SE462613B - Foerfarande foer framstaellning av ett vaevnadsbindemedel - Google Patents

Description

462 615 2 10 15 20 25 30 c) fullständig resorberbarhet av bindemedlet under sårläkningsprocessen, d) sårläkningsbefrämjande egenskaper.

Att tidigare preparat icke uppfyller ovannämnda fordringar i tillräcklig utsträckning kan delvis bero på, att de för blodstillningen nödvändiga koaguleringsfaktorerna icke före- finnes i ett optimalt förhållande till varandra hos kända preparat och även därpå, att den fibrinolytiska aktiviteten inom klistringsområdet icke har kunnat helt behärskas.

Man erhöll ofta en för tidig upplösning av dessa Vävnads- hopklistringar genom enzymatisk inverkan.

Uppfinningen avser att undvika dessa nackdelar och svårig- heter och ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma ett vävnadsbindemedel på basis av fibrinogen och faktor XIII av humanteller animalt ursprung, som uppfyller ovan angivna fordringar och ändamålet med uppfinningen är särskild att tillhandahålla ett vävnadsbindemedel, som innehåller utvalda optimala mängdförhållanden på fibrinogen, faktor XIII, albumin och en inhibitor för hämning av den fibrinolytiska aktiviteten och som föreligger i lyofiliserad form och är rekonstruerbar utan svårigheter. Det föreligger ett behov för en sådan preparation med hänsyn till dess längre håll- barhet och bättre transport- respektive lagringsförmåga.

Detta löses enligt uppfinningen medelst ett förfarande, som kännetecknas därigenom, att ett fibrinogen och faktor XIII innehållande utgångsmaterial, nämligen plasmakryo- precipitat, utvinnes ur human eller animal plasma, en eller flera gånger tvättas med en buffertlösning, som innehåller en plasminogen-aktivator-inhibitor eller en plasmin-inhi- bitor, vid ett pH-värde av mellan 6 - 8, varpå den eller de i kyla lösligt protein innehållande tvättvätskan avskildes 10 15 20 25 30 3 462 613 den kvarvarande fällningen under tillsats av humanalbumin och eventuellt av glycin , heparin och en ytterligare mängd av den plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin- inhibitor löses och lösningen lyofiliseras till ett lyofili- sat, som åtminstone innehåller 33 vikt% fibrinogen, varvid förhållandet av faktorn XIII till fibrinogenet, uttryckt i enheter av faktorn XIII per gfibrinogen, uppgår till åtminstone 80.I totalproteinet förefinnes fibrinogen och albumin i ett förhållande av 33 - 90: 5 aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor uppgår till 250 - 25 000 KIE per g fibrinogen. - 40 och halten plasminogen- Såsom plasminogen-aktivator-inhibitor respektive plasmin- inhibitor användes företrädesvis aprotinin.

Enligt en föredragen utföringsform användes såsom tvätt- vätska en buffterlösning, som innehåller cirka 6,6 g Na3- citrat-2H2O, cirka 3,4 g NaCl, cirka 10 g glycin, cirka 13,0 g glukos-lH20 och cirka 50 000 KIE aprotinin per liter och uppvisar ett pH-värde av cirka 6,5.

Genom halten av glycin, glpkos eller sackaros förbättras den lyofiliserade produktens återupplösbarhet.

Genom halten av heparin i en mängd av cirka 0,2 - 200 IE heparin per g fibrinogen uppnås en stabiliserande effekt.

Det enligt uppfinningen framställda vävnadsbindemedlet uppvisar karaktäristiska förnätningsegenskaper efter upp- lösning, som kunna bestämmas enligt natriumlaurylsulfat- (SDS)-polyakrylamid-gelelektroforesmetoden. Denna test utföres på sådant sätt, att en blandning av vävnadsbinde- medlet med samma volym av en lösning, som innehåller 40 ;MolCaC12 Health-Enheter) trombin per ml inkuberas vid 37°C. Förnät- ningsgraden bestämäæefifiæfæireaktionen har upphört och en och 15 NIH-enheter (US National Institutes of 462 10 15 20 25 30 615 4 reduktiv spaltning av de i proteinerna förefintliga disulfid- broarna genom tillsats av en blandning av urinämne, natrium- dodecylsulfat och P-mærkaptoetanol genom gelelektrofores.

Karaktäristiskt för det enligt uppfinningen föreslagna vävnadsbindemedlet är en fullständig förnätning av fibrin- Oš-kedjorna efter 3 - 5 minuter och en åtminstone 35% för- nätning av fibrin-0<-kedjorna efter 2 timmar.

För genomförande av det enligt uppfinningen föreslagna förfarandet framställes lämpligen kryoprecipitat av human eller animalisk färskplasma, vilket djupfrystes vid -20°C.

I en ökning av temperaturen till mellan 0 - 2°C utvinnes kryoprecipitatet och avskiljes genom caflïifugering. Fäll- ningen elueras genom en eller flera elusioner med buffert- lösningen, som uppvisar ett pH-värde av mellan 6 - 8,0 och centrifugeras vid en temperatur av mellan 0 - 4°C för att avlägsna det i kyla lösliga plasmaproteinet och för att uppnå det önskade förnätningsbarhetsegenskaperna. Behand- lingen med buffertlösningen genomföres till uppnåendet av det önskade faktor XIII-fibrinogen-förhållandet.

Den renare fällningen löses med en ytterligare buffert- lösning, som innehåller humanalbumin, glycin och eventuellt glukos och sackaros, en plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor samt heparin och har ett pH-värde av 6,5 - 9,0 och utspädes till en proteinkoncentration av mellan 4,0 - 9,0 %. Lösningen filtreras genom membranfilter med en porstorlek av upp till 0,2 pm, avfylles till slut- behållare och lyofiliseras.

Det så erhållna lyofiliserade vävnadsbindemedlet kan lagras vid +4OC, och är bruksfärdigt efter rekonstitution med Aqua ad iniectabilia, vid rumstemperatur eller företrädesvis som efter val kan försättas med en plasminogen-aktivator- inhibitor eller plasmin-inhibitor, företrädesvis aprotinin. 10 15 20 25 s 462 615 Vid upplösningen av det lyofiliserde preparatet måste be- aktas, att den bruksfärdiga lösningen innehåller åtmins- tone 70 mg fibrinogen per ml.

Det enligt uppfinningen framställda bindevävnadsmedlet upp- visar en universell användbarhet. Sålundalæm det användas för en sömlös hopbindning av humana eller animaliska vävnads- eller organdelar, förfälsårförsegling eller blodstillning samt för en förbättring av sårläkningsprocessen.

Föredragna användningsområden, där det enligt uppfinningen framställda vävnadsbindemedlet kan användas med framgång, är för indikationer inom området hals-, näs-, öron- och käkkirurgin, inom tandvården, neurokirurgin, plastikkirurgin, allmän kirurgin, abdominalkirurgin, thorax- och kärlkirurgin, ortopedin, olyckfallskirurgin, urologin,oftalmologin och gynekologin.

Med fördel försättes bindemedlet före applikationen av det- samma på den för hopbindning avsedda vävnaden med en bland- ning av trombin och kalciumklorid eller också kan denna blandning appliceras på vävnaden.

Uppfinningen skall enligt följande förklaras närmare under hänvisning till nedanstående exempel: Exempel 1 21 liter humant, vid -ZOOC djupfryst färskplasma uppvärmdes till +2oC. Det erhållna krygprecipitatet (435 g) avskildes genom centrifugering vid +2OC och behandlades vid +2oC med 4,3 liter av en buffertlösning med ett pH-värde av 6,5 och innehållande 6,6 g Na3-citrat-2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 g glycin, 13,0 g glukos-lH2O, 50 000 KIE aprotinin och 200IE heparin per liter och därefter följde en ytterligare centri- 462 613 6 10 15 20 25 30 fugering vid +2°C. Den avskiljda fällningen löstes i en ytterligare buffterlösning med en pH-värde av 7,9, som innehöll 35,0 g humanalbumin, 20,0 g glycin, 50 000 KIE aprotinin och 200 IE heparin per liter och spädes ut till en koncentration av 70 mg protein per ml.

Därefter sterilfiltrerades lösningen genom membranfilter med en porstorlek av upp till 0,2 pm och fylldes i slut- behållare vardera innehållande 2,2 ml, djupfrystes och lyofiliserades. Efter rekonstitutionen av den lyofiliserade produkten till en fibrinogenkoncentration av 90 mg/ml upp- visade det bruksfärdiga vävnadsklisterpreparatet i förnät- ningstesten en fullständig fibrin-Ä-förnätning efter 5 minuter och en 66 %-ig fibrin-CX-förnätning efter 2 tim- mar vid 3700.

Förhållandet av de i vävnadsbindemedletförefintliga protei- nerna fibrinogen till albumin till i kyla olösligt globulin fastställdes med 64,0: 22,3: 7,7. Heparinhalten uppgick till 4,5 IE per g fibrinogen. Aprotinin förelåg i en koncentration av 1133 KIE per g fibrinogen. Halten av faktor XIII uppgick till 161 enheter per g fibrinogen. Halten av totalproteinet i det lyofiliserade preparatet uppgick till 72,2 %, halten av fibrinogen i lyofiliserat preparat till 46,2 %.

Ovanstående bestämningar genomfördes på följande sätt: bestämningen av faktor XIII-enheterna genomfördes medelst en förnätningstest, vid vilken faktor XIII-fritt fibrino- gen användes som substrat och den genom tillsatsen av den okända utspädda provet åstadkomna fibrinförnätningen tjänst- gjorde såsom mått för den däri förefintliga mängden av faktor XIII. En motsvarande kontrollkurva uppnåddes med polad humant citratplasma,varvid per definition 1 ml plasma innehåller l enhet faktor XIII. Den kvantitativa protein- bestämningen genomfördes medelst Kjeldahl-metoden. 10 15 20 25 7 462 613 Bestämningen av proteinerna relativt varandra genomfördes likaledes enligt SDS-polyakrylamid-gelelektrofores-metoden, nämligen a) med ett icke reducerat och b) med ett med /ß- merkaptoetanol reducerat prov av vävnadsbindemedlet.

Exempel 2 15 liter humant, vid -35oC, djupfryst färskplasma uppvärmdes till 4°C, varpå det erhållna kryoprecipitatet avskildes genom centrifugering och behandlades vid 4OC med 1,5 liter av en buffertlösning med ett pH-värde av 7,4 och innehållande 6,6 g Na3-citrat~2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 glycin, 50 000 KIE aprotinin och 200 IE heparin per liter och centrifugerades därefter ännu en gång vid 4°C.

Den avskiljda fällningen löstes därefter i en ytterligare buffertlösning mede$t:pH-värde av 7,4 och innehållande 10,0 g humanalbumin, 8,0 g glycin, 1,0 g Na-citrat-2H2O och 500 000 KIE aprotinin per liter och utspäddes till en koncentration av 48 g protein per liter. Därefter steril- filtrerades lösningen, fylldes på slutbehållare med vardera 5,0 ml, djupfrystes och lyofiliserades.

Efter rekonsitution av den lyofiliserade produkten till en fibrinogenkoncentration av 85 mg/ml visade det bruksfärdiga vävnadsbindemedelpreparatet i förnätningstesten en full- ständig fibrin-5-förnätning efter 5 minuter och en 63 %-ig fibrin-04-förnätning efter 2 timmar vid 37°C.

Förhållandet av de i vävnadsbindemedlet förefintliga protei- nerna fibrinogen till albumin till i kyla olösligt globulin faststälh&§;till 70,8: 15,0: 4,2. Heparinhalten uppgick till 2,3 IE per g fibrinogen. Aprotinin förefanns i en koncentration av 9412 KIE per g fibrinogen. Halten av faktor XIII uppgick 462 615 s 10 15 20 25 till 118 enheter per g fibrinogen. Halten av totalproteinet i det lyofiliserade preparatet uppgick till 78,6 %, halten av fibrinogen i det lyofiliserde preparatet till 56,9 %.

Exempel 3 20 liter human, vid -35OC, djupfryst färskplasma uppvärmdes till ZOC, de erhållna kryoprecipitatet avskildes genom centrifugering och behandlades vid 2°C med 2 liter av en buffertlösning med ett pH-värde av 7,4 och innehållande 4 g Na3-citrat-2H2O, 8 g NaCl och 50 000 KIE aprotinin per liter och centrifugerades ännu en gång. Den avkylda fäll- ningen löstes i en ytterligare buffertlösning med ett pH- värde av 7,4 och innehållande 12 g humanalbumin, 1 g Na3- citrat-2H2O och 100 000 KIE aprotinin per liter och spädes ut till en proteinkoncentration av 49 g per liter. Därefter sterilfiltrerades lösningen och avfylldes på slutbehållare vardera innehållande 2,5 ml, djupfrystes och lyofiliserades.

Efter rekonstitution av den lyofiliserade produkten på en fibrinogenkoncentration av 80 mg/ml visade det bruksfärdiga vävnadsbindemedelpreparatet i förnätningstesten en fullstän- dig fibrin- Å-förnätning efter 5 minuter och en 74 %-ig fibrin-0<-förnätning efter 2 timmar.

Sammansättningen av preparatet: fibrinogen: albumin: CIG =70,8: 16,7: 5,9. fibrinogen: 63,7 % av det lyofiliserade preparatet aprotinin: 2247 KIE/g fibrinogen faktor XIII: fibrinogen = 127 E/g

Claims (3)

10 15 20 25 30 9 462 615 P a t e n t k r a v

1. Förfarande för framställning av ett vävnadsbindemedel av human eller animal plasma med en halt av faktor XIII och fibrinogen, k ä n n e t e c k n a t av, attett fibrino- gen och faktor XIII innehållande utgångsmaterial, nämligen plasmakryoprecipitat, utvinnes ur human eller animal plasma, en eller flera gånger tvättas med en buffertlösning, som innehåller en plasminogen-aktivator-inhibitor eller en plasmin- inhibitor, vid ett pH-värde av mellan 6 - 8, den eller de i kyla lösligt protein innehållande tvättvätskan - tvättväts- korna avskiljes, den kvarvarande fällningen under tillsats av humanalbumin och eventuellt av glycin, heparin och en ytterligare mängd av en plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor löses och lösningen lyofiliseras till ett lyofilisat, som innehåller åtminstone 33 vikt% fibrinogen, varvid förhållandetav faktorn XIII till fibrinogen, uttryckt i enheter av faktorn XIII/g fibrinogen, åtminstone uppgår till 80, i totalproteinet fibrinogen och albumin förefinnes i ett förhållande av 33 - 90: 5 - 40 och halten plasminogen- aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor uppgår till mel- lan 250 - 25 000 KIE per g fibrinogen.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av, att man såsom plasminogen-aktivator-inhibitor respektive plasmin-inhibitor använder aprotinin.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t av, att man såsom tvättvätska använder en buffertlösning, som innehåller cirka 6,6 g Na3-citrat-2H2O, cirka 3,4 g NaCl, cirka 10 g glycin, cirka 13,0 g glukos-lH2O och cirka 50 000 KIE aprotinin per liter och uppvisar ett pH-värde av cirka 6,5.