DE2702510A1

DE2702510A1 - Verfahren zur zubereitung eines faktors viii - produktes

Info

Publication number: DE2702510A1
Application number: DE19772702510
Authority: DE
Inventors: Rodger L Bick; Lajos F Fekete
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-01-22
Filing date: 1977-01-21
Publication date: 1977-07-28
Also published as: US4027013A; BE850646A; GB1521639A; US4085095A

Description

"Verfahren zur Zubereitung eines Faktor VIII - Produktes"

Die Erfindung betrifft das Zubereiten eines Faktor VHI-Produktes, das frei von gerinnbarem Fibrinogen ist. Faktor VIII ist eines der Spurenproteine, die zum Gerinnen von menschlichem Blut erforderlich sind. Wenn im Blut eines Patienten der Faktor VIII fehlt oder aus irgendeinem Grund biologisch nicht aktiv ist, findet ein normales Gerinnen nicht statt. Eine Behandlung für einen solchen Patienten besteht darin, durch Injizieren normalen Faktor VIII dem Blut des Patienten beizugeben.

Ein Problem in dieser Hinsicht besteht darin, daß es bielang nicht wirtschaftlich durchführbar war, Faktor VIII und Fibrinogen zu trennen. Somit würde bislang ein hochwirksames, im Handel verfügbares Faktor VIII - Konzentrat unvermeidlich eine besordere Konzentration von Fibrinogen enthalten. Die Injizierurg einer überschüssigen Menge an Fibrinogen ergibt oft ein Njerenversagen. Aus diesem Grund war es oft unmöglich,

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eine wirkscune Dosierung an Faktor VIII einem Patienten zu verabreichen, welcher dieses Mittel zum normalen Gerinnen benötigt.

Gemäss der Erfindung wird ein Faktor VIII - Konzentrat zubereitet, welches frei von gerinnbarem Fibrinogen ist. Das Verfahren ist für die Produktion hoher Ausbeuten an Faktor VIII - Konzentrat auf einer kommerziellen Basis geeignet. Dieses Produkt ist zum Injizieren bei Patienten geeignet, welche an einer Bluterkrankheit leiden. Auch kann gewünschtenfells dieses von gerinnbarem Fibrinogen befreite Faktor VII!-Konzentrat einer Lyophilisation zum Zwecke der Lagerung und des Transportes unterworfen werden.

Im allgemeinen umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei welchem ein wesentlicher Teil an gerinnbarem Fibrinogen (mehr als annähernd 9o%) in einer anfänglichen Separationsstufe ausgeschieden wird, wobei der Faktor VIII in Lösung verbleibt. Das ausgefällte Fibrinogen wird getrennt und ausgeschieden. Die sich ergebende fibrinogenarme überstehende Flüssigkeit wird durch Ausfällen und Wiederbildung konzentriert, um das Flüssigkeitsvolumen zu reduzieren. Das rekonstituierte Faktor VIII-Fibrinogen-Präzipitat wild mit einer geringen Menge eines thrombinmimetischen Enzyms behandelt, welches verursacht, daß das verbleibende gerinnbare Fibrinogen gerinnt, aber nicht bemer-

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kenswert die biologische Aktivität des Faktors VIII beeinträchtigt. Diese thrombinmimetischen Enzyme kommen in der Natur in verschiedenen Schlangengiften vor und werden für die Verwendung gemäss Erfindung isoliert und gereinigt. Der Faktor VIII verbleibt in der überstehenden Flüssigkeit, und das geronnene Fibrinogen wird abgeschieden. Der Faktor VIII, der nun frei von gerinnbarem Fibrinogen ist, wird wiederum ausgefällt, und die überstehende Flüssigkeit wird abgeschieden. Das sich ergebende Faktor Vlll-Präzipitat wird in einer kLeinen Menge Salzlösung wieder in Lösung gebracht, und menschliches Albumin wird zugefügt, um den Faktor VIII während der Lyophilisation zu stabilisieren. Die Ausbeute an Faktor VII £ ist so hoch wie annähernd 9o%, und das der Lyophilisation unterworfene Produkt weist bei Wiederbildung im wesentlichen die gesamte biologische Aktivität des Faktors VIII auf, welches der Faktor VIII vor der Lyophilisation besessen hat.

Das gesamte Verfahren mit Ausnahme der Lyophilisation kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und vorzugsweise bei Temperaturen im Bereich von 15-3o°C, obwohl Temperaturen so gering \/ie lo°C und so hoch wie 35°C angewandt werden können. Temperaturen unterhalb ungefähr lo°C neigen dazu, die Wirksamkeit des Faktors VIII zu beeinträchtigen, und Temperaturen « berhalb von ungefähr 35°C beeinträchtigen die

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biologische Aktivität des Faktors VIII. Bei einer Temperatur von ungefähr 4o°C wird die Wirksamkeit des Faktors VIII vollständig zerstört.

Im allgemeinen wird die Salzkonzentration der Faktor VIII-Lösungen, welche den Faktor VIII enthalten, auf physiologische Werte (o, 15 molares Natriumchlorid) eingestellt, obwohl Salzkonzentrationen etwas oberhalb und unterhalb der physiologischen Werte verwendet werden können, wenn dies gewünscht ist. Nachdem Faktor VIII von dem Fibrinogen getrennt ist, ist er etwas empfindlich gegen Salzkonzentrationen, so daß Salzkonzentrationen von ungefähr o,o5 bis o,25 molares Natriumchlorid für die Verwendung bei Faktor VIII enthaltenden Lösungen bevorzugt werden, nachdem Fibrinogen entfernt worden ist. Vor dem Entfernen des Fibrinogens können Salzkonzentrationen von ungefähr o,o5 bis o,5o molares Natriumchlorid gewünschtenfalls verwendet werden, ohne die Wirksamkeit des Faktors VIII oder des thrombinmimetisqhen Enzyms zu beeinträchtigen, und ohne den Faktor VIII aus der flüssigen Phase auszuscheiden. Natriumzitrat kann während des Verfahrens und in dem abschließenden der Lyophilisation unterworfenen Produkt gewünschtenfalls zusätzlich zu Natriumchlorid verwendet werden.

Im allgemeinen kann der pH-Wert der Lösungen, die bei der Zubereitung des gerinnbaren Fibrinogen-Faktor Vlll-Produktes

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verwendet werden, im Bereich von 6,ο bis 8,0 und vorzugsweise von ungefähr 6,5 bis 7,ο liegen. Unterhalb eines pH-Wertes von 6 bildet das Fibrinogen Flocken, welche den Faktor VIII mit sich tragen, und oberhalb eines pH-Wertes von ungefähr 8 sind die Ausbeuten so gering, daß im wesentlichen kein Faktor VIII gewonnen wird. Nachdem Fibrinogen von dem Faktor VIII abgetrennt ist, wird er etwas empfindlicher gegenüber dem pH-Wert, und die pH-Werte sollten in dem Bereich von ungefähr 6,7 bis 7,ο gehalten werden.

Die anfäng. iche Ausscheidung eines wesentlichen Anteiles des Fibrinogens als auch die nachfolgenden Ausscheidungen der Faktor VIII enthaltenden Materialien wird zweckmässig durchgeführt, indem verschiedene Konzentrationen gewisser Blockcopolymere verwendet werden. Die besonderen Blockcopolymere, die in diesen selektiven Aussehe!düngeverfahren verwendet werden, werden durch Kondensieren von Äthylenoxyd mit PoIyoxypropyleiipolymer zubereitet. Die sich ergebenden Kondensationsprodu :te sind bekannte Materialien, die durch die folgende Strukturformel dargestellt werden können.

HO (CH₂CH₂O)_a(CHCH₂O)
CH₃

Blockcopolymere, die für diese Zwecke geeignet sind, sind

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von Wyandotte Chemicals Corp. unter den Bezeichnungen "Pluronic F-38" und "Pluronic F-68" erhältlich. Das Pluronic F-38-Material enthält ungefähr 80% Polyäthyleneinheiten, und der Polyoxypropylenpolymer-Anteil des Moleküls hat ein Molekulargewicht von ungefähr 95o. Das Kondensationsprodukt hat ein Molekulargewicht von 475o. Das Pluronic F-68-Material enthält ebenfalls ungefähr 80% Polyoxyäthyleneinheiten, und der Polyoxypropylenpolymer-Anteil des Moleküls hat ein Molekulargewicht von ungefähr 175o, wobei das gesamte Molekulargewicht des Kondensationsproduktes ungefähr 875o ist. Im allgemeinen enthalten diese Blockcopolymere wenigstens ungefähr 5o% Äthylenoxyd in dem Molekül, und der Polyoxypropylenpolymer-Anteil des Moleküls hat ein Molekulargewicht von wenigstens ungefähr 9oo. Die Blockcopolymere müssen müssen wasserlöslich bei Konzentrationen von wenigstens ungefähr 2o% auf der Basis von Gewicht pro Volumen bei Temperaturen von ungefähr Io bis 35°c sein. Diese Materialien müssen giftfrei sein.

Im allgemeinen wird die anfängliche Trennungsstufe, in welcher ein wesentlicher Anteil des Fibrinogens durch Ausfällen aus einer Faktor VIII enthaltenden, überstehenden Flüssigkeit getrennt wird, bei einer Konzentration von ungefähr 1 bis 4,5 Grammprozent (Gramm pro loo ecm) und vorzugsweise 3 bis 4 Grammprozent des Blockcopolymers bei einer Salzkonzentration

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von ungefähr ο, 15 molares Iiatriuinchlorid und einer Temperatur von ungefähr 15 bis 3o 'c durchgeführt. Bei Konzentrationen unterhalb ungefähr 1 Grammprozent wird bei dem Verfahren nicht eine ausreichende Menge an Fibrinogen entfernt, und bei Konzentrationen oberhalb ungefähr 4,5 Grammprozent wird ebenfiills ein wesentlicher Anteil des Faktors VIII ausgeschieden. Die Partialtrennung von Fibrinogen und Faktor VIII unter Verwendung von Pluronic F-38 und F-68 ist in der US-PS 3 77o 631 beschrieben.

In nachfolgenden Stufen, wenn es gewünscht ist, den gesamten Faktor VIII auszuscheiden, liegt die Konzentration des Blockcopolymeren im Bereich von ungefähr 6-lo Grammprozent und vorzugsweise von ungefähr 8 bis Io Grammprozent. Unterhalb 6 Grammprozent Blockcopolymer ist die Ausbeute an Faktor VIII sehr gering. Oberhalb ungefähr Io Grammprozent werden im wesentlichen alle Bakterien, die vorhanden sein können, ausgeschieden. Wenn die Temperatur unterhalb ungefähr 15° abgesenkt wird, sollte die Konzentration des Blockcopolymers langsam reduziert werden, um somit die Ausscheidung überschüssiger Mengen an Bakterien zu verhindern, die in den Blutplasmafraktionen vorhanden sein können.

Die thrombinmimetischen Enzyme oder Reagentien werden verwendet, um das restliche Fibrinogen zu gerinnen und somit abzutrennen, das nach der anfänglichen Fibrinogen-Trennungsstufe verbleibt. Diese Reagenzien, abweichend Thrombin,

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beeinträchtigen nicht die biologische Aktivität des Faktors VIII. Diese thrombinmiitietisehen Reagenzien werden aus dem Gift verschiedener Schlangen extrahiert wie beispielsweise die Malaiische Pit-Viper (Agkistrodon rhodostoma), die südamerikanische Schlange Bothrops atrox und die Schlangen Crotalus terrilicui) und Crotalus adamanteus. Diese thrombinmimetischen Enzyme sind unter den Warenbezeichnungen "Arvin" (Twyford Laboratories, London, England), "Ancord" (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) und "Reptillase" (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) erhältlich. Es wurde früher vorgeschlagen, daß diese thrombinmimetischen Enzyme verwendet werden können, um geringe Mengen an Faktor VIII zuzubereiten, der frei von Fibrinogen ist, Green, D.: "A Simple Method for the Purification of Factor VIII (Antihemophiliac Factor) Employing Snake Venom." J. Lab, Clin. Med. 77: 153-158 (1971).

Die entsprechenden Fibrinogen- und Faktor VIII-Ausscheidungsstufen, anders die Gerinnungsstufe, können durchgeführt werden, wobei Ausfällungsreagenzien anders als Äthylenoxyd-Polyoxypj opylen-Blockcopolymer-Konderisationsprodukte verwendet werden. Beispielsweise kann Polyäthylenglycol unter wesentlich herabgesetzter Ausbeute an Faktor VIII verwendet werden, wie beispielsweise beschrieben ist von A. Poison und C. Ruiz-Bravo: "Fractionation of Plasma with Polyethylene

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Glycol" Vox Sang. 23: Io7-118 (1972). Äthanol, Ammoniumsulfat und Glycine erfordern die Anwendung geringer Temperaturen, die nachteilig für die Wirksamkeit von hochkonzentriertem Faktor VIII sind. Dialyseverfahren können gewünschtenfalls ebenfalls verwendet werden, obwohl sie im allgemeinen wirtschaftlich nicht ausführbar sind. Die Blockcopolymere schaffen die besten Ergebnisse und werden bevorzugt, polyäthylenglycol ergibt annehmbare Ergebnisse für ein kommerzielles Verfahren.

Die Wirksamkeit der thrombinmimetisehen Enzyme wird hier in Ausdrücken von Thrombin-Einheiten gegeben, wobei eine Iowa-Einheit Thrombin gleich einer Einheit thrombinmimetisches Enzym ist. Eine Iowa-Einheit Thrombin ist die Menge an Thrombin, welche normales Fibrinogen in 15 Sekunden bei 28°c zur Gerinnung bringt. Die biologische Aktivität oder Wirksamkeit des Faktors VIII wird in Einheiten Faktor VIII gemessen, wobei eine Einheit Faktor VIII die Menge an Faktor VIII ist, welche in 1 ml frisch gezogenem, gesam-meltem Plasma vorkommt. Der Faktor VIII wird wie das thrombinmimetische Enzym in Einheiten gemessen, weil dieses Protein in solchen sehr kleinen Mengen vorkommt, daß das Gewicht und Volumen nicht mit herkömmlichen Laborausrüstungen bestimmt werden kann.

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Die Konzentration des thrombinmimetischen Enzyms, das bei der Zubereitung des von gerinnbarem Fibrinogen freien Faktors VIII verwendet wird, sollte so gering wie möglich gehalten werden. Bei hohen Konzentrationen greift das Enzym den Faktor VIII an und kann in das abschließende Produkt übertragen werden. Das Enzym, wenn es in einen Patienten injiziert wird, wird übermässiges Bluten verursachen, selbst
wenn es das Gerinnen des Fibrinogens in vitro verursacht.
Somit ist die Injektion des Enzyms in einen an Bluterkrankheit leidenden Patienten sehr unerwünscht. Durch Entfernen eines wesentlichen Anteiles des Fibrinogens, bevor das
thrombinmimetische Enzym verwendet wird und das sich ergebende fibrinogen-arme Material konzentriert wird, ist es
möglich, Enzymkonzentrationen zu verwenden, die nicht bemerkenswert die Wirksamkeit des Faktors VIII beeinträchtigen. Die Wirkung des Enzyms scheint katalytisch zu sein, so
daß es selbst in sehr geringen Konzentrationen wirksamst. Die Konzentrationen sollten jedoch angemessen sein, um ein Gerinnen des gesamten gerinnbaren Fibrinogens in der Zumischung innerhalb ungefähr 24 Stunden zu verursachen. Geringere Enzymkonzentrationen ergeben ein vollständiges Gerinnen des Fibrinogens, jedoch sind hierzu einige Tage erforderlich. Der Faktor VIII neigt dazu, seine biologische Aktivität zu verlieren, wenn er für eine zu lange Zeitperiode InL ösung verbleibt. Aus diesem Grund erzeugen extrem geringe Konzentrationen des thrombinmimetischen Enzyms keine ausreichende Ausbeute an Faktor VIII. Auch erlauben übermässige Gerinn-

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zeiten den Wachstum unerwünschter Bakterien in dem Gemisch. Konzentrationen des thrombinmimetischen Enzyms, die wirksam sind, um Fibrinogen innerhalb ungefähr '24 Stunden bei ungefähr 22 C zu gerinnen, ohne wesentlich die Wirksamkeit des Faktors VIII zu beeinträchtigen, sind von ungefähr o,5 Einheiten Enzym bis 3 Einheiten Enzym pro looo mg Fibrinogen und vorzugsweise von ungefähr o, 75 Einheiten Enzym bis 2 Einheiten Enzym pro looo mg Fibrinogen und vorzugsweise von ungefähr q75 Einheiten Enzym bis 2 Einheiten Enzym pro looo mg Fibrinogen. Bei einer Konzentration von o, 15 Einheiten Enzym pro looo mg Fibrinogen erfordert ein Gerinnen ungefähr 4o Stunden, und bei einer Konzentration von 3 Einheiten Enzym pro looo mg Fibrinogen fällt die Ausbeute von Faktor VIII auf ungefähr 5o% ab.

Im allgemeinen sollte die Konzentration . an gerinnbarem Fibrinogen auf weniger als ungefähr o,2 mg gerinnbares Fibrinogen pro Einheit Faktor VIII reduziert werden, bevor das throitibinmimetische Enzym verwendet wird, um das restliche Fibrinogen zu gerinnen. Bei höheren Fibrinogenkonzentrationen werden übermässige Mengen an thrombinmimetischem Enzym bezüglich Faktor VIII erforderlich, um ein Gerinnen innerhalb der gewünschten Zeit durchzuführen, und die Wirksamkeit des Faktors VIII wird beeinträchtigt. Vorzugsweise enthält das an gerinnbarem Fibrinogen arme Faktor VIII Konzentrat weniger als ungefähr o,15 mg Fibrinogen pro

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Einheit Faktor VIII. Frisch gesammeltes Plasma enthält ungefähr 2 mg Fibrinogen pro Einheit Faktor VIII.

Nach der anfänglichen Fibrinogenentfernungsstufe wird das an gerinnbarem Fibrinogen arme wässrige Faktor VIII - Gemisch auf eine Faktor VIII - Wirksamkeit von wenigstens ungefähr 15 und vorzugsweise wenigstens ungefähr 35 Einheiten pro Milliliter konzentriert, um so ein übermässiges Verdünnen des thrombiiunimetischen Enzymes zu vermeiden.

Der Faktor VIII neigt dazu, seine Wirksamkeit zu verlieren, wenn er in der flüssigen Form gelagert und transportiert wird. Demzufolge ist es notwendig, zum Zwecke des Transportes und der Lagerung den Faktor VIII einer Lyophilisation zu unterwerfen. Bislang wurde angenommen, daß es nicht möglich war, den an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII einer Lyophilisation auszusetzen, ohne daß seine Wirksamkeit wesentlich zerstört wird. Gemäß Erfindung stabilisiert die Zugabe von menschlichem Albumin zu dem an gerinnbarem Fibrinogen freiem Faktor VIII - Material den Faktor VIII, so daß er gefriergetrocknet und wiedergebildet werden kann, ohne wesentlich seine Wirksamkeit einzubüssen. Wenigstens ungefähr o,5 Grammprozent menschliches Albumin (g pro looo ml) ist erforderlich, um den Faktor VIII während der Lyophilisation zu stabilisieren. Vorzugsweise ist die Konzentration an humanem Albumin in der an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII-Konzentratlösung wenigstens ungefähr 1 Graran-

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prozent. Größere Mengen an humanem Albumin können bis zu den Grenzen der Löslichkeit dieses Materials verwendet werden; jedoch werden keine Vorteile durch Erhöhen der Menge des menschlichen Albumins erhalten, und die erhöhten Mengen neigen dazu, das Produkt weniger geeignet für Injektionen für Patienten zu machen. Das der Lyophilisation angesetzte Produkt enthält wenigstens ungefähr Io und vorzugsweise wenigstens 2o Einheiten Faktor VIII pro mg menschliches Albumin.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, begrenzen sie jedoch nicht.

Beispiel I

Der Zweck dieses Beispieles besteht darin, die Zubereitung eines fibrinogenfreien Faktor VIII-Konzentrates hoher Wirksamkeit mit Hilfe eines Verfahrens zu zeigen, das für die Verwendung in einem wirtschaftlichen Maßstab geeignet ist.

Ein grobes Fibrinogen enthaltendes flüssiges Faktor VIII-Konzentrat wurde als Ausgangsmaterial ausgewählt. Dieses Faktor Vlll-Konzentrat hat eine Wirksamkeit von 4,7 Einheiten pro ml Faktor VIII, bestimmt durch in vitro-Bioprüfungs verfahren. Die 266 ml-Ausgangsprobe dieses Faktor VIII-

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Konzentrates enthielt 27oo mg Fibrinogen pro loo ml Probe. Das Gesamtgewicht des Fibrinogens in dieser 266 ml-Probe betrug 7 182 mg, wie dies durch herkömmliche in vitro - Bioprüfungsverfahren bestimmt wurde.

Anfängliche Fibrinoqenausfälluna

Der pH-Wert dieser 266 ml-Probe wurde auf einen Wert von 6_#5 eingestellt, und die Temperatur wurde auf ungefähr 22°C gehalten.

Ungefähr 3,5% auf der Basis Gewicht pro Volumen (g pro loo ecm) eines Blockcopolymers wurde zu der Probe des groben Faktor VIII-Konzentrates zugefügt. Das Blockcopolymer war ein Äthylenoxyd-Propylenglycol-Kondensationsprodukt, in dem ungefähr 8o% des Blockcopolymers aus Polyoxyäthylen Einheiten bestand. Der Polyoxypropylen-Anteil des Polymers hatte ein Molekulargewicht von ungefähr 175o. Das Gesamtmolekulargewicht des Copolymers betrug ungefähr 875o. Dieses Material ist im Handel von Wyandotte Chemicals Corp. unter der Bezeichnung "Pluronic F-68" erhältlich. Die das gelöste Blockcopolymer enthaltende sich ergebende Mischung wurde während ungefähr 2ο Minuten gerührt; während dieser Zeit wurde ein Präzipitat gebildet.

Das Präzipitat wurde bei 5ooo g (Schwerkraft bzw. Erdbeschleunicung) während einer Zeit von ungefähr 15 Minuten

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zentrifugiert. Die den Faktor VIII enthaltende überstehende Flüssigkeit wurde wiedergewonnen, und das Präzipitat wurde abgeleitet. Das Präzipitat bestand primär aus Fibrinogen. Proben der sich ergebenden zurückgehaltenen, an Fibrinogen armen überstehenden Flüssigkeit wurden abgezogen und mit Hilfe von in vitro - Bioprüfungsverfahren zwecks Faktor VIII-Wirksamkeit und Fibrinogen-Konzentration analysiert. Die Faktor Vlll-Wirksamkeit wurde mit ungefähr 4,8 Einheiten pro ml ermittelt. Die überstehende Flüssigkeit enthielt ungefähr 2oo mg Fibrinogen. Das Volumen der überstehenden Flüssigkeit, die verblieb, nachdem die Proben zwecks Auswertungszwecke abgezogen wurden, betrug 234 ml.

Anfängliche Faktor VIII-Ausscheiduncr

Der pH-Wert dieser 234 ml - Probe wurde auf einen Wert von ungefähr 6,88 eingestellt. Die Temperatur dieser Probe betrug ungefähr 22°C. Eine Menge des gleichen Blockcopolymers, das vorher verwendet worden ist (Pluronic F-68) und ausreichend ist, um die gesamte Konzentration des Blockcopolymers auf loX auf der Basis von Gewicht pro Volumen (g pro loo ecm) zu bringen, wurde der Mischung zugegeben. Die Mischung wurde während ungefähr 15 Minuten gerührt, während welcher Zeit ein Präzipitat gebildet wurde. Das Faktor VIII enthaltende Präzipitat wurde während 15 Minuten bei 5ooo g zentrifugiert.

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Es befand sich im wesentlichen die gesamte Menge an Faktor VIII und Fibrinogen in diesem Präzipitat. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgeleitet. Die Salzkonzentration der grobes Fibrinogen enthaltenden Faktor Vlll-Probe, die als Ausgangsmaterial in diesem Beispiel verwendet wurde, hatte einen physiologischen Wert von o,15 molares Natriumchlorid. Diese Salzkonzentration blieb während des Verfahrens bis zu diesem Punkt auf ungefähr diesem Wert in der flüssigen Phase. Das aus dieser Stufe wiedergewonnene Präzipitat war sehr reich an Faktor VIII.

Wiederaufaelöster reduzierter Faktor VIII.

Dieses an Faktor VIII reiche Präzipitat wurde in einer zitrathaltigen Salzlösung wieder in Lösung gebracht. (1 Volumenteil von o,1 molarem Natriumeitrat und 4 Teile Volumenteile von ο,15 molarer Natriumchloridlösung.) Das Volumen des wieder in Lösung gebrachten, an reduziertem Faktor VIII reichen Präzipitats betrug 3o ml. Der pH-Wert wurde auf 6,88 eingestellt, und die Temperatur wurde auf einem Wert von ungefähr 22°C gehalten. Die Faktor Vlll-Wirksamkeit, bestimmt durch herkömmliche Bioprüfungsverfahren, betrug ungefähr 5o Einheiten pro ml. Die 3o ml des wiedergelösten reduzierten Präzipitats enthielten ungefähr 2oo ml Fibrinogen .

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Enzymatische Fibrinoaentrennuna.

Das verbleibende Fibrinogen wurde aus dem wiedergelösten reduzierten Präzipitat abgetrennt, indem o, 2 Einheiten eines thrombinmimetischen Enzyms zu dem wiedergelösten reduzierten Präzipitat zugegeben wurde. Diese Enzymkonzentration betrug ungefähr 1 Einheit Enzym zu looo mg Fibrinogen. Das thrombinmimetische Enzym war eine gereinigte Enzymfraktion des Giftes der Malaiischen Pit-Viper, die unter dem Handelsnamen ;Ancrod" von Abbott Laboratories erhältlich ist. Dieses Enzym aktiviert nicht den Faktor VIII, so daß der Faktor VIII seine Wirksamkeit behielt. Eine feste Masse (Klümpchen) bildete sich in der sich ergebenden Mischung in ungefähr 24 Stunden. Die sich ergebende Masse wurde bei 5ooo g während ungefähr 2o Minuten zentrifugiert, und die an Faktor VIII reiche überstehende Flüssigkeit wurde wiedergewonnen. Das gesamte gerinnbare Fibrinogen wurde in der festen Masse entfernt. Es wurde etwas Wirksamkeit des Faktors VIII in dieser Stufe verloren, jedoch war der Verlust geringer als ungefähr loX und als nicht bemerkenswert bezeichnet.

Fibrinoaenfreies Faktor Vlll-Präzipitat.

Der pH-Wert des an Faktor VIII reichen und fibrinogenfreien Konzentrats wurde geprüft, um zu gewährleisten, daß er auf einem Wert von 6,88 blieb. Das oben beschriebene Block-

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copolymer (Pluronic F-68) wurde zu der fibrinogenfreien überstehenden Flüssigkeit zugesetzt. Die Menge des Blockcopolymers war ausreichend, um die Konzentration des Blockcopolymers in der überstehenden Flüssigkeit auf einen Wert von loX auf der Basis Gewicht pro Volumen (g pro loo ecm) zu bringen. Die das gelöste Blockcopolymer enthaltende Mischung wurde während ungefähr 2o Minuten bei einem pH-Wert von 6,88 und einer Temperatur von ungefähr 22°C gerührt. Ein Faktor VIII enthaltendes Präzipitat wurde gebildet, das aus der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren der Mischung bei 5ooo g während ungefähr 26 Minuten abgetrennt wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgeschieden.

Wieder in Lösung gebrachter Faktor VIII.

Das sich ergebende Faktor Vlll-Präzipitat wurde in 1 ml zitrathaltiger Salzlösung wieder in Lösung gebracht, welche die obenbeschriebene Zusam mensetzung aufweist« und die sich ergebende Lösung wurde weiterhin für Untersuchungszwecke auf ein Gesamtvolumen von 8 ml verdünnt. Um die Wirksamkeit des Faktors VIII .während der Lyophilisation aufrecht zu erhalten, wurde 1 Gew. % (g pro loo ecm) Humanalbumin zugesetzt. Dieses 8 ml - Volumen des stabilisierten Faktor VIII-Konzentrates enthielt kein gerinnbares Fibrinogen,

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wie dies durch herkömmliche in vitro - Bioprüfungsverfahren bestimmt worden war.

Ausbeute.

Das grobes Fibrinogen enthaltende Faktor VIII - Konzentrat Ausgangsmaterial enthielt 125o Einheiten Faktor VIII, und das abschließende konzentrierte an Fibrinogen freie Produkt enthielt 975 Einheiten Fakbor VIII als Ausbeute von 78X. Ein Teil des Faktors VIII ging in den Bioprüfungsverfahren verloren, die an verschiedenen Punkten der Trennung des fibrinogenfieien Faktor VIII-Konzentrates hoher Wirksamkeit durchgeführt wurden. Unter Vernachlässigung der Verluste auf Grund des Abziehens von Proben für Prüfungszwecke war die Ausbeute ungefähr 9o%. Eine Ausbeute dieser Größenordnung in einem kommerziellen Betrieb ergibt eine Konservierung des Rohmaterials, das von humanen Spendern erhalten werden muß und in geringem Vorrat ist. Im Betrieb auf wirtschaftlicher Basis würde das Ausgangsmaterial ein Volumen von wenigstens Io 1 mit einer Wirksamkeit des Faktors VIII von annähernd 4,7 Einheiten pro ml haben.

Lyophilisation zum Lagern und Transport.

Die Salzkonzentration wurde auf o,15 molares Natriumchlorid eingestellt, und das Produkt wurde der Lyophilisation aus-

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gesetzt. Es wurde gefunden, daß nach Wiederbildung das der Lyophilisation ausgesetzte Produkt seine Wirksamkeit beibehalten hatte und für die Anwendung bei den Patienten geeignet war. Es verblieb keine Spur an thrombinmimetischem Enzym in dem Produkt. Das Lyophilisationsverfahren erforderte ungefähr 36 Stunden. Die Dauer des Verfahrens ausschließlich der Lyophilisation erforderte ungefähr 32 Stunden. Mit Ausnahme der Lyophilisation wurde das Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt.

Beispiel II

Es wurde Beispiel I unter Verwendung von Natriumchloridkonzentrationen zwischen o,25 und o,o5 molarem Natriumchlorid wiederholt und ergab zufriedenstellende Ausbeuten an Faktor VIII.

Ein Wiederholen des Beispiels 1 unter Verwendung des Blockcopolymers geringeren Molekulargewichtes, das unter der Bezeichnung "Pluronic F-38" angegeben und oben beschrieben ist, schafft ausreichende Ausbeuten. Im allgemeinen sind die Konzentrationen des Blockcopolymers ungefähr o,5 g X höher als für Pluronic F-68, so daß bei der anfänglichen Fibrinogen-Ausscheidung eine Konzentration von 4 g % angewendet und bei der Faktor VIII-Ausfellung eine Konzentration von ungefähr 12 g % angewendet wird.

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Ein Wiederholen der Lyophilisations-Verfahren nach Beispiel I ergab die Zubereitung eines der Lyophilisation unterworfenen Mittels, das, wenn es in einer Ampulle mit einer Kapazität von 1 ml angeordnet wird, mit 1 ml sterilen Wassers wiedergewonnen werden kann, um so ein injizierbares Faktor VIII-Konzentrat zu erzeugen. Das Lyophilisationsverfahren wird mit aufeinanderfolgenden Proben wiederholt, welche unterschiedliche Faktor VIII - Wirksamkeiten haben, so daß die wiedergebildete 1 ml Lösung entsprechend 3oo, looo und 25oo Einheiten Faktor VIII enthält,(entsprechend 3o, loo und 25o Einheiten Faktor VIII pro mg humanen Albumins.)

Jedes Material ist zum Injizieren bei einem an Bluterkrankheit leidenden Patienten geeignet. Auf Grund der Abwesenheit von Fibrinogen sind diese Materialien für intramuskuläre Injektion geeignet.

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Claims

■.4-It InaohqereichtI BERLIN 33 · ' 8 MÜNCHEN It Auguata-Viktorlt-SlnO· 05 p. Dl ICPUI/C 0 DADTKICD Pianzwiauardra··3 P.t.-Anw. Df. Ing. Ruschke UT. KUO^IIiSfc Ct ΓΑΚΙΙΝΕΚ Pat.-Anw.Otpl.-lng. PATENTANWÄLTE j τ·ι·ίοη:<Β0/J*»* BERLIN - MÜNCHEN T#Ulo": m' «·««· T»l«flr»mm-Adr»«»e: '""■" ™ Quadratur Berlin Quadratur TELEX: 183786 TELEX: 5»7t7 München, den 21, 1. 77 W 8ol/Ro/.le William L. Wilson, Venice, Kalifornien / V. St. A. Rodger L. Bick, Los Angeles, Kalifornien / V. St. A. Lajos F. Fekete, Costa Mesa, Kalifornien /V. St. A. Patentansprüche

1. Verfahren zum Zubereiten eines Faktor VIII-Produktes, dadurch Gekennzeichnet, daß ein an gerinnbarem Fibrinogen armes Faktor VlII-Konzentrat, das weniger als annähernd o_f2 mg gerinnbares Fibrinogen pro Faktor VIII - Einheit enthält, mit von ungefähr o,5 bis 3 Einheiten pro looo mg gerinnbares Fibrinogen eines thiombinmimetischen Reagenzes gemischt wird, das nicht wesentlich die Wirksamkeit dieses Faktors VIII beeinträchtigt, daß das cerinnbare Fibrinogen ein Klümpchen in der sich ergebenden Mischung bilden kann und daß dieses Klümpchen von der sich ergebenden Mischung getrennt wird und ein an gerinnbarem Fibrinogen freies Faktor VIII - Konzentrat wiedergewonnen wi rd.

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2. Verfahren zum Zubereiten eines Faktor VIII - Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch ausgewählt wird, welches gerinnbares Fibrinogen und Faktor VIII enthält, daß das meiste Teil des gerinnbaren Fibrinogens aus der Mischung entfernt wird, um ein an gerinnbarem Fibrinogen armes Faktor Vlll-Produkt zu bilden, daß dieses Produkt konzentriert wird, um ein Konzentrat zu bilden, daß diesem Konzentrat eine Menge an thrombinmimetrischem Reagenz zugemischt wird, die ausreichend ist, um das gesamte Fibrinogen in dem Konzentrat innerhalb annähernd 24 Stunden gerinnen zu lassen, ohne die Wirksamkeit des Faktors VIII bemerkenswert zu beeinträchtigen, daß dieses gerinnbare Fibrinogen einen Klumpen bilden kann, daß dieser Klumpen abgetrennt wird und ein an gerinnbarem Fibrinogen freies Faktor VIII - Konzentrat zurückbehalten wird, daß diesem an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII-Konzentrat eine Menge an humanem Albumin zugemischt wird, die ausreichend ist, um diesen Faktor VIII zu stabilisieren, und daß der sich ergebende stabilisierte Faktor VIII einer Lyophilisation unterworfen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ungefähr 9o% des gerinnbaren Fibrinogens aus der Mischung entfernt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das an gerinnbarem Fibrinogen arme Faktor Vlll-Produkt

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auf eine Faktor VIII - Wirksamkeit von wenigstens annähernd 15 Einheiten konzentriert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einer Temperatur von ungefähr 15 bis 35°C durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einer Salzkonzentration von ungefähr o,o5 bis o,25 molares Natriumchlorid ausgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einem pH-Wert von ungefähr 6,ο bis 8,ο durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der sich ergebende stabilisierte Faktor VIII einer Lyophilisation unterworfen wird, um ein lyophilisiertes Produkt zu erzeugen, das wenigstens ungefähr 2o Einheiten Faktor VIII pro Milligramm humanes Albumin enthält.

9. Verfahren zum Lyophilisieren eines an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII - Konzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige flüssige Mischung des Faktor VIII-Konzentrages und wenigstens ungefähr o,5% humanes Albumin

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auf der Basis von Gewicht pro Volumen zubereitet wird, und daß diese wässrige flüssige Mischung einer Lyophilisation unterworfen wird.

10. Lyophilisiertes, an gerinnbarem Fibrinogen freies Faktor VIII - Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es einen an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII und humanes Albumin umfaßt, und daß es wenigstens ungefähr Io Einheiten Faktor VIII pro Milligramm Albumin enthält.

11. Produkt nach Anspruch Io, dadurch gekennzeichnet, daß es an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII und humanes Albumin umfaßt und daß es wenigstens annähernd loo Einheiten Faktor VIII pro Milligramm Albumin enthält.

12. Produkt nach Anspruch Io, dadurch gekennzeichnet, daß es einen an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII und menschliches Albumin umfaßt und daß es wenigstens annähernd 25o Einheiten Faktor VIII pro Milligramm Albumin enthält.

13. Produkt nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, daß es an gerinnbarem Fibrinogen freien Faktor VIII und wenigstens ungefähr o,5 % humanes Albumin auf der Basis Gewicht pro Volumen enthält.

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14. Verfal·ren zum Zubereiten eines Faktor VIII - Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß ein an gerinnbarem Fibrinogen armes Faktor VIII-Konzentrat, welches weniger als annähernd o,2 mg geiinnbares Fibrinogen pro Einheit Faktor VIII enthält, mit von ungefähr o,5 bis 3 Einheiten pro looo mg gerinnbares Fibrinogen eines thrombinmimetischen Reagenzes gemischt wird, welches nicht bemerkenswert die Wirksamkeit des Faktors VIII beeinträchtigt, daß das gerinnbare Fibrinogen ein IGümpchen in der sich ergebenden Mischung bilden kann, daß dieses Klümpchen von der sich ergebenden Mischung getrennt wird und ein an gerinnbarem Fibrinogen freies Faktor VIII - Konzentrat wiedergewonnen wird, daß diesem von gerinnbarem Fibrinogen befreiten Faktor VIII-Konzentrat wenigstens ungefähr o,5 % Humanalbumin auf der Basis Gewicht pro Volumen zugegeben wird, um diesen Faktor VIII zu stabilisieren, und daß das sich ergebende stabilisierte Faktor VIII - Konzentrat einer Lyophilisation unterworfen wird.

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