DE2462222A1

DE2462222A1 - Loesliches, natives human-kollagen, dessen nicht-helikale peptide teilweise oder vollstaendig abgetrennt sind

Info

Publication number: DE2462222A1
Application number: DE19742462222
Authority: DE
Inventors: Spaeter Genannt Werden Wird
Original assignee: TROMMSDORFF FA H
Current assignee: TROMMSDORFF FA H
Priority date: 1974-02-02
Filing date: 1974-02-02
Publication date: 1976-05-06

Description

Lösliches, natives Human-Kollagen, dessen nicht-helikale Peptide teilweise oder vollständig abgetrennt sind.
(1. Ausscheidung aus Patent/Patentanmeldung P 24 05 002.0-41) Die Erfindung betrifft aus Humangewebe, insbesondere Placenta, gewonnenes lösliches natives Kollagen, das durch partielles oder vollständiges Abtrennen der nicht-helikalen Peptide modifiziert ist, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Heilmittel, das aus Humangewebe gewonnenes, lösliches, natives Human-Kollagen in der modifizierten Form enthält.
Kollagen ist ein faseriges Eiweiß, das je nach Ausgangsmaterial unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung aufweist.
Es ist wahrscheinlich das häufigste Eiweiß im Tier- und Menschenkörper und kommt hauptsächlich in Haut, Sehnen, Knochen und Bindegewebe vor. Frisch isoliertes Kollagen liegt in Form von weißen, silber-glänzenden Faserbündeln vor, die unter dem Einfluss von Wärme und Wasser schrumpfen. Um etwa 40 % geschrumpftes Kollagen denaturiert und verliert damit seine natürlichen Eigenschaften.
Die kleinste Moleküleinheit des Kollagens ist das Tropokollagen vom Molekulargewicht 360.000, das aus drei in sich schraubenförmigen Ketten besteht, die helikal umeinander gedreht sind und durch Wasserstoffbindungen miteinander verknüpft sind. Die endständigen Peptide der Tropokollagenmoleküle, die Telopeptide, besitzen keine helikale Struktur.
Die Kollagenfasern entstehen durch Aneinanderlagern vieler Tropokollagenmoleküle. Solange das Kollagen, das im Gegensatz zu den meisten Proteinen des Tierkörpers nicht am Stoffwechsel teilnimmt und deshalb altert, noch jung ist, ist es in verdünnten Säuren, Alkalien und Salzlösungen löslich. Mit zunehmendem Alter vernetzen sich die Tropokollagenmoleküle durch Ausbildung von Hauptvalenzen in steigendem Maße, wodurch das Kollagen unlöslich wird. Diese Quervernetzung ist irreversibel und erfolgt insbesondere dann schnell, wenn die nicht-helikalen Telopeptide mit ihren C- und N-terminalen Bereichen voll reaktionsfähig sind.
Der Ubergang des löslichen Kollagens in seine unlösliche Form geschieht sowohl im Organismus als auch in vitro, sogar bei getrocknetem isoliertem Kollagen und ist durch chemische oder physikalische Maßnahmen praktisch nicht steuerbar.
Da die Festigkeit des tierischen Gewebes in erster Linie durch die kollagenen Fasern bedingt ist, wurde die Venencnc von Kollagen zur Beschleunigung der reparativen Vorgange bei der Wundheilung untersucht. Die einzelnen künstlich zugeführten löslichen Kollagenmoleküle vernetzen miteinander und mit dem im Gewebe, z.B. der Wunde, neu gebildeten und vorhandenen Kollagen und bilden auf diese Weise das neue cesunde Gewebe von hoher Beanspruchbarkeit und Reißfestigkeit.
Durch Zusatz von nativem, löslichem Kollagen ist es daher möglich, das Verhältnis lösliches Kollagen zu vernetztes unlösliches Kollagen in der Wunde zugunsten des löslichen zu verschieben. Damit kann die Gewebsneubildung verbessert werden.
+) Struck, H. und G.H. Engelhardt: Z. Gerontologie 5, 356-368 (1971> Wie aus vorstehendem klar wird, ist für diesen Zweck weder denaturiertes Kollagen noch unlösliches, quervernetztes Kollagen geeignet. Daher lassen sich zur Beschleunigung der Wundheilung weder die bekannten Kollagen-Hydrolysate, welche aus tierischen Knochen und Hufen durch säure- oder enzymatische Hydrolyse gewonnen werden, noch Gelatine, die aus ähnlichem Rohmaterial durch alkalischen Aufschluss und Erhitzen gewonnen wird, verwenden. Bei diesen bekannten Kollagen-Produkten sind die Tropokollagenmoleküle hydrolysiert und die helikale Struktur weitgehend oder vollständig zerstört, so daß hieraus keine Kollagenfibrillen gebildet werden können.
Es sind auch Zubereitungen bekannt, die natives Kollagen aus dem Bindegewebe, meistens der Haut, junger Tiere enthalten.
Mit solchen tierischen Kollagenen wurden bei Versuchstieren, z.B. Ratten, deutliche Steigerungen der Wundfestigkeit beobachtet. Im histologischen Bild erkennt man nach einer solchen Krllagenapplikation eine früher und verstärkt einsetzende Fibroblastenbildung. Als Folge läßt sich dann auch früher als bei den Kontrolltieren eine kräftige Faserneubildung feststellen. Solche Verbesserungen der Wundheilung ließen sich experimentell sowohl mit autologen als auch mit heterologen Xollagenpräparaten erzieien, wobei die löslichen Xollagenpräparationen aus Schweinehaut die geringste Antigenität unter allen bisher untersuchten Spezies zeigten.
Jedoch ist die Anwendung von tierischem Kollagen auf den Menschen nicht nur wegen der antigenen Wirkung mit einet hohen Risiko belastet. Da natives, lösliches Kollagen sehr schonend extrahiert werden muß, besteht die Gefahr der Übertragung von Bakterien und latenter Viren vom Tier auf den Menschen, die aus medizinischer Sicht nicht hingenommen werden kann. Daher wurden bisher tierische Kollagene am Menschen nur mit großem Vorbehalt versuchsweise angewandt.
Aufgabe der Erfindung ist es, für medizinische Verwendung ein Kollagen zur Verfügung zu stellen, das durch Anregung der Fibrillenbildung die Heilung von Bindegewebserkrankungen, Haut- und Knochenerkrankungen ermöglicht und dabei jedes antigene und infektiöse Risiko vermeidet. Gegenstand der Erfindung ist daher aus Humangewebe, insbesondere Placenta, gewonnenes, lösliches, natives Human-Kollagen, dessen nichthelikale Peptide teilweise oder vollständig abgetrennt sind.
Die Erfindung besteht weiterhin in einem Verfahren zur Herstellung solchen Kollagens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das gereinigte Humangewebe in Anwesenheit von Eis unter sterilen Bedingungen zerkleinert, in einer wässrigen Salzlösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das vorwiegend aus Monomeren bestehende Zentrifugat (A) abtrennt, den festen Rückstand in einer wässrigen Harnstofflösung, welche zusätzlich Ascorbinsäure enthalten kann, in der Kälte rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (B) abtrennt und zur weiteren Extraktion mit einer Äthylurethan enthaltenden wässrigen Lösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (C) abtrennt, die vereinigten Zentrifugate (A), (B) und (C) bis zur völligen Ausfällung gegen Leitungswasser dialysiert, das ausgefallene unreine-Kollagen abzentrifugiert, in verdünnter wässriger Carbonsäurelösung auflöst, durch Sättigen der Lösung mit einem Salz, vorzugsweise Kochsalz, von letzten Verunreinigungen abtrennt, in einem geeigneten Dispergiermittel dispergiert und die reines Kollagen enthaltende Dispersion von einer Pepsin oder Ficin enthaltenden wässrigen Lösung von pH 1 bis 4, vorzugsweise 2, 10 bis 50 h lang bei -etwa 250C behandelt, dann mit einer Base, vorzugsweise Natronlauge, neutralisiert, gegen Leitungswasser dialysiert und das ausgefallene, teilweise oder vollständig von nichthelikalen Peptiden befreite Kollagen abzentrifugiert und in einer verdünnten Carbonsäurelösung aufbewahrt. Vorzugsweise wird bei Temperaturen unter 60C gearbeitet.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwirft man das Zentrifugat (A) und verarbeitet lediglich die vereinigten Zentrifugate (B) und (C) weiter zum Endprodukt.
Weiterebevorzugte Maßnahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind den folgenden Beispielen und den Patentansprüchen zu entnehmen.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich Heilmittel, die das erfindungsgemäße Kollagen als Wirksubstanz enthalten.
Das erfindungsgemäße Kollagen wird vorzugsweise aus Humanplacenta gewonnen, wobei die Placenten zusammen mit den Nabelschnüren verarbeitet werden können. Das Ausgangsmaterial wird mit Wasser von unter 60C blutfrei gewaschen und vorzugsweise in Anwesenheit von Eis fein zerkleinert. Hierbei hat es sich als günstig erwiesen, das Eis aus Leitungswasser, dem Antiseptica in geringer Menge zugesetzt wurden, herzustellen.
Die Waschlflüssigkeiten werden verworfen.
Eine erste Kollagenfraktion (A), die jedoch überwiegend monomolekulare Peptide enthält, wird durch Rühren des zerkleinerten und vom Blut gereinigten Gewebes über längere Zeit, beispielsweise 12 bis 72 h, in einer Salzlösung von Temperaturen unter 6"C gewonnen. Diese Fraktion kann zusammen mit den weiteren Fraktionen zum Produkt aufgearbeitet werden, sie wird jedoch zur Erzielung eines besonders wirksamen Produkts vorzugsweise verworfen. Der feste Rückstand der ersten Extraktion wird mit einer Harnstofflösung, der noch Ascorbinsäure zugesetzt sein kann, über längere Zeit in der Kälte behandelt, vorzugsweise in einem Rührwerk gerührt. Auch diese Extraktion kann beispielsweise 12 bis 72 h fortgeführt werden. Es werden dabei etwa 60 % des gesamten, in der Placenta enthaltenen löslichen Kollagens herausgelöst. Nach Zentrifugieren wird das Zentrifugat (B) abgetrennt und in der Kälte aufbewahrt, der Rückstand noch einmal extrahiert. Zur vollständigeren Extraktion des Kollagens hat sich eine wässrige Äthylurethanlösung als besonders geeignet herausgestellt. Hiermit lassen sich innerhalb von etwa 12 bis 72 h unter Rühren nahezu 40 % des in der Placenta enthaltenen löslichen Kollagens extrahieren. Die überstehende Flüssigkeit (C) wird abzentrifugiert und in der Kälte aufbewahrt.
Die abgetrennten Extrakte (A), (B) und (C), vorzugsweise jedoch nur die Extrakte (B) und (C) werden gegen Leitungswasser dialysiert. Dabei fällt rohes Kollagen aus, das noch verschiedene unerwünschte Gewebeeiweißstoffe und Verunreinigungen enthält, die unspezifische Reaktionen hervorufen können und daher in der Therapie kontraindiziert sein können. Es ist jedoch möglich, dieses rohe Kollagen in externer Kosmetik, beispielsweise Hautpflegemitteln, zu verwenden. Zur Reinigung wird das Rohkollagen abzentrifugiert, in einer schwachen Carbonsäure, vorzugsweise Essigsäure, Milchsäure oder Zitronensäure gelöst und schließlich mit einem geeigneten Salz, vorzugsweise Kochsalz, gesättigt. Hierdurch wird das reine Kollagen ausgefällt, während die Verunreinigungen in der konzentrierten Salzlösung in Lösung bleiben.
Das erhaltene reine Kollagen wird durch Abbau der Telopeptide modifiziert. Dies hat den Vorteil, daß die Vernetzungsreaktion und schnelle Bildung von unlöslichem Kollagen langsamer vonstatten gehen, so daß sowohl die Halbarkeit des Kollagens verbessert wird als auch die Wirksamkeit bei der medizinischen oder kosmetischen Anwendung erhöht wird. Die Abspaltung wird mit bekannten proteolytischen Enzymen, wie Pepsin oder Ficin in saurem Medium durchgeführt. So gibt man beispielsweise auf 100 1 H20 65 bis 110 g Pepsin, stellt mit Salzsäure auf pH 1 bis 4 ein und löst anschließend das gereinigte extrahierte Kollagen. Die Einwirkungszeit kann bei etwa 250C 10 bis 50 h betragen. Die Menge der abgespaltenen Telopeptide ist der Dauer der enzymatischen Einwirkung nahezu proportional. Erfindungsgemäß werden jedoch nur bis zu etwa 85 % der Telopeptide abgebaut. Ein Produkt mit 15 bis 40 % an Telopeptiden hat sich als besonders wirksam erwiesen.
Anschließend wird mit Lauge, vorzugsweise 1 n Natronlauge neutralisiert und gegen Leitungswasser -dialysiert. Dabei fällt das modifizierte Kollagen aus, das abzentrifugiert wird und als solches, vorzugsweise aber in einer Zitratpuffer-d-Ketoglutarsäure-Lösung in Konzentrationen von 1 bis 5 % aufgelöst, gelagert wird. Entweder wird das modifierte Kollagen in dieser Lösung angewendet oder gefriergetrocknet und dann zu einem.
Heilmittel oder kosmetischen Mittel nach bekannten Verfahren konfektioniert.
Es'hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Lösung, die das Endprodukt enthält, mit Gammastrahlen von etwa 5 M-Rad zu sterilisieren und in lichtundurchlässigen Behältern kühl aufzubewahren.
Das erfindungsgemäße modifizierte oder unmodifizierte Kollagen kann in der Medizinvielfältige Anwendung finden. Durch geeignete, dem Fachmann geläufige Konfektionierungen lassen sich daraus Präparate herstellen, die zum Heilen von Brandwunden, Wunden, mechanischen Verletzungen und Trauma ähnlicher Art, zur Korrektur oder Veränderung von Wachstumsmißbildungen, zum Gebrauch in der kleinen und großen Chirurgie, zum Heilen von Störungen oder Erkrankungen der Gelenkhaut an Knochen, Knorpeln und Sehnen sowie zum Heilen von Rheumatismus, Atherosclerose und ähnlichem geeignet sind.
Weiterhin lassen sich daraus Präparate herstellen, die die Alterung, insbesondere der Haut, aufschieben. Für solche Anwendungen ist in der Kosmetik ein großes Bedürfnis vorhanden.
Beispiel 1 10 kg Humanplacenta mit Nabelschnur werden in kaltem Wasser solange gewaschen, bis sie von Blut und anderen Verunreinigungen frei sind. Das Ausgangsmaterial wird grob zerkleinert und mit Wasser von 40C weiter gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird verworfen.
Das Rohmaterial wird mit Hilfe eines Fleischwolfes in Anwesenheit von Eis, das 0,1 % einer Mischung von zwei Drittel Natriumbenzoat und ein Drittel Chloramin T enthält, fein zerkleinert und noch einmal mit Wasser von 40C solange gewaschen, bis das Gewebe blutfrei ist. Die Waschflüssigkeit wird verworfen.
In 30 1 H20 werden 45 Mol = 2631 g NaCl und 6 Mol = 852 g NaH2P04 aufgelöst und in ein Rührwerk gegeben. Das zerkleinerte und gereinigte Gewebe wird zugesetzt und über 48 h langsam in der Kälte gerührt, anschließend portionsweise zentrifugiert und das Zentrifugat (A) abgetrennt.
Der Rückstand wird in ein Rührwerk gebracht, in 50 1 H20, in dem 18 kg Harnstoff und 500 g Ascorbinsäure aufgelöst wurden, gegeben und über 48 h langsam in der Kälte gerührt.
Anschließend wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit (B) abgetrennt und bei 40C aufbewahrt.
Der feste Rückstand wird noch einmal in das Rührwerk gebracht und mit 30 1 H20, das 3 kg Äthylurethan (H2N-CO-OC2H5) gelöst enthält, gegeben und über 48 h langsam in der Kälte gerührt.
Anschließend wird die überstehende Flüssigkeit (C) abzentrifugiert und bei 40C aufbewahrt.
Die abgetrennten Extrakte (B) und (C) werden zusammengegeben und bis zur völligen Ausfällung (ca. 24 h) gegen Leitungswasser dialysiert. Das erhaltene rohe Kollagen wird abzentrifugiert, in 0,01 molarer Essigsäure suspendiert und bis zur Auflösung gerührt. Die klare Lösung wird mit NaCl gesättigt, über Nacht stehengelassen und anschließend ausgefällt und von Verunreinigungen und überschüssigem Kochsalz durch Zentrifugieren abgetrennt.
Zur Teilabspaltung der nicht-helikalen Peptide wird eine Lösung von 65 bis 110 g Pepsin in 100 1 H20 hergestellt und mit HCl auf pH 2 angesäuert. In diese Lösung wird etwa 1 kg des aus den Extrakten (B) und (C) gewonnenen reinen Kollagens gegeben und bis zum vollständigen Lösen gerührt (ca. 24 h bei 25"C), danach mit 1 n NaOH neutralisiert und über Nacht gegen Leitungswasser dialysiert. Das ausgefallene modifizierte Kollagen (Produkt) wird abzentrifugiert.
Das Produkt wird in einer Zitratpuffer-«-Ketoglutarsäure-Lösung, die aus 147 g (0,5 Mol) Tri-Natriumzitrat-2-Hydrat und 21 g (0,2 Mol) Zitronensäure sowie 4,38 g (0,035 Mol) s-Ketoglutarsäure pro Liter H20 hergestellt wurde, in Konzentrationen von 1 bis 5 %, vorzugsweise 2 %, aufgelöst.
Falls nötig, kann das so erhaltene lagerfähige Produkt noch einmal zentrifugiert und durch -Strahlen von 5 M-Rad sterilisiert werden. Anschließend wird es in lichtundurchlässigen Behältern kühl aufbewahrt.
Das so erhaltene Produkt ist eine farblose, silberglänzende leicht trübe kolloidale Lösung, die Viskositäten zwischen 10 und 20 dl/g (150C) besitzt. Ihr pH-Wert liegt zwischen 3 und 5, die optische Drehung >cJ 360 mp beträgt 0,8 bis1,4. Die Lösung ist geruchlos. Das UV-Spektrum hat einen Peak bei 275 nm.
Das erhaltene modifizierte Kollagen hat eine Denaturierungstemperatur von 35 bis 380C und ist in verdünnten Säuren, Alkalien und Salzlösungen löslich, mit Wasser mischbar, in Fetten und organischen Lösungsmitteln unlöslich.
Beispiel 2 Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch der Extrakt (B) nicht mit Harnstoff und Ascorbinsäure, sondern mit Äthylurethan gewonnen wird.
Beispiel 3 Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird das erhaltene rohe Kollagen statt in Essigsäure in verdünnter Milchsäure suspendiert.
Beispiel 4 Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch die enzymatische Spaltung statt mit Pepsin mit Ficin durchgeführt wird.

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von löslichem nativem Kollagen, dessen nicht-helikale Peptide teilweise oder vollständig abgetrennt sind, aus Humangewebe, insbesondere Placenta, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte Humangewebe in Anwesenheit von Eis unter sterilen Bedingungen zerkleinert, in einer wässrigen Salzlösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das vorwiegend aus Monomeren bestehende Zentrifugat (A) abtrennt, den festen Rückstand in einer wässrigen Harnstofflösung, welche zusätzlich Ascorbinsäure enthalten kann, in der Kälte rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (B) abtrennt und zur weiteren Extraktion mit einer Äthylurethan enthaltenden wässrigen Lösung in der Kälte rührt, zentrifugiert, das Zentrifugat (C) abtrennt, die vereinigten Zentrifugate (A), (B) und (C) bis zur völligen Ausfällung gegen Leitungswasser dialysiert, das ausgefallene unreine Kollagen abzentrifugiert, in verdünnter wässriger Carbonsäurelösung auflöst, durch Sättigen der Lösung mit einem Salz, vorzugsweise Kochsalz, von letzten Verunreinigungen abtrennt, in einem geeigneten Dispergiermittel dispergiert und die reines Kollagen enthaltende Dispersion mit einer Pepsin oder Ficin enthaltenden wässrigen Lösung vom pH 1 bis 4, vorzugsweise 2, 10 bis 50 h lang bei etwa 250C behandelt, dann mit einer Base, vorzugsweise Natronlauge, neutralisiert, gegen Leitungswasser dialysiert und das ausgefallene, teilweise oder vollständig von nicht-helikalen Peptiden befreite Kollagen abzentrifugiert und in einer verdünnten Carbonsäurelösung aufbewahrt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei TemperatUren unter 60Carbeitet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte und zentrifugierte Humangewebe in einer wässrigen Salzlösung rührt, die in bezug auf Kochsalz etwa 1,5 molar und in bezug auf Natriumdihydrogenphosphat etwa 0,2 molar ist und nach Abtrennen des Zentrifugats (A) den festen Rückstand in einer etwa 360 g Harnstoff und 10 g Ascorbinsäure pro Liter Wasser enthaltenden Lösung löst, wobei die Äthylurethan enthaltende Lösung etwa 100 g Äthylurethan pro Liter Wasser enthält, und die Zentrifugate (B) und (C) gewinnt und zum Endprodukt aufarbeitet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgefallene unreine Kollagen in etwa 0,01 molarer wässriger Essig- oder Milchsäure gelöst wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugat (A) verwirft und lediglich die vereinigten Zentrifugate (B) und (C) weiterverarbeitet.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als verdünnte Carbonsäurelösung zur Aufbewahrung des Produkts eine Zitratpuffer18-Ketoglutarsäure-Lösung verwendet und daß man die Produkt enthaltende Carbonsäurelösung mit -Strahlen sterilisiert.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt gefriertrocknet.
8. Aus Humangewebe, insbesondere Placenta, gewonnenes, lösliches, natives Humankollagen, dessen nicht-helikale Peptide teilweise oder vollständig abgetrennt sind.
9. Heilmittel, enthaltend Kollagen nach Anspruch 8 als Wirksubstanz.