DE3002934A1 - Gewebeklebstoff - Google Patents

Gewebeklebstoff

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DE3002934A1
DE3002934A1 DE19803002934 DE3002934A DE3002934A1 DE 3002934 A1 DE3002934 A1 DE 3002934A1 DE 19803002934 DE19803002934 DE 19803002934 DE 3002934 A DE3002934 A DE 3002934A DE 3002934 A1 DE3002934 A1 DE 3002934A1
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Description

IMMUNO Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte Wien, Österreich
Gewebeklebstoff
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Gewebeklebstoff
Die Erfindung betrifft einen Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen, enthaltend Fibrinogen und Faktor XIII.
Es ist seit langem bekannt, Blutgerinnungssubstanzen zur. Stillung von Blutungen bzw. für Wundversiegelungen heranzuziehen. Nach den ersten derartigen Vorschlägen wurden Fibrintampons bzw. Fibrinplättchen verwendet. Während des Zv/eiten Weltkrieges wurden Gewebeklebungen mit Hilfe von Blutplasma vorgeschlagen.
In letzter Zeit wurde von H. Matras u.a. in der "Wiener Medizinischen Wochenschrift", 1972, Seite 517, ein Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und Faktor XIII zur nahtlosen interfaszikulären Nerventransplantation im Tierexperiment beschrieben.
Eine weitere Studie stammt von Spängier u.a. in der "Wiener Klinischen Wochenschrift", 19 73, Seiten 1 bis 7. Auch hier wurde in Tierversuchen die Möglichkeit aufgezeigt, mit Hilfe von Fibrinogen als Kryopräzipitat und Thrombin eine Gewebeklebung vorzunehmen.
Die bekannten Präparate haben sich noch nicht als zu-
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friedenstellend erwiesen, weil sie die an einen Gewebeklebstoff zu stellenden Forderungen, welche die folgenden sind:
a). hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen sowie.sichere und anhaltende Blutstillung, d.h. gute Haftfähigkeit des Klebers an den Wund- bzw. Gewebsflachen, sowie hohe innere Festigkeit desselben,
b) regelbare Haltbarkeit der Klebungen im Körper
c) vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlauf des Wundheilungsprozesses
d) wundheilungsfordernde Eigenschaften,
noch nicht in ausreichendem Maße erfüllen. Dies mag teilweise darauf zurückzuführen sein, daß die für die Blutstillung notwendigen Gerinnungsfaktoren in den bekannten Präparaten nicht in einem optimalen Verhältnis zueinander vorhanden waren und auch daran, daß die fibrinolytische Aktivität im Klebebereich nur ungenügend beherrscht wurde. Es kam häufig durch enzymatische Einwirkung zu einer vorzeitigen Auflösung der Gewebeklebungen.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, einen lyophilisierten Gewebeklebstoff menschlichen oder tierischen Ursprungs zu schaffen, der die weiter oben aufgestellten Voraussetzungen erfüllt und in lyophilisierter Form vorliegt, wonach wegen der längeren Haltbarkeit und besseren Transport- bzw. Lagerfähigkeit ein Bedürfnis besteht.
Dementsprechend besteht die Erfindung in der Kombination der folgenden Merkmale:
a) daß er mindestens 33 Gew.% Fibrinogen enthält,
b) daß das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
c) daß im Gesamtprotein Fibrinogen und Albumin in ei-
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nem Verhältnis von 33 bis 90 : 5 bis 40 enthalten sind,
d) daß er einen Gehalt an Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, in einer Menge von 250 bis 25.000 Kallikrein-Inaktivator-Kinheiten (KIE) pro g Fibrinogen enthält,
e) daß das Präparat lyophilisiert ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Gewebeklebstoff zusätzlich Glycin, wodurch die Wiederauflösbarkeit des lyophilisierten Produktes verbessert wird.
Weiters kann der Gewebeklebstoff zusätzlich Glucose oder Saccharose enthalten, welche Komponenten ebenfalls die Auflösbarkeit fördern.
Der Gewebeklebstoff kann weiters 0,2 bis 200 IE Heparin pro g Fibrinogen enthalten, wodurch eine stabilisierende Wirkung erreicht wird.
Der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung besitzt charakteristische Vernetzbarkeitseigenschaften nach der Auflösung, welche nach der Natriumlaurylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode bestimmbar sind.Per Test wird derart durchgeführt, daß nach dem Vermischen des Gewebeklebstoffes mit dem gleichen Volumen einer Lösung,enthaltend 40 uMol CaCl2 und 15 NIH-Einheiten (US-National Institute of Health-Einheiten) Thrombin pro ml, die Mischung bei 37°C inkubiert wird. Der Vernetzungsgrad wird nach Stoppen der Reaktion und reduktiver Spaltung der in den Proteinen enthaltenen Disulfidbrücken durch Zugabe eines Gemisches von Harnstoff, Natrxumdodecylsulfat und /?-Mercaoptoäthanol durch Gelelektrophorese bestimmt. Charakteristisch für den erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff ist eine vollständige Vernetzung der Fibrin-JT-Ketten nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35 %ige Vernetzung der Fibrin-oO-
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Ketten nach 2 Stunden.
Fibrinogen, Albumin und kälteunlösliches Globulin im Gesamtprotein sollen im erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff in einem bestimmten Verhältnis stehen; dieses Verhältnis beträgt 33 bis 90 : 5 bis 40 : 0,2 bis 15.
Die Erfindung umfaßt des weiteren ein Verfahren zur Herstellung des beschriebenen Gewebeklebstoffes, ausgehend von Plasmakryopräzipitat, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Natriumeitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor und Heparin enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt, der gereinigte Niederschlag gelöst, Humanalbumin zugesetzt und die Lösung lyophilisiert wird.
Vorteilhaft wird das Kryopräzipitat aus humanem oder tierischem Frischplasma hergestellt, welches bei -20 C eingefroren wurde. Bei Erhöhung der Temperatur auf 0 bis 2 C wird das Kryopräzipitat gewonnen und durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wird durch ein- oder mehrmalige Elution mit der Pufferlösung, die einen pH-Wert von 6 bis 8,0 aufweist, eluiert und bei 0 bis 4 C zentrifugiert, um das kältelösliche Plasmaprotein zu entfernen. Die Behandlung mit der Pufferlösung wird bis zum Erreichen des gewünschten Faktor XIII - Fibrinogen Verhältnisses durchgeführt.
Der gereinigte Niederschlag wird mit einer weiteren Pufferlösung, die Humanalbumin, Glycin und gegebenenfalls Glucose oder Saccharose/ einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor sowie Heparin enthält und einen pH-Wert von 6,5 bis 9,0 aufweist, gelöst und auf eine Proteinkonzentration von 4,0 bis 9,0 % verdünnt. Die Lösung wird über Membranfilter einer Porengröße bis zu 0,2 pn filtriert, in die Endbehälter abge-
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füllt und lyophilisiert.
Der so erhaltene lyophilisierte Gewebekleber kann bei Zimmertemperatür oder vorzugsweise bei +4 C gelagert werden; er ist nach Rekonstitution mit Aqua ad iniectabilia, dem wahlweise ein Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, beigefügt werden kann, gebrauchsfertig. Bei der Auflösung des lyophilisierten Präparates ist darauf zu achten, daß die gebrauchsfertige Lösung mindestens 70 mg Fibrinogen pro ml enthält.^
Der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung weist eine universeile Anwendbarkeit auf. Er kann zum nahtlosen Verbinden von menschlichen oder tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung und Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen verwendet werden.
Bevorzugte Anwendungsgebiete, für welche der erfindungsgemäße Gewebeklebstoff erfolgreich eingesetzt werden kann, sind:
Indikationen im Bereich der Hals-, Nasen-, Ohren- und Kieferchirurgie, Zahnheilkunde, Neurochirurgie, plastischen Chirurgie, allgemeinen Chirurgie, Abdominalchirurgie, Thorax- und Gefäßchirurgie, Orthopädie, Unfallchirurgie, Urologie, Ophthalmologie und Gynäkologie.
Vorteilhaft wird vor der Applikation des erfindungsgemäßen Gewebeklebstoffes auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung von Thrombin und Calciumchlorid dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe aufgebracht:
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch' das folgende Beispiel näher erläutert:
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BAD ORIßlNAi
21 1 humanes, bei -20 C eingefrorenes Frischplasma wurden auf +2 C erwärmt. Das entstandene Kryopräzipitat (4 35 g) wurde bei +2 C durch Zentrifugieren abgetrennt und bei +2 C mit 4,3 1 einer Pufferlösung vom pH-Wert 6,5, die 6,6 g Na3-Citrat.2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 g Glycin, 13,0 g Glucose.iH^O, 50.000 KIE Aprotinin und 200 IE Heparin pro 1 enthielt, behandelt und nochmals bei +2 C zentrifugiert. Der abgetrennte Niederschlag wurde in einer weiteren Pufferlösung vom pH-Wert 7,9, welche 35,0 g Humanalbumin, 20,0 g Glycin, 50.000 KIE Aprotinin und 200 IE Heparin pro 1 enthielt, gelöst und auf eine Konzentration von 70 mg Protein pro ml verdünnt.
Sodann wurde die Lösung über Membranfilter bis zu einer Porengröße von 0,2 pm sterilfiltriert, zu je 2,2 ml in Endbehälter abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution des lyophilisierten Produktes auf eine Fibrinogenkonzentration von 90 mg/ml zeigte das gebrauchsfertige Gewebeklebstoffpräparat im Vernetzungstest eine vollständige Fibrin-pA'-Vernetzung nach 5 Minuten und eine
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66 %ige Fibrin-pc-Vernetzung nach 2 Stunden bei 37 C.
Das Verhältnis der im Gewebeklebstoff enthaltenen Proteine Fibrinogen zu Albumin zu kälteunlöslichem.Globulin wurde mit 64,0 : 22,3 : 7,7 festgestellt. Der Heparingehalt betrug 4,5 IE pro g Fibrinogen. Aprotinin war in einer Konzentration von 1133 KIE pro g Fibrinogen enthalten. Der Gehalt an Faktor XIII betrug 161 Einheiten pro g Fibrinogen. Der Gehalt an Gesamtprotein im lyophilisierten Präparat betrug 72,2 %, der Gehalt an Fibrinogen im lyophilisierten Präparat 46,2 %.
Die Bestimmungen erfolgten in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor XIII-Einheiten erfolgte mittels ei-.35 nes Vernetzungstests, bei dem Faktor XHI-freies Fibrinogen als Substrat verwendet und die durch die Zugabe der
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unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibrinvernetzung als Maß für die darin enthaltene Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gepooltem humanem Citratplasma erhalten, wobei per definitionem 1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die quantitativen Proteinbestimmungen erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Die Bestimmung der Proteine relativ zueinander erfolgte ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, u.zw. a) mit einer nicht reduzierten und b) mit einer mit /j-Mercaptoäthanol reduzierten Probe des Gewebeklebstoffes .
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Claims (9)

Patentansprüche:
1. Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen, enthaltend Fibrinogen und Faktor XIII, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Merkmale:
a) daß er mindestens 33 Gew.% Fibrinogen enthält,
b) daß das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
c) daß im Gesamtprotein Fibrinogen und Albumin in einem Verhältnis von 33 bis 90 : 5 bis. 40 enthalten sind,
d) daß' er einen Gehalt an Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor·, vorzugsweise Aprotinin, in einer Menge von 250 bis 25.000 KIE pro g Fibrinogen enthält,
e) daß das Präparat lyophilisiert ist.
2. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich Glycin enthält.
3. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich Glucose oder Saccharose enthält.
4. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er 0,2 bis 200 IE Heparin pro g Fibrinogen enthält.
5. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine vollständige Vernetzbarkeit der
Fibrin-if"-Ketten durch Inkubation nach 3 bis 5 Minuten ö
und eine mindestens 35 %ige Vernetzbarkeit der Fibrin-tX-Ketten nach zweistündiger Inkubation, bestimmt nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, nach Auflösung des lyophilisieften Präparates.
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6. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Fibrinogen zu Albumin zu kälteunlöslichem Globulin im Gesamtprotein 33 bis 90 : 5 bis 40 : 0,2 bis 15 beträgt.
7. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 6 aus Plasmakryopräzipitat, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer-Pufferlösung, welche Natriumeitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor und Heparin enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt, der gereinigte Niederschlag gelöst, Humanalbumin zugesetzt und die Lösung lyophilisiert wird.
8. Anwendung des Gewebeklebstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 7 zum nahtlosen Verbinden von menschlichen oder, tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung und Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen.
9. Anwendung des Gewebeklebstoffes nach Anspruch 8 mit der Maßgabe, daß vor seiner Applikation auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung von Thrombin und Calciumchlorid dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe aufgebracht wird.
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