierte Fällung
nach bekannten Verfahren mit Hilfe eines Fällungsmittels, wie beispielsweise
Ethanol oder Polyethylenglycol, durchgeführt. Natürlich ist für jedes zur Verwendung geeignete
Fällungsmittel
zweckmäßig vorher
zur prüfen,
ob sich die notwendigen Gerinnungsfaktoren in den gleichen Fraktionen
wie das Fibrinogen befinden. Dafür
genügt
es in der Praxis zu prüfen,
ob das gewonnene Fibrinogenkonzentrat in weniger als 5 min durch
einfache Zugabe von Calciumionen zu gerinnen vermag, was nur Routineexperimente
erfordert.
-
Ein weiteres bekanntes Verfahren
besteht in der Herstellung eines Kryopräzipitats. Hierfür wird das Plasma
tiefgefroren, beispielsweise bei einer Temperatur von kleiner oder
gleich –20°C, dann wird
das gewonnene tiefgefrorene Produkt aufgetaut, beispielsweise bei
einer Temperatur von 0 bis 5°C,
und insbesondere von 2 bis 4°C.
Es werden so eine plasmatische Flüssigkeit und ein unlösliches
Produkt, das Kryopräzipitat
genannt wird, das im wesentlichen aus Fibrinogen und verschiedenen
Gerinnungsfaktoren besteht, gewonnen. Dieses Kryopräzipitat
kann durch Zentrifugieren oder durch Filtration abgetrennt werden;
siehe beispielsweise das Dokument FR-2 718 033.
-
Ein weiteres bekanntes Verfahren
besteht in der Konzentrierung des Plasmas mit Hilfe einer Membran,
die Wasser und niedermolekulare Bestandteile unter Zurückhaltung
der Proteine durchtreten lässt.
-
Die Erfindung betrifft auch eine
Vorrichtung zur Durchführung
eines wie vorstehend definierten Verfahrens in dem Fall, in dem
der Aktivator ein unlöslicher
Feststoff ist.
-
In einer nicht einschränkenden
Ausführungsform
ist diese Vorrichtung hauptsächlich
dadurch gekennzeichnet, dass sie einen ersten Behälter zur
Aufnahme des Plasmas vor und/oder während der Aktivierung umfaßt, einen
zweiten Behälter
zur Aufnahme des Plasmas nach der Aktivierung, Einrichtungen, um
das Plasmas unter sterilen Bedingungen vom ersten in den zweiten
Behälter
zu überführen, Einrichtungen,
um das Plasma mit einem Aktivator der Kontaktphase in Kontakt zu
bringen und gegebenenfalls Einrichtungen, um das aktivierte Plasma
und den Aktivator voneinander so zu trennen, dass das in dem zweiten
Behälter
aufgefangene Plasma frei von Aktivator ist.
-
In einer bestimmten Ausführungsform
umfassen die Einrichtungen zum in Kontakt bringen ein Rohr, in das
der Aktivator eingebracht ist, wobei die Überführungseinrichtungen einerseits
einen Schlauch umfassen, der eine Ausgangsöffnung des ersten Behälters mit
einem Ende des Rohrs verbindet, und andererseits einen Schlauch,
der eine Eingangsöffnung
des zweiten Behälters
mit dem anderen Ende des Rohrs verbindet, so dass das Plasma mit
dem Aktivator in dem Rohr in Kontakt tritt, wenn es vom ersten Behälter in
den dem zweiten Behälter
fließt.
-
In einer zweiten Ausführungsform
umfassen die Einrichtungen zum in Kontakt Bringen des Plasmas mit
dem Aktivator und zum Trennen des aktivierten Plasma und des Aktivators
voneinander ein Kompartiment, in das der Aktivator eingebracht ist,
wobei das Kompartiment im Inneren des ersten Behälters liegt. Das Kompartiment
umfasst eine für
Flüssigkeiten
durchlässige
Wand, was gleichzeitig den Kontakt mit dem Aktivator, wenn sich
das Plasma schon in dem ersten Behälter aufhält, und die Abtrennung des
Plasmas von dem Aktivator, wenn man das voraktivierte Plasma weiter
in den zweiten Behälter
fliessen lässt,
erlaubt.
-
In einer weiteren Ausführungsform
umfassen die Einrichtungen zum in Kontakt Bringen des Plasmas mit
dem Aktivator im Inneren des ersten Behälters eine Wand, auf der der
Aktivator durch Verkleiden fixiert ist, und in diesem Fall besteht
kein Grund, Einrichtungen zum Abtrennen des aktivierten Plasmas
von dem Aktivator vorzusehen.
-
Gegenstand der Erfindung ist auch
ein Verfahren zur Verwendung des biologischen Klebstoffs, wie er vorstehend
definiert wurde. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass
dem Klebstoff eine wässrige
Lösung,
die Calciumionen enthält,
ohne Zugabe von Thrombin zugesetzt wird. Anschließend kann
der Klebstoff auf bekannte Weise auf die Operationsstelle oder Verletzung,
deren Behandlung erwünscht
ist, aufgebracht werden.
-
Die Calciumionen werden dem biologischen
Klebstoff insbesondere in Form einer wässrigen Lösung, beispielsweise einer
wässrigen
Lösung
von Calciumchlorid, zugesetzt. Die zugesetzte Menge an Calciumionen
ist eine Menge, die ausreicht, damit das gewonnene Produkt "freie", d. h. nicht durch
einen Komplexbildner chelatisierte Calciumionen enthält. Dieser
Vorgang wird "Rekalzifizierung" genannt. Die Menge
an freien Calciumionen muss ein Menge sein, die ausreicht, damit
die Gerinnung des biologischen Klebstoffs in ausreichend kurzen
Zeiträumen
möglich
ist. Diese Menge kann im Voraus durch einfach Routineexperimente
bestimmt werden.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die
Erfindung.
-
BEISPIEL 1
-
Citrat-versetztes Blutplasma, das
als Ausgangsprodukt verwendet wird, ist ein Plasma, das reich ist an
Thrombozyten, das durch Zentrifugation von Vollblut bei 2200 g während 6
min gewonnen wird. Dieses Plasma enthält Natriumcitrat (17 mM).
-
2 cm3 einer
Lösung
von 0,1 M Zinksulfat werden 270 cm3 des
auf 4 °C
abgekühlten
Plasmas werden zugesetzt. Man lässt
das Plasma über
eine Polyvinylchloridsäule
laufen, die 10 cm3 Korallenkügelchen
einer Korngröße von 630–1000 μm (INOTEB,
ST-GONNERY, FRANCE) enthält.
Die Dimensionen der Säule
sind folgende: Durchmesser : 1,4 cm; Höhe 14 cm.
-
Die Säule ist vertikal angeordnet,
wobei ihre obere Öffnung über einen
Schlauch mit einem Beutel verbunden ist, der das Blutplasma, dem
Zinksulfat zugesetzt wurde, enthält.
Der Beutel ist über
der Säule
angeordnet, und das Plasma fließt,
indem es durch die Schwerkraft nach unten läuft. Das untere Ende der Säule umfasst
ein Filter, durch das sich die Korallenpartikel zurückhalten
lassen. Dieses untere Ende ist über
einen Schlauch mit einem weichen Beutel verbunden, in dem sich das
voraktivierte Plasma sammeln lässt.
-
Die Durchlaufdauer des Plasmas durch
die Säule
beträgt
insgesamt 45 min.
-
Kallikrein wird dem Plasma auf folgende
Weise dosiert: In eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte werden 50 μl Veronal-Acetatpuffer
mit pH 7,35 (Diagnostika Stago, Ref. 360) eingebracht, und es werden
50 μl einer Kallikrein-Eichlösung (CHROMOGENIX,
SCHWEDEN, Ref. 820845) oder 50 μl
der zuzugebenden Probe zugefügt.
Man erwärmt
auf 37°C,
und nun werden 100 μl
einer 1,04 mM Lösung
von Substrat S-2302 (CHROMOGENIX, Ref. 820340), vorgeheizt auf 37 °C, zugefügt. Die Änderung
in der optischen Dichte während
1 Minute bei 405 nm wird gemessen, und daraus die Kallikrein-Aktivität durch
Vergleich dieser Änderung
der optischen Dichte mit derjenigen, die für das Eich-Kallikrein festgestellt
wurde, abgeleitet.
-
Der Gehalt an Kallikrein des Plasmas
nach Durchlaufen der Korallenkügelchen
beträgt
20 Einheiten/1.
-
Anschließend wird das Plasma bei –30°C tiefgefroren,
sodann während
24 h in einem Behältnis
bei +4°C
aufgetraut. Das gewonnene Plasma wird zentrifugiert (2000 g). Das
Zentrifugationspellet, d. h. das Kryopräzipitat, wird gewonnen und
auf 37°C
erwärmt.
-
Die Gerinnungsdauer des gewonnenen
Produkts (Kryopräzipitat)
wird durch Thromboelastographie mit Hilfe des Parameters "r+k" bestimmt: siehe
beispielsweise MALLETT S.V. und COXD.J.A., British Journal of Anaesthesia,
69 : 307–313
1992). Hierzu werden 175 μl
Kryopräzipitat
bei 37°C
in eine Thromboelastographieküvette
(HELLIGE) eingebracht. Bei 37°C
werden 175 μl
einer wässrigen
Lösung
von 36 mM Calciumchlorid zugefügt.
Das Gerät
zeichnet die Messung der Thromboelastographie automatisch auf. Auf
der Spur wird der Wert des Parameters "r+k" gemessen.
Angesichts der Tatsache, dass sich das Papier, auf dem die Spur aufgezeichnet
ist, mit einer Geschwindigkeit von 2 mm/min verschiebt, entspricht
die Gerinnungsdauer in Minuten der Hälfte der Länge von "r+k",
ausgedrückt
in mm.
-
Die ermittelte Gerinnungsdauer beträgt 2 min.
-
Das Kryopräzipitat kann auch durch Tiefgefrieren
konserviert und anschließend
zum Gebrauch aufgetaut werden.
-
Ein wie vorstehend angegeben hergestelltes
Kryopräzipitat,
das entweder gerade gewonnen oder durch Tiefgefrieren konserviert
und dann aufgetaut wurde, ist bei einer Temperatur von 20°C für mehrere
Stunden stabil: es wird keine spontane Gerinnung festgestellt.
-
Das gewonnene Kryopräzipitat
kann auch durch Gefriertrocknen konserviert werden.
-
BEISPIEL 2
-
Es wird wie in Beispiel 1 verfahren,
mit der Ausnahme, dass die Korallenkügelchen durch 14 g Glaskugeln
mit einem Durchmesser von 200–300 μm (SIGMA,
Ref. G. 1277, L'ISLE
D'ABEAU, FRANCE)
ersetzt werden. Die Durchlaufdauer des Plasmas durch die Säule mit
Glaskugeln beträgt
30 min. Der Gehalt an Kallikrein des Plasmas nach Durchlaufen der
Glaskugeln beträgt
19 Einheiten/1.
-
Die durch Thromboelastographie bestimmte
Gerinnungsdauer des Kryopräzipitats
beträgt
3 min.
-
BEISPIE L 3
-
Es wird ähnlich verfahren wie in Beispiel
1 beschrieben, wobei die Korallenkügelchen durch Kaolinpulver
(SIGMA, Ref. K. 7375) ersetzt werden. Es wurden verschiedene Tests
durchgeführt,
wobei als Ausgangsprodukt entweder ein Plasmas, das reich ist an
Thrombozyten (PRP), oder ein Plasma, das arm ist an Thrombozyten
(PPP), verwendet wurde.
-
PRP und PPP wurden wie nachstehend
angegeben gewonnen.
-
PRP wird durch Zentrifugation des
abgenommenen Bluts bei 2200 g während
6 min gewonnen.
-
PPP wird durch Zentrifugation bei
2500 g während
15 min gewonnen.
-
Für
die ausgehend von PRP gewonnenen Kryopräzipitate beträgt die Gerinnungsdauer
100±30
s (Mittelwert von vier Tests).
-
Für
die ausgehend von PPP gewonnenen Kryopräzipitate beträgt die Gerinnungsdauer
190±35
s (Mittelwert von drei Tests).
-
BEISPIEL 4
-
Es wird ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben
mit verschiedenen thrombozytenreichen Plasmaproben verfahren.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle zusammengefasst. TABELLE
1
In den folgenden Experimenten (Proben Nr. 4 bis
9) wird ferner die Anzahl von Thrombozyten in dem Ausgangsplasma
bestimmt, und das Plasmin wurde zu verschiedenen Stadien des Verfahrens
dosiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst.
-
-
Die Bedeutung von (a), (b) und (c)
ist unter der vorstehenden Tabelle 1 angegeben.
-
Es wird festgestellt, dass das Plasminogen
nicht nennenswert als Plasmin aktiviert ist, weder während der
Aktivierung des Kontaktsystems noch während der Herstellung des Kryopräzipitats.
-
Freisetzungsstudie für Fibrinopeptid
A
-
Es ist bekannt, dass Fibrinogen ein
Dimer ist, dessen monomeres Molekül drei Ketten, Aα, Bβ und γ, umfasst
(die das molekulare Gesamtgewicht dieses Monomers beträgt 170000).
Durch die Wirkung von Thrombin wird dieses Molekül unter Freisetzung des Fibrinopeptids
A (fpA) und des Fibrinopeptids B (fpB), 1 Molekül fpA und 1 Molekül fpB pro
monomeres Molekül, teilweise
hydrolysiert. Die so freigesetzten fpA- und fpB-Moleküle bilden
die Fibrin-Monomere, die sich untereinander über Wasserstoffbrückenbindungen
assoziieren und demnach das lösliche
Fibrin bilden. Der erfindungsgemäße biologische
Klebstoff ist praktisch frei von Fibrin, wie es die Messung von
fpA, beispielsweise mit Hilfe des Messungskits Asserachrom® (STAGO),
zeigt.
-
Gehalt an Fibrinogen des biologischen
Klebstoffs: 50 d/l(Mittelwert von 5 Präparationen). Gehalt an fpA:
365 ng/ml (Mittelwert von 5 Präparationen).
-
Der Gehalt an fpA im Plasma liegt
in der Größenordnung
von 0 bis 2,3 ng/ml, und derjenige eines Thrombozyten-Standard-Konzentrats
liegt Größenordnung
von 14 ng/ml (Bode und Miller, Vox Sanguinis 51, 192-196, 1986).
-
Da das Molekurgewicht von fpA in
der Größenordnung
von 1500 liegt, kann leicht ausgerechnet werden, dass der Gewichtsteil
von Fibrinogen, der unter Freisetzung von fpA hydrolysiert worden
ist, in der Größenordnung
von 0,08 % liegt. Dies beweist, dass der biologische erfindungsgemäße Klebstoff
praktisch frei ist von Fibrin und demnach auch von Thrombin.
-
BEISPIEL 5
-
Es wird verfahren wie in Beispiel
1, wobei man die Kontaktdauer mit dem Aktivator variiert und den Gehalt
an Kallikrein des Plasmas jeweils nach der Aktivierung misst. Es
wird festgestellt, dass der Gehalt an Kallikrein mit der Dauer des
Kontakts mit dem Aktivator steigt. Anschließend wird mit jedem getesteten
Plasma ein Kryopräzipitat
hergestellt, so dann werden die nach Rekalifizierung erhaltenen
Gerinnungszeiten gemessen. Die Ergebnisse sind in der beigefügten 1 zusammengefasst, die die
Gerinnungszeit des Kryopräzipitats
als Funktion des Gehalts an Kallikrein des entsprechenden Plasmas
nach der Aktivierung zeigt. Es ist zu sehen, dass die Gerinnungszeit
unter 5 min liegt, wenn der Gehalt an Kallikrein mindestens etwa
20 UI/l beträgt.
Eine stärkere
Aktivierung (aufgrund einer längeren
Kontaktzeit mit dem Aktivator) führt
zu einem Anstieg des Gehalts des Plasmas an Kallikrein, beeinflusst
jedoch nicht die Gerinnungszeit.
