DE2029455C3 - Verfahren zur Herstellung eines neuen Prothrombinkomplexes - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines neuen ProthrombinkomplexesInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Prothrombin-Komplexes,
der die Koagulations-Faktoren Prothrombin (Faktor II), Proconvertin (Faktor VtI), den
antihaemophilen Faktor B (Faktor IX) und den Stuart-Prower-Faktor (Faktor X) enthält.
Die Gerinnung des Blutes ist ein komplizierter physiologischer Vorgang, bei dem zahlreiche, in
normalem gesundem Blut anzutreffende Substanzen zusammenwirken. Es ist bekannt, daß bei bestimmten
Menschen einige, zur Blutgerinnung beitragende Faktoren fehlen oder nur in unzureichender Menge
vorhanden sind. Eine dieser Substanzen ist der antihaemophilen Faktor B (Faktor IX), der auch als
Plasmathromboplastin-Komponente (I'I'C) oder als
Christmas-Faktor bekannt ist. Bei Personen, die unter
congcnilalcr Haemophilie (Hacmophilic B) leiden, fehlt
dieser Faktor vollständig oder teilweise.
Andere, für die Blutgerinnung ebenfalls wichtige Faktoren sind die Faktoren II, VII und Xr Auch diese
Faktoren können, wie der Faktor IX, bei bestimmten Personen teilweise oder vollständig fehlen.
Zur Behandlung von Patienten, die unter einem Mangel an diesen Faktoren leiden, ist bekanntlich ein
Plasmakonzentrat sehr geeignet, das einige oder alle der genannten Faktoren enthält So wird z. B. in der
USA--Patentschrift 29 99 791 die Herstellung eines Prothrombin-Komplexes aus frischem Plasma durch
Bariutnsulfat-Adsorption beschrieben, und nach der
.Veröffentlichung von SouIier et al. in »La Presse
Medicale«, Band 72, Seiten 1223-1228 (1964), kann
dieser Komplex aus frischem Plasma durch Tricalciumphosphat-Adsorption gewonnen werden. In »Brit j.
is Haemat«, Band 13, Seiten 568—580 (1967), wird die
Herstellung eines Prothrombin-Komplexes aus einer, als G7 bezeichneten Fraktion, die reich an Globulinen
ist, beschrieben. Diese GrFraktion wird nach Bidwell
durch Alkohol-Ausfällung von Plasma erhalten und dann weiter fraktioniert, um durch Tricalciumphosphat-Adsorption
und Behandlung mit Diethylether bei niedrigen Temperaturen einen Prothrombin-Komplex
zu gewinnen. Weiterhin ist aus der NL-Patentanmeldung 68-06 162 ein Verfahren zur Herstellung eines
AH F-Konzentrates bekannt, bei welchem als Ausfällungsmittel
bei der Fraktionierung Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20 000
verwendet wird.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung eines Prothrombin-Komplexes.
Weiterhin soll ein neuer Prothrombin-Komplex mit hoher Wirksamkeit geschaffen werden, der intravenös
und intramuscular injiziert werden kann.
Unter der Bezeichnung »Prothrombin-Komplex« ist ein Konzentrat von Blutproteinen zu verstehen, das zur Blutgerinnung beiträgt und im wesentlichen aus den Faktoren II, VII, IX und X bestehi.
Unter der Bezeichnung »Prothrombin-Komplex« ist ein Konzentrat von Blutproteinen zu verstehen, das zur Blutgerinnung beiträgt und im wesentlichen aus den Faktoren II, VII, IX und X bestehi.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Prothrombin-Komplexes, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) eine Cohn-Plasmafraktion, ausgewählt aus der Gruppe von II + Hl, III. III-0, IV-I+IV-4, in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert,
b) im Falle der Verwendung einer Cohn-Plasmafraktion III oder IH-O die Kochsalz-Suspension einer Ausfällungsstufe mit Polyäthylenglykol eines Molekulargewichts von 200 bis 20000 bei einem pH-Wert von 4,6 bis 5,2 und einer Polyäthylenglykolkonzentration von 1,5 bis 33% aussetzt, wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird,
a) eine Cohn-Plasmafraktion, ausgewählt aus der Gruppe von II + Hl, III. III-0, IV-I+IV-4, in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert,
b) im Falle der Verwendung einer Cohn-Plasmafraktion III oder IH-O die Kochsalz-Suspension einer Ausfällungsstufe mit Polyäthylenglykol eines Molekulargewichts von 200 bis 20000 bei einem pH-Wert von 4,6 bis 5,2 und einer Polyäthylenglykolkonzentration von 1,5 bis 33% aussetzt, wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird,
c) den pH-Wert der nach a) oder b) erhaltenen Suspension auf 6,8 bis 7,2 einstellt, die überstehende
Flüssigkeit zur Adsorption der Koagulationsfakto-
κ ren sorgfältig mit 03 bis 2 Gew.-% tribasischem
Calciumphosphat, bezogen auf die Suspension, vermischt,
d) die adsorbiertes Protein enthaltende Tricalciumphosphatausfällung
sorgfältig mit 0,05-M- bis 0,2-M-Trinatriumcitrat vermischt, wobei die erhaltene
Suspension '/10 bis '/200 des Volumens der Ausgangssuspension beträgt,
c) die so erhaltene überstehende Flüssigkeit gewinnt und diese zweimal mit Polyäthylenglykol eines
ft1· Molekulargewichts von 200 bis 20 000 ausfällt,
zuerst bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,0 und einer
l'olyälhylenglykolkonzerilration von 5% bis 10%
unter Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit
und dann bei einem pH-Wert von 5,0 bis 5,4 und
einer Polyälhylenglykolkonzentration von wenigstens 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gewicht
der überstehenden Flüssigkeit,
f) die so erhaltene Ausfällung als aktiven Prothrom- s
bin-Komplex gewinnt, worauf
g) dieser bis zu einem Volumen von '/25 bis </io des
Volumens der ursprünglichen Cohn-Plasmafraktionsuspension
in citratisierter Kochsalzlösung suspendiert wird.
Diese Cohn-Praktionen sind im wesentlichen «-, ß-
und/oder y-GIobulin-Fraktionen von Blutplasma und
werden durch aufeinanderfolgende Ausfällungen mit kaltem Äthanol erhalten; eine genaue Beschreibung
dieser Fraktionen ist dem Band 68 des »]. Am. Chem. Soc.«, Seiten 495—575 (1946) zu entnehmen.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäBen
Verfahrens ist darin zu sehen, daß die als Ausgangsmaterial verwendeten Cohn Plasmafraktionen sowohl aus
überaltertem wie aech aus frischem Plasma gewonnen
werden können. So kann also eine sonst zu verwerfende,
überalterte Plasmafraktion als Ausgangsmaterial für das
erfindungsgemäße Verfahren dienen.
Wie bereits oben angedeutet worden ist, wird in der
niederländischen Patentanmeldung 68-06 162 ein Verfahren zur Herstellung eines AHF-Konzentrates beschrieben,
bei welchem als Ausfällungsmittel ebenfalls Polyäthylenglykol verwendet wird. AHF unterscheidet
sich jedoch von dem erfindungsgemäß herzustellenden Prothrombin-Komplex, welcher aus den Faktoren II,
VII, IX und X besteh», erheblich. In der DE-OS 23 24 717
wird sogar beschrieben, daß der Prothrombin-Komplex für AHF. welches den Faktor VIII enüiält, schädlich ist
In M.S. Sirridge, »Laboratory Evaluation of
Hemostasis« (1974) ist auf Seite 7 beseht eben, daß die 4 Prothrombin-Komplexfaktoren bezüglich ihres Molekulargewichtes
und der Proteinart von AHF stark verschieden sind. Nur die Faktoren VII und IX sind
Beta-Globuline und sie haben ein erheblich geringeres
Molekulargewicht als das des Faktors VIII mit 196 000. Es war von daher gesehen überraschend, daß die
Ausfällung des von AHF so verschiedenen Prothrombin-Komplexes ebenfalls mit Polyäthylenglykol unter
genauer Einhaltung der oben angegebenen Bedingungen gelingt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Cohn-Plasmafraktion, vorzugsweise eine Fraktion IV-I,
in einer normalen physiologischen Kochsalzlösung (ca. 0,9% Kochsalz) suspendiert, der pH-Wert auf 6,8 bis 7,2
eingestellt und (ribasisches Calciumphosphat sorgfältig mit der Suspension vermischt, um die Koagulationsfaktoren
zu adsorbieren. Die so erhaltene, adsorbiertes Protein enthaltende tribasische Calciumphosphat-Ausfällung
wird dann sorgfältig mit 0,05-M- bis 0,2-M-Trinatriumcitrat
vermischt, worauf die überstehende Flüssig- v> keit, die die gewünschten Koagulationsfaktoren enthält,
gewonnen wird. Die überstehende Flüssigkeit wird, vorzugsweise nach Zugabe eines Abtrennungsmittels
für Calciumioncn, zweimal mit Polyäthylenglykol ausgefällt: zuerst bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,0 und M)
bis zu einer Konzentration von 5 Gcw.-% bis lö Gcw.-% Polyäthylenglykol, wobei die überstehende
Flüssigkeit gewonnen wird, und dann bei einem pH-Wert von 5.0 bis 5,4 und bis zu einer Konzentration
des Polyäthylenglykols von wenigstens 20 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gewonnenen überstehenden
Flüssigkeit, wobei die Ausfällung zurückbehalten wird. IJiesc Ausfüllung, die den aktiven Prothrombin-Komplex
enthält, wird dann vorzugsweise in eitralisierter
Kochsalzlösung suspendiert, bis ein Volumen von 1/25 bis 1/10 des Volumens der ursprünglichen Cohn-Plasmafraktion-Suspension
erreicht worden ist.
Sobald das Ausgangsmaterial nach den erfindungsgemäßen Verfahren suspendiert worden ist, erfolgt die
Adsorption der Koagulationsfaktoren, indem man den pH-Wert der Suspension auf 6,8 bis 7,2 einstellt und
anschließend eine kleine Menge tribasisches Calcwmphosphat
zusetzt Das erfindungsgemäß verwendete tribasische Calciumphosphat ist ein polymeres Material
der Formel
10CaOaP2O5H2O
Ca,o(OH)2(P04)6.
Ca,o(OH)2(P04)6.
Durch Verwendung von 0,5 bis 2 Gew.-% tribasischem
Calciumphosphat kann eine gute Adsorption der Koagulationsfaktoren erzielt werden; eine Konzentration
von etwa 1 Gew.-% wird bevorzugt Eine maximale Adsorption der Koagulationsfaktoren wird erzielt,
wenn sich das tribasische Calciumphosphat etwa 15 bis etwa 30 Minuten mit der Suspension vermischen kann.
Die adsorbiertes Protein enthaltende tribasische Calciumphosphat-Ausfällung wird dann durch Zentrifugieren
abgetrennt und in Trinatriumcitrat suspendiert wobei das Volumen der so erhaltenen Suspension V10
bis etwa '/200 des Volumens der Ausgangs-Suspension beträgt Eine wäßrige Lösung aus bis zu etwa
0,005-molarem Trinatriumcitrat kann zum Auswaschen der gegebenenfalls anwesenden verunreinigenden Proteine
verwendet werden, während die Koagulationsfaktoren mit 0,05- bis 0,2molarem Trinatriumcitrat aus dem
tribasischen Calciumphosphat-Adsorbierungsmittel ausgewaschen werden. Die Ausfällung wird vorzugsweise
in dem Trinatriumcitrat suspendiert, wobei etwa 15 bis etwa 30 Minuten ständig gerührt wird, um eine
maximale Auswaschung (Eluierung) der verunreinigenden Proteine und der gewünschten Kqrgulationsfaktoren
zu erzielen. Diese Substanzen werden vorzugsweise durch Zentrifugieren unter ständigem Rühren von den
Tricalciumphosphat-Teilchen getrennt.
Nach Entfernung der tribasischen Calciumphosphat-Ausfällung wird der Lösung vorzugsweise ein Abtrennungsmittel
für Calciumionen zugesetzt z. B. das Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure. Vorzugsweise
werden auf je 11 Lösung etwa 3 bis 4 g des Dinatriumsalzes von Äthylendiamintetraessigsäure
(0,01 M) verwendet
Das erfindungsgemäß als Ausfällungsmittel verwendete Polyäthylenglykol ist ein Polymerisat mit hohem
Molekulargewicht, das im allgemeinen durch Umsetzung von Äthylenoxyd mit Äthylenglykol oder Wasser
hergestellt wird und folgende Strukturformel aufweist:
In dieser Formel steht η für die durchschnittliche Anzahl
der Oxyäthylengruppen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sollte dieses Polyäthylenglykol nicht toxisch
sein, und sein Molekulargewicht kann zwischen etwa 2ÖÖ und etwa 20 000 liegen, vorzugsweise zwischen
etwa 400 und etwa 6000. Bevorzugt wird PEG 4000, ein Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von etwa 4000. Die Ausfällung mit diesen Polyäthylenglykolen erfolgt vorzugsweise bei Zimmertemperatur,
d. h. etwa 25°.
Nachdem zweimal hintereinander mit Polyäthylenglykol ausgefällt worden ist, wird die erneut suspendier-
te Polyäthylenglykol-Ausfällung, die den aktiven Prothrombin-KompIex
enthält, zur Erhaltung eines praktisch trockenen Produktes vorzugsweise lyophilisiert,
nachdem zuerst ein Koagulations-Schutzmjttel, z.B.
Heparin, in einer Menge von etwa 1 bis etwa 10 Einheiten pro ecm (U, S. Pharmacopeia-Einheiten)
zugegeben, der pH-Wert auf etwa 6,8 gebracht und filtriert wurde, um unerwünschte Teilchen zu entfernen
und gleichzeitig ein steriles Produkt ohne Erhitzen zu erhalten. Das trockene, lyophilisierte Produkt ist stabil
und kann vor der Verwendung bei intravenösen, süibcutanen oder intramusculären Injektionen mit
Wasser rekonstituiert werden. Durch intravenöse, subcutane oder intramusculäre Verabfolgung des
Prothrombin-Komplexes läßt sich vorübergehend der Gehalt an Faktoren H, VH, IX und X bei Personen,
denen diese Faktoren fehlen, korrigieren; außerdem können durch diese Injektionen Blutungen zum
Stillstand gebracht und/oder zu erwartende Blutungen verhindert werden, z. B. Blutungsstörungen bei Leberkrankheiten
oder haemorrhagische Erkrankungen bei Neugeborenen.
Wenn das erfindungsgemäß verwendete Ausgangsmaterial unlösliche Teilchen, Plasminogen oder Lipide,
enthält, wie z. B. bei den Cohn-Plas· .afraktionen III und
HI-O, so muß nach Suspendierung des Ausgangsmaterials, z. B. eine Cohn-Plasmafraktion-III-Paste, gleich zu
Beginn des Verfahrens eine zusätzliche Ausfällungsstufe mit Polyäthylenglykoi eingeschoben werden. Sobald
eine Suspension erhalten worden ist, wird der anfängliche pH-Wert von etwa 5,4 auf 4,6 bis 5,2,
vorzugsweise etwa 4,8, gesenkt, Polyäthylenglykoi bis zu einer Konzentration von 1,5 bis 3,5, vorzugsweise 2,5
Gew.-%, zugegeben und die Suspension zentrifugiert. Durch dieses Ausfällungsverfahren werden die obengenannten,
unerwünschten Stoffe und verschiedene andere verunreinigende Proteine, die aus der vorhergehenden
Fraktionierung stammen, entfernt.
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes alkalisches Reaktionsmittel zur Regelung des pH-Wertes ist eine
wäßrige Lösung von etwa 1-N-Natriumhydroxyd. Anstelle von Natriumhydroxyd kann jedoch z. B. auch
Natriumbicarbonat verwendet werden. Wird zur Regelung des pH-Wertes Säure benötigt, so wird eine
wäßrige Lösung von etwa 1-N-Salzsäure bevorzugt.
Die nachstehenden Beispiele- dienen zur Erläuterung
des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wenn nicht anders angegeben, verstehen sich alle genannten Teile und
Prozentsätze auf einer Gewichts-Volumen-Basis (Gewicht/Volumen).
Eine Cohn-Plasmafraktion IV-I wurde in normaler
physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 10% (Gewicht/Volumen) suspendiert und mit
1-N-NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 gebracht. Dann wurden 500 g tribasisches Calciumphosphat zu 501
dieser Suspension der Fraktion IV-I gegeben, und die Mischung wurde etwa 30 Minuten gerührt. Die
Suspension wurde anschließend zentrifugiert und die Oberstehende Flüssigkeit verworfen. Die zurückbehaltene
Ausfällung wurde in 0,1-M-Trinatriumcitrat bis zu einem Volumen von 51 suspendiert. Die Suspension
wurde erneut zentrifugiert und die Ausfällung wurde verworfen. Dann wurde der pH-Wert der gewonnenen
überstehenden Flüssigkeit (etwa 5 I) mit 1 -N-HCI auf 7,2 gebracht; es wurde Polyäthylenglykoi 4000 bis zu einer
Konzentration von 5% zugegeben und die so erhaltene Suspension etwa 30 Minuten gerührt. Die Suspension
wurde durch Zentrifugieren geklärt, wobei die überstehende Flüssigkeit behalten und die Ausfällung verworfen
wurde. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde mit 1-N-HCI auf 5,2 gebracht, und dann wurden
Polyäthylenglykoi 4000 zugegeben, bis eine Konzentration von 20% erhalten worden war. Die Suspension
wurde zentrifugiert und die gewonnene Ausfällung in citratisierter Kochsalzlösung (1 Teil 0,1-M-Trinatriumcitrat
auf 4 Teile 0,9% Natriumchlorid) bis zu einem Volumen von 2 bis 51 gelöst; dieses Volumen entsprach
'/25 bis Vio des Volumens der ursprünglichen Suspension
der Fraktion IV-I. Es wurde nun Heparin in einer Menge von 1 Einheit pro ecm zugesetzt, und die Lösung
wurde geklärt und sterilisiert, indem sie durch eine Kombination von Membranfiltern mit abgestufter
Porengröße geleitet wurde. Dann wurde die Lösung unter aseptischen Bedingungen in sterile Flaschen eines
Fassungsvermögens von 10 ecm bis 30 ecm gefüllt, gefriergetrocknet und verschlossen. Das gefriergetrocknete
Material kann mit sterilem Wasser rekonstruiert und dann durch intravenöse, subcutane oder intramusculäre
Injektion Patienten verabreicht werden, die an einem Mangel der genannten Koagulaticnsfaktoren,
insbesondere des Faktors IX, leiden. Die Faktor-IX-Wirksamkeit
des so erhaltenen Produktes beträgt etwa das 20fache eines gleichen Volumens an normalem
Gesamtplasma und ist, verglichen mit normalem Gesamtplasma, in etwa '/ie der Prnteinmenge enthalten.
Eine Cohn-Plasmafraktion-III-Paste aus frischem Plasma wurde in 0,85%iger Kochsalzlösung bis zu
einem Volumen suspendiert, das 1A des Volumens des
ursprünglichen Plasmas entsprach, und dann bis zur Erzielung einer homogenen Suspension gerührt. Der
pH-Wert wurde mit einer wäßrigen Lösung von 1-N-Salzsäure auf 4,8 gebracht. Darauf wurde die
Suspension zentrifugiert, und zu der gewonnenen überstehenden Flüssigkeit wurde Polyäthylenglykoi
(PEG 4000) bis zu einer Konzentration von 2,5% gegeben. Nachdem 30 Minuten vermischt worden war,
wurde die Suspension zentrifugiert, und der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde mit 1-N-NaOH auf
7,0 gebracht Dann wurde tribasisches Calciumphosphat (N.F.) zu der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer
Konzentration von 1% gegeben. Die so erhaltene tribasische Calciumphosphat-Ausfällung wurde in 0,005-M-Trinatriumcitrat
suspendiert, bis das Volumen '/200
so des Volumens der ursprünglichen Cohn-Fraktion-III
betrug. Nachdem 30 Minuten bei 5° gemischt worden war, wurde die Suspension zentrifugiert, u:n die
unerwünschten Verunreinigungen zusammen mit der überstehenden Flüssigkeit zu entfernen. Die zurückbehaltene
Ausfällung wurde in 0,2-M-Trinatriuincitrat bis
zu einem Volumen von '/200 der ursprünglichen Cohn-Fraktion-III suspendiert Die Suspension wurde
erneut 30 Minuten bei 5° gemischt und dann zentrifugiert um die tribasischen Calciumphosphatteil-
so chen zu entfernen. Das Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure
wurde zu der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Molarität von 0,01 in bezug auf
das Dinatriumsalz der Athylendiamintetraessigsäure gegeben, und dann wurde der pH-Wert mit 2-N-Essigsäure
auf 6,8 gebracht. Es wurde soviel PEG 4000 zugesetzt, daß die abschließende Konzentration 10%
betrug. Die sich bildende Ausfällung wurde verworfen. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde auf
5,2 gebracht, und es wurde PEG 4000 bis zu einer Konzentration von 20% zugesetzt. Die Suspension
wurde zentrifugiert und die gewonnene Ausfällung in citratisierter Kochsalzlösung (1 Teil 0,1-M-Natriumcitrat
auf 9 Teile einer 5%igen Natriumchloridlösung) bis zu einem Volumen gelöst, das 40 Einheiten des Faktors
IX pro ecm lieferte. Der pH-Wert wurde mit 1-N-Natriumhydroxyd auf 6,8 gebracht. Dann wurde
Heparin in einer Menge von 3 Einheiten pro ecm zugegeben, und die Lösung wurde filtriert, indem sie
durch eine Reihe von Millipore-Filtern mit abgestufter Porengröße geleitet wurde. Die Lösung wurde unter
aseptischen Bedingungen in sterile 100-ccm-Glasflaschen
gegeben, wobei in jede Flasche 20 ecm Lösung gefüllt wurden. Nach dem Gefrieren (shell-freezing) und
dem Gefriertrocknen unter aseptischen Bedingungen wurden die Flaschen im Vakuum mit sterilen Verschlüssen
versehen. Das so erhaltene trockene Produkt kann pro Einheit mit jeweils 20 ecm sterilem Wasser
aufgefüllt und dann für intravenöse oder intramusculäre
Injektionen verwendet werden.
Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei jedoch die Cohn-Plasmafraktion-Ill nicht aus
frischem, sondern aus überaltertem Plasma gewonnen wurde. Das von einer Blutbank erhaiiene Plasma war 2
Wochen bis 2 Monate alt und bis zu 9 Wochen bei — 25°C gelagert worden, bevor es entsprechend dem
Verfahren des Beispiels 1 verarbeitet wurde. Der auf diese Weise erhaltene Prothrombin-Komplex wurde
nach der Auffüllung mit sterilem Wasser wie folgt analysiert:
a) Gehalt an Faktor II: Die Prothrombin-Wirksamkeit der Lösung wurde gemäß den Verfahren von
Ware und S e e g e r s, »Am. J. Clin. Pathol.«, Band
19, Seiten 471-482 (1949), und Wagner et al.,
>>Blood Coagulation, Hemorrhage and Thrombof.is«,
T ο c a η t i η s und K a ζ a I, herausgegeben von Grüne and Stratton, New York, Seiten 159-165
(1964), bestimmt.
b) Gehalt an Faktor IX: Die Lösung wurde gemäß
dem mit Kaolin aktivierten Teilthromboplastin-Zeitkorrektur-Verfahren
in »Hyland Reference Manual of Coagulation Procedures«, erschienen von den Hyland Laboratories, Los Angeles, Ca.,
, Seite 19-21 (2. Aufl., 1964), auf PTC Wirksamkeit
untersucht.
c) Thrombin-Wirksamkeit: Die Anwesenheit von Thrombin wurde ermittelt, indem die Verklumpungszeit
von recalcifiziertem normalem Plasma
ίο bei verschiedenen Verdünnungen gemäß dem
Verfahren von Bidwell und Dike, »Treatment "'■
Hemophilia and Other Coagulation Disorders«, bearbeitet von Biggs und MacFarlane,
herausgegeben durch F. A. Davis Co., Philadelphia, Seiten 62-69(1966), bestimmt wurde.
d) Gesamt-Proteingehalt: Der Gesamt-Proteingehalt wurde durch Ultraviolett-Adsorption bei einer
Wellenlänge von 280 ιτιμ bestimmt.
Die obigen Verfahren ergaben. ύ»ύ tier Prothrombin-Komplex
dieses Beispiels keine Thrombin-Wirksamkeit zeigte und im Durchschnitt etwa 8 mg Protein pro tem
enthielt. D;o durchschnittliche Faktor-IX-Wirksamkeit
der Proben betrug etwa das 20- bis 40fache eines gleichen Volumens an normalem Gesamtplasma, und
auch für durchschnittliche Faktor-Il-Wirksamkeit war
etwa 5- bis 15mal so groß wie die eines gleichen Volumens an Gesamtplasma. Da normales Gesamtplasma
tiwa 70 mg Protein pro ecm enthält, ist die
Faktor-IX-Wirksamkeit des Prothrombin-Komplexes
M> dieses Beispiels in einer Protein-Menge enthalten, die
nur etwa '/200 bis '/400 der Proteinmenge entspricht, die
bei normalem Plasma eine ähnliche l'akior-lX-Wirksamkeit
hervorrufen würde. Die Faktor-II-Wirksamkeit kann mit dem Prothrombin-Komplex dieses Beispiels
li mit 1Ao bis '/iso der Proteinmenge erzielt werden, dis bei
normalem Plasma für die gleiche Wirkung benötigt wird.
Auch die Faktor-VII- und Faktor-X-Wirksamkeiten
des Prothrombin-Komplexes dieses Beispiels sind, verglichen mit normalem Gesamtplasma, sehr hoch. Sie
werden im allgemeinen zur Bestimmung des Proconvertin-Stuart-Prower-Komplexes
zusammen gemessen.
Claims (1)
- Patentanspruch;Verfahren zur Herstellung eines Prothrombin-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß mana) eine Cohn-Plasmafraktion, ausgewählt aus der Gruppe von H+ HI, III, IH-O, IV-H-IV-4, in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert,b) im Falle der Verwendung einer Cohn-Plasmafraktion IH oder IH-O die Kochsalz-Suspension einer Ausfällungsstufe mit Polyäthylenglykol eines Molekulargewichts von 200 bis 20 000 bei einem pH-Wert von 4,6 bis 5,2 und einer Polyäthylenglykolkonzentration von 1,5 bis 3,5% aussetzt, wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird,c) den pH-Wert der nach a) oder b) erhaltenen Suspension auf 6,8 bis 7,2 einstellt, die überstehende Flüssigkeit zur Adsorption der Koagulationsfaktoren sorgfältig mit 0,5 bis 2 Gew.-% tribasischem Calciumphosphat, bezogen auf die Suspension, vermischt,d) die adsorbiertes Protein enthaltende Tricalciumphosphatausfällung sorgfältig mit 0,05-M-bis 0,2-M-Trinatriumcitrat vermischt, wobei die erhaltene Suspension </io bis 1/200 des Volumens der Ausgangssuspension beträgt,e) die so erhaltene überstehende Flüssigkeit gewinnt und diese zweimal mit Polyäthylenglykol eines Molekulargewichts von 200 bis 20 000 ausfällt, zuerst bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,0 und einer Polyäthylenglykolkonzentration von 5% bis 10% unter Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit und dann bei einem pH-Wert von 5,0 bis 5,4 und einer Polyäthylenglykolkonzentration von wenigstens 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gewicht der überstehenden Flüssigkeit,Q die so erhaltene Ausfällung als aktiven Prothrombin-Komplex gewinnt, woraufg) dieser bis zu einem Volumen von '/25 bis '/io des Volumens der ursprünglichen Cohn-Plasmafraktionsuspension in citratisierter Kochsalzlösung suspendiert wird.
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