AT407834B

AT407834B - Einkomponenten-gewebekleber sowie verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: AT407834B
Application number: AT261387A
Authority: AT
Original assignee: Aventis Behring Gmbh
Priority date: 1987-10-08
Filing date: 1987-10-08
Publication date: 2001-06-25
Also published as: ATA261387A

Description

Die Erfindung betrifft einen Gewebekleber, der Fibrinogen, Faktor XIII, einen Thrombininhibitor, Prothrombinfaktoren, Caiciumionen und gegebenenfalls einen Plasmininhibitor enthält. Durch an der zu verklebenden Wunde natürlicherweise vorhandene Acceleratoren wird aus dem Prothrombin des Klebers das zur Klebung nötige Thrombin freigesetzt.

Als Ergebnis der physiologischen Vorgänge bei der Reparation von Läsionen menschlicher oder tierischer Gewebe schlägt sich im Verletzungsbereich Fibrin nieder. Dies wird dadurch ausgelöst, dass aus den verletzten Zellen Thromboplastin ausströmt, das beim Kontakt mit dem Plasmafaktor Vil den Faktor-X-Aktivator bildet, der dann zusammen mit dem Faktor V und im Komplex mit Phospholipiden und Calcium Prothrombin in Thrombin umwandelt. Unter der Wirkung von Thrombin wiederum entstehen über die Abspaltung der Fibrinopeptide A und B aus dem Fibrinogen Fibrinmonomere, die durch Aggregation Fibrinstränge bilden, die vom F Xllla, einer Transglutaminase, die ebenfalls durch Thrombin aktiviert wird, unter Bildung von Isopeptidbindungen kovalent vernetzt werden.

Ein Inhibitor, nämlich das alpha2-Antiplasmin, wird vom Faktor X) t) an die Fibrinstränge gebunden und schützt diese vor dem Abbau durch Plasmin.

Dieser Ablauf der Hämostase und Wundheilung lässt erkennen, dass neben dem Fibrinogen als Substrat zwei Enzyme erforderlich sind : das Thrombin und der Faktor XIII.

Dabei ist es Aufgabe des Thrombins, sowohl das Fibrinogen als auch den Faktor XIII zu aktivieren, das heisst in ihre reaktionsfähige Form umzuwandeln. Das ist im Falle des Fibrinogens das Fibrinmonomer und im Falle des Faktors XIII die katalytisch aktive Transglutaminase (F Xllla).

Aus EP 0 068 047 ist eine angereicherte Plasmafraktion bekannt, die als Wundverschluss geeignet ist und Fibrinogen, einen Fibrinolyse-lnhibitor und Thrombin oder Prothrombin in einem wasserfreien System enthält. Dieser Kleber kann nicht in Wasser aufgelöst sondern nur als Pulver appliziert werden, was für die Anwendung von Nachteil ist. Wenn das Gemisch in Wasser gelöst wird, reagieren die Komponenten miteinander und es entsteht ein Gerinnsel.

In EP 68 048 ist ein Kleber beschrieben, der alle für die Klebung notwendigen Faktoren als Pulver enthält, das auf die Wundfläche aufgesprüht wird. Das Pulver kommt erst zur Wirkung, wenn es sich in Körperflüssigkeiten gelöst hat. Demgemäss kommt dieser Kleber für die Klebung trockener Wundflächen nicht in Betracht.

AT 359 652 beschreibt einen Gewebekleber, der vor Anwendung aus mehreren Komponenten zubereitet werden muss.

Auch DD 240 334 betrifft einen Mehrkomponentenkleber.

Diesem Stand der Technik ist nicht die Lehre der vorliegenden Patentanmeldung zu entnehmen, wie nämlich eine Zubereitung erhalten werden kann, die als Einkomponenten-Gewebekleber geeignet ist.

Es ist für einen Einkomponenten-Kleber mit Wasser als Lösemittel schwierig, die Wirksubstanzen so und in solchen Mengenverhältnissen zu kombinieren, dass während der Herstellung des Klebers, der Rekonstitution mit einem Lösungsmittel und der Bereithaltung für die Anwendung keine vorzeitige und unerwünschte Aktivierung erfolgt und zum anderen aber nach dem Aufbringen auf die Klebestelle eine genügend hohe Festigkeit relativ schnell erreicht wird.

Überraschenderwelse wurden Bedingungen gefunden, die eine reproduzierbare Herstellung eines praktisch handhabbaren Einkomponentenklebers in einem physiologischen Milieu ermöglichen.

Voraussetzung für die Herstellung und Verarbeitungsfähigkeit eines solchen Einkomponentenklebers sind optimal aufeinander abgestimmte Konzentrationen von Fibrinogen, Plasmininhibitor, F XIII, Prothrombinkonzentrat, Thrombininhibitor und Calciumionen. Das trifft im besonderen Masse
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Gerinnungsfaktoren essentiell sind. Hohe Konzentrationen beschleunigen die Thrombinbildung, kleine verzögern sie. Daher ist eine optimale Konzentration von Calciumionen erforderlich.

Da sich bei einer solchen die Bildung von Thrombin nicht ausschliessen lässt, ist die Kombination mit einem Thrombininhibitor, vorzugsweise AT 111 zweckmässig Denn einerseits muss bei der Herstellung des Klebers die Bildung von Thrombin ausgeschlossen werden, andererseits muss der Kleber schnell ein festes Gerinnsel bilden, wenn beim Kontakt mit Wundoberflächen die Gerinnung, das heisst die Abscheidung eines Fibrinfilms ausgelöst wird. Demzufolge ist die Herstellung eines Thrombin-haltigen Einkomponentenklebers und seine Anwendung in wässriger Lösung nicht denkbar, und auch Prothrombin lässt sich nur unter Bedingungen verwenden, die eine Aktivierung zu Thrombin wäh-

rend der Herstellung und Vorbereitung zur Anwendung verhindern.

Dazu gehört die Einstellung bestimmter Konzentrationen an Thrombininhibitor und Calciumionen.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Gewebekleber, enthaltend in wässriger Lösung Fibri. nogen, F XIII, einen Thrombininhibitor, Prothrombinfaktoren, Calciumionen und gegebenenfalls einen Plasmininhibitor.

Ausgestaltungen des Gewebeklebers sowie ein Verfahren zur dessen Herstellung sind in der Patentansprüchen dargelegt.

Es war überraschend, dass Fibrinogen zusammen mit Prothrombin als sogenannte hypercoagulable Lösung, die zudem noch Calciumionen und AT 111 enthält, abgefüllt und als Gewebekleber verwendet werden kann.

Ein solcher erfindungsgemässer Kleber kann in eine feste Form gebracht, beispielsweise Iyophilisier, und mit Wasser rekonstituiert werden. Er kann alle Wirksubstanzen in pasteurisierter Forrr enthalten und ist dann frei vom Risiko einer Hepatitis-und HTLV) tt-Übertragung.

Das Mischungsverhältnis der Wirksubstanzen Fibrinogen, Plasmininhibitor, F XIII, Prothrombinfaktoren, Calciumionen und AT 111 ist derart, dass keine vorzeitige Aktivierung auftritt, dass aber das Gemisch beim Kontakt mit Wundoberflächen spontan gerinnt und Fibrin abscheidet.

Die Zeit in der dies geschieht, entspricht den klinischen Erfordernissen. Der erfindungsgemässe Einkomponentenkleber unterscheidet sich in seiner Wirkung nicht von den ZweikomponentenSystemen des Standes der Technik.

Die Wirksubstanzen sind in diesem Kleber so gemischt, dass in der Anwendungslösung die Konzentration von Fibrinogen bei 70-90 mg/ml und die der Prothrombinfaktoren zwischen 10 und 30 E/ml, bezogen auf F 11, liegt. Die Konzentration an Calciumionen, die im Kleber zum Teil gebunden an Protein vorliegen, soll in der Anwendungslösung bei 0, 5-1 mmolli liegen. Als Thrombininhibitor, beispielsweise AT 111, Hirudin oder Heparin, wird vorzugsweise AT 111 in einer Konzentration von 0, 1 - 1 E/ml Gewebekleber verwendet ; in dieser Konzentration verhindert es bei den oben genannten Konzentrationen an Prothrombinfaktoren und Calciumionen eine vorzeitige Fibrinbildung.

Andererseits kann diese aber begünstigt werden, wenn dies von der Indikation her wünschenswert erscheint. Zu diesem Zweck kann man den Iyophilisierten Kleber in einer höheren Calciumionen- Endkonzentration als 0, 5-1 mmoill lösen. Dies erfordert allerdings eine schnelle Anwendung nach der Rekonstitution.

Zur Herstellung des Klebers werden die Wirksubstanzen zunächst in möglichst aktiver und gegebenenfalls pasteurisierter löslicher Form hergestellt. Die Fibrinogenkonzentration sollte möglichst hoch sein, da die Klebefestigkeit mit steigender Konzentration zunimmt. Das Fibrinogen kann beispielsweise nach der EP 0 103 196 hergestellt und pasteurisiert und nach EP 0 085 923 durch Zusätze vom Typ harnstoff- oder guanidinreste-enthaltende Verbindung auf die gewünschte Löslichkeit gebracht werden. Faktor XIII kann gemäss EP 0 018 561 und die Prothrombinfaktoren können nach EP 0 056 629 pasteurisiert werden.

Die Wirksubstanzen des bevorzugten erfindungsgemässen Klebers bestehen im Prinzip aus
Humanfibrinogen in einer möglichst hohen Konzentration, angereichert mit Faktor XIII und der Faktoren des Prothrombinkomplexes (Faktor 11, VII, IX und X), Calciumionen sowie Antithrombin 111.
Der Gewebeklebstoff enthält ferner einen Inhibitor, der Plasminogenaktivatoren und/oder Plasmin inhibiert und damit das entstandene Fibrin vor einem Abbau durch Plasmin schützt. Dieser Inhibitor kann als Begleitsubstanz des für die Klebung ausgewählten Fibrinogens vorliegen, wird aber vorzugsweise in Form von Aprotinin dem Kleber zugesetzt.

Zur Verbesserung der Rekonstitution des
Gewebeklebstoffes nach Lyophilisation kann dieser Albumin und/oder Substanzen, die den Harn stoff- oder Guanidinrest enthalten, sowie gegebenenfalls auch eine Aminosäure mit hydrophobe
Seitenkette oder eine wasserlösliche Fettsäure und weiterhin Heparin enthalten.

Für die Zubereitung des Gewebeklebstoffes kommt vorzugsweise gereinigtes Fibrinogen in Be- tracht, das Faktor XIII bereits enthält. Daneben eignet sich aber auch Kryopräzipitat, in dem erfah- rungsgemäss neben Faktor XIII auch alpha2-Antiplasmin und Humanalbumin vorliegen. Ein Kleb- stoff vergleichbarer Wirkung kann aber auch aus den einzelnen Komponenten durch Mischen her- gestellt werden, nämlich : Humanfibrinogen, Faktor XIII (aus Plasma oder auch Plazenta), Plasmin-
Inhibitoren, Prothrombinfaktoren (Faktor ! t, Vti, ! X und X), Albumin, AT 111 und Calciumionen, eine
Verbindung mit einem Harnstoff- oder Guanidinrest oder einer Aminosäure mit hydrophober Sei- tenkette oder einer wasserlösliche Fettsäure.

Das Gemisch der Wirkstoffe für den Kleber liegt vorteilhafter Weise in fester Form, vorzugsweise als Lyophilisat vor.

Vorzugsweise enthält der Gewebekleber folgende Mengen gegebenenfalls pasteurisierter Wirkstoffe bezogen auf 1 ml Anwendungslösung :
65 - 115, bevorzugt 70 - 90 mg hochgereinigtes Humanfibrinogen
40 - 80 E Faktor XIII
1 - 50, bevorzugt 10 - 30 IE PPSB (Prothrombinfaktoren), bezogen auf F 11 (Prothrombin) 0 - 10000 KIE Aprotinin 0, 01-50, bevorzugt 0, 1-1 IE Antithrombin 111
0 - 5 USP-E Heparin und
0, 1-5, bevorzugt 0, 5 - 1 mmol/l Calciumionen, vorzugsweise als Calciumchlorid.

Als Stabilisatoren und Lösungsvermittler kann der Kleber beispielsweise Glutaminat, L-Isoleu- cin, L-Arginin oder Humanalbumin enthalten.

Das Gemisch der festen Wirkstoffe des Gewebeklebstoffs kann in kurzer Zeit bei 20 C in Wasser oder einem calciumionenhaltigen Lösungsmittel gelöst werden. Der Kleber entwickelt innerhalb einer genügend kurzen Zeit eine hohe Klebefestigkeit, wenn er auf das zu verbindende oder zu klebende Gewebe gebracht wird, ohne dass als zweite Komponente Thrombin erforderlich ist.

Demzufolge kann der Kleber mit einer einzigen Spritze in flüssiger Form aufgetragen werden, so dass Zubereitung, Handhabung und Anwendung einfach sind. Der Kleber ist verträglich und wird voll resorbiert.

Dieser Einkomponenten-Kleber unterscheidet sich weder in der Klebezeit noch in der Reissfestigkeit von einem Zwei-Komponenten-Kleber, wie in Klebeversuchen am Modell der RattenhautStanzwunde und bei der Klebung von kleinen Darmanastomosen beim Schwein gefunden wurde.

Durch die Wahl einer optimalen Calciumionen-Konzentration der Lösung, mit der man die Iyophili- sierten Wirkstoffe löst, kann man die Klebefestigkeit noch verstärken.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.

Beispiel 1
Zur Herstellung von 500 ml Gewebekleber wurden 580 g pasteurisiertes, hochgereinigte Humanfibrinogen, das 2 g Atom Calciumionen pro Mol enthielt und nach EP 0 103 196 gewonnen worden war, in 580 ml Puffer, pH 7, 5 (Dialysepuffer) mit folgender Zusammensetzung gelöst : 0, 05 molll NaCI 0, 005 molll Tri-Natriumcitrat
0, 3 g/100 ml L-Argininmonohydrochlorid
Die so erhaltene Fibrinogenlösung wurde zweimal 16 Stunden und einmal 8 Stunden gegen je 36 I Puffer derselben Zusammensetzung bei +4 OC dialysiert.

Das Volumen der Fibrinogenlösung betrug nach der Dialyse 1, 53 I. Die Lösung wurde anschliessend 20 min bei 8 000 g zentrifugiert. Die optische Dichte der Lösung, gemessen bei 280 nm, betrug 47. Diese Lösung wurde mit dem obigen Puffer, dem die anderen Kleberkomponenten zugesetzt worden waren (s. unten), auf eine optische Dichte (280 nm) von 35 bis 37, d. h. auf etwa 20 gil Humanfibrinogen verdünnt.

Im einzelnen wurde dabei folgendermassen verfahren : Die dialysierte und zentrifugierte Human-
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I)0, 2 go filtriert. Zu der erhaltenen sterilen Fibrinogenlösung wurden 117, 5 ml pasteurisiertes F XIII- Konzentrat, enthaltend 350 E F Xlillml physiologischer Kochsalzlösung, durch ein Filter mit 0, 2 11m Porenweite filtriert.

Dann wurden 515 000 KIE (Kallikrein Inhibitor Einheiten) Aprotinin, 5, 13 g Na-Glutaminat,
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de über ein Filter mit 0, 2 jim Porenweite zu der F Lil-haltigen Fibrinogenlösung filtriert. Es wurden etwa 2 055 ml Lösung von pH 7, 5 und folgender Zusammensetzung erhalten :

Humanfibrinogen 2, 0 g/100mi Humanalbumin 0, 33 g/100 ml Arginin 0, 3 g/100 ml Na-Glutaminat 2, 5 g/1 Isoleucin 3, 3 gli Faktor Xlil 20 000 E/) Aprotinin 250000 KIE/I
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Die sterile Lösung wurde zu 4 ml abgefüllt und Iyophilisiert. Es wurde ein farbloses, schnell losliches Lyophilisat erhalten.

Zur Anwendung als Gewebekleber wurde eine Abfüllung in 1 mi Lösungsmittel aufgenommen.

Beispiel 2
Zur Herstellung von 125 mi Gewebekleber wurden 100 g einer pasteurisierten, hochgereinigten Humanfibrinogenfraktion, gewonnen nach EP 0 103 196, in 112 ml Dialysepuffer gelöst und dreimal gegen je 10 I desselben Puffers wie in Beispiel 1 dialysiert. Das Volumen der konzentrierten Fibrinogeniösung betrug nach Dialyse 269 mi. Sie wurde 20 min bei 8 000 g zentrifugiert. Die optische Dichte der Lösung bei 280 nm betrug 69, 2. Mit einem Puffer, dessen Zusammensetzung dem Dialysepuffer entspricht und dem alle anderen Kleberbestandteile beigemischt sind, wurde die Lösung so verdünnt, dass eine optische Dichte bei 280 nm von 35 - 37, bezogen auf das Fibrinogen, erreicht wurde.

Dabei wurde wie folgt verfahren :
127 ml vorgelegtem Puffer wurden 8, 2 ml Humanalbumin-Lösung, die 20 g Humanalbumin pro
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Anschliessend wurde diese Lösung mit der oben beschriebenen Fibrinogenlösung und 0, 75 ml einer 0, 1 molaren CaC12-Lösung homogen gemischt und bei 35-37 C über ein Filter der Porenweite von 0, 2 im sterilfiltriert. Es wurden etwa 500 ml sterile Lösung der Zusammensetzung wie im Beispiel 1 erhalten. Diese Lösung wurde in 4-mi-Mengen abgefüllt und Iyophilisiert. Es wurde ein farbloses, schnell lösliches Lyophilisat erhalten.

Zur Anwendung als Gewebekleber wird eine Abfüllung in 1 ml Lösungsmittel aufgenommen.

PATENTANSPRÜCHE : 1. Gewebekleber, enthaltend in wässriger Lösung Fibrinogen, F Xih. einen Thrombininhibitor,
Prothrombinfaktoren und Calciumionen sowie gegebenenfalls einen Plasmininhibitor,
2. Gewebekleber enthaltend in wässriger Lösung Fibrinogen, F Xi)), einen Thrombininhibitor,
Prothrombinfaktoren und Calciumionen sowie gegebenenfalls einen Plasmininhibitor, da- durch gekennzeichnet, dass er in 1 ml Lösung
65-115mg Humanfibrinogen,
40 - 80 E Faktor XIII, 1 - 50 IE PPSB (Prothrombinfaktoren), bezogen auf F 11 (Prothrombin), 0, 01 - 50 IE Antithrombin 111, 0, 1 - 5 mmolll Calciumionen und gegebenenfalls
1-10 000 KIE Aprotinin enthält.

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

3. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebers enthaltend in wässriger Lösung, Fibrino- <Desc/Clms Page number 5> gen, F XIII, einen Thrombininhibitor, Prothrombinfaktoren und Calciumionen sowie gegebenenfalls einen Plasmininhibitor dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer gegebenenfalls pasteurisierten und gegebenenfalls sterilfiltrierten wässrigen isotonischen Lösung von pH 7, 5, die mindestens 16 g/ ! Humanfibrinogen, 2 g Atome Calciumimol Fibrinogen und 1 - 6 g/l L-Argininmonohydrochloird enthält, so viel einer gegebenenfalls pasteurisierten Lösung von Human-Faktor XIII, von Human-Albumin, von Prothrombinkonzentrat, von Antithrombin 111 und von Aprotinin sowie gegebenenfalls Na-Glutaminat und Isoleucin zugibt,

dass die Iyophilisierte Lösung nach Rekonstitution in 1/4 des Abfüllvolumens diese Stoffe in folgenden Konzentrationsbereichen enthält : 65-115 mg/mi Humanfibrinogen, 40 - 80 Elml Faktor XI 11, 4 - 40 mg/mi Human-Albumin, 1 - 50 IElml PPSB (Prothrombinfaktoren), bezogen auf F 11 (Prothrombin), EMI5.1 und 0 - 20 g/l Na-Glutaminat und 0 - 20 9/1 Isoleucin.