DE3002934C2 - Gewebeklebstoff - Google Patents
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Description
2. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er Aprotinin in einer Menge
von 250 bis 25 000 KIE pro g Fibrinogen enthält.
3. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich Glycin enthält.
4. Gewebeklebstoff nach dei< Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich Glucose
oder Saccharose enthält.
5. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er 0,2 bis 200IE
Heparin pro g Fibrinogen enthält Jo
6. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis
von Fibrinogen zu Albumin zu kälteunlöslichem Globulin im Gesamtprotein 33 bis 90 :5 bis 40 :0,2
bis 15 beträgt.
7. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 6 aus Plasmakryopräzipitat,
dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung
mit einer Pufferlösung, welche Natriumeitrat, ■">
Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
oder Plasmin-Inhibitor und Heparin enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt, der gereinigte Niederschlag gelöst. Albumin
zugesetzt und die Lösung lyophilisiert wird.
Die Erfindung betrifft einen Gewebeklebstoff auf so
Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen, enthaltend Fibrinogen und Faktor XIII.
Ei ist seit langem bekannt, Blutgerinnungssubstanzen
zur Stillung von Blutungen bzw. für Wur.dversiegelungen heranzuziehen. Nach den ersten derartigen
Vorschlägen wurden Fibrintampons bzw. Fibrinplättchen verwendet. Während des Zweiten Weltkrieges
wurden Gewebeklebungen mit Hilfe von Blutplasma vorgeschlagen.
In letzter Zeit wurde von H. Matras u. a. in der60
»Wiener Medizinischen Wochenschrift«, 1972, Seite 517. ein Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und
Faktor XIII zur nahtlosen interfaszikulären Nervcntransplantation im Ticrcxperiment beschrieben.
Eine weitere Studie stammt von Spängier u. a. in der b5
»Wiener Klinischen Wochenschrift«. 1973, Seiten 1 bis 7. Auch hier wurde in Tierversuchen die Möglichkeit
aufgezeigt, mit Hilfe von Fibrinogen als Kryopräzipitat und Thrombin eine Gewebeklebung vorzunehmen.
Die bekannten Präparate haben sich noch nicht als zufriedenstellend erwiesen, weil sie die an einen
Gewebeklebstoff zu stellenden Forderungen, welche die folgenden sind:
a) hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen sowie sichere und anhaltende Blutstillung,
d. h. gute Haftfähigkeit des Klebers an den Wund- bzw. Gewebsflächen, sowie hohe innere
Festigkeit desselben,
b) regelbare Haltbarkeit der Klebungen im Körper,
c) vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlauf des Wundheilungsprozesses,
d) wundheilungsfördernde Eigenschaften,
noch nicht in ausreichendem Maße erfuf.M. Dies mag
teilweise darauf zurückzuführen sein, daß die für die Blutstillung notwendigen Gerinnungsfaktoren in den
bekannten Präparaten nicht in einem optimalen Verhältnis zueinander vorhanden waren und auch
daran, daß die fibrinolytische Aktivität im Klebebereich nur ungenügend beherrscht wurde- Es kam häufig durch
enzymatische Einwirkung zu einer vorzeitigen Auflösung der Gewebeklebungen.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die
Aufgabe, einen lyophilisierten Gewebeklebstoff menschlichen oder tierischen Ursprungs zu schaffen, der
die weiter oben aufgestellten Voraussetzungen erfüllt und in lyophilisierter Form vorliegt, wonach wegen der
längeren Haltbarkeit und besseren Transport- bzw. Lagerfähigkeit ein Bedürfnis besteht.
Dementsprechend ist die Erfindung gekennzeichnet durch die folgenden Merkmale:
a) daß er mindestens 33 Gew.-°/o Fibrinogen enthält,
b) daß das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro
Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
c) daß im Gesamtprotein Fibrinogen und Albumin in einem Gewichtsverhältnis von 33 bis 90:5 bis 40
enthalten sind,
d) daß er einen Gehalt an Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
oder Plasmin-Inhibitor enthält,
e) daß das Präparat lyophilisiert ist.
Vorteilhaft enthält der Gewebeklebstoff Aprotinin in einer Menge von 250 bis 25 000 KIE pro g Fibrinogen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Gewebeklebstoff zusätzlich Glycin, wodurch die
WiederauflösDarkeit des lyophilisierten Produktes verbessert wird.
Weiters kann der Gewebeklebstoff zusätzlich Glucose oder Saccharose enthalten, welche Komponenten
ebenfalls die Auflösbarkeit fördern.
Der Gewebeklebstoff kann weiters 0,2 bis 200 IE Heparin pro g Fibrinogen enthalten, wodurch eine
stabilisierende Wirkung erreicht wird.
Der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung besitzt charakteristische Vernetzbarkeitseigenschaften nach
der Auflösung, welche nach der Natriumlaurylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode bestimmbar
sind. Der Test wird derart durchgeführt, daß nach dem Vermischen des Gewebeklebstoffes mit dem
gleichen Volumen einer Lösung, enthaltend 4OnMoICaCI2 und 15 NIH-Einheiten (US National
Institute of Health-Einheiten) Thrombin pro ml, die
Mischung bei 37° C inkubiert wird Der Vernetzungsgrad wird nach Stoppen der Reaktion und reduktiver
Spaltung der in den Proteinen enthaltenen Disulfidbrükken
durch Zugabe eines Gemisches von Harnstoff, Natriumdodecylsulfat und 0-Mercaptoäthanol durch
Gelelektrophorese bestimmt Charakteristisch für den erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff ist eine vollständige
Vernetzung der Fibrin-y-Ketten nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35°/oige Vernetzung der
Fibrin-«-Ketten nach 2 Stunden.
Fibrinogen, Albumin und kälteunlösliches Globulin im
Gesamtprotein sollen im erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff in einem bestimmten Verhältnis stehen; dieses
Verhältnis beträgt 33 bis 90 :5 bis 40 :0,2 bis 15.
Die Erfindung umfaßt des weiteren ein Verfahren zur Herstellung des beschriebenen Gewebeklebstoffes,
ausgehend von Plasmakryopräzipitat, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß aus dem Kryopräzipitat durch
ein- oder mehrfach/" Behandlung mit einer Pufferlösung,
weiche Natriumckrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose
und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor
und Heparin enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt, der gereinigte Niederschlag gelöst,
Albumin zugesetzt und die Lösung lyophilisiert wird.
Vorteilhaft wird das Kryopräzipitat aus humanem oder tierischem Frischplasma hergestellt, welches bei
—200C eingefroren wurde. Bei Erhöhung der Temperatur
auf 0 bis 2° C wird das Kryopräzipitat gewonnen und durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag
wird durch ein- oder mehrmalige Elution mit der Pufferlösung, die einen pH-Wert von 6 bis 8,0 aufweist,
eluiert und bei 0 bis 4° C zentruugiert, um das
kältelösliche Plasmaprotein zu 2ntfernen. Die Behandlung mit der Pufferlösung wird bis zur Erreichen des
gewünschten Faktor XIII-Fibrinogen-Verhältnisses durchgeführt.
Der gereinigte Niederschlag wird mit einer weiteren Pufferlösung, die Humanalbumin, Glycin und gegebenenfalls
Glucose oder Saccharose, einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor sowie Heparin
enthält und einen pH-Wert von 6,5 bis 9,0 aufweist, gelöst und auf eine Proteinkonzentration von 4,0 bis
9,0% verdünnt. Die Lösung wird über Membranfilter einer Porengröße bis zu 0,2 μπι filtriert, in die
Endbehälter abgefüllt und lyophilisiert.
Der so erhaltene lyophilisierte Gewebekleber kann bei Zimmertemperatur oder vorzugsweise bei +4° C
gelagert werden; er ist nach Rekonstitution mit Aqua ad iniectabilia, dem wahlweise ein Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, beigefügt werden kann, gebrauchsfertig. Bei der
Auflösung des lyophilisierten Präparates ist darauf zu achten, daß die gebrauchsfertige Lösung mindestens
70 mg Fibrinogen pro ml enthält.
Der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung weist eine universelle Anwendbarkeit auf. Er kann zum
nahtlosen Verbinden von menschlichen oder tierischen Gewebe- oder Organteüen, zur Wundversiegelung und
Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen verwendet werden.
Bevorzugte Anwendungsgebiete, für welche der erfindungsgemäße Gewebeklebstoff erfolgreich eingesetzt
werden kann, sind:
Indikationen im Bereich der Hals-, Nasen-, Ohren- und Kieferchirurgie, Zahnheilkunde, Neurochirurgie, plastischen
Chirurgie, allgemeinen Chirurgie, Abdominalchirurgie, Thorax- und Gefäßchirurgie, Orthopädie, Unfallchirurgie,
Urologie, Ophthalmologie und Gynäkologie.
Vorteilhaft wird vor der Applikation des erfindungsgemäßen
Gewebeklebstoffes auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung von Thrombin und Calciumchlorid
dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe aufgebracht
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:
211 humanes, bei — 200C eingefrorenes Frischplasma
wurden auf +20C erwärmt. Das entstandene Kryopräzipitat
(435 g) wurde bei +20C durch Zentrifugieren
abgetrennt und bei +20C mit 431 einer Pufferlösung
vom pH-Wert 6,5, die 6,6 g Na3-Citrat · 2H2O, 3,4 g
NaCl, 10,0 g Glycin, 13,0 g Glucose - IH2O, 50 000 KIE
Aprotinin und 200IE Heparin pro 1 enthielt, behandelt
und nochmals bei +20C zentrifugiert Der abgetrennte Niederschlag wurde in einer weiteren Pufferlösung vom
pH-Wert 7,9, welche 35,0 g Humanalbumin, 20,0 g Glycin, 50 000 KIE Aprotinin und 200 IE Heparin pro I
enthielt, gelöst und auf eine Konzentration von 70 mg Protein pro ml verdünnt
Sodann wurde die Lösyng über Membranfilter bis zu einer Porengröße von 0,2 μπι sterilfiltriert, zu je 2,2 ml in
Endbehälter abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution des lyophilisierten Produktes auf
eine Fibrinogenkonzemration von 90 mg/ml zeigte' das
gebrauchsfertige Gewebeklebstoffpräparat im Vernetzungstest eine vollständige Fibrin-y-Vernetzung nach
5 Minuten und eine 66°/oige Fibrin-α-Vernetzung nach 2 Stunden bei 37°C.
Das Verhältnis der im Gewebeklebstoff enthaltenen Proteine Fibrinogen zu Albumin zu kälteunlöslichem
Globulin wurde mit 64,0 :223 :7,7 festgestellt. Der Heparingehalt betrug Ί.5 IE pro g Fibrinogen. Aprotinin
war in einer Konzentration von 1133 KIE pro g Fibrinogen enthalten. Der Gehalt an Faktor XIII betrug
161 Einheiten pro g Fibrinogen. Der Gehalt an Gesamtprotein im lyophilisierten Präparat betrug
72,2%, der Gehalt an Fibrinogen im lyophilisierten Präparat 46,2%.
Die Bestimmungen erfolgten in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor Xlll-Einheiten erfolgte mittels
eines Vernetzungstests, bei dem Faktor XHI-freies Fibrinogen als Substrai verwendet und die durch die
Zugabe der unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibrinvernetzung als Maß für die darin enthaltene
Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gcpoltem humanem Citratplasma
erhalten, wobei per definitionem 1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die quantitativen Proteinbestimmungen
erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Die Bestimmung der Proteine relativ zueinander erfolgte ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode,
u. zw.
a) mit einer nicht reduzierten und
b) mit einer mit ß-Mercaptoäthanol reduzierten
Probe des Gewebeklebstoffes.
Claims (1)
1. Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen, enthaltend Fibrinogen
und FaktorXIII, gekennzeichnet durch die
folgenden Merkmale:
a) daß er mindestens 33Gew.-% Fibrinogen
enthält
b) daß das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII
pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
c) daß im Gesamtprotein Fibrinogen und Albumin in einem Gewichtsverhältnis von 33 bis 90 :5 bis
40 enthalten sind,
d) daß er einen Gehalt an Plasminogen-Aktivator-Inhibitor
oder Plasmin-Inhibitor enthält,
e) daß das Präparat lyophilisiert ist.
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