DE3750793T2

DE3750793T2 - Verfahren zur Behandlung von Kollagen zur Erleichterung seiner Vernetzung und das so erhaltene Kollagen.

Info

Publication number: DE3750793T2
Application number: DE3750793T
Authority: DE
Inventors: Michel Tardy; Jean-Louis Tayot
Original assignee: Imedex SA; Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Imedex Biomateriaux
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1987-07-06
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2007-07-07
Also published as: ATE114689T1; EP0253715A2; JP2520858B2; US4931546A; EP0253715A3; DE3750793D1; FR2601371B1; JPS6333400A; EP0253715B1; ES2065323T3; FR2601371A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Kollagen insbesondere im Hinblick darauf, seine Vernetzung zu erleichtern und es zu gestatten, ein vernetztes Kollagen mit verbesserter Stabilität und verbesserten mechanischen Eigenschaften zu erhalten.
Kollagen muß bei seinen medizinischen und biomedizinischen Verwendungen sehr strengen mechanischen, physikalischchemischen und biologischen Anforderungen gewachsen sein.
Eine der Beschränkungen bei der Verwendung von Kollagen liegt in seiner häufig ungenügenden Beständigkeit gegen die Bioabbaubarkeit und in seinen schwachen mechanischen Eigenschaften, die seine Handhabung schwierig machen.
Die Bioabbaubarkeit von Kollagen hängt im wesentlichen vom Vernetzungsgrad und der Weise, auf die die Vernetzung durchgeführt worden ist, ab. Sie kann von einigen Tagen bei einem nicht-gegerbten Kollagen bis zu mehreren Monaten bei einem stark vernetzten Kollagen schwanken. Diese Vernetzung gestattet es, eine gewisse Zahl an intra- und interkettigen Kreuzverknüpfungen einzuführen, um die Löslichkeit von Kollagen zu verringern.
Die Vernetzung von Kollagen kann entweder auf chemischem Weg mit Hilfe von Gerbmitteln, wie beispielsweise Glutaraldehyd oder Formaldehyd oder auch Diisocyanat, oder durch physikalische Mittel, wie beispielsweise gamma-, beta- oder Ultraviolettstrahlen, bewirkt werden. Aber dieses letztgenannte Verfahren ist schwer und mitunter schwierig durchzuführen und über die Vernetzungen hinaus ruft es auch Spaltungen hervor.
Die Behandlung mit Glutaraldehyd, die die am häufigsten verwendete Behandlung ist, um Kollagen zu vernetzen, und die darin besteht, Pulver, Filme, Gele oder mehr oder weniger konzentrierte Lösungen in eine Lösung von Glutaraldehyd einzutauchen, weist bei bestimmten Anwendungen eine gewisse Anzahl von Nachteilen auf. Die Einführung von Glutaraldehyd in eine wäßrige Kollagen-Struktur (Gel oder Schwamm) führt zur Bildung von Polymeren von Glutaraldehyd mit sehr hohem Molekulargewicht, die schwierig durch einfaches Waschen zu entfernen sind und hydrolysiert werden und ein Aussalzen von Glutaraldehyd mit-sich bringen oder in situ weiterbestehen und nach Verschwinden des Kollagenteils freigesetzt vorliegen können.
Man hat auch schon Kollagen, das mit einer speziellen Oxidase behandelt worden ist, vernetzt, aber eine derartige Behandlung ist kostspielig und besonders heikel und kann nur unter sehr speziellen Bedingungen durchgeführt werden (Schwierigkeit, die Lysyloxidase am Ende der Behandlung zu entfernen).
Man hat bereits die Wirkung von Periodsäure oder von Periodaten auf gewisse Kollagenkomponenten untersucht. Robert B. ARONSON et al. (Journal of Biological Chemistry, Vol. 242, Nr. 5, 1967, 809-812) zeigen, daß es möglich ist, einen Teil lediglich des Hydroxylysins eines Kollagens durch Behandlung mit Periodsäure in Gegenwart von Natriumhydroxid zu zerstören. Die Kollagenlösung bleibt nach der Behandlung flüssig und ist dazu bestimmt, chromatographiert zu werden. William BUTLER et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 240, 1965, PC 3449-50, beschreibt ebenfalls die Zerstörung des Hydroxylysins durch die Einwirkung von Periodsäure auf Glykopeptide, die aus einer gründlichen Verdauung eines Kollagens hervorgehen. Die Lehre dieser Dokumente führt nicht zur Vernetzung der Kollagenlösungen.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die vorgenannten Nachteile zu beseitigen, indem sie ein Verfahren zur Behandlung von Kollagen vorschlägt, das es gestattet, Kollagen in der Masse und auf homogene Weise ohne kovalente Addition chemischer Reagenzien zu vernetzen.
Eines der Ziele der Erfindung ist es, Kollagengele bereitzustellen, die auf homogene Weise und mit großer Stabilität vernetzt sind.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein wesentlich flexibleres Verfahren zur Vernetzung von Kollagen bereitzustellen, das es zu einem ersten Zeitpunkt gestattet, eine teilweise Oxidation des Kollagens herbeizuführen, ohne eine nennenswerte Vernetzung einzuleiten (indem man mit dem pH spielt: saurerer Bereich), und zu einem zweiten Zeitpunkt nach Wunsch durch Neutralisierung oder Alkalisierung des pH eine Vernetzung der Kollagenmoleküle einzuleiten.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Kollagenpulver oder -filme bereitzustellen, die eine verbesserte Stabilität und verbesserte Eigenschaften, insbesondere der Unlöslichkeit, selbst bei saurem pH aufweisen.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Pulver oder Filme bereitzustellen, die auf der Oberfläche reaktive Gruppen aufweisen, die das Kuppeln des Kollagens mit biologisch aktiven Molekülen gestatten.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Vernetzung von Kollagen in wäßriger Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es darin besteht, das Kollagen einer teilweisen Oxidation durch eine Periodsäure- oder Natriumperiodatlösung bei einer Konzentration zwischen 10&supmin;¹ und 10&supmin;&sup4; M bei Umgebungstemperatur bei saurem pH zu unterziehen, dann eine Verfestigung des Kollagens vorzunehmen.
Die Behandlung mit dem Natriumperiodat kann entweder mit Kollagenlösungen oder mit bereits gebildeten Gelen oder auch mit Filmen oder Pulvern durchgeführt werden.
Wenn die Behandlung mit dem Periodat mit Kollagenlösungen im Hinblick auf die Herstellung von Gelen durchgeführt wird, gibt man zu der Kollagenlösung, deren Konzentration bezüglich Kollagen im allgemeinen zwischen 0,1 und 20% eingeschlossen ist, eine Lösung von Periodsäure oder Natriumperiodat bis zum Erhalt einer Konzentration von 0,1 M bis 0,0001 M, wobei der pH, der zwischen 2 und 8 eingeschlossen sein kann, vorteilhafterweise zu einem ersten Zeitpunkt sauer, dann zu einem zweiten Zeitpunkt neutral oder alkalisch ist, was schnell zur Bildung eines Gels führt, das in einem sehr großen pH-Bereich unlöslich ist, einschließlich eines sauren pH, bei dem das Kollagen vor dieser Behandlung löslich war.
Die im Überschuß auf dem Kollagenmolekül gebildeten Aldehydgruppen werden beispielsweise durch eine Glykokoll-, Ethanolamin- und/oder Natriumborhydridlösung neutralisiert, oder sie werden für das Kuppeln mit Proteinen, Fibronektin, Wachstumsfaktoren, Glykosaminoglykanen, Enzymen, Bakteriziden oder bakteriostatischen Mitteln, Antibiotika oder einem ganz anderen Produkt, das eine bessere Biokompatibilität und eine größere Beständigkeit gegen die Bioabbaubarkeit gestattet, verwendet.
Die Behandlung mit dem Periodat kann gegebenenfalls durch ein Gerben der Oberfläche entweder mit einer NaIO&sub4;-Lösung oder mit einer Di- oder Polyaldehyd-Lösung ergänzt werden.
Ein Gerben der Oberfläche wird, falls notwendig, zu einem zweiten Zeitpunkt erhalten, indem man das Kollagengel mit einer Lösung von Periodsäure oder Natriumperiodat oder mit einer Lösung von Di- oder Polyaldehyd, deren Konzentration zwischen 0,1 und 0,001 M eingeschlossen ist, behandelt und indem man gleichzeitig oder zu einem zweiten Zeitpunkt den pH auf einen Wert zwischen 5 und 8 eingeschlossen führt, um die Vernetzung der Kollagenketten zu begünstigen.
Die mit Periodsäure oder Natriumperiodat behandelten Kollagenlösungen können verwendet werden, um durch an sich bekannte Verfahren Fasern, Pulver, Kügelchen oder Filme usw.
herzustellen, deren mechanische Eigenschaften verbessert sind und die mit biologisch aktiven Molekülen verknüpft werden können.
Wie vorstehend angegeben, kann die Behandlung mit Periodsäure oder Natriumperiodat auch mit bereits gebildeten Gelen im Hinblick auf die Verleihung einer besseren Stabilität bewirkt werden.
Dazu ist zu bemerken, daß Periodsäure oder Natriumperiodat aufgrund ihrer kleinen Molekülgröße leicht in das Innere eines Gels diffundieren und eine homogene Vernetzung sicherstellen.
Das Gel wird mit einer Periodsäure- oder Natriumperiodat- Lösung, deren Konzentration vorteilhafterweise zwischen 10&supmin;¹ und 10&supmin;&sup4; M eingeschlossen ist, bei einem pH oberhalb von 5, der so gewählt wird, um eine Wiederauflösung des Gels vor der Reaktion zu vermeiden, über 3 bis 20 Stunden bei Umgebungstemperatur behandelt.
Es ist auch möglich, die Behandlung gemäß der Erfindung mit Filmen oder Pulvern durchzuführen, um ihnen eine größere Stabilität zu verleihen oder um auf ihre Oberfläche reaktive Gruppen für ein späteres Kuppeln zu schaffen.
Diese Kollagenfilme oder -pulver werden mit einer Lösung von Periodsäure oder deren Salzen behandelt, deren Konzentration zwischen 0,1 und 0,0001 M eingeschlossen ist, unter Bedingungen eines pH, bei dem der Film oder das Material unlöslich verbleibt, vor einem zweiten Schritt bei pH 5 bis 8, der die Vernetzung fördert, was zu einer verstärkten Unlöslichkeit führt.
Auf allgemeine Weise wird man vorteilhafterweise auf die Behandlung gemäß der Erfindung jedes Mal zurückgreifen, wenn man die Stabilität und die mechanischen Eigenschaften eines vernetzten Kollagens verbessern und/oder das Kollagen mit einem biologisch aktiven Molekül verknüpfen möchte.
Andere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beispiele, die verschiedene Weisen der Durchführung der Erfindung erläutern, offenkundig.
Das Beispiel 1 erläutert die Herstellung eines Implantats oder einer Linse ausgehend von einer Kollagenlösung, wobei die Behandlung mit dem Periodat in diesem Beispiel mit einem bereits gebildeten Gel durchgeführt wird.
Das Beispiel 2 erläutert die Herstellung eines Implantats oder einer Linse ausgehend von einer Kollagenlösung, wobei die Behandlung mit Periodsäure mit der Kollagenlösung durchgeführt wird.
Die Beispiele 3 und 4 erläutern die Herstellung eines Implantats oder einer Linse ausgehend von einer Kollagenlösung, bei der die Behandlung der Kollagenlösung durch das Periodat mit einer Gerbung auf der Oberfläche durch eine Natriumperiodat- oder Glutaraldehyd-Lösung ergänzt wird.
Die Beispiele 5 und 6 betreffen die Herstellung eines unlöslichen Kollagengels ausgehend von einer Kollagenlösung, die zuvor mit Periodat behandelt worden ist.
Das Beispiel 7 betrifft die Herstellung eines unlöslichen Gels aus Kollagen, das mit einem biologisch aktiven Molekül (Fibronektin) verknüpft ist.
Die Beispiele 8 bis 10 beschreiben die Herstellung von unlöslichen Kollagenfasern ausgehend von Kollagenlösungen, die mit Periodat behandelt worden sind, welche mit einem biologisch aktiven Molekül (Fibronektin) verknüpft sind.
Das Beispiel 11 betrifft die Herstellung eines unlöslichen Pulvers ausgehend von einer Kollagenlösung, die mit Periodat behandelt worden ist.
Das Beispiel 12 betrifft die Herstellung eines unlöslichen Kollagenpulvers ausgehend von einer Lösung, die mit Periodat behandelt worden ist, und das mit einem biologisch aktiven Molekül (Fibronektin oder Glykosaminoglykan) verknüpft ist.
Das Beispiel 13 beschreibt die Herstellung eines unlöslichen Kollagenfilms ausgehend von einer Kollagenlösung, die mit Periodat behandelt worden ist.
Das Beispiel 14 erläutert die Herstellung von unlöslichen Kollagenkügelchen ausgehend von einer Kollagenlösung, die mit Periodat behandelt worden ist.
Die Beispiele 15 und 16 betreffen die Herstellung von Gelen, Filmen, Fasern oder unlöslichen Kügelchen ausgehend von einer Kollagenlösung, die mit Periodat behandelt worden ist, und die mit einem biologisch aktiven Molekül (Glykosaminoglykan) verknüpft sind.
Das Beispiel 17 erläutert die Durchführung der Behandlung mit Periodat bei einem Kollagenpulver.

BEISPIEL 1

Eine 15%-ige saure Lösung von menschlichem Plazenta-Kollagen, die in Bezug auf den Typ IV angereichert ist, in destilliertem Wasser wird durch das folgende Verfahren hergestellt:
300 kg Plazenta werden in einfrorener Form zerkleinert, um Stücke von einigen cm³ zu ergeben. Das Zerkleinerungsgut wird anschließend in 300 l wäßrige Lösung, die 8% Ethanol, 6 g/l NaCl und 10 kg Cellulose enthält, eingemischt. Nach Rühren bei 10ºC wird das Ganze einem Pressverfahren mit einer MABILLE- Presse unterzogen, um das Blut des Plazentagewebes abzutrennen. Man erhält 102 kg Plazentagewebe, das 65% Wasser enthält.
Der Gewebeextrakt der Presse wird 30 Minuten bei 10ºC in 500 l 0,05 M Natriumcitrat, pH 7,2, gerührt, dann einem Pressen unterzogen, um die Waschlösung zu entfernen und das Gewebe zu gewinnen. Ein zweites Waschen wird mit 500 l 0,05 M Natriumcitrat, pH 7,2, das mit 30 g/l NaCl versetzt ist, durchgeführt. Ein drittes Waschen wird mit 500 l 0,05 M Natriumcitrat, pH 7,2, durchgeführt. Das so gewaschene Gewebe mit neutralem pH wird anschließend 3 aufeinanderfolgenden Waschvorgängen bei saurem pH und 10ºC unterzogen:
- mit 500 l 0,05 M Zitronensäure und einem End-pH, der durch Zugabe von 2N HCl auf 2,8 eingestellt ist; man rührt 30 Minuten vor dem Pressverfahren;
- mit 500 l 0,5 M Ameisensäure über 15 Stunden;
- mit 500 l 0,05 M Zitronensäure, die mit 20 g/l NaCl versetzt ist, über 30 Minuten.
Das so bei saurem pH gewaschene Plazentagewebe ist von weißem Aussehen, was die gute Entfernung der roten Pigmente des ursprünglichen Plazentabluts belegt. Das erhaltene Gewicht beträgt 82 kg.
Es wird 15 Stunden bei 10ºC einer enzymatischen Verdauung durch Pepsin in 500 l 0,05 M Zitronensäure, pH 2,8, die 300 g Pepsin enthält, unterzogen. Die Suspension wird dann durch Zugabe von 500 l Wasser von 10ºC verdünnt. Der pH wird durch Zugabe von 4 N NaOH auf 7,5 eingestellt, um das Pepsin zu denaturieren und dessen Proteasewirkung zu unterdrücken. Nach 15-stündiger Wartezeit bei 10ºC wird der Geweberückstand, der den wesentlichen Teil der nicht gelösten Kollagene I und III enthält, durch eine kontinuierliche Zentrifuge (Westfalia KG 10006) abgetrennt. Das Gewicht dieses Rückstandes beträgt 103 kg; er kann einer zweiten enzymatischen Verdauung, die mit der ersten identisch ist, unterzogen werden, gefolgt von der Extraktion und Abtrennung von jedem der Kollagene I und III gemäß in der Literatur beschriebenen Verfahren.
Der Überstand, der der ersten enzymatischen Verdauung entspricht, enthält den wesentlichen Teil der Kollagene und andere Makromoleküle, die nach Einwirkung des Pepsins bei neutralem pH löslich sind. Er enthält insbesondere das Kollagen vom Typ IV.
Der pH des Überstandes wird mit 2 N HCl auf 5 eingestellt, nach 15-stündiger Wartezeit bei 10ºC wird der gebildete Niederschlag durch kontinuierliche Zentrifugation mit einer Zentrifuge "Bactofuge" Alfa Laval entfernt.
Der erhaltene Überstand, der sehr klar ist, wird durch Zugabe von 4 N NaOH auf pH 7,5 und auf eine Endkonzentration von 1,2 M bezüglich NaCl eingestellt. Nach 15 Stunden bei 16ºC wird der gebildete Kollagenniederschlag durch kontinuierliche Zentrifugation mit der Zentrifuge "Bactofuge" gewonnen.
Der Niederschlag von 13 kg wird anschließend in 600 l 0,01 N HCl gelöst, dann wird der pH durch Zugabe von 4 N NaOH auf 7,5 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wird nach 15-stündiger Wartezeit bei 4ºC mit der Zentrifuge "Bactofuge" entfernt (erhaltenes Gewicht 10 kg).
Der klare Überstand wird mit 2 N HCl auf pH 2,8 angesäuert und bei 4ºC mit NaCl auf eine Endkonzentration von 0,6 M versetzt.
Nach 15 Stunden wird der Kollagenniederschlag mit der Zentrifuge "Bactofuge" gewonnen. Der Niederschlag, dessen Gewicht 6,5 kg beträgt, hat ein flüssiges Aussehen. Er wird langsam mit 7 l Aceton versetzt, was zur Bildung von Kollagenfasern führt, die man durch Filtration auf einem Sieb gewinnt. Das Waschen dieser Fasern durch mehrere Behandlungen mit Aceton gestattet es nach Trocknen unter einem lauwarmen und sterilen Luftstrom 180 g trockene Fasern des Endprodukts zu erhalten.
Das Auflösen dieser Kollagenfasern in Wasser ergibt eine saure Lösung.
Diese Lösung, die in destilliertem Wasser auf 15% gebracht wird, wird 30 Minuten bei 45-60ºC erwärmt. Die vollständig homogene und fluide Lösung wird über Membranen von einer Porosität, die zwischen 0,8 und 8 um eingeschlossen ist, bei der gleichen Temperatur filtriert und in eine zuvor auf 45-60ºC erwärmte Form zur Ausbildung einer Linsenform oder Form ophtalmischer Implantate gegossen. Das Ganze wird sofort 15 Stunden bei 4ºC gekühlt. Nach Herausnehmen aus der Form wird die Linse oder das Implantat 15 Stunden bei Umgebungstemperatur in eine 0,01 M Natriumperiodat-Lösung von pH 7,5 gegeben. Anschließend wird die Linse oder das Implantat 3 Stunden bei Umgebungstemperatur in einen Glykokollpuffer von 20 g/l, pH 7,5, oder 0,05 M Ethanolaminpuffer und/oder in eine 0,02 M Natriumborhydrid-Lösung überführt.
Die erhaltenen Implantate oder Linsen sind vollständig transparent, sehr geschmeidig und sehr hydrophil und erweisen sich als leichter handhabbar, wobei sie mechanisch fester und von einer sehr guten Stabilität sind und einer einstündigen thermischen Behandlung bei 95ºC in einem Puffer mit neutralem pH standhalten, während ein(e) nicht mit Natriumperiodat behandelte(s) Implantat oder Linse sehr schnell hydrolysiert wird.

BEISPIEL 2

In eine vollständig homogene und fluide saure 15%-ige Kollagenlösung des Beispiels 1 gibt man eine Periodsäure- Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,0001 M. Nach Homogenisieren und Entfernen der Blasen wird die Lösung in eine zuvor auf 45-60ºC erwärmte Form gegossen. Das Ganze wird sofort 15 Stunden bei 4ºC gekühlt.
Nach der Entfernung aus der Form wird die Linse oder das Implantat 15 Stunden in einen 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5, NaCl 10 g/l, dann 3 Stunden bei Umgebungstemperatur in einen Glykokollpuffer, 20 g/l, pH 7,5, oder 0,05 M Ethanolaminpuffer und/oder eine 0,02 M Natriumborhydrid-Lösung zum Vollsaugenlassen gegeben.
Die Linse oder das Implantat weist die gleichen Eigenschaften wie diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben werden, auf.

BEISPIEL 3

Die Linse oder das Implantat, gemäß Beispiel 2 hergestellt, wird bei der Herausnahme aus der Form 15 Stunden bei Umgebungstemperatur in eine 0,01 M Natriumperiodat-Lösung, pH 7,5, dann 3 Stunden bei Umgebungstemperatur in einen Glykokollpuffer, 20 g/l, NaCl 10 g/l, pH 7,5, oder 0,05 M Ethanolaminpuffer und/oder eine 0,02 M Natriumborhydrid- Lösung zum Vollsaugenlassen gegeben.
Die Linse oder das Implantat weist die gleichen Eigenschaften, wie diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben werden, auf.

BEISPIEL 4

Die Linse oder das Implantat, gemäß Beispiel 2 hergestellt, wird bei der Herausnahme aus der Form bei Umgebungstemperatur 15 Stunden in eine 0,2%-ige Glutaraldehyd-Lösung, pH 7,5, dann 3 Stunden bei Umgebungstemperatur in einen Glykokollpuffer 20 g/l, NaCl 10 g/l, pH 7,5, oder 0,05 M Ethanolaminpuffer und/oder eine 0,02 M Natriumborhydrid-Lösung zum Vollsaugenlassen gegeben.

BEISPIEL 5

Eine 0,2%-ige Lösung von menschlichem Kollagen (Typ III, I oder IV) oder saurem Rinderkollagen (Typ I) in destilliertem Wasser wird 2 Stunden bei Umgebungstemperatur mit 0,001 M Natriumperiodat behandelt. Die Lösung wird anschließend 20 Stunden gegen 0,01 N Salzsäure dialysiert.
Der pH der Lösung wird dann durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf 7,5 eingestellt; nach 10 Minuten bei Umgebungstemperatur erhält man die Bildung eines Gels, das nach Waschen mit Glykokoll- oder Ethanolaminpuffer und Äquilibrieren mit einem Kulturmedium für die Zellkultur oder als Produkt zur Auffüllung von Wunden verwendet werden kann.
Man erhält so bei Umgebungstemperatur sehr stabile Gele, die bei extremen pH-Werten (HCl 0,01 N) beständig und sehr handhabbar sind. Diese Gele werden auch mit säurelöslichen Kollagenen oder Kollagenen, die durch enzymatische oder alkalische Behandlung solubilisiert worden sind, mit oder ohne Telopeptide, erhalten.

BEISPIEL 6

Eine Mischung gleicher Volumina von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen und von 0,6%-igem normalem Kollagen in destilliertem Wasser, deren pH mit 0,1 N NaOH auf 7,5 eingestellt wird, wird innerhalb 10 Minuten bei Umgebungstemperatur als Gel gewonnen.

BEISPIEL 7

Eine Mischung von:
- einem Volumen Kollagen, gemäß Beispiel 5 oxidiert,
- einem Volumen 0,6%-igem normalem Kollagen in destilliertem Wasser,
- 0,2 Volumina Plasma-Fibronektin zu 10 g/l
wird innerhalb 10 Minuten bei Umgebungstemperatur und bei neutralem pH als Gel gewonnen.
Die Anteile der verschiedenen Reaktanten können in großem Bereich abgeändert werden, um mehr Fibronektin einzuschließen, falls notwendig.

BEISPIEL 8

Eine Lösung von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen wird unter Rühren in einen 0,04 M Phosphat-Puffer, pH 7,2, bei 37ºC gegossen. Es bilden sich sofort Kollagenfäserchen. Nach 2 Stunden werden diese Fäserchen mit Glykokoll- oder Ethanolaminpuffer und/oder mit einer 0,02 M Natriumborhydrid- Lösung 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gewaschen.
Diese sehr stabilen Fäserchen lösen sich nicht wieder in saurem Medium und können als Produkt zum Auffüllen für Wunden oder für die Adsorption von Proteinen (Fibronektin usw.) verwendet werden.

BEISPIEL 9

Die Mischungen der Beispiele 6 und 7 werden unter Rühren in einen 0,04 M Phosphat-Puffer, pH 7,5, bei 37ºC gegossen. Es bilden sich sofort Kollagenfäserchen. Nach 2 Stunden werden diese Fäserchen in Glykokoll- oder Ethanolaminpuffer und/oder mit einer 0,02 M Natriumborhydrid-Lösung 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gewaschen.

BEISPIEL 10

Eine Lösung von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen wird in eine Lösung von Plasma-Fibronektin zu 0,01 g/l in 0,04 M Phosphatpuffer, pH 7,5, gegossen. Es bilden sich sofort Kollagenfäserchen, die das Plasma-Fibronektin einschließen.

BEISPIEL 11

Eine Lösung von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen wird auf pH 3 eingestellt, dann mit einer Natriumchlorid-Lösung bis auf eine Endkonzentration von 1 M versetzt. Nach 15 Stunden gewinnt man durch Zentrifugieren einen Niederschlag, der nach Dehydratisieren mit 100%-igem Aceton, Trocknen im Luftstrom und Mahlen ein unlösliches Kollagenpulver ergibt, das im Hinblick auf eine anschließende Kupplung reaktive Gruppen besitzt oder als Produkt für eine knöcherne Auffüllung verwendbar ist.

BEISPIEL 12

Eine Lösung von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen wird auf pH 4 eingestellt, dann schnell mit 0,01 g/l Plasma-Fibronektin und/oder 0,1%-igem Glykosaminoglykan versetzt. Nach 2-stündigem Kontakt gibt man eine Natriumchloridlösung, 1 M Endkonzentration, dazu. Nach 15 Stunden gewinnt man durch Zentrifugieren einen sehr festen Niederschlag, der für die Reparatur von Gewebeverletzungen verwendet werden kann.

BEISPIEL 13

Die Lösung von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen oder die in Beispiel 6 verwendete Mischung werden mit Glycerin, 1,5% Endkonzentration,-versetzt, dann auf einen hydrophoben Träger gegossen. Nach Trocknen bei Umgebungstemperatur unter einem sterilen Luftstrom erhält man einen Film. Nach 30-minütiger Behandlung in Alkohol 95, anschließender Dehydratisierung in einem Bad aus 100%-igem Aceton, erhält man einen unlöslichen Film, dessen Geschmeidigkeit, Dicke und Beständigkeit als Funktion der Konzentration bezüglich Kollagen und Glycerin variieren können.

BEISPIEL 14

Die Lösung von gemäß Beispiel 5 oxidiertem Kollagen oder die in Beispiel 6 verwendete Mischung wird tropfenweise auf eine Mischung von 9 Volumina Aceton und einem Volumen 0,1 N NaOH gegeben. Jedes Tröpfchen geliert sofort und bewahrt endgültig seine kugelförmige Gestalt. Die erhaltene Suspension wird dann mit einer sterilen physiologischen Lösung gewaschen, um auf definitive Weise das Aceton zu entfernen und den pH zu neutralisieren.
Die so erhaltenen Kügelchen können in Zellkulturen verwendet werden.
Man kann selbstverständlich andere Verfahren verwenden, um große Mengen an Kollagen-Mikrokügelchen herzustellen. Insbesondere kann man alle Verfahren verwenden, die bekannt sind, um Mikrotröpfchen-Emulsionen herzustellen.

BEISPIEL 15

- Ein Volumen gemäß Beispiel 5 oxidiertes Kollagen,
- ein Volumen 0,1%-iges Glykosaminoglykan (6-Chondroitinsäuresulfat oder 4-Chondroitinsäuresulfat, Heparansulfat, Dermatansulfat, Hyaluronsäure), dessen pH mit 0,1 N NaOH auf 7,5 eingestellt wird, gestatten es, Gele, Fasern oder Kügelchen herzustellen.

BEISPIEL 16

Eine 0,5%-ige Lösung von oxidiertem Kollagen wird in gleichen Volumina mit einer Lösung von 0,2%-igem Glykosaminoglykan gemischt, der pH wird auf 7,5 eingestellt, und die Mischung wird sofort so in eine Form gegossen, daß man eine Dicke von ungefähr 1 cm erhält. Nach 2 Stunden bei Umgebungstemperatur wird die Platte eingefroren und lyophilisiert. Man erhält Kompressen, die gegen einen Bioabbau beständiger sind und als Produkt zum Auffüllen verwendbar sind.

BEISPIEL 17

Ein Salzniederschlag von Kollagen ergibt nach Dehydratisieren mit Aceton, Trocknen im Luftstrom und Mahlen ein Pulver.
Dieses letztgenannte wird zu 0,2% in einer 0,001 M NaIO&sub4;-Lösung in Alkohol 95 aufgenommen. Nach 2-stündigem Kontakt unter Rühren bei Umgebungstemperatur wird das Pulver auf einem Nylontuch in Alkohol 95, dann 100%-igem Aceton gewaschen, vor Trocknen unter einem Luftstrom und Mahlen.
Diese unlöslich gewordenen Pulver reagieren mit dem Schiff- Reagenz. Das Kollagenpulver ohne Telopeptid (Trillagene von SADUC) bleibt in Wasser löslich und geliert, sobald der pH der Lösung auf 7,5 eingestellt wird.
Diese so erhaltenen Pulver und das in Beispiel 11 erhaltene Pulver, die unlöslich sind, werden mit einem nicht-oxidierten Kollagen und/oder mit Glykosaminoglykanen und/oder mit Antibiotika gemischt, um eine homogene Paste zu bilden, die als Produkt für eine knöcherne Auffüllung verwendbar ist.

Claims

1. Verfahren zur Vernetzung von Kollagen in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht, das Kollagen einer Oxidation zu unterziehen, die mit einer Periodsäure- oder Natriumperiodat-Lösung bei einer Konzentration zwischen 10&supmin;¹ und 10&supmin;&sup4; M eingeschlossen bei Umgebungstemperatur bei saurem pH durchgeführt wird, dann eine Verfestigung des Kollagens vorzunehmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verfestigung durch Fortführung der Behandlung bei neutralem oder alkalischem pH bewirkt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Verfestigung durch Erwärmen bewirkt wird.

4. Verfahren zur Vernetzung von Kollagen aus einem bereits gebildeten Kollagengel, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kollagengel einer Oxidation unterzieht, die durch Behandlung mit einer Periodsäure- oder Natriumperiodat- Lösung bei einer Konzentration zwischen 10&supmin;¹ und 10&supmin;&sup4; eingeschlossen bei einem pH oberhalb von 5 über 3 bis 20 Stunden bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH zwischen 5 und 8 eingeschlossen ist.

6. Verfahren zur Vernetzung von festem Kollagen in Form von Pulver oder eines Films, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kollagen einer Oxidation unterzieht, die durch Behandlung über 3 bis 20 Stunden bei Umgebungstemperatur mit einer Periodsäure- oder Natriumperiodat-Lösung bei einer Konzentration zwischen 10&supmin;¹ und 10&supmin;&sup4; M eingeschlossen bei einem pH durchgeführt wird, der ausreicht, um dessen Wiederauflösung zu verhindern, wobei der pH mindestens zu einem zweiten Zeitpunkt zwischen 5 und 8 eingeschlossen ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß darauf ein Wasch- oder Neutralisationsschritt folgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Waschen durch eine Glykokoll-Lösung bewirkt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Waschen durch eine Ethanolamin-Lösung bewirkt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Waschen durch eine Natriumborhydrid-Lösung bewirkt wird.

11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß darauf gegebenenfalls eine Gerbung der Oberfläche folgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gerben der Oberfläche durch eine Natriumperiodat- Lösung bewirkt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbung der Oberfläche durch eine Di- oder Polyaldehyd-Lösung bewirkt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbung über 3 bis 20 Stunden mit einer Natriumperiodat-Lösung, deren Konzentration zwischen 0,1 und 0,001 M eingeschlossen ist, bei einem pH zwischen 5 und 8 eingeschlossen bewirkt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbung über 3 bis 20 Stunden mit einer Di- oder Polyaldehyd-Lösung, deren Konzentration zwischen 0,1 und 0,001 M eingeschlossen ist, bei einem pH zwischen 5 und 8 eingeschlossen bewirkt wird.

16. Verwendung von Kollagenlösungen, die durch das Verfahren nach Anspruch 1 behandelt worden sind, bei der Herstellung von Pulvern, Fasern, Klötzchen oder Filmen.

17. Kollagengel, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Verwendung des Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, 7 bis 15 erhalten wird.

18. Vernetztes Kollagen, das in Form von Filmen oder Pulvern vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es einer Behandlung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 4 und 8 bis 12, 6, 7 bis 10 unterzogen worden ist.

19. Kollagengel, das reaktive Gruppen aufweist, die für eine spätere Kupplung verwendbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Anwendung des Verfahrens gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, 7 bis 15 erhalten worden ist.

20. Kollagen in Form von Filmen oder Pulvern, das auf der Oberfläche reaktive Gruppen aufweist, die für eine spätere Kupplung verwendbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Anwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 6 erhalten worden ist.

21. Kollagengel gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Gruppen mit Proteinen, Fibronektin, Wachstumsfaktoren, Glykosaminoglykan, Enzymen, bakteriziden oder bakteriostatischen Mitteln oder Antibiotika gekuppelt sind.

22. Kollagen in Form von Filmen oder Pulvern nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Gruppen mit Proteinen, Fibronektin, Wachstumsfaktoren, Glykosaminoglykan, Enzymen, bakteriziden oder bakteriostatischen Mitteln oder Antibiotika gekuppelt sind.