DE2405002B2 - Lösliches natives Kollagen aus menschlicher Plancenta sowie dieses als therapeutischen Wirkstoff enthaltendes Mittel - Google Patents
Lösliches natives Kollagen aus menschlicher Plancenta sowie dieses als therapeutischen Wirkstoff enthaltendes MittelInfo
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Description
Die Erfindung betrifft aus menschlicher Placenta gewonnenes lösliches natives Kollagen. Die Erfindung
betrifft weiterhin ein Mittel, das aus menschlicher Placenta gewonnenes lösliches natives Kollagen als therapeutischen
Wirkstoff enthält.
Kollagen ist ein faseriges Eiweiß, das je nach Ausgangsmaterial unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung
aufweist. Es ist wahrscheinlich dps häufigste Eiweiß im Tier- und Menschenkörper und
kommt hauptsächlich in Haut, Sehnen, Knochen und Bindegewebe vor. Frisch isoliertes Kollagen liegt in
Form von weißen, silber-glänzenden Faserbündeln vor, die unter dem Einfluß von Wärme und Wasser
schrumpfen. Um etwa 40% geschrumpftes Kollagen denaturiert und verliert damit seine natürlichen Eigenschaften.
Die kleinste Moleküleinheit des Kollagens ist das Tropokollagen vom Molekulargewicht 360000, das
aus drei in sich schraubenförmigen Ketten besteht, die helikal umeinander gedreht sind und durch Wasserstoffbindungen
miteinander verknüpft sind. Die endständigen Peptide der Tropokollagenmoleküle, die
Telopeptide, besitzen keine helikale Struktur. Die Kollagenfasern entstehen durch Aneinanderlagern
vieler Tropokollagenmoleküle. Solange das Kollagen, das im Gegensatz zu den meisten Proteinen des Tierkörpers
nicht am Stoffwechsel teilnimmt und deshalb altert, noch jung ist, ist es in verdünnten Säuren, Alkalien
und Salzlösungen löslich. Mit zunehmendem Alter vernetzen sich die Tropokollagenmoleküle durch
Ausbildung von Hauptvalenzen in steigendem Maße, wodurch das Kollagen unlöslich wird. Diese Quervernetzung
ist irreversibel und erfolgt insbesondere dann schnell, wenn die nicht-helikalen Telopeptide mit ihren
C- und N-terminalen Bereichen voll reaktionsfähig sind. Der Übergang des löslichen Kollagens in
seine unlösliche Form geschieht sowohl im Organismus als auch in vitro, sogar bei getrocknetem isoliertem
Kollagen und ist durch chemische oder physikalische Maßnahmen praktisch nicht steuerbar.
Da die Festigkeit des tierischen Gewebes in erster Linie durch die kollagenen Fasern bedingt ist, wurde
die Verwendung von Kollagen zur Beschleunigung der reparativen Vorgänge bei der Wundheilung untersucht.
Struck, H. und G. H. Engelhardt: Z. Gerontologie 5, 356-368 (1971). Die einzelnen künstlich
zugeführten löslichen Kollagenmoleküle vernetzen miteinander und mit dem im Gewebe, z. B. der
Wunde, neu gebildeten und vorhandenen Kollagen und bilden auf diese Weise das neue gesunde Gewebe
von hoher Beanspruchbarkeit und Reißfestigkeit. Durch Zusatz von nativem, löslichem Kollagen ist es
daher möglich, das Verhältnis lösliches Kollagen zu vemetztes unlösliches Kollagen in der Wunde zugunsten
des löslichen zu verschieben. Damit kann die Gewebsneubildung verbessert werden.
Wie aus vorstehendem klar wird, ist für diesen Zweck weder denaturiertes Kollagen noch unlösliches,
quervernetztes Kollagen geeignet. Daher lassen sich zur Beschleunigung der Wundheilung weder die
bekannten Kollagen-Hydrolysate, welche aus tierischen Knochen und Hufen durch Säure- oder enzymatische
Hydrolyse gewonnen werden, noch Gelatine, die aus ähnlichem Rohmaterial durch alkalischen
Aufschluß und Erhitzen gewonnen wird, verwenden. Bei diesen bekannten Kollagen-Produkten sind die
Tropokollagenmoleküle hydrolysiert und die helikale Struktur weitgehend cder vollständig zerstört, so daß
hieraus keine Kollagenfibrillen gebildet werden können.
Es sind auch Zubereitungen bekannt, die natives Kollagen aus dem Bindegewebe, meistens der Haut,
junger Tiere enthalten. Mit solchen tierischen Kollagenen wurden bei Versuchstieren, z. B. Ratten, deutliche
Steigerungen der Wundfestigkeit beobachtet. Im histologischen Bild erkennt man nach einer solchen
Kollagenapplikation eine früher und verstärkt einsetzende Fibroblastenbildung. Als Folge läßt sich dann
auch früher als bei den Kontrolltieren eine kräftige Faserneubildung feststellen. Solche Verbesserungen
der Wundheilung ließen sich experimentell sowohl mit autologen als auch mit heterologen Kollagenpräparaten
erzielen, wobei die löslichen Kollagenpräparationen aus Schweinehaut die geringste Antigenität unter
allen bisher untersuchten Spezies zeigten.
Jedoch ist die Anwendung von tierischem Kollagen auf den Menschen nicht nur wegen der antigenen Wirkung
mit einem hohen Risiko belastet. Da natives, lösliches Kollagen sehr schonend extrahiert werden
muß, besteht die Gefahr der Übertragung von Bakterien und latenter Viren vom Tier auf den Menschen,
die aus medizinischer Sicht nicht hingenommen werden kann. Daher wurden bisher tierische Kollagene
am Menschen nur mit großem Vorbehalt versuchsweise angewandt.
Aufgabe der Erfindung ist es, für medizinische und kosmetische Verwendung ein Kollagen zur Verfügung
zu stellen, das durch Anregung der Fibrillenbildung die Heilung von Bindegewebserkrankungen, Haut-
und Knochenerkrankungen ermöglicht und dabei jedes antigene und infektiöse Risiko vermeidet.
Der Fachmann, der sich die Aufgabe stellte, tierisches Kollagen für die Human-Medizin durch Hu-
man-KoUagen zu ersetzen, stand vor den folgenden
Schwierigkeiten:
Erstens waren keine zugänglichen Quellen bekannt, aus denen Human-Kollagen in löslicher, nativer
Form in ausreichender Menge beschafft werden konnte, und zweitens war ein Verfahren zur Gewinnung
von Human-Kollagen nicht bekannt.
Beide Schwierigkeiten werden durch die vorliegende Erfindung gelöst. Dabei lag es keineswegs nahe,
Human-Placenta als Ausgangsstoff zu verwenden, da deren genaue Gewebezusammensetzung bis zum heutigen
Tag nicht geklärt ist. Insbesondere war nicht bekannt, wie das darin enthaltene Kollagen sich auf die
drei wichtigsten Kollagen-Arten, nämlich
a) Pro-Kollagene
b) lösliches Kollagen
c) unlösliches Kollagen
aufteilt. Sowohl die Kollagen-Arten a) als auch c) sind
für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ungeeignet, da ski nicht zu löslichem nativem Kollagen führen.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß der Anteil an löslichem Kollagen b) in der Placenta relativ hoch
ist, so daß eine technische Gewinnung der erfindungsgemäßen Substanz erfolgversprechend erschien.
Bei dem Versuch, aus Placenta das erfindungsgemäße lösliche Human-Kollagen zu gewinnen, entstanden
jedoch weitere beträchtliche Schwierigkeiten. Es stellte sich nämlich heraus, daß die bekannten Verfahren
zur Gewinnung von animalischem Kollagen zur Lösung der gestellten Aufgabe ungeeignet sind und
auch nicht durch leichte Modifizierungen angepaßt werden können. Bei tierischem Kollagen wird nämlich
das Gewebe mit neutraler Salzlösung, z. B. NaCl-Losung, oder schwacher Säurelösung, z. B. Essigsäureoder
Zitronensäurelösung, extrahiert (vgl. Biochemistry 5, 3460-3473), insbesondere 3461 (1966).
Dagegen wird erfindungsgemäß mit einer Mischung, von Harnstoff und Äthylurethan, gegebenenfalls unter
Zusatz von Ascorbinsäure, extrahiert. Eine Überprüfung des erfindungsgemäß verwendeten Verfahrens
auf tierisches Kollagen ergab, daß unter denselben Bedingungen tierisches Kollagen teilweise
hydrolisiert und die helikale Struktur zerstört wird, wodurch das Kollagen denaturiert wird. Gleichzeitig
gehen dabei unerwünschte Substanzen in Lösung.
Die Schwierigkeiten der Herstellung des nativen Human-Kollagens lagen darin, daß das native Kollagen
in reiner Form gewonnen werden mußte, wobei chemisch ähnliche Substanzen abgetrennt werden
mußten und doch die helikale Struktur des Kollagens erhalten bleiben sollte.
Bis heute wurde nirgendwo in der Literatur die Isolierung des Kollagens aus Placenta beschrieben, obwohl
die Fachwelt sich diese Aufgabe bereits seit langer Zeit gestellt hat.
Gegenstand der Erfindung ist daher aus menschlicher Placenta gewonnenes lösliches natives Kollagen.
Das erfindungsgemäße Kollagen wird hergestellt, indem man die gereinigte Placenta in Anwesenheit
von Eis zerkleinert, in einer wäßrigen Salzlösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das vorwiegend aus Monomeren
bestehende Zentrifugat (A) abtrennt, den festen Rückstand in einer wäßrigen Harnstofflösung,
weiche zusätzliche Ascorbinsäure enthalten kann, in der Kälte rührt, zentrifgugiert, das Zentrifugat (B)
abtrennt und zur weiteren Extraktion mit einer Äthylurethan enthaltenden wäßrigen Lösung in der Kälte
rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (C) abtrennt, die
vereinigtenZentrifugate (A), (B) und (C) bis zur völligen
Ausfällung gegen Leitungswasser dialysiert, das ausgefallene unreine Kollagen abzentrifugiert, in verdünnter
wäßriger schwacher Carbonsäurelösung auflöst, durch Sättigung der Lösung mit Kochsalz von
letzten Verunreinigungen abtrennt und die reines Kollagen enthaltende Dispersion gefriertrocknet oder
in einer verdünnten Carbonsäurelösung aufbewahrt.
Vorzugsweise wird das Gewebe unter sterilen Bedingungen zerkleinert und bei Temperaturen unter
6° C gearbeitet.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwirft man das Zentrifugat (Λ) und verarbeitet
lediglich die vereinigten Zentrifugate (B) und (C) weiter zum Endprodukt. Weitere bevorzugte
Maßnahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind den folgenden Beispielen und den Patentansprüchen
zu entnehmen.
Gegenstand der Erfindung sind lediglich Mittel, die das erfindungsgemäße Kollagen als Wirksubstanz
enthalten.
Das erfindungsgemäße Kollagen wird aus Humanplacenta gewonnen, wobei die Placemen zusammen
mit den Nabelschnüren verarbeitet werden können. Das Ausgangsmaterial wird mit Wasser von unter
60C blutfrei gewaschen und vorzugsweise in Anwesenheit
von Eis fein zerkleinert. Hierbei hat es sich als günstig erwiesen, das Eis aus Leitungswasser, dem
Antiseptics in geringer Menge zugesetzt wurden, herzustellen.
Die Waschflüssigkeiten werden verworfen.
Eine erste Kollagenfraktion (A), die jedoch überwiegend monomolekulare Peptide enthält, wird durch
Rühren des zerkleinerten und vom Blut gereinigten Gewebes über längere Zeit, beispielsweise 12 bis 72 h,
in einer Salzlösung von Temperaturen unter 6° C gewonnen. Diese Fraktion kann zusammen mit den weiteren
Fraktionen zum Produkt aufgearbeitet werden, sie wird jedoch zur Erielung eines besonders wirksamen Produkts vorzugsweise verworfen. Der feste
Rückstand der ersten Extraktion wird mit einer Harnstofflösung, der noch Ascorbinsäure zugesetzt sein
kann, über längere Zeit in der Kälte behandelt, vorzugsweise in einem Rührwerk gerührt. Auch diese
Extraktion kann beispielsweise 12 bis 72 h fortgeführt werden. Es werden dabei etwa 60% des gesamten,
in der Placenta enthaltenen löslichen Kollages herausgelöst. Nach Zentrifugieren wird das Zentrifugat (ß)
abgetrennt und in der Kälte aufbewahrt, der Rückstand noch einmal extrahiert. Zur vollständigeren Extraktion
des Kollagens hat sich eine wäßrige Äthylurethanlösung
als besonders geeignet herausgestellt. Hiermit lassen sich innerhalb von etwa 12 bis 72 h
unter Rühren nahezu 40% des in der Placenta enthaltenen löslichen Kollagens extrahieren. Die überstehende
Flüssigkeit (C) wird abzentrifugiert und in der Kälte aufbewahrt.
Die abgetrennten Extrakte (A), (B) und (C), vorzugsweise jedoch nur die Extrakte (B) und (C) werden
gegen Leitungswasser dialysiert. Dabei fällt rohes Kollagen aus, das noch verschiedene unerwünschte
Gewebeeiweißstoffe und Verunreinigungen enthält, die unspezifische Reaktionen hervorrufen können und
daher in der Therapie kontraindiziert sein können. Es ist jedoch möglich, dieses rohe Kollagen in externer
Kosmetik, beispielsweise Hautpflegemitteln, zu verwenden. Zur Reinigung wird das Rohkollagen abzentrifugiert,
in einer schwachen Carbonsäure, vorzugsweise Essigsäure, Milchsäure oder Zitronensäure
gelöst und schließlich mit Kochsalz gesättigt. Hierdurch wird das reine Kollagen ausgefällt, während die
Verunreinigungen in der konzentrierten Salzlösung in Lösung bleiben.
Das reine Kollagen wird abzentrif ugiert, und entweder als solche oder nach Zugabs, einer Carbonsäure
oder eines Carbonsäurepuffers aufbewahrt oder gefriergetrocknet und dann aufbewahrt bzw. zu einem
Heilmittel durch Zugabe geeigneter Grundlagen und Trägerstoffe sowie Verarbeitungshilfsmittel verarbeitet.
Das abzentrif ugierte Kollagen wird vorzugsweise in einer Zitratpuffer- -Ketoglutarsäure-Lösung in
Konzentration von 1 bis 5% aufgelöst gelagert. Entweder wird das Kollagen in dieser Lösung angewendet
oder gefriergetrocknet und dann zu einem Heilmittel nach bekannten Verfahren konfektioniert.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Lösung, die das Endprodukt enthält, mit Gammastrahlen von etwa
5 M-Rad zu sterilisieren und in lichtundurchlässigen Behältern kühl aufzubewahren.
Das erfindungsgemäße Kollagen kann in der Medizin vielfältige Anwendung finden. Durch geeignete,
dem Fachmann geläufige Konfektionierungen lassen sich daraus Präparate herstellen, die zum Heilen von
Brandwunden, Wunden, mechanischen Verletzungen und Trauma ähnlicher Art, zur Korrektur oder Veränderung
von Wachstumsmißbildungen, zum Gebrauchin der kleinen und großen Chirurgie, zum Heilen
von Störungen oder Erkrankungen der Gelenkhaut an Knochen, Knorpeln und Sehnen sowie, zum
Heilen von Rheumatismus, Atherosclerose und ähnlichem geeignet sind.
10 kg Humanplacenta mit Nabelschnur werden in kaltem Wasser solange gewaschen, bis sie von Blut
und anderen Verunreinigungen frei sind. Das Ausgangsmaterial wird grob zerkleinert und mit Wasser
von 4 ° C weiter gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird verworfen.
Das Rohmaterial wird mit Hilfe eines Fleischwolfes in Anwesenheit von Eis, das 0,1% einer Mischung
und zwei Drittel Natriumbenzoat und ein Drittel Chloramin T enthält, fein zerkleinert und noch einmal
mit Wasser von 4° C so lange gewaschen, bis das Gewebe blutfrei ist. Die Waschflüssigkeit wird verworfen.
In 301 H2O werden 45 Mol = 263 Ig NaCl und
6 Mol = 852 g NaH2PO4 aufgelöst und in ein Rührwerk
gegeben. Das zerkleinerte und gereinigte Gewebe wird zugesetzt und über 48 h langsam in der
Kälte gerührt, anschließend portionsweise zentrifugiert und das Zentrifugat (A) abgetrennt.
Der Rückstand wird in ein Rührwerk gebracht, in 50 1 H2O, in dem 18 kg Harnstoff und 500 g Ascorbinsäure
aufgelöst wurden, gegeben und über 48 h langsam in der Kälte gerührt. Anschließend wird zentrifugiert
und die überstehende Flüssigkeit (B) abgetrennt und bei 4° C aufbewahrt.
Der feste Rückstand wird noch einmal in das Rührwerk gebracht und mit 301 H2O, das 3 kg Äthylurethan
(H2N-CO-OC2H5) gelöst enthält, gegeben und
über 48 h langsam in der Kälte gerührt. Anschließend wird die überstehende Flüssigkeit (C) abzentrif ugiert
und bei 4° C aufbewahrt.
Die abgetrennten Extrakte (B) und (C) werden zusammengegeben
und bis zur völligen Ausfällung (ca. 24 h) gegen Leitungswasser dialysiert. Das erhaltene
rohe Kollagen wird abzentrif ugiert, in 0,01 molarer Essigsäure suspendiert und bis zur Auflösung gerührt.
Die klare Lösung wird mit NaCl gesättigt, über Nacht stehen gelassen und anschließend ausgefällt und von
Verunreinigungen und überschüssigem Kochsalz durch Zentrifugieren abgetrennt.
Das Produkt wird in einer Zitratpuffer-ct-Ketoglurarsäure-Lösung,
die aus 147 g (0,5 Mol) Tri-Natriumzitrat-2-Hydrat und 21g (0,2 Mol) Zitronensäure
sowie 4,38 g (0,035 Mol) a-Ketoglutarsäure pro Liter H2O hergestellt wurde, in Konzentrationen
von 1 bis 5%, vorzugsweise 2%, aufgelöst.
Falls nötig, kann das so erhaltene lagerfähige Produkt
noch einmal zentrifugiert und das y-Strahlen von 5 M-Rad sterilisiert werden. Anschließend wird es in
lichtunduichlässigen Behältern kühl aufbewahrt.
Das so erhaltene Produkt ist eine farblose silberglänzende leicht trübe kolloidale Lösung, die Viskositäten
zwischen 10 und 20 dl/g (15° C) besitzt. Ihr pH-Wert liegt zwischen 3 und 5, die optische Drehung
[α] 360 πιμ beträgt 0,8 bis 1,4. Die Lösung ist geruchlos.
Das UV-Spektrum hat einen Peak bei 275 nm.
Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird das erhaltene rohe Kollagen statt in Essigsäure in verdünnter
Milchsäure suspendiert.
Claims (2)
1. Lösliches natives Kollagen aus menschlicher Placenta, dadurch gekennzeichnet, daß es
hergestellt worden ist, irdem man gereinigte Placenta in Anwesenheit von Eis unter sterilen Bedingungen
zerkleinert, in einer wäßrigen Salzlösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das
vorwiegend aus monomeren Peptiden bestehende Zentrifugat (Λ) abtrennt, den festen Rückstand
in einer wäßrigen Harnstofflösung, welche zusätzlich Ascorbinsäure enthalten kann, in der Kälte
rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (fi) abtrennt und zur weiteren Extraktion mit einer Äthylurethan
enthaltenden wäßrigen Lösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (Q abtrennt,
die vereinigten Zentrifugate (A), (·Β) und (C) bis zur völligen Ausfällung gegen Leitungswasser dialysiert,
das ausgefallene unreine Kollagen abzentrifugiert, in verdünnter wäßriger schwacher Carbonsäure
auflöst, durch Sättigen der Lösung mit Kochsalz von letzten Verunreinigungen abtrennt
und gefriertrocknet oder in einer verdünnten Carbonsäurelösung, insbesondere in Zitratpuffer
α-Ketoglutarsäurelösung aufbewahrt.
2. Mittel enthaltend das Kollagen nach Anspruch 1 als therapeutischen Wirkstoff.
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| DE19742405002 DE2405002B2 (de) | 1974-02-02 | 1974-02-02 | Lösliches natives Kollagen aus menschlicher Plancenta sowie dieses als therapeutischen Wirkstoff enthaltendes Mittel |
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