DE1802386A1 - Verfahren zur Gewinnung von cytobiotischen Globulinen aus tierischen Organen - Google Patents

Description

• DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NiEMANN DR. M. KÖHLER DlPL-ING. C. GERNHARDT

MÖNCHEN HAMBURG

telefon. s5S47i 8000 MÜNCHEN 15, lo. Oktober I960

TELEGRAMME. KAiPATENT . NUSSBAUMSTRASSE

W. 13 888/68 12/RS

Robert A r d r y 92-Clamart (Prankreich)

und

Michel Robiiliart Paris (Prankreich)

Verfahren zur Gewinnung von cytobiotisehen Globulinen aus tierischen Organen

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren, welches es ermöglicht, aus Organen gesunder Tiere, wie sie im Schlachthof erhalten werden können, d.h. aus Organen, welche von Tieren stammen, die keinerlei vorhergehender Behandlung unterworfen worden sind, proteinhaltige Substanzen und insbe-

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üondero die an di-ouon Organen haftendem Globuline-,aj^utron.- nen, die eine cytobiotiache Aktivitat booitzen,-VZQlChG^ .d-fite- _tsr, jenigen von gewebezerstörenden Antikörperchen analog- ist, ,-d^cfc Γ aus Tierblut erhalten v/erden, das zuvor einer lanzen Über-i-m-munisierung mittels eines zweckentsprechenden Gewebe-Antigens unterv/orfen worden ist, . ... .·-:■■-:.,■.<:.,

Die Erfindung betrifft gleichfalls die nach diesem Ver- ' fahren erhaltenen Produkte. ■.·-"·""."

Die cytobiotischen Globuline weisen die folgenden Eigen- schäften auf:

(a) sie haben keine aggresive oder toxische Aktivität gegenüber dem menschlichen Organismus; ' '„'

(b) sie haben einen spezifischen Tropismus für die homologen Gewebe von tierischen Geweben, aus denen sie abgetrennt * bzw. isoliert worden sind;

(c) sie vermögen auf beschädigte Gewebe eine regenerative Wirkung auszuüben, die zu einer Wiederherstellung des normalen biologischen Kreislaufes führt.

Die Abtrennung dieser cytobiotischen Globuline erfordert eine besondere Kombination technischer Mittel, welche die Ori-r giiialität des nachstehend beschriebenen Verfahrens darstellt·,

1. Vorbereitung der Organe. . . · . . -

Das für die Gewinnung spezifischer cytobiotischer Globuline ausgewählte Organ, welches beispielsweise die Mere ' für Globuline mit Nierenwirkung oder das Herz für Globuline mit Herzwirkung sein kann, wird sofort nach Erhalt vom Schlachthof oder, falls dies nicht möglich ist, nach einem Einfrieren verwendet, das unmittelbar nach der Abnahme des Organs von dem Tier vorgenommen wird.

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Nach einem rasch durchgeführten Zerhacken wird das Organ einem ersten Waschen mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung unterworfen, um den größten Teil des restlichen Blutes zu beseitigen. Danach wird das gehackte Organ in einem Mixer oder Kit irgendeiner anderen ähnlichen Vorrichtung zerkleinert und in einer dem Zehnfachen seines Gewichtes entsprechenden Menge der gleichen Salzlösung suspendiert. Nach einem etwa 1-stündigen Rühren und Inberührung-halten mit der Salzlösung wiiä der unlösliche Teil abgesondert und bei einer Temperatur unterhalb -2o°C eingefroren, um ein Reißen der Zellen hervorzurufen.

. Nach dem Auftauen wird dieser unlösliche Teil wieder in einer dem Zahnfachen seines Gewichts entsprechenden Menge der Salzlösung suspendiert, abgesondert und erneut gewaschen, bis die Waschflüssigkeit kein lösliches Element mehr mitführt.

2. Eluieren der cytobiotischen Globuline Es können mehrere Mittel verwendet werden, um die Bindungen zwischen den Proteinen aufzubrechen und damit aus dem Gewebe die cytobiotischen Globuline zu eluieren.

Beispielweise kann der unlösliche Zellenanteil, der in einer Eluierlösung dispgrgiert ist, einer Erwärmung auf 6o°G während 15 Minuten unterworfen werden. Die Eluierlösung kann eine wäßrige toS&Lge Natriumsalicylätlösung oder eine wäßrige Harnstofflösung, deren Konzentration ^e nach dem gewählten Organ zwischen 15 und 3o# schwanken kann, oder eine der mit Puffer versetzten Lösungen sein, die von variabler lonenstärke sind tmö in dem alkalischen Bereich (Phosphatpuff er) pH-Wert von 9,5 bis 11 txna in dem sauren Bereich (Citratpuffer) pH-Wert von 2,8 bis %2 zu erzielen gestatten.

Jedoch weist das unter Verwendung einer der vorgenannten Eluieriösung erhaltende Endprodukt einen variablen Hete-

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rogonitätsgrad auf und erfordert eine nachträgliche Reinigung .

Es wird ein besseres Ergebnis erhalten,, wenn eine Eluierlösung mit einem pH-Wert von 3,1 - OjOl verwendet wird und wenn dem Eluieren eine erste Entfernung dea nicht cytobioti-Qchon Anteils durch Übergang auf einen pH-Wert von 6 nachfolgen gelassen wird.

Die angewendete Arbeitsweise ist folgendes Der bei der Behandlung der Organe erhaltene unlösliche Geweberückstand wird, je nach «dem gewählten Organ, mit einer dem Zwei- bis Dreifachen seines Gewichtes entsprechenden Menge einer Natriumcitratlösung mit einem pH-Wert von 3»1 - O₉!(Ionenstärke ο„15 m) behandelt. Der pH-Wert des Gemisches v/ird nachgeprüft und erforderlichenfalls durch Zugabe der nötigen und ausreichenden Menge Salzsäure auf 3,1 - o,l eingestellt.

Nachdem das Gemisch während etwa 1 Stunde bei der Raumtemperatur des Laboratoriums stehengelassen worden ist, wird es zentrifugiert, wonach die überstehende Flüssigkeit durch Zugabe der nötigen und genügenden Menge Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 6 oder nahe 6 gebracht wird. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren und Filtrieren entfernt. Diese Reinigung ist für die spätere, ausschließliche Gewinnung der cytobiotischen Globuline wesentlich.

Das Filtrat wird anschließend auf einen,dem neutralen Zustand entsprechenden pH-Wert (Band entsprechend einem pH-Wert von 7) gebracht und ihm wird eine genügende Menge Ammoniumsulfatlösung - (NH^)₂SO₁₁. - zugesetzt, um eine endgültige Konzentration von 1,85 M (wäßrige Lösung mit 4-5$ Salz bei 25⁰C) zu erhalten.

Nach Stehenlassen während einiger Stunden v/ird der gebildete Niederschlag gesammelt und in der gerade erforderli-

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chon Mongo gereinigten Wassers aui'golöot. Die Lösung wird gogonübor gereinigtem bzw. dostilliertem Wasser dialyciert, bio ■ jede Spur des Ammoniumsalze3 verschwunden ist. Hn bildet eich allgemein ein neuer Niederschlag, der durch Zentrifugieren ■ der dialysierten Lösung entfernt wird.

3. Konzentration der cytobiotiachen Globuline.

Die nach dem Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit kann gemäß zwei verschiedenen Arbeitsweisen behandelt werden, je nachdem, ob sogenannte "rohe" cytobiotische Globuline, d.h. solche, die mit Proteinen mit verringerter cytobiotischer Aktivität oder mit einer cytobiotischen Aktivität Null gemischt sind, oder cytobiotische Globuline von hohem Reinheitsgrad erhalten werden sollen.

In dem ersten Fall wird die dialysierte und zentrifugierte Lösung filtriert und lyophilisiert. Das trockene Endprodukt besteht aus den "rohen" cytobiotischen Globulinen, die für die Verwendung in ein geeignetes Auflösungsmittel eingeschlossen v/erden.

In dem zv/eiten Fall wird der dialysierten und zentrifugierten Lösung Natriummonophosphat zugegeben, um eine Endkonzentration von o,ol75 M (pH-Wert 6,3) zu erhalten. Diese Lösung wird danach durch eine Säule von Diäthylaminomethylcellulose hindurchgeführt und in einer Pufferlösung von Mononatriumphosphat von o,2 M (pH-Wert 6,3) dispergiert und dann mit den Mononatriumphosphatpuffer von o,ol75 M (pH-Wert 6,3) gewaschen. Die endgültigen Anteile werden durch den gleichen Puffer verdrängt. Die ausfließende Lösung enthält die "gereinigten" cytobiotischen Globuline, die im wesentlichen IgG-Globuline darstellen.

Nach erneutem Dialysieren und Filtrieren wird die Lösung lyophilisiert, und der trockene Rückstand besteht aus

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cytobiotischen Globulinon von hohem Heinheitü^rad. Dieae Globuline v/erden zum Zeitpunkt ihres Gebrauchs in dem geeigneten Auflösungsmittol gelöst. Die so erhaltenen cytobiotischen Globuline besitzen eine Anzahl von Sigcnachaftcn, die sie für ihre Verwendung in der Kosmetik geeignet machen. So haben die aus der Haut bzw. dem Pell gewisser Tiere oder aus dem Gewebe eines Tieres im Zustand foetalen Lebens isolierte Substanzen auf die menschliche Oberhaut und selbst auf die Lederhaut eine stimulierende Wirkung, die sich in einer neuen Kräftigung und einem besonders frischen Aussehen ψ der Haut äußert.

Die cytobiotischen Globuline können auf die Haut in Form einer Creme, einer Pomade usw. oder in ?orn einer Lösung, einer Lotion, einer tlilch usw. aufgebracht werden.

Unabhängig von der verwendeten Porm kann eine Regenerierung der Teile des Körpers, auf die sie aufgebracht wird, erhalten werden, und es ergibt sich daraus ein frisches Aussehen der Haut und eine sehr bemerkenswerte Straffung der Gewebe.

Nachstehend werden zwei Beispiele von in der Kosmetik verwendbaren Zusammensetzungen angegeben, die cytobiotische Globuline enthalten.

Beispiel 1-(Revitalisierungscreme) (Regenerieriingscreme)

5$ige wäßrige Lösung von cytobiotischen

Globulinen - 4 g".

polyoxyäthylenierte Oleinglyceride 5^2 g

Glykolstearat 22 g

Glycerin, )

gereinigtes baw» destilliertes Wasser !gleiche * .'. ·1ο ο g

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Beispiel 2 (Hautmilch)

5^c/olßQ wäßrige Lösung von cytobiotiöchen Globulinen

polyoxyäthylenierte Oleinglyceride Polyäthylenglykolstearat p-Natriumme thyloxybenzoat

gereinigtes bzw. destilliertes Wasser auf

Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Gewinnung von cytobiotischen G-lobulinen kann abgewandelt v/erden mit dem Ziel, eine Selektion der cytobiotischen Globuline zu ermöglichen, indem aus der Gesamtheit der Fraktionen mit immunologischen Eigenschaften die stabilsten Fraktionen abgetrennt werden, die eine optimale cytobiotische Aktivität aufweisen.

Aus dem in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Tierorgan bzw. Qüergewebe wird ein antigener Extrakt hergestellt, mit welchem ein Blutspender (beispielsweise ein Pferd) immunisiert wird.

Das Verfahren kann jedoch auch bei menschlichen Organen oder Geweben angewendet werden.

1. Abtrennung der immunen Globuline.

Das Blut des immunisierten Tieres wird auf einem Antikoagulierungsmittel gesammelt, wobei die endgültige Konzentration des Antikoagulierungsmittels o,o2 M beträgt.

Nach Abtrennung der genannten Bestandteile kann das erhaltene Plasma nach einer der beiden nachstehenden bekannten Arbeitsweisen behandelt werden:

(a) Arbeitsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat.

Dem Plasma wird eine gesättigte wäßrige Lösung von Ammoniumsiilfat zugesetzt, so daß eine Endkonzentration von

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I,o25 M deo Ammoniumsalzeα erhalten wird. Der entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt.

Die Ammoniumsulfatkonzentration wird danach durch Zu-'gäbe einer zweckentsprechenden Menge gesättigter wäßriger Losung auf 1,56 M gebracht. Der Niederschlag wird gesammelt und mit einer Ammoniumsulfatlösung mit einer Konzentration von 1,56 M gewaschen.

Nach Aufnahme des Niederschlags in Form einer Paste in gereinigtem bzw. destilliertem Wasser wird er einer Dialyse gegen gereinigtes Wasser bis zum vollständigen Verschwinden des Ammoniumsalzes unterworfen. Die Dialyse muß derart aus» geführt werden, daß eine richtige Proteinkonzentration für die Durchführung der zweiten Phase des Verfahrens, d.h» der Selektion der Globuline, aufrechterhalten wird.

(b) Arbeitsweise unter Verwendung eines Metallsalzes.

Das Plasma wird zuerst in drei Volumen einer wäßrigen Natriumchloridlösung verdünnt, wobei die Salzkonzentration eine Funktion der Tierart ist, von welcher das behandelte Blut stammt.

Danach wird ein Zinksalz zugegeben, um eine Konzentration von Io Millimol zu erhalten. Der bei Raumtemperatur entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt«, Die Flüssigkeit wird filtriert, .und dem Filtrat wird das gleiche Zinksalz zugegeben, um die Konzentration auf 18,6 Millimol zu erhöhen, sowie eine basische Aminosäure zugesetzt, um eine Konzentration von ο,43 Millimol zu erhalten.

Nach dem Zentrifugieren wird der Niederschlag in gereinigtem V/asser gewaschen (ein Volumen auf drei Volumen Ausgangsplasma) . Nach einem erneuten Zentrifugieren und Wegschütten des Waschwassers wird der Niederschlag mit gereinigtem Wasser auf pastenförmige Konsistenz gebracht und dann während 24 Stunden gegen gereinigtes Wasser dialysiert.

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2. Seloktion der Globuline

Die Selektion erfolgt- gemäß der nachstehenden Arbeitsweise, welche die Abwandlung der eingangs beschriebenen Arbeitsweise darstellt.

(a) Die gesamten immunen Proteine werden in lösung gebracht, indem der 3ich aus der Dialyse ergebenden Suspension gereinigtes. Wasser, Natriumchlorid und Natriumhydroxyd zugesetzt werden, so daß sich ein pH-Wert nahe dem Ueutralitätspunkt ergibt und eine Ionenstärke erhalten wird, die zum Beseitigen verschiedener Globuline geeignet ist.

Die optimalen Konstanten sind:

Konzentration an proteinhaltigen Bestandteilen 5 i° pH-Vfert 7,3 - o,3

Ionenstärke 0,06

Nach. Mischen und Auflösen der löslichen Proteine unter diesen Bedingungen werden 1 bis 2$ Kohlepulver (beispielsweise die unter der Bezeichnung "Muchar C 19o" erhältliche Kohle) zugegeben. Das Gemisch wird während einer Stunde stehen gelassen,und nach dem Dekantieren oder Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit mit einem Klärfilter filtriert.

(b) Die Abtrennung der eine optimale cytobiotische Aktivität aufweisenden Globuline erfolgt dadurch, daß die Lösung der Globuline in Berührung mit dem unlöslichen Rückstand eines Homogenates des Organs oder Gewebes gehalten wird, das mit dem Organ bzw. Gewebe identisch ist, welches zum Herstellen des Antigens verwendet wurde, das zum Immunisieren des Pferdes gedient hat.

Dieses spezifische Homogenat des der Reinigung unterworfenen Antikörpers war vorher zunächst mit einer Citratlösung von einer Konzentration von o,15 M und mit einem pH-Wert von 3,1 - o,l behandelt und danach mit einer Hatriumchloridlösung

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von ο,15 M, die auf einen pH-Wert von 7,5 - o,3 gepuffert war, sorgfältig gewaschen worden.

Nach Abtrennen der an den GeweTbehoinogenat nicht anhaftenden und in Lösung gebliebenen Globuline werden die adsorbierten Globuline mittels der Citratlöoung von o,15 M und einem pH-\Yert von 3,1 eluiert. Das eluierte Material wird danach auf einen pH-\7ert von 7,5 - o,3 neutralisiert. Die unlöslichen Bestandteile werden abgetrennt, und die Lösung wird einer Dialyse gegen eine Natriumchloridlösung von. o,15 LI unter-worfen.

Im Fall eines geringen Proteingehaltes ist es empfehlenswert, die Dialyse gegen gereinigtes Y/asser auszuführen, die dialysierte Lösung einer Ly-ophilisierung zu unterwerfen und dann die ly-ophilisierten Proteine in einer Natriumchloridlösung von o,15 M und einem pH-Y/ert*von im wesentlichen 7,5 aufzulösen.

Schließlich werden die Lösungen der Globuline auf sterilisierenden, mit Milliporen versehenen Platten in sterilem Medium filtriert.

Die abgewandelte Ausführungsforni der Erfindung wird nachstehend an zwei Beispielen näher erläutert.

Beispiel 3

(a) Abtrennung der immunen Globuline aus der Gesamtheit der Globuline,

6 1 Blut eines immunisierten Pferdes werden mit loo ml einer 33$igen Trinatriumcitratlösung zusammengebracht.

Ein Volumen einer gesättigten Aiaaoniumsulfatlösung wird drei Volumen des Plasmas zugegeben. Mach Abtrennung.des Nie~

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derSchlags werden 22o ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung je Liter der überstehenden Flüssigkeit zugegeben. Der nach der zv/eiten Fällung gesammelte Niederschlag v/ird mittels einer Uischung aus 38 Teilen gesättigter Ammoniumsulfatlösung und 62 Seilen gereinigten Wassers gewaschen, Er v/ird dann wieder in gereinigtem V/asaer suspendiert und einer Dialyse unter den vorstehend genannten Bedingungen unterworfen.

(b) Selektion der Globuline.

Das Dialysa't wird auf eine Proteinkonzentration von 5^cß> gebracht. Es werden je Liter Suspension 35 g natriumchlorid zugegeben. Der pH-Wert wird auf 7,5 - Q,3 gebracht, und zwar mittels der notwendigen und ausreichenden Menge von normaler Natriumhydroxydlösung, die zuvor an einem aliquoten Teil bestimmt worden ist.

Der Arbeitsvorgang wird dann in der vorstehend angegebenen \7eise zu Ende geführt.

Beispiel 4

(a) Abtrennung der immunen Globuline aus der Gesamtheit der Globuline.

Einem Volumen Pferdeblutplasma werden drei "Volumen einer o,9$igen Natriumchloridlösung zugesetzt. Dann werden je Liter der Verdünnungslösung 3o ml einer 9,6$igen wäßrigen Zinksulf at lösung zugegeben..

Nach Abtrennung des Niederschlags werden je Liter FiI-trat 21 ml 9,6$iger wäßriger Zinksulfatlösung und 5 ml o,65$iger wäßriger Glyeinlösung zugegeben.

(b) Selektion der Globuline,

Es wird wie in dem vorhergehenden Beispiel 3 vorgegangen.

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Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die insbesondere als biologisches Stimulans und Aktivator doa Zellonmotabolismus verwendbar ist und als aktiven Bestandteil cytobiotische Globuline enthält, welche aus Tierorganen gemäß dem eingangs beschriebenen Verfahren gewonnen worden sind.

Die gemäß dem eingangs beschriebenen Verfahren erhaltenen cytobiotischen Globuline liegen in Form eines sehr leichten Pulvers vor, das eine etwas in's Graue gehende weis- W se Farbe hat und in Wasser und in physiologischem Serum löslieh ist.

Diese cytobiotischen Globuline sind zum Gegenstand einer pharmakologischen Prüfung gemacht worden, die ihre biologische Aktivität erkennbar gemacht hat, welche zu einer metabolischen Stimulierung der Gewebe'führt.

Io Wirkung auf embryonale Organe in einer Kultur der Organe.

Das embryonale Organ in Organkultur ist ein gewähltes Material, um die biologische Aktivität und den Grad der Cy- ) totoxizität eines Produktes erkennbar zu machen. Die Empfindlichkeit des Kulturgewebes ist außerordentlich hoch und ermöglicht sehr feine Bestimmungen. Dem Kulturmedium wurden acht Tropfen einer l^igen lösung des untersuchten Globulins je ml des Mediums zugesetzt.

Im Falle des embryonalen Schienbeins (tibia) wurde das tägliche \7achsen photographisch aufgezeichnet, und der Vergleich mit einer Kontrollkultur zeigte ein beschleunigtes und intensiveres Wachsen in Gegenwart des Globulins sowie eine beträchtliche Verminderung von Mißbildungen. bei den Kontrollproben 7o$ und im Fall der mit dem spezifischen Globulin behandelten Schienbeinproben nur

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Eine an den Körpern dieser Schienbeinproben durchgeführte Autoradiographie zeigte einen viel intensiveren Einschluß von radioaktivem Schwefel S,c (der aus dem dem llllhmedium zugesetzten markierten Methionin stammt) als bei den Kontrollproben.

2. Die auf die Gewebe ausgeübte Erneuerungswirkung.

Die spezifischen Globuline riefen die Heilung von experimentellen Wunden in einer merklich kürzeren Zeit als bei den Kontrollproben hervor.

Dieses Phänomen ist an Knochenbeschädigungen bei einer Ratte sichtbar gemacht worden. Die Geschwindigkeit der Verheilung war im Mittel doppelt so hoch wie bei den Kontrollproben. ■ -

(a) Wirkung auf die Niere.

Die Erzeugung von Nierenschäden der Amyloseart durch Injektion von Natriumcaseinat wurde durch die gleichzeitige Verabreichung des spezifischen Globulins verlangsamt oder verhindert. Der Schutz der Niere war derart, daß die behandelten Tiere überlebten, während die Kontrolltiere starben.

(b) Wirkung auf die leber.

Die Gewebeerneuerung ging nach einer operativen Entfernung einea großen Teiles der Leber erheblich rascher nach der Verabreichung von LebergIobulinen vor sich.

(c) Wirkung auf die Haut.

Auch in diesem Fall wurde die Gewebeerneuerung beschleunigt, wenn die experimentelle Wunde mit einer Lösung des spezifischen Hautglobulins behandelt wurde j gegenüber den Kontrollproben war die Geschwindigkeit der Wundenheilung verdoppelt .

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Anhand von verschiedenen durchgeführten Testen konnte außerdem festgestellt werden, daß die cytobiotiischen Globuline beim Tier die folgenden Eigenschaften ergaben:

Schutz der Haus gegen akute Vergiftung durch Ammoniumchlorid;

Beschleunigung des Metabolismus bei der Ratte, die einer aus dem Gleichgewicht gebrachten und mangelhaften Ernährung ausgesetzt war;

Doping-Effekt bei unterernährten Tieren, die mit Beginn der Wiederaufnahme der normalen Nahrung einem Test hinsichtlich der physischen Aktivität unterworfen wurden;

Protido-anabolische Wirkung, bei der jede androgene Wirkung fehlte;

Verzögerung des Auftretens der Lluskelermüdung;

Zurückhaltende Wirkung auf den Arteriendruck des Kaninchens;

Beschleunigung der Heilung von experimentellen Wunden zufolge von Verbrennung beim Kaninchen»

Die toxikologische Untersuchung der cytobiotischen Globuline hat erwiesen:

daß sie keine akute Vergiftung bei der Maus und dem Meerschweinchen verursachen;

daß sie keine chronische Vergiftung bei dem Kaninchen und dem Meerschweinchen verursachen;

daß sie keine Antikörper enthalten, die mittels der Diffusionsmethode in Gelose gegen verschiedene menschliche, amniotische und vom Schwein stammende Zellen auffindbar sind;

daß sie keine Antikörper enthalten, die mittels Fixierung des Komplementes gegen zerriebene menschliche, am» 909848/1114

niotiuche Zellen und zerriebene Schwoinenieren auffindbar sind;

daß sie keine teratogene Aktivität bei der Haus, der Ratte und dem Kaninchen verursachen.

Zur Anwendung in der menschlichen Therapie können die nachstehend als Beispiele genannten pharmazeutiachen Zusammensetzungen benutzt werden:

Losung zur parenteralen Injektion.

Lyophilisat von spezifischen

Globulinen (Niere, Leber, Haut) Io mg

physiologisches Serum 2 ml

je Ampulle

Lösung für lokale Anwendungen.

Lyophilisat von spezifischen*
Kehrfaehgewebe-Globulinen o,6ο g

Lösungsmittel (destilliertes Wasser

oder physiologisches Serum) q.s.p. loo ml

Es können auch andere Formen, wie z.B. Zäpfchen, benutzt werden·

Die cytobiotischen Globuline sind in der menschlichen Therapie zum Gegenstand einer Untersuchung bezüglich von Störungen in der Ernährung, Asthenie- und Abmagerungserscheinungen gemacht worden.

Das Medikament wurde in Form einer injizierbaren Lösung verabreicht. Die intramuskuläre Verabreichung erwies sich ebenfalls als frei von Nachteilen.

Der angenommene Verabreichungsrhythmus bestand aus zwei bis drei Injektionen je Woche. Die Dauer der Behandlung betrug drei Wochen.

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Die erzielten Ergebnisse waren allgemein gut.

In der Geriatrie waren die Ergebnisse noch auegeprägter. Die Besserungsquote lag in der Größenordnung von 80$ der Fälle·

Die Y/iederholung der Injektionen hatte keinerlei Sensibilitätsstörung nach sich gezogene

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Claims (6)

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT MÖNCHEN m HAMIURO telefon· 55J47« 8000 Mönchen 15, 3o.Dezember 1968 TELEORAMMEi KAKPATENT NUSSBAUMSTHASSEiO W. 13 888/68 13/Loe P 18 02 386.4 Neue Patentansprüche

1) Verfahren zur Gewinnung von cytobiotischen Globulinen aus tierischen O_rganen, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial Organe verwendet werden, die von gesunden Tieren stammen, welche keinerlei vorherige Behandlung erfahren haben, die Organe rasch zerkleinert und mehrmals mit einer 0,9#igen Natriumchloridlösung gewaschen werden, die cytobiotischen Globuline mittels einer Natriumeitratlösung mit einem pH-Wert von 3,1 + 0,01 (Ionenstärke 0,15 M) eluiert werden, nach dem Zentrifugieren die überstehende Flüssigkeit durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert nahe 6 gebracht wird, der gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren und Filtrieren entfernt wird, das Filtrat durch Zusatz einer 45#igen Ammoniumsulfatlösung auf den neutralen pH-Wert gebracht wird, der Niederschlag in der gerade ausreichenden Menge Wasser gelöst wird, die Lösung dialysieii; und zentrifugiert wird und die nach dem Zentrifugieren erhaltene Lösung dialysiert, zentrifugiert, filtriert und lyophilisiert wird, so dad sich als trockenes Endprodukt. "rohe" cytobiötische Globuline ergeben«

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2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung von cytobiotischen GIabulinen von hohem Reinheitsgrad der dialysierten und zentrifugierten Lösung Natriummonophosphat mit einer Konzentration von 0,0175 M zugesetzt wird, die Lösung durch eine Säule von Diäthylaminomethylcellulose hindurchgeführt und in einer Pufferlösung von Mononatriumphosphat von 0,2 M dispergiert und dann mit Mononatriumphosphatpuffer gewaschen wird, die ausfließende Lösung

" dialysiert und filtriert wird und· das Filtrat lyophilisiert wird, so daß sich als trockener Rückstand cjrtobiotische Globuline von hohem Reinheitsgrad ergeben.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus tierischen Organen oder Geweben erhaltenes Plasma zwecks Isolierung der Gesamtheit der Globuline entweder einer Behandlung durch Ausfällen mittels Ammoniumsulfat, Abtrennen des Niederschlags, Suspendieren des Niederschlags und Dialysieren des Niederschlags oder einer Behandlung durch Ausfällen mittels eines Zinksäl·· zes, Abtrennen des Filtrats, erneutes Ausfällen mit dem gleichen Zinksalz, dem eine basische Aminosäure zugesetzt ist, Abtrennen des Niederschlages und Suspendieren und Dialysieren des Niederschlags unterworfen wird, die Gesamtheit der Globuline in Lösung gebracht wird, indem der sich aus der Dialyse ergebenden Suspension gereinigtes Wasser, Natriumchlorid und Natriumhydroxyd in vorbestimmten Anteilen zugesetzt werden, dann die Lösung mit Kohlepulver behandelt wird, nach Stehenlassen die überstehende Flüssigkeit durch Filtrieren getrennt wird, die Lösung der Globuline in Berührung mit einem Homogenat des Organs oder Gewebes gehalten wird, die ad sorbierten Globuline durch Auswaschen mittels einer Citratlösung abgetrennt werden,die erhaltene Lösung

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neutralisiert wird, die unlöslichen Bestandteile abgetrennt werden, die Lösung einer Dialyse gegen eine Natriumchloridlösung unterworfen wird und die Lösung der Globuline auf sterilisierenden Platten filtriert und schließlich lyophilisiert wird.

4) Arzneimittel in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die insbesondere als biologisches Stimulans und Aktivator des Zellenmetabolismus verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil cytobiotische Globuline enthält, die aus Tierorganen gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 gewonnen worden sind.

5) Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die Form einer injizierbaren Lösung oder die Form einer Lösung für lokale Anwendungen oder die Form von Zäpfchen hat.

6) Kosmetisches Erzeugnis, insbesondere in Form einer Creme oder Lotion, dadurch gekennzeichnet, daß es cytobiotische Globuline enthält, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 erhalten sind.

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