DE2720041A1 - Herzstaerkendes mittel - Google Patents
Herzstaerkendes mittelInfo
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- DE2720041A1 DE2720041A1 DE19772720041 DE2720041A DE2720041A1 DE 2720041 A1 DE2720041 A1 DE 2720041A1 DE 19772720041 DE19772720041 DE 19772720041 DE 2720041 A DE2720041 A DE 2720041A DE 2720041 A1 DE2720041 A1 DE 2720041A1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
Description
Patentanwälte 2 7 2 O O A
Dr.-Ing. Walter Abitz Dr. Dieter F. M ο rf
Dipl.-Phys. M. Gritschneder 8 München 8b, Pienzenauerstr. 28 ^
1977 15 881Y
UNIVERSITY OF HAWAII
2540 Maile Way Honolulu, Hawaii/ V. St. A.
Herzstärkendes Mittel
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Es wurde gefunden, daß das als Anthopleurin-A bezeichnete
neue Peptid, das im folgenden als AP-A bezeichnet wird und aus der Seeanemone Anthopleura xanthogrammica erhalten wird,
herzstärkende Aktivität aufweist.
Die Mittel, die derzeit zur Stimulierung des gestörten Herzens verwendet werden, sind wegen ihrer toxischen Wirkungen
auf das Herz oder der schädlichen Nebenwirkungen auf den peripheren Kreislauf begrenzt. Obgleich beispielsweise die
Herzglycoside myocardiale Stimulierungsmittel sind und eine
Störung des Herzens wieder beseitigen können, wirken sie in Dosismengen, die sehr nahe an denen liegen, die toxische
Symptome, wie Herzarrhythmie, Übelsein und Erbrechen ergeben.
Die Verwendung sympathomimetischer Mittel ist durch ihre assoziierte Arrhythmie, Tachycardie, Tachyphylaxie
oder geänderten peripheren Widerstand beschränkt.
Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt überraschende pharmakologische
Eigenschaften. Sie beeinflußt hauptsächlich die kontraktilen Kräfte des Herzmuskels. Sie besitzt insbesondere
eine potente, herztonische Wirkung auf den Herzmuskel verschiedener Lebewesen in vivo und in vitro und hat keine
erkennbare Wirkung auf den Blutdruck, die Herzrate und den vaskulären glatten Muskel. Die Verbindung verursacht weiterhin
eine positive inotrope Wirkung auf das Atrium bei starken Temperaturbeanspruchungen, Anoxie und in Anwesenheit niedriger
Ca++-Konzentrationen. Die Herzglycoside sind bei diesen
Belastungszuständen unwirksam. Die spezifischen positiven
inotropen Eigenschaften von AP-A und die damit einhergehende
Zunahme im Herzminutenvolumen bewirken, daß sie bei der Behandlung von Stauungsherzstörungen nützlich ist.
Die Erfindung betrifft ein neues Peptid, das aus der Seeanemone Anthopleura xanthogrammica extrahiert wird und das
ausgeprägte Herzstimulationswirkungen zeigt. Der vorliegenden
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Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, dieses neue Peptid zu schaffen. Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren
zur Erzeugung des neuen Peptid aus Seeanemonen geschaffen werden.
Erfindungsgemäß sollen weiterhin Zubereitungen und Verfahren für die Behandlung von Herzversagen unter Verwendung dieses
Peptids zur Verfügung gestellt werden.
Das erfindungsgemäße neue Peptid Anthopleurin-A (AP-A) wird
aus der Seeanemone Anthopleura xantogrammica, die an der
Bodega Bay (Bodega Bucht) in Californien gesammelt wird, erhalten.
Die Seeanemonen werden homogenisiert und mit Wasser oder mit einer Lösung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel extrahiert. Der Anthopleurin-A enthaltende Rohextrakt wird einer Gelfiltration unterworfen. Dabei
erhält man eine 40fache Steigerung in der Reinheit von Anthopleurin-A. Alternativ können semi-permeable Membranen
zur Erreichung der Ergebnisse verwendet werden, die man durch Gelfiltration erzielt. Kationenaustausch-Chromatographie ergibt
eine sehr gute Trennung von Anthopleurin-A in einer Reinheit von etwa 30 bis 8O?o, abhängig von der besonderen
Sammlung der Anemonen. Der Rest besteht aus biologisch inaktiven Peptiden und den Puffersalzen. Zur Herstellung von
analytisch reinem, salzfreiem Material wird das obige Material weiter durch Gelfiltration, Kationenaustausch-Chromatographie
gereinigt und entsalzt. Alle erfindungsgemäßen Trennverfahren werden durch Bioassay (Bioanalyse) unter Verwendung
isolierter Rattenatria für die Bestimmung der positiven inotropen Wirkung unter Verwendung des Verfahrens, wie es in
dem Teil mit der Überschrift "Bioassay" beschrieben wird,
verfolgt.
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Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Anthopleurin-A ist die Extraktion der gesammelten, nassen Seeanemone Anthopleura
xanthogrammica mit Wasser, Alkohol oder einem wäßrigen alkoholischen Gemisch, Durchführung einer Gelfiltrationschromatographie
mit dem Rohextrakt an einer mit vernetzten! Dextran gepackten Säule und Eluieren mit wäßriger NHaHCO,-Lösung
oder einer anderen flüchtigen Salzlösung. Die aktive Fraktion wird lyophilisiert und an einer mit Kationenaustauschharz
gepackten Säule chromatographiert und mit einem Puffer oder mit einem Puffer und einem Gradienten aus einer
ionisierbaren Salzlösung eluiert. Eine geeignete Lösung für die Eluierung des Kationenaustauschharzes ist ein Phosphatpuffer
oder ein Phosphatpuffer mit einem Gradienten aus NaCl-Lösung. Die aktive Fraktion wird zur Herstellung von
gereinigtem Anthopleurin-A lyophilisiert. Das lyophilisierte
Material enthält 1,0 bis 1,4% Anthopleurin-A, der Rest besteht aus 0,2 bis 2,0% inaktiven Polypeptiden, Puffersalzen
und ionisierbaren Salzen. Zur Herstellung des salzfreien Materials wird das getrocknete Material an einer mit vernetztem
Dextran gepackten Säule chromatographiert und zur Entfernung des Phosphats mit einer Salzlösung eluiert. Die aktive Fraktion
wird gesammelt und durch Chromatographie an einer Säule entsalzt, die mit vernetztem Dextranharz gepackt ist, wobei
mit einer verdünnten Lösung aus einer niedrigen organischen Säure, wie Essigsäure, eluiert wird.
Zur Herstellung von analytisch reinem AP-A wird das entsalzte Material der Gelfiltrationschromatographie an einer mit vernetztem
Dextran gepackten Säule unter Elution mit Wasser und der Ionenaustauschchromatographie an einer mit Sulfoäthylcellulose
gepackten Säule und Elution mit Pyridinacetat-Puffern
unterworfen.
Bei einem weiteren bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Anthopleurin-A aus Anthopleura xanthogrammica
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werden die nassen Anemonen in etwa 2 cm Stücke geschnitten, homogenisiert und mit 3O?oigem wäßrigem Äthanol t :trahiert.
Der Rohextrakt wird zu einer wäßrigen Lösung konzentriert, die zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert wird und
mit Chloroform verteilt wird. Die mit Chloroform extrahierte, wäßrige Lösung wird lyophilisiert und der Rückstand wird der
Gelfiltrationschromatographie an einer mit vernetztem Dextran, wie Sephadex G-50 gepackten Säule mit einer Ausschlußgrenze
von 30 000 für kugelförmige Proteine (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Box 175, S-751 04, Uppsala) unterworfen,
wobei mit 0,1 M NH^HCO, eluiert wird. Die Fraktion mit einem Ve/Vo-Wert von 1,84 bis 2,57 enthält 4Ofach gereinigtes
Anthopleurin-A. Die Fraktion mit einem Ve/Vo-Wert von 1,84 bis 2,57 wird lyophilisiert und weiter durch Chromatographie
an einer mit schwach saurem Kationenaustauschharz, v/ie CM-Sephadex C-25, gepackten Säule unter Eluierung
mit 0,03 M, pH 7,5, Phosphatpuffer mit Gradientenelution bis zu 0,5n NaCl gereinigt. Anthopleurin-A wird bei Ve/Vo
2,99 bis 3,39 eluiert und wird lyophilisiert. Die Ve/Vo 2,99 bis 3,39 Fraktion wird an einer mit Sephadex G-50 gepackten
Säule mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 erneut chromatographiert, wobei mit 0,017 M Essigsäure, die 0,03 M
in NaCl ist, eluiert. Die bei Ve/Vo 1,66 bis 2,16 eluierte Fraktion wird zur Herstellung von im wesentlichen phosphatfreiem
Anthopleurin-A lyophilisiert. Das Natriumchlorid wird entfernt, indem man die Probe auf eine Säule gibt, die mit
einem vernetzten Dextranharz, wie Sephadex G-10, mit einer Ausschlußgrenze von 700 gepackt ist, gefolgt von etwa dem
3fachen Probenvolumen von 20%iger Natriumchloridlösung und
anschließende Eluierung mit 0,017 M Essigsäure. Reines (30-8096 AP-A), salzfreies Anthopleurin-A eluiert bei
Ve/Vo 0,93 bis 1,12. Da gefunden wurde, daß die assoziierten Polypeptide inaktiv sind, ist dieses Material für pharmakologische
Untersuchungen geeignet.
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Zur Erzeugung von AP-A, das von assoziierten inaktiven Peptiden frei ist, wird die Ve/Vo 0,93Ms 1,12 Fraktion in destilliertem
Wasser gelöst und an freien Sephadex G-25 in destilliertem
Wasser chromatographiert. Die Eluierung mit dem destillierten V/asser ergibt die Hauptmenge des aktiven Peptids
(90%) 75% rein bei Ve/Vo zwischen 1,3 und 1,7, während der
Rest des aktiven Peptids rein mit 0,2 M NHaOAc eluiert wird. Die Ve/Vo 1,3 bis 1,7 Fraktion wird lyophilisiert, in destilliertem
Wasser erneut aufgelöst und an Cellex-SE Cellulose (Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien) chromatographiert,
mit 0,05 M Pyridin äquilibriert und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt. AP-A wird rein durch einen linearen
Gradienten mit gleichen Volumen von je 0,05 M Pyridinacetat, pH 2,7, und 0,2 M Pyridinacetat, pH 3,1, in einem Gebiet,
das 0,1 M Pyridinacetat entspricht, eluiert. Dieses Material ist analytisch rein, bestimmt durch Aminosäure-Analyse und
Sequenzbestimmung.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von reinem Anthopleurin-A
wird in dem folgenden Schema 1 erläutert.
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Schema 1
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Extraktions- und Reinigungsschema von Anthopleurin-A aus
A. xanthogrammica
5,5 kg nasses A.xanthogrammica
27 1 3096 EtOH homogenisiert, filtriert,zentrifugiert
27 000 χ g
ausgelaugtes Material, überstehende Lösung
verworfen
13 g CHCl3,löslich
auf 2,5 1 flashdestilliert(< 4O°C),
mit 12,5 1 CHCI3 extrahie**t, zentrifugiert,
lyophilisiert
g in Wasser lösliche Stoffe
6,4 g in V/asser lösliche Stoffe
19,5 g Grenzflächenmaterial
Gelfiltrationchromatographie mit 2600 ml Sephadex G-50 in vierzig
6,4 g Ansätzen
0,215 g A
0,107 g B 0,163 g 5,034g 0,73 g CDE
0,0
4 g
Ve/Vo = 0,95-1,18 1,18-1,84 1,84-2,57 2,57-3,08 3,08-3,38 3,38-4,10
akjtiv 98,5% Gewinnung
mg Fraktion C
ι CM-Sephadex C-25,eluiert mit Phosphatpuffer bei pH 7,5 und Gradien-
v tenelution mit 0,5n NaCl
mg Fraktion G
Ve/Vo 2,99 bis 3,39
Ve/Vo 2,99 bis 3,39
Gelpermeationschromatographie an
Sephadex G-50,eluiert mit 0,017 M ν Essigsäure, 0,03 M in NaCl
mg Fraktion H
Ve/Vo 1,66 bis 2,16
Ve/Vo 1,66 bis 2,16
entsalzt an Sephadex G-10,eluiert mit 0,017 M Essigsäure
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Schema 1 (Fortsetzung)
1,4 mg 20-80% reines Anthopleurin-A
Ve/Vo 0,93 bis 1,12
Sephadex G-25(fein), eluiert mit
Wasser und dann mit 0,2 M NH^OAc
Fraktion I
Ve/Vo 1,3 bis 1,7
Ve/Vo 1,3 bis 1,7
Chromatographie an Sulfoäthylcellulose,Gradientenelution
mit gleichen Volumen an 0,05 M Pyridinacetat, pH 2,7, und
0,2 M Pyridinacetat, pH 3,1
0,7 mg >95% reines Anthopleurin-A
Das erfindungsgemäße neue Peptid wird Patienten mit Herzversagen bzw. Herzstörungen in einer Rate von etwa 0,01 bis
etwa 5/ug/kg Körpergewicht/h entweder durch Infusion oder
durch eine Einzeldosis, wie es dem Arzt geläufig ist, verabreicht.
Für eine solche Verwendung kann die erfindungsgemäße Verbindung oral oder parenteral als solche oder vermischt mit an
sich bekannten pharmazeutischen Trägerstoffen verabreicht werden. Der parenterale Weg ist bevorzugt. Sie kann oral in solchen
Formen, wie Tabletten, dispergierbaren Pulvern, Granulaten, Kapseln, Sirupen und Elixieren, und parenteral in Form
von Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Emulsionen u.a., z. B. als sterile, injizierbare, wäßrige Lösung, verabreicht
werden. Die Verbindung kann ebenfalls chemisch, wie durch Acylierung und Veresterung, oder physikalisch, wie unter Herstellung
eines künstlichen Liposoms, zur Verminderung von Verdauungsstörungen geändert v/erden. Der bevorzugte Verabreichungsweg
ist durch Injektion.
Eine bevorzugte pharmazeutische Zubereitung von AP-A enthält den aktiven Bestandteil in Gelatine und ein PhenoIkonservie-
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rungsmittel. Eine weitere, bevorzugte pharmazeutische Zubereitung,
die für die Injektion geeignet ist, enthält steriles, pulverförmiges, lyophilisiertes AP-A, das in trockener Form
bei Zimmertemperatur stabil ist. Das lyophilisierte Pulver kann in hydrolysierte Gelatine enthaltenden Ampullen abgepackt
sein. AP-A muß zum Zeitpunkt der Verwendung durch Auflösen in einem geeigneten Volumen an sterilem Wasser für die Injektion
oder Natriumchloridlösung für die Injektion auf solche Weise rekonstituiert werden, daß die individuelle Dosis in 1 bis
2 ml Lösung enthalten ist. Die rekonstituierte Lösung sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden und vor der Zersetzung oder
bevorzugt innerhalb von 24 Stunden verwendet werden.
Diese pharmazeutischen Zubereitungen können bis zu etwa aktiven Bestandteil zusammen mit dem Träger oder Adjuvans en"thalten.
Die herzstärkende, wirksame Menge an aktivem Bestandteil, die zur Behandlung von Stauungsherzversagen bzw. Stauungsherzstörungen
verwendet wird, kann variieren, abhängig von der Heftigkeit des zu behandelnden Zustands. Im allgemeinen werden
jedoch zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn Anthopleurin-A
in einer stündlichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 5/Ug/kg Lebewesenkörpergewicht oder in Depotform verabreicht
wird, die während einer vom Arzt, bestimmten.Zeit wirkt.
Die für die innere Verwendung geeigneten Dosiseinheitsformen enthalten etwa 2 bis etwa 360 /ug an aktiver Verbindung in
innigem Gemisch mit einem festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Die bevorzugten
pharmazeutischen Zubereitungen sind bezüglich der Herstellung und der Leichtigkeit der Verabreichung injizierbare
Zubereitungen, insbesondere solche, die etwa 0,05 bis etwa 10/Ug/ml enthalten.
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Bioassay (Bioversuch bzw. -analyse) für die Bestimmung der
positiven inotropen Wirkung
Die Bioassays von Anthopleurin-A enthaltenden Lösungen werden an isolierten Atria von Rattenherzen durchgeführt. Das Atrium
wird von dem Rest des Herzens abgetrennt und in einem isolierten Organbad (20, 25 oder 50 ml), das Krebs Ringer-Bicarbonatmedium
(pH 7,4) der folgenden Zusammensetzung in destilliertem, entionisiertem Wasser enthält (in mMol), suspendiert:
Na+ 145; K+ 6,02; Ca+2 1,22; Mg+2 1,33; Cl" 126; HCO3"3 25,3;
PO^"3 1,2; SO^ 1,33; und Glucose 5,5. Die Temperatur des
Organbads wird bei 300C gehalten, und das Krebs Ringer-Medium
wird kontinuierlich mit 95% 02_5%C02 belüftet.
Die spontan schlagende Atriumpräparation wird mit einem dünnen Seidenfaden mit einem Kraftverdrängungswandler (Graas Modell
FT.03) verbunden, und die kontraktilen Bewegungen werden auf einem Polygraphen Grass Modell 7 mit sechs Kanälen aufgezeichnet.
Die Präparation kann unter einer Spannung von 750 mg während 60 Minuten vor dem Versuchsbeginn den Gleichgewichtszustand
annehmen. Nach dieser Gleichgewichtseinstellung, während der die Präparationen alle 30 Minuten gewaschen werden,
bleibt die spontane Schlagrate der Atrla konstant. Die Änderung während einer lOminütigen Beobachtung ist geringer als
5 Schläge/min. Änderungen, die durch die Anthopleurin-A enthaltende Testlösung in der kontraktilen Kraft und der Rate
hervorgerufen werden, werden als Prozentgehalt Erhöhung oder Abnahme in der Spannung und im Rhythmus angegeben, verglichen
mit der Zeit unmittelbar vor der Zugabe der Testlösung zu dem Gewebebad als Grundlinie für den Vergleich.
Zur Durchführung der elektrophoretischen und Aminosäure-Analyse wird das gemäß Beispiel 1 erhaltene Anthopleurin-A an
CM Sephadex C-25, Sephadex G-50 und G-10 entsprechend dem in
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Beispiel 1, Stufen c, d und e, beschriebenen Verfahren erneut chromatographiert. Das doppelt gereinigte Material wird
unter Verwendung im Handel erhältlicher, vorgegossener 12#iger Acrylamidgels und passender Puffersysteme, erhältlich von
Bio Rad Laboratories, 32nd and Griffin, Richmond, Californien,
der elektrophoretischen Analyse unterworfen.
Die isoelektrische Fokussierung ergibt den isoelektrischen
Punkt bei einem pH-Wert von 8,2. Scheibengelelektrophorese mit 12%igem Polyacrylamidgel bei pH 3»6 ergibt einen R^-Wert von
0,46 gegenüber einem gleichlaufenden Methylgrünfarbstoff. AP-A tritt in ein basisches Gel bei pH 8,9 nicht ein, was
ein mögliches Fehlen verfügbarer Carboxylgruppen anzeigt. Natriumdodecylsulfat (SDS)-Scheibengelelektrophorese unter
Verwendung von 1Obigem Gel zeigt eine Molekulargewicht von
etwa 4700 nach der Inkubierung mit Dithioerythrit unter Verwendung
von RNase A und pankreatisehern Trypsin-Inhibitor (PTI) zum Vergleich an. Das Molekulargewicht ist so niedrig,
daß diese Werte nur ungefähre Werte sind. Aufgrund des Verlustes der biologischen Aktivität nach der Behandlung mit
proteolytischen Enzymen wurde festgestellt, daß AP-A ein Peptid ist.
Aminosäurensequenz des analytisch reinen S-carboxymethylierten
Anthopleurins-A ergibt die folgende Sequenz (in Übereinstimmung mit der Aminosäureanalyse eines Hydrolysats): GIy-Val-Ser-Cys-Leu-Cys-Asp-Ser-Asp-Gly-Pro-Ser-Val-Arg-Gly-Asn-Thr-Leu-Ser-Gly-Thr-Leu-Trp-Leu-Tyr-Pro-Ser-Gly-Cys-Pro-Ser-Gly-Trp-Hi
s-Asn-Cys-Lys-AIa-His-Gly-Pro-Thr-Ile-Gly-Trp-Cys-Cys-Lys-GIn.
Diese Sequenz entspricht einem Molekulargewicht von 5183 Dalton.
Die abgekürzten, für die Aminosäurekomponenten verwendeten Bezeichnungen
sind die folgenden:
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Lys Lysin
His Histidin
Arg Arginin
Asp Asparaginsäure
Thr Threonin
Ser Serin
GIn Glutamin
Pro Prolin
GIy Glycin
AIa Alanin
Cys Cystein
VaI Valin
He Isoleucin
Leu Leucin
Tyr Tyrosin
Trp Tryptophan
Asn Asparagin
Anthopleurin ist bei neutralen und niedrigen pH-Werten relativ stabil und in entionisiertem Wasser sehr löslich.
Anthopleurin kann weiter durch seine pharmakologischen Eigenschaften
charakterisiert werden. Die pharmakologischen Eigenschaften ergeben, daß Anthopleurin-A etwa 200 bis 1000 Mal
so potent ist wie Ouabain in der positiven inotropen Wirkung mit einem EDcQ-Wert bei 1,1 χ 10~" M auf isolierte Meerschweinchen-
Atria . Der LDcQ-Wert bei Mäusen (i.p.) beträgt
etwa 0,2 bis 0,3 mg/kg. Es zeigt keinerlei chronotrope Wir-
kung. Bei 3 x 10" M Konzentrationen von Anthopleurin-A wird keines der folgenden Enzyme inhibiert: Na, K-ATPase;
Monoamin-oxydase; Catechol-O-methyltransferase; cyclische
3',5'-Nucleotid-Phosphodiesterase; noch beeinflußt es den
3« ,5'-cyclischen AMP-Gehalt des Meerschweinchenherzens. Anthopleurin-A
ist nicht annähernd so empfindlich gegenüber Ca -
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Konzentrationen wie Ouabain. AP-A zeigt eine positive inotrope Wirkung an Atria in Anwesenheit von niedrigen Ca++-Konzentrationen.
Erniedrigte externe K+-Werte ergeben keine Erhöhung der Toxizität des Arzneimittels, wie bei Ouabain. Es
wurde gezeigt, daß Anthopleurin-A ein wirksames Cardiotonikum bzw. herzstärkendes Mittel beim isolierten Herzen
von Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Hunden und Katzen ist, und in dem in situ Herzen bei Hunden und Katzen. Es
besitzt eine vernachlässigbare Wirkung auf den Blutdruck und keine erkennbare mechanische Wirkung auf den isolierten
vaskulären Muskel.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Anthopleura xanthogrammica (Brandt)-Proben werden gesammelt, in 95%igem Äthanol konserviert und bei 40C vor der Extraktion
gelagert. Nasse Anemonen (5»5 kg), von denen das Wasser abgelaufen ist, werden in <■ 2cm Stücke geschnitten und ansatzweise
in einem Mischer während 5 min mit 27 1 3O#igem Äthanol homogenisiert. Das Äthanolvolumen schließt das
Äthanol, das zur Konservierung der Proben verwendet wurde, mit ein. Das Gemisch wird 1 Woche bei 2O°C bei gelegentlichem
Umrühren stehengelassen und dann durch sechs Schichten Mull filtriert. Das Filtrat wird bei ^4O0C auf etwa 2,5 1
flashdestilliert (d.h. unter Entspannung destilliert) und mit 12,5 1 Chloroform ansatzweise verteilt, wobei man gut
mischt und anschließend 30 min bei 27 000 χ g zentrifugiert. Man erhält 13 g in Chloroform lösliche Stoffe, 19,5 g Grenzflächenfeststoffe
und 256 g (lyophilisiertes Gewicht) wasserlösliche Stoffe, die das Anthopleurin-A enthalten.
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256 des rohen, wasserlöslichen Extrakts, der Anthopleurin-A
enthält, werden in vierzig gleiche Teile für die chromatographische
Trennung an Sephadex G-50 mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals) getrennt.
Eine 53 x 8,3 cm Säule, die 2600 ml nasses Sephadex G-50 (Vo = 825 ml) enthält, wird mit 0,1 M NH4HCO3, gesättigt
mit Chloroform (zur Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen) äquilibriert. 50 ml Wasser, das 6,4 g des rohen,
wasserlöslichen, Anthopleurin-A enthaltenden Extrakts enthält, werden auf die Säule gegeben und mit 0,1 M NH4HCO3 bei
8 bis 9 ml/min bei Zimmertemperatur eluiert. In der folgenden Tabelle I sind in Spalte 1 die Bereiche der Ve/Vo-Werte für
jede gesammelte Fraktion und in Spalte 2 das Gewicht des Rückstands, das bei der Lyophilisxerung von jeder Fraktion
erhalten wird, aufgeführt.
Frak- Bereich der tion Ve/Vo-Werte, in dem die Fraktion gesammelt wurde
Gewicht des Konzentration Rückstands in ppm der nach der Lyo- Testlösung
philisierung
g
g
^Zunahme in d.kontraktilen Kraft
(Zeit bis zum Maximum in min)
A | 0,95 | - 1,18 |
B | 1,18 | - 1,84 |
C | 1,84 | - 2,57 |
D | 2,57 | - 3,08 |
E 3,08 - 3,38 F 3,38 - 4,10
0,215
0,107
0,107
0,163
5,034
5,034
0,73
0,04
0,04
0,4
100 (6 min) 120 (5 min)
0
30
30
(4 min)
Die Ergebnisse der Bioassays für die kontraktile Kraft isolierter Rattenatria wurden, wie in dem Teil mit der Überschrift
"Bioassay", wie in Tabelle I, Spalte 4, aufgeführt,
durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen keine Aktivität bei den Schnitten A, E und F. Die Fraktion C enthält ca. 99# der
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herztonischen Aktivität. Insgesamt 6,4 g Fraktion C werden so aus 256 g des wasserlöslichen, bei der Stufe a erhaltenen
Rohmaterials erzeugt.
Ein 610 mg-Teil der bei der Stufe b erhaltenen Fraktion C wird
in 5 ml 0,03 M Nax(PO4) -Puffer bei pH 7,5 gelöst und auf eine
48 χ 4 cm Säule (Vo = 205 ml) gegeben, die 6OO ml nasses Kationenaustauschharz
CM-Sephadex C-25 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals), äquilibriert mit dem gleichen Puffer, gesättigt
mit Chloroform, enthält. Ein gerührtes Reservoir von 1500 ml des Puffers wird mit der Säule verbunden, und nachdem
110 ml Puffer durch die Säule geflossen sind, wird das Reservoirvolumen konstant durch Beschickung mit einem
0,03 M Nax(PO4) -Puffer 0,5 M in NaCl, eingestellt auf
einen pH-Wert von 7,5, für die Gradienteneluierung gehalten. Beide Lösungen sind mit Chloroform gesättigt. Die Strömungsrate von etwa 3 ml/min wird aufrechterhalten, und der Versuch
wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der Abstrom wird unter Verwendung eines UV-Absorption bei 280 nm mit
einem Modell UA-5 Absorbance Monitor, erhalten von Instrument Specialties Company, P.O. Box 5247, 4700 Superior Street,
Lincoln, Nebraska 68505, gemessen. Die Fraktion, die einen Ve/Vo-Bereich zwischen 2,99 und 3,39 und zentriert bei
Ve/Vo 3,17 besitzt, wird als Fraktion G bezeichnet und entsprechend dem Bioassay, wie unter der Überschrift "Bioassay"
beschrieben ist, ist diese Fraktion aktiv. Die Fraktion G wird lyophilisiert; man erhält 610 mg Material, das
Anthopleurin-A, vermischt mit Salzen, enthält. Die Fraktion G wird bei -200C gehalten und für alle pharmakologisehen
Untersuchungen verwendet.
Anthopleurin-A zeigt keine Anzeichen für die Zersetzung, wenn es ein Jahr bei -20°C als lyophilisierte Fraktion C, erhal-
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ten bei der Stufe b, oder als lyophilisierte Fraktion G aufbewahrt
wird. Die Fraktion G ist während mindestens 24 h bei 20,5°C in 10~7 Mol-Lösungen bei pH 4,55 bis 7,80 stabil,
sie zeigt jedoch einen etwa 90#igen Verlust ihrer herztonischen Aktivität bei einem pH-Wert über 11.
Die bei der Stufe c erhaltene Fraktion G wird weiter durch
Gelfiltrationschromatographie an Sephadex G-50 mit einer Ausschlußgrenze
von 30 Ό00 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals) gereinigt. Eine 50 ml Bürette (54 χ 1,2 cm) (Vo = 21,1 ml),
die 52 ml nasses G-50 enthält, wird mit 0,017 M CH^COOH,
0,03 M in NaCl, gesättigt mit Chloroform, äquilibriert. Eine Lösung aus 102,6 mg Fraktion G, gelöst in 0,4 ml H2O, wird
auf die Säule gegeben und dann wird bei Zimmertemperatur mit der Äquilibrierungslösung eluiert. Die Fraktion H wird
bei Ve/Vo 1,66 bis 2,16, zentriert bei Ve/Vo 1,86, gesammelt.
Vor der Fraktion H tritt kein Material, das UV absorbiert, bei 280 nm auf, und anschließend tritt nur eine Spur auf. Die
Fraktion H wird lyophilisiert; man erhält 20 mg Anthopleurin-A (einschließlich von NaCl).
Das Salz wird unter Verwendung einer mit Sephadex G-10 mit
einer Ausschlußgrenze von 700 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals) gepackten Säule entfernt. Die 20 mg Fraktion H,
erhalten in Stufe d, werden in 0,3 ml 1Oxigen NaCl gelöst
und auf eine mit 54 ml nassem Sephadex G-10 gepackte, 59 x 1,2 cm Säule, die mit 0,017 M Essigsäure, gesättigt
mit Chloroform, äquilibriert ist, gegeben. Auf die Probe gibt man 0,5 ml 10biges NaCl und dann die Äquilibrierungslösung.
Anthopleurin-A fällt vollständig und scharf bei einem Leervolumen (Ve/Vo 0,93 bis 1,12) aus und ist salzfrei. Es wird
sofort lyophilisiert; man erhält 1,4 mg 30 bis 80# reines Anthopleurin-A.
- 15 - . 709847/0869
2770041
Das gemäß den Stufen a bis e erhaltene Peptid (?OO mg) wird
in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule (34 χ 2,0 cm) aus Sephadex G-25, fein, in destilliertem Wasser
gegeben. Die Elution mit destilliertem Wasser ergibt die Hauptmenge des aktiven Peptids (90^) 75% rein bei Ve/Vo zwischen
1,3 und 1,7, während der Rest des aktiven Peptids mit 0,2 M NHaOAc rein eluiert wird. Das lyophilisierte Peptid (113 mg)
wird erneut in destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule (30 χ 1,5 cm) aus Cellex-SE Cellulose (Bio Rad Laboratories,
Richmond, Californien), äquilibriert mit 0,05 M Pyridin,
mit einem mit Essigsäure auf 2,7 eingestellten pH-Wert, gegeben. Das aktive Peptid wird rein mit einem linearen
Gradienten von je 300 ml 0,05 M Pyridinacetat, pH 2,7, und 0,2 M Pyridinacetat, pH 3,1, in einem Gebiet, entsprechend
0,1 M Pyridinacetat, eluiert. Es wird lyophilisiert; man erhält 80 mg >95% reines Anthopleurin-A.
Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Anthopleurin-A wird mit hydrolysierter,
steriler Gelatine im einer Menge von 3»5/ug Anthopleurin-A zu etwa 10 mg hydrolysierter Gelatine vermischt
und in sterilen Ampullen, die in Stickstoffatmosphäre abgedichtet werden, unter Verwendung an sich bekannter Verfahren
abgepackt. Das AP-A wird zum Zeitpunkt des Gebrauchs durch Zugabe von 1 ml sterilem Wasser rekonstituiert. Die
injizierbare Lösung ist für die Verabreichung während einer Stunde für ein Körpergewicht von 70 kg geeignet.
Ende der Beschreibung.
- 16
709847/0869
Claims (7)
- University of Hav/ai 15 881YPatentansprüche1 .J Als Anthopleurin-A bezeichnetes Peptid mit derfolgenden Aminosäuresequenz:Gly-Val-Ser-Cys-Leu-Cys-Asp-Ser-Asp-Gly-Pro-Ser-Val-Arg-Gly-Asn-Thr-Leu-Ser-Gly-Thr-Leu-Trp-Leu-Tyr-Pro-Ser-Gly-Cys-Pro-Ser-Gly-Trp-His-Asn-Cys-Lys-Ala-His-Gly-Pro-Thr-Ile-Gly-Trp-Cys-Cys-Lys-Gln.
- 2. Verfahren zur Herstellung von Anthopleurin-A aus Seeanemomen, dadurch gekennzeichnet, daß man(a) die Seeanemonen mit Wasser oder mit einem wäßrigen-alkoholischen Gemisch extrahiert,(b) den Extrakt der Gelfiltrationschromatographie an einer Säule aus vernetztem Dextran unterwirft, mit NH^HCO,-Lösung eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert;(c) die aktive Fraktion an einer Säule aus Kationenaus tauschharz chromatographiert und mit einem Phosphatpuffer mit einem Gradienten von NaCl eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man(d) die bei (c) erhaltene, aktive Fraktion an einer Säule aus vernetztem Dextran chromatographiert, mit einer NaCl-Lösung eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert;(e) die bei (d) erhaltene, aktive Fraktion durch Chromatographie an einer Säule aus vernetztem Dextran und Elution mit verdünnter Essigsäure entsalzt und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.709847/0889
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Seeanemone Anthopleura xanthogrammica verwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man(a) die Seeanemone, Anthopleura xantogrammica, mit 30%igem wäßrigem Äthanol extrahiert,(b) den Extrakt der Gelfiltrationschromatographie an einer Säule mit vernetztem Carboxymethyldextran mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 unterwirft, mit 0,1 M NH^HCO,-Lösung eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert,(c) die aktive Fraktion an einer Säule mit schwach saurem Kationenaustauschharz chromatographiert, mit 0,03 M Phosphatpuffer bei pH 7,5 und einem Gradienten von 0,5n NaCl eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man(d) die bei (c) erhaltene, aktive Fraktionan einer Säule mit vernetztem Dextran mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 chroma tographiert, mit 0,017 M Essigsäure, die 0,03 M in NaCl ist, eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert;(e) die bei (d) erhaltene, aktive Fraktion entsalzt, indem man die Lösung aus aktiver Fraktion auf eine Säule mit vernetztem Dextran mit einer Ausschlußgrenze von 700 gibt, gefolgt von einer Lösung aus 20tflger Natriumchloridlösung und mit 0,017 M Essigsäure eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.
- 7. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Peptid nach Anspruch 1, vermischt oder zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, enthält.709847/0869
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