DE1720120A1

DE1720120A1 - Injizierbare Zusatzmittel,Verfahren ihrer Herstellung und Verwendung und neue medizinische Zusammensetzungen,die dieses Zusatzmittel enthalten

Info

Publication number: DE1720120A1
Application number: DE19671720120
Authority: DE
Inventors: Hardy Frank Merril
Original assignee: HAVER LOCKHART LAB Inc
Current assignee: HAVER LOCKHART LAB Inc
Priority date: 1966-04-01
Filing date: 1967-03-30
Publication date: 1971-07-22
Also published as: CH492450A; GB1185225A; US3469003A; FR6362M

Description

21. März I967 Gzy/Ra.

Haver-Lockhart Laboratories, Inc., Shawnee, Kansas / USA.

Injizierbare Zusatzmittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung und neue medizinische Zusammensetzungen, die dieses

Zusatzmittel enthalten.

Die Erfindung betrifft injizierbare Zusatzmittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung und neue medizinische Zusammensetzungen, die dieses Zusatzmittel enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Zusatzmittels als Träger, um die Wirksamkeit eines injizierten Mittels zu erhöhen.

Es wurde gefunden, daß die Wirksamkeit verschiedener Arzneimittel erhöht werden kann, wenn das Arzneimittel in einen injizierbaren Träger eingebaut ist, der eine langsame Freisetzung des Arzneimittels in dem Körper bewirkt. Unter dem Ausdruck "Zusatzmittel¹¹ wird hier ein Stoff verstanden, der als Bindemittel, als Träger oder als Suspensionsmittel wirkt, und zwar für Vakzine und Arzneimittel allein oder in Kombination miteinander. Die Wirkung dieses Zusatzmittels besteht darin, daß es die Verteilung der Vakzine und Arzneimittel verzögert, so daß sie langsam im Körper aufgenommen werden und daher eine größere prophylaktische oder therapeutische Wirksamkeit enthalten können. Bei der Auswahl

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solcher Zusatzmittel missen verschiedene !Anstände berücksichtigt werden. Das Freisetzen des Arzneimittels muß langsam geschehen, ohne daß hierbei toxische, allergische oder antigene Wirkungen auftreten. Das Zusatzmittel muß nicht nur langsam im Körper verteilt werden, sondern es muß auch das Vakzin oder das Arzneimittel binden und es in dem Körper während einer bestimmten Zeit-P dauer freigeben. Der Träger kann also zum Einführen verschiedener Arzneimittel in dem Körper verwendet werden. Arzneimittel im Sinne der Erfindung sind alle Stoffe, welche Krankheiten verhüten, heilen oder erleichtern oder bestimmte physiologische Zustände verhüten, z.B. die Schwangerschaft.

Verschiedene Träger für diese Zwecke sind schon bekannt. Hierzu gehören beispielsweise Metalloxyde, wie Aluminiumhydroxyd, anorganische Chelate oder Salze, Gelatine, verschiedene Paraffin- ^ öle, synthetische Harze, Alginate, Mukoide und polysacharidische Verbindungen, Kaseinate, aus Blut erhaltene Stoffe, wie Fibrin. Keiner dieser Stoffe ist zufriedenstellend, weil sie eine schädliche Wirkung auf den Körper haben können.

Metalloxyde und Chelate von Salzen verursachen sterile Abszesse. ι Diese Stoffe werden auch schnell innerhalb des Körper· verteilt, wobei ihre Wirksamkeit als Zusatzmittel oder Träger leidet. Es ist ferner fraglich, ob diese Stoffe überhaupt vollständig aus dem Körper wieder entfernt werden; wahrscheinlich verbleiben anorganische Reste im Körper. Obwohl diese Salze und Oxyd· ansehe!-

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nend eine geringe Toxizität haben* so besteht doch die Möglichkeit, daß sie durch die Zellen des retikuloendothelxalen Systems, die litoralen und sinusoidalen Zellen der Leber und Milz phagozytisiert werden. Die hierbei entstehenden Reste können die verschiedenen iia Körper befindlichen Filter, z.B. die Leber, die Milz und die fieren, schädigen.

Synthetische Öle und Erdölderivate können besonders unerwünscht sein, da sie sich verhältnismäßig langsam im Körper verteilen. Hierbei können aromatische Kohlenwasserstoffe entstehen, die karzinogen wirken können. Auch diese Stoffe verursachen sterile Abszesse und werden zum Teil überhaupt nicht vollständig aus dem Körper entfernt.

Vollständig denaturierte Stoffe tierischen Ursprungs, wie Gelatine, haben zwar keine schädliche Wirkung auf den Körper, GeIa- λ tine wird aber zu schnell vom Körper aufgenommen, so daß es nicht als verzögernder Träger wirken kann. Daher behandelt man einen aus Gelatine bestehenden Träger vorher mit einem Gerbmittel oder anderen anorganischen Verbindungen, um seine schnelle Verteilung innerhalb des Körpers zu verzögern. Diese Zusätze können ihrerseits schädlich sein. Es ist nicht vollständig bekannt, was mit diesen Stoffen im Körper geschieht; es besteht aber die Möglichkeit, daß schädliche Rückstände entstehen können. Ein weiterer Nachteil solcher Stoffe wie Gelatine besteht darin, daß sie in-

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nerhalb des Körpers aufquellen, wobei unangenehme Nebenwirkungen entstehen.

Aus Blut gewonnenes Fibrin kann immunologische Reaktionen des Körpers bewirken. Aus diesem Grunde ist die Verwendung dieser Stoffe unerwünscht. Es ist allgemein bekannt, daß gewisse Ähn- ^ lichkeiten zwischen den Fibrinen, Fibrinogenen und Thrombinen verschiedener Tierarten bestehen. Die Wahrscheinlichkeit einer immunologischen oder allergenen Reaktion bei Verwendung dieser Stoffe ist daher groß. Es ist zwar richtig, daß verschiedene solche Träger bisher verwendet oder vorgeschlagen worden sind, weil sie eine langsame Verteilung des 'Arzeneimittels bewirken; sie haben aber Eigenschaften, die es schwierig machen, die Verteilungsgeschwindigkeit im Körper zu regeln.

Ein Ziel der Erfindung ist daher eine injizierbare Zusamaenset-W zung, bei welcher das Zusatzmittel die Freigabe des Vakzins oder

■•rfift .

Artneimittels regelt, ohne daß die schädlichen Wirkungen im Körper auftreten. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung eines Zusatzmittels, das von natürlichen Eiweißstoffen abgeleitet ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung dieses Zusatzmittels, bei welchem unerwünschte Bestandteile entfernt werden. Hierbei entsteht ein Träger, der die Eigenschaften von unverändertem Kollagen hat und zusawaen mit einen Arzneimittel verwendet werden kann, wobei dieses ohne unerwünschte oder schädliche Nebenwirkungen im Körper freigesetzt wird·

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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist eine injizierbare Zusammensetzung, aus welcher der Zusatzstoff langsam in dem Körper verteilt wird, so daß das mit ihm verbundene Arzneimittel in einer geregelten Geschwindigkeit während einer bestimmten Zeit freigesetzt wird. Es weLteres Ziel der Erfindung ist eine injizierbare Zusammensetzung, in welcher das wirksame Mittel eingebaut ist in den Zusatzstoff, so daß die Geschwindigkeit des Preiset- ' zens in dem Körper abhängig ist von der Konzentration des Zusatzmittels. Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine injizierbare Zusammensetzung, aus welcher das Zusatzmittel weitgehend im Körper absorbiert wird, so daß keine Rückstände entstehen.

Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist eine injizierbare Zusammensetzung, bei welcher der Träger für das Arzneimittel eine Salzlösung enthält, deren Konzentration und pH-Wert geregelt sind, um die Dissoziation und Ausscheidung des Zusatzmittels zu ermöglichen.

Ein anderes Ziel der Erfindung ist eine injizierbare Zusammensetzung, bei welcher der Träger für das Arzneimittel praktisch nicht toxisch und nicht allergenisch ist. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung einer solchen injizierbaren Zusammensetzung, wobei man das neue Zusatzmittel verwendet. Dieses Zusatzeittel wird mit dem Arzneimittel innige vermengt und

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entweder in fester oder flüssiger Fora injiziert. Bin noch weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzmittels für solche injizierbare Zusaaaensetsungen. Dieses Zusatzmittel enthalt ein aus Kollagen hergestelltes Produkt und eine wäßrige Lösung, um es leicht injizieren zu können. Innerhalb des Körpers bildet diese injizierbare Zusammensetzung ein dickeres Gel, das in Körper langsam dispergiert wird. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Zusatzmittels aus Kollagenen in Fora einer wäßrigen Lösung, so daß die Salzkonzentration und der pH-Viert des Trägers durch Änderung die Viskosität des Endproduktes ebenfalls ändern können. Ein weiterer wichtiger Gegenstand der Erfindung ist eine injizier· bare Zusammensetzung von Impfstoffen, die ein besondere wertvolles Zusatzmittel und ein ii—mnogenes Mittel enthält. Das Zusatzmittel ist hierbei verträglich sowohl mit dea Arzneimittel wie mit dem Körper, so daß praktisch das gesaarte in der Zusammensetzung enthaltene Arzneimittel, das ursprünglich in dem Träger enthalten war, nach der Injizierung verfügbar ist zur Bildung von Antikörpern, wobei aber unerwünschte immunologische Reaktionen auf ein Minimum herabgesetzt werden. Bin weiteres wichtiges Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zum Impfen eines Tieres, wobei das immunologische Mittel kombiniert ist mit einem langsam dispergierenden Zusatzmittel. Die Stimulierung nach dem Impfen zur Bildung von Antikörpern erstreckt sich also über eine verhältnismäßig lange Zeitdauer. Ein weiteres wichtiges Ziel der Brfin-

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dung ist eine Injizierbare Zusammensetzung zum Injizieren von Arzneimitteln wie Vakzinen und Drogen, wobei das aktive Mittel kombiniert iet mit einem langsam absorbierbaren Zusatzmittel. Die Geschwindigkeit der Freisetzung der aktiven Stoffe kann nach Wunsch geregelt werden durch Änderung der Salzkonzentration und des pH-Wertes in de« Zusatzmittel. Dadurch kann die Geschwindigkeit der Dissociation und die Dispersion des Zusatzmittels ™ geregelt werden.

Weitere Gegenstände der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

Kollagen ist der Hauptbestandteil von weißen faserigen Gewebe, das sich in Sehnen, Knorpeln und Knochen von Wirbeltieren findet. Kollagen findet sich auch in den gelben elastischen Geweben, z.B. in Bändern und Sehen. Eine weitere Quelle für Kollagen ist auch m tierische Haut. Das Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Kollagen aus den Geweben oder ihren Vorläufern kann verschieden durchgeführt werden und hängt von der Art des Rohstoffes ab. Insbesondere wichtig hierfür ist die Gesamtzusammensetzung der Rohstoffe.

Zur Herstellung eines Zusatzmittels der gewünschten Eigenschaften können Kollagen-Stoffe aus den obengenannten Rohstoffen erhalten werden. Hierbei sei bemerkt, daß wenigstens vier verschiedene

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allgemeine Arten von Kollagen festgestellt sind. Zwei von diesen Arten sind als Zusatzmittel gemäß der Erfindung verwendbar. Der erste Typ, der auch Tropokollagen oder Prokollagen genannt wird, wird erhalten durch Extrahieren von Kollagen enthaltenen Stoffen, wie Knorpeln oder Knochen mit einer Lösung von Natriumchlorid, oder aus Sehnen ohne Extraktion mit Salz. Dieses Kolagen enthaltene Material ist nicht sehr gut brauchbar allein für sich als Zusatzmittel, da es geringe Molekulargrößen hat, sich schnell im Körper nach dem Injizieren verteilt und im Vergleich mit anderen Arten von Kollagen sehr leicht löslich ist. Die zweite Art von Kollagen enthaltenden Stoffen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, wird erhalten durch Extraktion mit einer schwachen Säure aus den genannten Rohstoffen. Man arbeitet hierbei beispielsweise mit einer schwachen Essigsäure nach Entfernung der besser löslichen Stoffe mittels einer Extraktion mit einer Salzlösung. Die dritte Art des Kollagens, die ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist verhältnismäßig unlöslich in einer schwachen Säure. Man erhält diese dritte Art üblicherweise durch Altern der zweiten Art während längerer Zeit« Hierbei findet wahrscheinlich eine Repolymerisation wenigstens gewisser Anteile der Kollagenmoleküle statt. Die dritte Art ist deshalb langsamer im Körper dispergierbar, als die zweite Art. Die vierte Art von Kollagen wird erfindungsgemäß nxht verwendet. Sie findet sich in Narbengeweben. Wahrscheinlich entsteht sie durch wenigstens teilweise Denaturierung von ursprünglichen Kollagenstoffen durch

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Alkalose unter Vermittlung der im Körper vorhandenen Alkalien.

Das bevorzugte erfindungsgemäß zu verwendende Material besteht im wesentlichen aus Kollagen der Art zwei, auch in Kombination mit gewissen Anteilen von Kollagen der Art eins. Das Kollagen der Art eins kann zusammen mit Kollagenen der Arten zwei und drei verwendet werden, um die Dispersionsgeschwindigkeit des Zusatz- ^j mittels zu regeln. Das Verfahren zur Herstellung von Kollagenen der Art eins und zwei wird im nachstehenden genau beschrieben.

Es wurde weiter gefunden, daß die Stabilität des KolJqgen-Zusatzmittels und des Antigens gesteigert werden und eine permanente, kolloidale Suspension bilden kann, indem eine gewisse Menge eines verträglichen, nicht-toxischen und hochpolymeren synthetischen Harzes zugesetzt wird. Ein bevorzugtes Material ist Carboxypolymethylen, welches ein Carboxy-Vinylpolymer hohen Molekulargewichts ist, wie z.B. "Carbopol-934" der B. F. Goddrich Chemical Company. Das Kollagen-Zusatzmittel wird mit einem Antigen verbunden und dann den obigen Stabilisator zugesetzt. In vielen Fällen ermöglicht die Verwendung des Stabilisators aus synthetischem Harz die Weglassung eines Emulgators. So wird bei einer typischen Kollagen-Antigen-Verbindung 0,1 g des Stabilisators pro 100 ml der Lösung vorgesehen. Eine beispielsweise Abstimmung ist folgende:

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- ίο -

50 ml Rotlauf-Antigen

49 ml rekonstruiertes Kollagen (pH ist auf 7,2

eingestellt)

1 ml Emulgator "0" (der 0,6 Ml Baumwollsaatöl,

0,0025 Ml Span 20,

0,0025 al Tween 8o und Rest Wasser enthält)

0,1 ml Carboxy-Polymethylen

Frisches Rohmaterial, vorzugsweise Sehnen, werden deei Körper des Tieres, z.B. der Ratte, des Pferdes oder der Kuh, innerhalb von 15 bis 30 Minuten nach dem Töten entnci—au. Diese kurze Zeit ist vorzuziehen, um den postmortalen Effekt von Bnzylm-Kathepsinen und anderen abbauenden Stoffen zu verhindern, welche das Kollagen schädigen können. Man wäscht die Rohstoffe sorgfältig eehrere Mal mit destilliertem Wasser, um Spuren von Blut und anderen wasserlöslichen Stoffen zu entfernen· Dann wäscht Mandas Roh-" material mehrmals kurz mit einer physiologischen Salzlösung, die etwa 0,9 Gew.-£ Natriumchlorid enthält, alt einer sogenannten isotonischen Lösung, um weitere Stoffe zu entfernen. Man trocknet dann die gewaschenen Rohstoffe durch Abtupfen «it einem Gewebe oder Filtrierpapier und wägt sie.

Wenn man nicht gleich nach dem Waschen die Kollagene extrahieren will, sollte man die Rohstoffe in einer iaotonischen Salzlösung bei Temperaturen unter 0⁰C lagern. Die gefrorenen Rohstoffe soll-

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ten langsam aufgetaut werden, vorzugsweise in lauwarmem Wasser während etwa 15 bis 2O Minuten, bevor man mit der Extraktion beginnt«

Nach dem Vaschen oder Auftauen taucht man das Material während etwa 3 Stunden in Petroleumäther, um freie Fette, Fettsäuren und andere inerte lösliche Stoffe zu extrahieren. Nach diesem (k Extrahieren gießt man den Äther ab und wäscht die Rohstoffe mehrere Male ext entionisiertem destilliertem Wasser bei Raumtemperatur , um Reste des Äthers zu entfernen.

Der nächste Verfahrensschritt hängt davon ab, ob man ein Kollagen der Art eins oder der Art zwei extrahieren will. Will man ein Kollagen der Art zwei erhalten, so verfährt man wie folgt. Man bringt die Ausgangsstoffe in ein Bad einer 0,9 #igen Lösunf von NaCl, und rührt langsam während etwa zwei Stunden bei Raumtemperatur. Hierbei werden zusätzliche Proteine entfernt, die in der Salzlösung löslich sind. Man sollte hierbei wenigstens kO ml der isotonischen Lösung für jedes Gramm des Ausgangsstoffes,

bezogen auf das Gesamtgewicht vor der Extraktion, verwenden.

Bei diesem Verfahren werden äußerliche, in Salzlösungen lösliche Stoffe entfernt. Da Kollagen der Art eins ebenfalls in Salzlösungen löslich ist, muß man ein anderes Verfahren anwenden, um ein Produkt zu erhalten, das reich an Kollagen der Art eins ist.

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Da in Sehnen andere Proteine außer Kollagenen nur in geringen Mangen enthalten sind, sind Sehnen ein bevorzugtes Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Kollagen der Art eins. Um daher Kollagen der Art eins aus Sehnen zu erhalten, läßt man die Extraktion mit der 0,9 Jiigen Salzlösung vreg. Will nan Kollagene anderer Art, d.h. nicht der Art eins, erhalten, so verwendet manfc Sehnen oder Häute oder beide gemeinsam als Ausgangsstoffe. In diesen Fällen extrahiert man mit einer 0,9 Üigen Salzlösung, um ein Endprodukt größerer Reinheit zu erhalten.

Nach der Extraktion mit der Salzlösung spült man das Material mehrfach mit entionisiertem destilliertem Wasser, um seine Salzkonzentration herabzusetzen. Dann bringt man das Material in eine wäßrige Lösung von Trypsin, die 0,5 Gew.-96 Trypsin enthält und einen pH-Wert von etwa 8,0 hat. Dort beläßt man etwa zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, wobei das Zellenmaterial.entfernt wird und der Gehalt an Polysachariden und Mukopolysacfaariden herabgesetzt wird. Man benötigt hierzu etwa 4o ml der Lösung für jedes Gramm des ursprünglichen Ausgangsstoffes.

Nach der Behandlung mit Trypsin wuscht man das Material mehrfach mit entionisiertem destilliertem Wasser zur Entfernung des Trypsins. Dann bringt man wieder über Nacht bei Raumtemperatur in Petroleumäther, um die Konzentration an Lipoiden, Ölen und anderen in Äther löslichen Stoffen weiter herabzusetzen. Anschließend bringt man das Material über wacht bei Raumtemperatur in

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Chloroform, um in Chloroform lösliche Verunreinigungen zu entfernen. Dann wäscht man wieder mehrfach mit entionisiertem destilliertem Wasser, um das Chloroform zu entfernen.

Bei diesen Verfahrensschritten wird praktisch das gesamte NichtKollagen aus den Rohstoffen entfernt. Man erhält ein verhältnismäßig reines Kollagen mit glänzendem weiflen Aussehen. Das ver- M hältnismäßig reine Kollagen bringt man dann in ein Bad von etwa 0,Ul-normaler Essigsäure mit einem pH-Wert von vorzugsweise etwa 4,0. Man läßt bei Raumtemperatur etwa 5 Stunden lang das Material in dieser Lösung. Hierbei sollte man genügende Mengen der Essigsäure verwenden, um das Kollagen gut zu dispergieren. Geeignet sind etwa 2OO ml der Essigsäure für jedes Gramm des ursprünglichen Ausgangsstoffes.

Nach dem Dispergieren in der schwachen Essigsäure filtert man durch ein feinmaschiges Filter aus Nylon und verwirft den auf dem Filter verbleibenden Rückstand. Das erhaltene Filtrat ist viskos und hat ein klares bis wolkiges weißes Aussehen, was auch abhängig ist von der Menge der verwendeten Essigsäure.

Anschließend erhöht man den pH-Wert der Dispersion in der schwachen Essigsäure durch Zugabe einer ^jiigen Lösung von Natriumhydroxyd. Hierbei fällt das Kollagen aus. Der endgültige pH— Wart der Lösung ist von großer Bedeutung, wie später erklärt

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wird. Infolgedessen sollte aan den pH—tfert genau aeesen. Sei Erhöhung des pH-Vertes wird die kolloidale Suspension repolymerisiert, wobei das Kollagen ausfällt. Da* hierbei erhaltene Produkt wird als "rekonetituiertee Kollagen⁴¹ bezeichnet. Der endgültige pH-Wrrt der Lösung kann zwischen 6,O und 9»O liegen, vas auch von der Art der Ausgangsstoffe abhängt. Dieser pH-Wert hat et auch eine noch später zu erläuternde Bedeutung.

Nach Einstellung des pH-wertes der Dispersion salzt aon die wäßrige Lösung des rekonstituierten Kollagens Mit Natriumchlorid . Die Menge des hierbei verwendeten Salzes hängt ebenfalls von weiter unten gegebenen Erwägungen ab.

Bei diesem Punkt beginnt das rekonstituierte Kollagen auszufallen und zu aggloverleren. Die Stoffe setzen sich aber lang- ^ sam ab, so daß das gesamte System ein Molkiges Aussehen hat. Vorzugsweise zentrifugiert man dann «it etwa 2OOO U/Min, während etwa 20 Minuten, dann saugt mstn die überstehende Flüssigkeit ab oder gießt sie ab und verwirft sie. Der Niederschlag wird dann wieder etwa 30 Minuten lang «it etwa 3OQO U/Min, zentrifugiert, um restliche Flüssigkeit zu entfernen, «fill san Kollagen der Art eins herstellen, so ist es nicht erforderlich, das Konzentrat nach der Neutralisierung und der Zugabe des Salzes abzuschleudern.

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Bei diesem Punkt ist das Sediment am Boden der Röhren der Zentrifuge weiß, hochviskos, und enthält etwa 85 bis 99 % der Lösung, was auch vom Rohstoff und seinem Alter abhängt. In dieser Form ist das Zusatzaittel nach Einstellung des pH-Vfertes und der Salzkonzentration fertig zur Verwendung, wenn man es vorher sterilisiert. Die Sterilisation hängt ab von der Art des zu verwendenden Vakzxns oder des Arzneimittels. Soll das Mittel im wesentlichen aus einem abgetöteten Viraus bestehen, so kann man den Träger durch Zusatz geringer Mengen von Formalin in üblicher Weise sterilisieren. Handelt es sich aber um einen lebenden Virus, dann kann man bakterxostatxsche Mittel, wie Antibiotika verwenden. Man gibt das Vakzxn oder das Arzneimittel direkt dem Zusatzmittel zu. Hierbei entsteht ein Impfstoff, der nach der Injaktion ein leichtes Gel innerhalb des Körpers bildet, wobei das wirksame Mittel innig verbunden ist mit dem Träger. Ein festes Impfmittel kann hergestellt werden durch Trocknen des Zusatzmittels zusammen mit dem Vakzin oder dem Arzneimittel vor dem Injizieren. In je^er Form wird das eingeführte Mittel mit einer geregelten Geschwindigkeit im Körper verteilt, wobei das. wirksame Mittel freigesetzt wird und beide vom Körper absorbiert werden.

Es wurde gefunden, daß die Dispersionsgeschwindigkeit der Trägermasse in Gegenwart einer isotonischen Salzlösung in vitro abhängig ist von dem pH-Wert und der Salzkonzentration der Lösung, eben-

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so auch von der Art des Kollagens, d.h. davon, ob es sich um ein Kollagen der Art eins, der Art zwei, der Art drei oder von Kombination hiervon handelt. Die nachstehende Tabelle zeigt die relative Dispergierbarkeit des Trägers in Gegenwart einer isotonischen Salzlösung bei verschiedenen pH-Werten und verschiedenen Salzkonzentrationen.

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Dispergierbarkeit von rekcmstituiertem Kollagen in Gegenwart einer isotonischen Lösung mit verschiedenen pH-Werten und

Salzkonzentrat ionen

pH-Wert Salzgehalt Salzgehalt Salzgehalt Salzgehalt Salzgehalt

-» 0,00 0,45 g NaCl/ 0,9 g NaCl/ 1,35 S NaCl/ 1,8 g NaCl

to 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml

ο

DEEF

6,4 C D D E E

C D DE

CCDE BCDE BCDE

BCDE -^

BBCD fO

ABCD -

6	,0	C
6	,4	C
6	,8	B
7	,0	B
7	,4	B
7	,8	A
8	,0	A
8	,2	A
8	,5	A

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(Fortsetzung der Tabelle)

A - verhältnismäßig un.?|i§pe$ B - verhältnismäßig inngjam dispergierbar (50 % in }Q Tagen) C - langsam dispergierbar (50 Ji i» %k Tagen)

0 - mäßig diaper gier l»er (50 % in 7 Tactil)

E- gut diapergierbar [50 % Xn 3 Tagen) F - sehr gut dispergierbar (50 % in 36 Stun«!en) Durch sorgfältige Einstellung des pH-Wertes und der

tration im Zusatzniittel während der Ausfällung des rekQn8,truier-

ten Kpilagens kann mm. rt4e JLefee»«d_auer ten QeIs in vivo un<| eeil»e

Das Zusatzniittel »it dem beatie^ten pH-Wert und der §alzkQnsBentration ifir.f| dann direkt mit dep iipp te! oder dem Ar*neiwfit^fi gewischt. Hierbei dient *§ «1* für die Injektion, als suspendierendes LösungsMitteJL un<| als tel zui' Herabsetzung der Abeorptipnsgesphifindigkeit df« Mittels im Körper. Da lurch wird eine maximale iiumnogene und äretliche

Virksamkeit erreicht. Beispiel 1

Zum Immunisieren eines Pferdes gegen den Viraus der westlichen Pferde-rEnzephalomyelitis verwendet nan etwa 0,5 «1 yqj· flüssigem rekonstituiertem Kollagen, mit einem Gehfit ypn etwa P.OOl g

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rekonstituierte« Kollagen je 0,5 ml der Flüssigkeit, mit einem pH-Wert von etwa 8,O und einem Gehalt an Natriumchlorid von etwa 0,45 g NaCl/lOO ml. Dieser Träger wird sorgfältig gemischt mit etvraO, 5 ml eines abgetöteten Virus der westlichen Pferde-Enzephal^omyelitis, der aus einer Brutflüssigkeit mit einem Titer von 10 je O,O3 el der Flüssigkeit oder darüber, gemessen durch I.C.-Impfung in Mäusen erhalten ist. Die erhaltene Mischung wird

in zwei Dosen von etwa je 1 ml iiyzeitliehen Abständen von 7 bis ™

Ik Tagen unter die Haut eingespritzt.

Beispiel 2

Zum Immunisieren eines Pferdes gegen den Viraus der westlichen Pferde-Enzephalomyelitis verwendet man etwa 0,5 ml einer Lösung von flüssige« rekonstituiertem Kollagen, die etwa 0,001 g rekonstituiertes Kollagen je 0,5 ml der Flüssigkeit enthält, mit einem pH-Wert von etwa 8,0 und einer Konzentration an Natriumchlorid von etwa O,45 g Na Cl/lOO el. Diese Flüssigkeit mischt j man sorgfäütig mit etwa O,5 ml eines getöteten Virus der westlichen Pferde-Enzephalomyelitis. Dieses Mittel wurde erhalten aus einer Gewebekultur «it einem Titer von 10 je 0,03 ml der Flüssigkeit oder darüber, was durch Impfen in Mäusen bestimmt wurde. Die erhaltene Mischung wird in zwei Anteilen von je etwa 1 «1 in zeitliche« Abstand von 7 his l4 Tagen unter die Haut injiziert.

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Beispiel 3

Zum Immunisieren eines Pferdes gegen den Viraus der Venezulanischen Pferde-Enzephalomyelitis verwendete man etwa 0,5 ml einer Präparation von flüssigem rekonstituiertem Kollagen, die etwa 0,001 g rekonstituiertes Kollagen je 0,5 ml Flüssigkeit enthielt, einen pH-Bert von etwa 8,0 und Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 0,45 g NaCl/100 ml enthielt. Man mischte diese Flüssigkeit sorgfältig mit etwa 0,5 ml von abgetötetem Virus der Venezulanischen Pferde-Enzephalomyelitis, die aus einer Gewebekultur mit einem Titer von 10^'^ je O,03 ml Flüssigkeit oder darüber, was durch Einimpfen in Mäuse bestimmt wurde, erhalten war. Das erhaltene Mittel wird in zwei Anteile von etwa je 1 ml in einem zeitlichen Abstand von 7 bis 14 Tagen unter die Haut eingespritzt.

Beispiel 4

Zum Immunisieren eines Hundes gegen den Virus der Hunde-Staupe verwendete man etwa 2,0 ml eines flüssigen rekonstituierten Kollagens mit einem Gehalt von etwa 0,004 g rekonstituiertes Kollagen je 0,2 ml der Flüssigkeit, mit einem pH-Wert von etwa 7,2 und einem Gehalt an Natriumchlorid von etwa 0,45 g NaCl/lOOml. Hierzu mischt man sorgfältig etwa 100 mg einer lyophylisierten Präparation des Virus. Das erhaltene Gemisch wird intramuskulär injiziert.

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Beispiel 5

Zum Einspritzen von Vitamin A in Schweine oder Rindvieh verwendet man etwa 0,85 ml einer Flüssigkeit, die rkonstituiertes Kollagen in einer Menge von etwa 0,0017 g enthält, einen pH-Wert von etwa 7»0 und einer Konzentration von !Natriumchlorid von etwa 1,8 g NaCl/lOO ml hat. Diese Flüssigkeit wird innig gemischt mit 0,01 ml einer Präparation von Penicillin und Streptomycin mit etwa 100 000 antibiotischen Einheiten je ml, und außerdem 0,025 ml Polysorbat-80, 0,015 ml Äthanol, 0,05 ml Baumwollsaatöl, 0,05 ml Sojaöl und 100 000 Einheiten Vitamin A enthält. Das erhaltene Gemisch wird in Dosen von je 1,0 ml entweder subkutan oder intramuskulär injiziert.

Beispiel 6

Zum Injizieren von Vitamin A in Schweinen oder Rindvieh verwendet man etwa 0,75 ml einer Präparation von rekonstituiertem flüssigem Kollagen mit etwa 0,0015 g rekonstituiertem Kollagen je 0,75 ml der Flüssigkeit, mit einem pH-Wert von etwa 7»0 und einer Konzentration von etwa 1,8 g IMaCl/lOO ml. Hierzu mischt man sorgfältig 0,10 ml einer Natriumchloridlösung mit einem Salzgehalt von 1,8 g NaCl/100 ml, die 0,01 ml einer Präparation von Penicillin und Streptomicin enthält. Diese Präparation hatte 100 000 antibiotische Einheiten je ml, enthielt 0,025 ml von Polyeorbat-80, 0,015 ml Äthanol, 0,05 ml Baumwollsaatöl, 0,05 ml Sojaöl und 100 000 Einheiten Vitamin A. Diese Mischung wird ent-

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weder subkutan oder intramuskulär in Anteilen von 1,0 ml injiziert. Das injizierte Gemisch wirkt schneller als das Gemisch nach Beispiel 5·

Die obigen Beispiele zeigen die Herstellung von flüssigen Mitteln, die im Körper ein leichtes Gel bilden. Die Bestandteile dieser Mittel können aber auch getrocknet werden, um ein festes Material zu erhalten. Hierzu kann man das Trocknen an Luft, das Trocknen durch Ausfrieren oder durch Ultrazentrifugieren verwenden, was Fachleuten bekannt ist. So wurde z.B. gefunden, daß ein durch Extrusion hergestellter Faden sehr brauchbar ist. Man kann diesen Faden in kurze Stücke schneiden und leicht in der Bohrung einer Injektionsnadel unterbringen. In fester Form wird eine solche Mischung nach der Injektion im Körper sehr langsam durch die Körperflüssigkeiten dissoziiert.

Im Körper wirken diese Injektionsmittel unabhängig davon, ob sie in flüssiger oder fester Form vorliegen, gleichmäßig. Das rekonstituierte Kollagen ähnelt in seinen Eigenschaften dem natürlichen Kollagen. Natürliches Kollagen und rekonstituiertes Kollagen sind beides Proteine. Beide haben die bei Proteinen seltenen Eigenschaften, keine antigenen Wirkungen im Körper hervorzurufen. Rekonstituiertes Kollagen ist auch verhältnismäßig nicht-toxisch und nicht-allergen bei Säugetieren. Ee ist schließlich verhältnismäßig inert gegenüber immunologenen Mitteln, die

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mit ihm kombiniert sind. Rekonstxtuiertes Kollagen wird im Körper von den Körperflüssigkeiten langsam dissoziiert. Die Rückstände hiervon werden im Körper vollständig abgebaut, da der Träger lediglich aus natürlichem Material und Salzlösungen besteht·

Nach dem Gelieren der Flüssigkeit im Körper oder nach dem ^

Trocknen unter Entstehung einer festen Masse bildet das Zusatzmittel eine stabile Matrix, die das immunologene Mittel umgibt und festhält. Eine Titrierung des Antigens findet statt entweder wenn das Zusatzmittel selbst dissoziiert ist oder wenn es in die umgebenden Körperflüssigkeiten eindiffundiert. Das Mittel wird also im Körper mit praktisch derselben Geschwindigkeit dispergiert, wie das Zusatzmittel diepergiert wird. Versuche haben gezeigt, daß ein Zuaatzmittel mit einem Gehalt an rekonstituiertem Kollagen nach der Injektion keine sterilen Abszesse erzeugt. Der immunologene Impfstoff und die Verfahren zu seiner % Herstellung oder Verwendung sind der eigentliche Gegenstand der Erfindung. Hierbei werden alle Schwierigkeiten verringert oder praktisch ganz vermieden, die bei Verwendung der bekannten Impfstoffe auftreten. Die gewünschten Eigenschaften der immunologischen Impfstoffe gehen aber nicht verloren.

Die Beschreibung und die Beispiele zeigten insbesondere die Herstellung von injizierbaren Mischungen einschließlich solcher

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mit Vitaminen, und stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Es ist aber klar, daß Kollagen als Zusatzmittel auch beim Injizieren anderer Arten von Arzneimitteln, wie von Hormonen und Antibiotika, verwendet werden kann. Der Ausdruck "Arzneimittel" soll hierbei im weitesten Sinne verstanden werden, und auch verschiedene Vakzine und Drogen einschließen. Da der Träger wenigstens bei einigen Verfahrensstufen seiner Herstellung in flüssiger Form vorliegt, so können flüssige und feste Arzneimittel leicht und homogen eingearbeitet werden. Die erfindungsgemäßen Mittel und die Zusatzstoffe können verarbeitet und hergestellt werden, ohne daß hierbei erhöhte Temperaturen benötigt werden. Man kann also verschiedene Arten von Arzneimittel in den Träger einarbeiten, wobei natürlich der pH-Wert und die Salzkonzentration so gehalten sein müssen, daß sie nicht schädlich

sind.

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Claims

- 25 Pat entansprüche

dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff mit verhältnismäßig geringer Geschwindigkeit in dem Körper vollständig dissoziiert und absorbiert wird, ferner gekennzeichnet durch ein Arzneimittel, das mit dem Träger gemischt ist.

2. Mittel nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff aus einem länglichen, verhältnismäßig dünnen, injizierbaren, festen Faden besteht.

3· Mittel nach Anspruch 1,dadurch geken nzeichnet, daß der Zusatzstoff eine verhältnismäßig viskose injizierbare Lösung ist, deren Viskosität in vivo nach dem Injizieren zunimmt.

k. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Zusatzstoff enthält, der in dem Körper mit einer vorausbestimmten verhältnismäßig niedrigen Geschwindigkeit praktisch vollständig lissoziiert und absorbiert wird, ferner durch ein immunologisches Mittel, das in den Träger homogen eingearbeitet ist, so daß es gleichzeitig mit der Dissoziation und der Absorption des Trägers vom Körper aufgenommen wird.

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5. Mittel nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Proteinstoffen besteht, die aus Verbindungsteilen von Wirbeltieren gewonnen sind.

6. Mittel nach Anspruch 5i dadurch geken nzeichnet, daß die Proteinstoffe rekonstituiertes

B Kollagen sind.

7. Mittel nach Anspruch 6,dadurch geken nzeichnet, daß es Natriumchlorid in einer solchen Konzentration enthält, die nicht höher als etwa das Zweifache der iMatriumchloridkonzentration in einer isotonischen Losing ist.

8. Mittel nach Anspruch 6,dadurch geken n-

^ zeichnet, daß die Lösung einen pH-Wert von etwa

6 bis etwa 9 hat.

9. Mittel nach Anspruch 6,dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 85 bis 99 Gew.-% des Trägers in wäßriger Lösung enthält.

10. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, daß man einen flüssigen als Zusatzstoff dienenden Träger herstellt, der

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mit verhältnismäßig geringer Geschwindigkeit im Körper praktisch vollständig dissoziiert und absorbiert wird, daß man diesem Träger das Arzneimittel zugibt, und daß man die Mischung rührt, bis eine praktisch homogene Masse entstanden ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, daß man ein aus M dem Körper von Wirbeltieren erhaltenes, Kollagen enthaltendes Material mit einer schwachen Säurelösung solange behandelt, bis das Kollagen in der Lösung dispergiert ist, daß man dann den pH-Wert der Lösung so weit erhöht, daß rekonstituiertes Kollagen ausfällt, und daß man schließlich den ausgefällten Anteilen ein immunologisches Mittel zumischt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kollagen enthaltende Ausgangsmaterial vor der Behandlung mit der schwachen Säure mit einem * Lösungsmittel für Fettbestandteile solange behandelt, daß die Fette und Fettsäuren aus dem Material entfernt werden.

13· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausgangsmaterial nach dem Entfetten solange mit einer Salzlösung behandelt, daß die in Salzlösungen löslichen Proteine entfernt werden.

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Ik. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch geken n-

zeichnet, daß man die Ausgangsstoffe mit einer Trypsin enthaltenden Lösung solange behandelt, daß der Gehalt an Kohlenhydraten herabgesetzt wird.

15· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch geken nfe zeichnet, daß man den pH-Wert durch Zusatz eines Alkali zu der Lösung soweit erhöht, daß er zwischen etwa und 9 liegt.

l6. Verfahren nach Anspruch 11,dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung mit dem Miederschlag zentrifugiert, bis ein viskoses, pastenförmiges Konzentrat von rekonstituiertem Kollagen entstanden ist.

17* Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekenn-

^w zeichnet, daß man das rekonstituierte Kollagen solange zentrifugiert, bis ein Konzentrat entstanden ist, das wenigstens etwa 5 g rekonstituiertes Kollagen je 250 ml der Paste enthält.

l8. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man den Salzgehalt der Lösung so einstellt, daß die Konzentration des Salzes nicht mehr als etwa das Doppelte der Salzkonzentration in einer isotonischen Lösung ist.

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19· Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern in Wirbeltieren mit einer geregelten Geschwindigkeit, dadurch geken nzeichnet, daß man dem Wirbeltier ein Mittel injiziert, welches einen mit verhältnismäßig geringer Geschwindigkeit im Körper praktisch vollständig dissoziierbaren und absorbierbaren Träger enthält und ferner ein in diesen Träger innig eingearbeitetes immunologisches Mittel enthält, das ^ gleichzeitig mit dem Stoffwechsel des Trägers in dem Körper freigesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19idadurch gekennzeichnet, daß der Träger rekonstituiertes Kollagen enthält.

21. Verfahren nach Anspruch 20, d a d u r c h gekennzeichnet, daß die Lösung einen pH-Wert von etwa

6 bis 9 hat. I

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration der Lösung nicht höher als etwa das Doppelte der Salzkonzentration in einer isotonischen Lösung ist.

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23· Verfahren nach Anspruch 19, dadurch geken nzeichnet, daß der Träger zwei verschiedene Arten von rekonstituiertem Kollagen enthalt, die mit verschiedenen Geschwindigkeiten in dem Körper dissoziiert und absorbiert werden.

2k, Zusatzstoff für ein Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Proteinmaterial enthält, das erhalten ist aus dem Körper von Wirbeltieren und mit verhältnismäßig langsamer Geschwindigkeit in dem Körper praktisch vollständig dissoziiert und absorbiert wird.

25. Mittel nach Anspruch 24,dadurch gekennzeichnet, daß es rekonstituiertes Kollagen enthält.

26. Mittel nach Anspruch 251 dadurch gekennzeichnet, daß es einen pH-Wert von 6 bis 9 hat.

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