DE3645191C2 - - Google Patents

Description

Hyaluronsäure, die nachfolgend einfach als HA bezeichnet wird, ist ein natürlich vorkommendes Glucosaminoglycan von hohem Molekulargewicht mit einer sich wiederholenden Disaccharideinheit von D-Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin- 2-acetamid-2-desoxy-D-glucose, die durch β-(1 →3)- glucosidische Bindung vereinigt sind. Die Disaccharide sind durch β-(1 →4)-glucosidische Bindungen so vereinigt, daß sie eine unverzweigte, unvernetzte Polysaccharidkette bilden.

HA tritt in tierischem Gewebe, beispielsweise in Nabelschnur, Glaskörper- und Gelenkflüssigkeit, Hahnenkämmen und Haut auf. Es gibt Berichte, daß das Molekulargewicht gereinigter HA im Bereich von 50 000 bis 8 000 000 liegt, je nach der Quelle, der Isolierungsmethode und dem Verfahren zur Bestimmung des Molekulargewichtes [Balazs, E. A., Fed. Proceed. 17, 1086-1093 (1958)].

Es sind verschiedene Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von HA aus tierischem Gewebe und Bakterienkulturen vorgeschlagen worden. Dazu gehört die enzymatische Digestion von Proteinen [E. D. T. Atkins, C. F. Phelps und J. K. Sheehan, Biochem. J. 128, 1255-1263 (1972); R. Varma, R. S. Varma, W. S. Alten und A. H. Wardi, Carbohydr. Res. 32, 386-395 (1974)]; Behandlung mit Ionenaustauschharzen [T. C. Laurent, J. Biol. Chem. 216, 263- 271 (1955); E. R. Berman, Biochim. Biophys. Acta 58, 120-122 (1962)]; Ausfällung mit kationischen oberflächenaktiven Stoffen [T. C. Laurent, M. Ryan und A. Pietruszkiewicz, Biochem. Biophys. Acta 42, 476-485 (1960)]; Behandlung mit Trichloressigsäure [H. Hofmans, O. Schmut, H. Sterk und H. Koop, Naturforsch. 34c, 508-511 (1979); D. Schmut, und H. Hofmans, Biochim. Biophys. Acta 673, 192-196 (1981)]; präparative Dichtegefällesenkung [P. Silpanata, J. R. Dunstone, A. G. Ogston, Biochem. J. 109, 43-50 (1968)]; elektrochemische Abscheidung [S. Roseman, D. R. Watson, J. F. Duff und W. D. Robinson, Annals Rheumatic Diseases 15, 67-68 (1955)]. Man kann auch ein Verfahren anwenden, welches verschiedene Behandlungen umfaßt, z. B. enzymatische Digestion und Ausfällung mit Cetylpyridinchlorid [J. E. Scott, Biochem. J. 62, 31 (1956)].

Das bei der Gewinnung von HA aus jeder beliebigen biologischen Quelle auftretende Hauptproblem besteht in der Trennung des Polymerisats (HA) von Proteinen und anderen biologischen Polymerisaten, die gemeinsam mit der HA aus dem Gewebe extrahiert werden. Je nach dem Ausgangsstoff kann die Menge unerwünschter Polymerisate sehr groß sein und die Menge an HA um ein Vielfaches übersteigen. Die vorstehend genannten Verfahren zur Gewinnung von HA werden alle zur Ausfällung von HA im Labor angewendet; sie sind wegen verschiedener, jedem dieser Verfahren innewohnender Nachteile kaum zur Erzeugung von HA in großem Maßstab verwendbar.

Das fortschrittlichste Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von HA im Maßstab der Großfabrikation ist in US-PS 41 41 973 (E. A. Balazs) beschrieben. Mit diesem Verfahren wird eine hochreine HA mit einem Proteingehalt von weniger als 0,5 Gew.-% und einem Molekulargewicht von mehr als 1 200 000 durch Wasserextraktion aus Hahnenkämmen oder menschlicher Nabelschnur gewonnen. Proteine und sonstige Stoffe werden mit mehreren Chloroformextraktionen bei unterschiedlichen pH-Werten entfernt. Bei einer Chloroformextraktion des Wasserextraktes bildet sich eine Grenzschicht, in der sich denaturierte Proteine und sonstige Stoffe sammeln. Einige Stoffe, z. B. Fette, werden vermutlich in der Chloroformphase lösbar gemacht. Das Verfahren kann auch eine Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, z. B. Pronase, umfassen. Durch Zusammenfassen mehrerer, ziemlich ausgefeilter Behandlungen ist ein Verfahren entwickelt worden, mit dem man eine pyrogenfreie, nichtentzündliche Fraktion von HA erhalten kann. Dies Produkt wird gegenwärtig als 1%ige Lösung in der Organchirurgie verwendet, wo es Gewebe vor mechanischer Beschädigung schützt, Raum bietet und die Handhabung von Geweben während der Operation erlaubt (E. A. Balazs, Healon, J. Wiley und Sohn, NY, 1983, S. 5-28).

Die DE-OS 34 34 104 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen, biokompatiblen Hyaluronsäurezubereitung, bei dem Hyaluronsäure in Form eines Pulves, eines Films oder eines Gels eingesetzt wird und mit Divinylsulfon als Vernetzungsmittel bei Raumtemperatur in wäßrigem alkalischem Medium bei einem pH-Wert von mehr als 9 vernetzt wird.

Die DE-OS 23 12 615 beschäftigt sich mit einem Verfahren zum Kuppeln von Verbindungen mit Hydroxyl- und/ oder Aminogruppen an Polymere, wobei Divinylsulfon als Kupplungsmittel beschrieben wird.

Die DE-OS 26 31 908 beschreibt die gemeinsame Vernetzung von Mucopolysacchariden mit Kollagen unter Verwendung von Aldehyden.

Die Vernetzung von Hyaluronsäure unter Verwendung von 1,2,3,4-Diepoxybutan in alkalischer Lösung bei 50°C ist beschrieben worden von T. C. Laurent, K. Hellsing und B. Gelotte, Acta Chem. Scand. 18 (1984), Nr. 1, 274 bis 5. Das gemäß diesem Verfahren erhaltene Produkt ist ein Gel, welches in Wasser beträchtlich quillt bzw. anschwillt.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, eine neue Hyaluronsäurezubereitung zur Verfügung zu stellen, die insbesondere hohe Reinheit aufweist.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Hyaluronsäurezubereitung gemäß dem Patentanspruch.

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand von Kurven näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine graphische Darstellung der Abhängigkeit zwischen Viskosität und Schergeschwindigkeit für eine 1-Gew.-%-Lösung von Hylan (HY) in wäßrigem 0,15 M NaCl (V=Viskosität, S=Scherbeanspruchung);

Fig. 2 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Schwingungsversuches an einer 1-Gew.-%-Lösung von HY in wäßrigem 0,15 M NaCl (V=Viskosität, F=Phasenwinkel; G′=dynamische Speichermoduli, G″=Verlustmoduli),

Fig. 3 eine Relaxationskurve einer 1-Gew.-%-Lösung von HY in wäßrigem 0,15 M NaCl;

Fig. 4 eine graphische Darstellung der Verteilung der Äquivalentkugeldurchmesser (ESD) für eine 1-Gew.-%- Lösung von HY (Grenzviskositätszahl 4300 cm³/g in wäßrigem 0,15 M NaCl;

Fig. 5 eine Relaxationskurve eines gallertartigen Produktes gemäß der Erfindung.

Durch die Erfindung wird eine neuartige, hochreine, pyrogenfreie, nichtentzündliche, chemisch modifizierte HA geschaffen, die ca. 0,005 bis 0,05 Gew.-% Aldehydvernetzungsgruppen enthält, welche homöopolar an die Hyaluronsäurepolymerisatketten gebunden sind. Diese HA ist herstellbar mit einem Verfahren, bei dem an Ort und Stelle eine chemische Modifizierung von HA in tierischen Geweben vor der Extraktion aus denselben vorgenommen wird. Dadurch erfolgt eine Reinigung der HA, die dann in chemisch modifizierter Form gewonnen wird.

Die Erfindung geht aus von der Feststellung, daß HA in situ chemisch modifiziert werden kann, ehe es aus tierischem Gewebe extrahiert wird, wenn man das Gewebe mit einem Stoff behandelt, der mit Proteinen und HA in wäßrigen Medien umsetzbar ist. Zu diesen Stoffen gehören Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal. Diese chemische Modifizierung in situ ruft, wie festgestellt wurde, wesentliche Änderungen in der Primärstruktur des HA-Makromoleküls, der molekularen Größe sowie der inter- und intramolekularen Wechselwirkungen und sich ergebenden rheologischen Eigenschaften von aus diesem modifizierten Produkt hergestellten Lösungen hervor. Deshalb ist es gerechtfertigt, dieser chemisch modifizierten HA einen neuen Namen zu geben. Es wurde beschlossen, diesen Stoff Hylan zu nennen, hier kurz bezeichnet als HY. Bei der Extraktion von HA aus tierischem Gewebe geht normalerweise eine große Menge von Proteinen mit in die Lösung. Je nach der Art des Gewebes und den Parametern der Extraktion kann die Proteinmenge deutlich schwanken. Bei der Extraktion von HA aus Hahnenkämmen kann das Gewichtsverhältnis von HA zu Proteinen von 1 : 0,5 bis zu 1 : 4 schwanken (US-PS 43 03 676, E. A. Balazs). Folglich stellt die Entfernung von Proteinen die erste Schwierigkeit bei der Gewinnung reiner HA aus tierischem Gewebe dar. Es wurde festgestellt, daß sich bei Anwendung der vorstehend genannten vorläufigen Behandlung des Gewebes ein Wasserextrakt von HY mit wesentlich geringerem Proteingehalt ergibt als beim Weglassen einer solchen Behandlung.

Die genaue Art der bei der Behandlung des Gewebes stattfindenden chemischen Vorgänge ist nicht voll aufgeklärt, so daß die Erfindung nicht durch irgendeine spezifische chemische Umsetzung eingegrenzt sein sollte. Es wird davon ausgegangen, daß die Proteine infolge chemischer Umsetzungen zwischen Proteinen im Gewebe und einem Reagens in dem Behandlungsgemisch denaturiert und in den Geweben immobilisiert werden und folglich bei der nachfolgenden wäßrigen Extraktion unlöslich sind.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige Substanz verwendet werden, die mit Proteinen in einem wasserhaltigen Medium umsetzbar ist. Es hat sich erwiesen, daß der vorteilhafteste Stoff Formaldehyd ist. Es können aber auch andere Aldehyde, wie Glutaraldehyd oder Glyoxal, beim erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden.

Die Behandlung des Gewebes kann in einer Lösung des Reagens in Wasser durchgeführt werden. Allerdings entsteht dabei ein wesentlicher Verlust an HY wegen seiner guten Löslichkeit in Wasser. Deshalb wird bevorzugt, die Behandlung des Gewebes in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel durchzuführen. Das Lösungsmittel sollte mit dem für die Immobilisierung des Proteins verwendeten Reagens nicht reagieren. Zu diesen Lösungsmitteln gehören niedere Ketone, z. B. Azeton oder Methyläthylketon, Alkohole, wie Äthanol oder Isopropanol, und aprotische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Dimethylsulfoxid. Wird ein solches Lösungsmittel mit einem Gewebe gemischt, welches eine große Menge Wasser enthält, meistens 80-90 Gew.-% odere mehr, entsteht ein Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel. Durch Ändern des Verhältnisses zwischen Lösungsmittel und Gewebe oder durch Hinzufügen von Wasser zum Gemisch kann das Verhältnis von Wasser zu Lösungsmittel im Gemisch auf jedes beliebige Niveau eingestellt werden. Das bevorzugte Verhältnis zwischen Wasser und Lösungsmittel wird durch die HY-Löslichkeit in dem Sinne bestimmt, daß das HY in dem für die Behandlung des Gewebes benutzten Gemisch nicht löslich sein sollte. Die HY-Löslichkeit hängt von der Art des verwendeten Lösungsmittels, dem Verhältnis Wasser zu Lösungsmittel, der Anwesenheit und Konzentration eines Elektrolyten im Gemisch sowie dem pH- Wert des Gemisches ab. Durch Einführen eines Elektrolyten in das Gemisch kann die HY-Löslichkeit wesentlich herabgesetzt werden. Dazu eignet sich jeder beliebige Elektrolyt, der in dem Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel löslich ist und bei dem sich der gewünschte pH-Wert des Gemisches ergibt. Wenn z. B. Azeton als Lösungsmittel benutzt wird, läßt sich als löslicher Elektrolyt zweckmäßigerweise Natriumacetat verwenden.

Die Zusammensetzung des Gemisches zur Behandlung des Gewebes kann je nach der Art des Gewebes, der Art des verwendeten Lösungsmittels und der Art des Elektrolyten in weiten Grenzen schwanken. Wie schon erwähnt, sollte HY aus dem Gewebe in dem Behandlungsgemisch nicht löslich sein, dieses aber genügend Wasser enthalten, damit das Gewebe quellen kann, um die Umsetzung zwischen dem Reagens und den Gewebepolymerisaten zu erleichtern. Es hat sich gezeigt, daß bei Verwendung von Hahnenkämmen als Quelle von HY die Zusammensetzung des Gemisches unter Berücksichtigung des Wassers aus den Kämmen im folgenden Bereich, ausgedrückt in Gewichtsprozent, liegen kann: Wasser 10-50, Lösungsmittel 40-85, Elektrolyt 0-20, Reagens 0,2-10. Wenn gewünscht, können mehrere verschiedene Lösungsmittel in dem gleichen Behandlungsgemisch verwendet werden. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, geringe Mengen an nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Chloroform, im Behandlungsgemisch zu verwenden. Der Gehalt an diesen Lösungsmitteln im Gemisch kann von 0,5 bis 10 Gew.-% reichen.

Der pH-Wert des Behandlungsgemisches kann je nach der Art der Reagenzien, der Zusammensetzung des Gemisches, der Temperatur und Behandlungszeit unterschiedlich sein. Bei der Gewinnung von HY aus tierischem Gewebe gemäß der Erfindung sind folgende Überlegungen äußerst wichtig. Ein Teil der Reagenzien, wie Formaldehyd, kann mit Hydroxylgruppen von HA-Makromolekülen bei niedrigem pH-Wert umgesetzt werden und ein vernetztes Polymerisat ergeben, welches in Wasser unlöslich ist. Lang ausgedehnte Behandlung in einem Medium mit verhältnismäßig hohem pH-Wert führt zum Abbau von HA, und es kann nur ein Polymerisat von niedrigem Molekulargewicht gewonnen werden. Bei Verwendung eines Aldehyds als Reagens gemäß der Erfindung wurden die besten Ergebnisse mit einem pH-Wert in der Nähe des neutralen Wertes, z. B. im Bereich von 4 bis 10, festgestellt.

Das Verhältnis zwischen dem Behandlungsgemisch und dem Gewebe kann innerhalb weiter Grenzen unterschiedlich sein. Die Untergrenze wird meistens dadurch festgelegt, daß das Gewebe, welches im Fall von Hahnenkämmen ziemlich voluminös ist, mindestens vollständig mit dem Gemisch bedeckt sein sollte. Die Obergrenze kann aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen gewählt werden. Bei der Behandlung von Hahnenkämmen gemäß der Erfindung ist das Verhältnis des Behandlungsgemisches zum Gewebe (berechnet auf der Basis des Trockengewichtes des Gewebes) meistens höher als 10 : 1.

Die Temperatur beeinflußt die Wirksamkeit der Behandlung gemäß der Erfindung. Da allerdings HY bei hohen Temperaturen für Hydrolyse empfänglich ist, wird eine Behandlung bei Zimmertemperatur oder darunter bevorzugt, um ein Produkt mit hohem Molekulargewicht zu erhalten.

Die für das Behandeln notwendige Zeit hängt von vielen Faktoren, einschließlich der Zusammensetzung des Gemisches, der Art des Gewebes und der Temperatur, ab. Der Begrenzungsfaktor bei der Behandlung liegt vermutlich in der Diffusion des Reagens in die Gewebeschnipsel, und aus diesem Grund ist die Größe dieser Schnipsel ein wichtiger Parameter. Bei der Behandlung von Hahnenkämmen, die in Stückchen mit einer Dicke von 1-3 mm aufgeschnitten waren, hat sich eine Behandlungszeit im Bereich von 4-24 Stunden ergeben.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise behandelte Gewebe wird dann mit einem Lösungsmittel oder einem Gemisch aus Lösungsmittel und Wasser gewaschen oder gespült, um die überschüssige Behandlungsmischung vom Gewebe zu entfernen. Es ist zweckmäßig, das gleiche Lösungsmittel zu verwenden wie in dem Gemisch für die Behandlung des Gewebes. Man kann eine beliebige Anzahl von Waschvorgängen vornehmen, aber es hat sich erwiesen, daß ein einmaliger Waschprozeß zufriedenstellende Ergebnisse bringt.

Das gewaschene Gewebe wird dann unmittelbar mit Wasser extrahiert, um HY zu gewinnen. Der Wirkungsgrad der Extraktion hängt, wie festgestellt wurde, von dem Verhältnis zwischen Wasser und Gewebe, dem pH-Wert der Extraktionsmittel, der Temperatur und der Zeit ab. Der Wirkungsgrad der Extraktion des behandelten Gewebes kann ferner wesentlich erhöht werden, wenn zunächst das behandelte Gewebe getrocknet wird, um das Lösungsmittel zu entfernen, welches für die Behandlungs- und Waschschritte benutzt wurde. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn das Gewebe auf ¼ bis ½ seines ursprünglichen Gewichtes getrocknet wird.

Das Verhältnis Wasser zu Gewebe beim Extraktionsschritt wird aufgrund von verschiedenen Überlegungen gewählt. Zunächst sollte genügend flüssige Phase vorhanden sein, um das Gewebe während der Extraktion zu bedecken. Andererseits sollte aber die Wassermenge nicht zu groß sein, damit die größtmögliche Konzentration an HY im Extrakt erhalten wird, damit die Menge an Fällungsmittel für den nächsten Verfahrensschritt verringert werden kann. Als bevorzugtes Verhältnis von Wasser zu Gewebe hat sich bei Hahnenkämmen ein Wert von 2 : 5, ausgehend vom Gewicht der unbehandelten Kämme, erwiesen.

Der pH-Wert der Extraktionsmittel kann je nach der gewünschten Qualität des Endproduktes neutral, sauer oder alkalisch gehalten werden. Um ein Produkt mit ultrahohem Molekulargewicht zu erhalten, hat sich erwiesen, daß der pH-Wert der Extraktionsmittel im Bereich von 6-8,5 liegen sollte. Ein höherer pH-Wert führt zu einem Anstieg der HY-Konzentration im Extrakt, aber gleichzeitig zu einer Verringerung des Molekulargewichtes des Produktes und zu Änderungen anderer Eigenschaften des Polymerisats, die noch näher erläutert werden. Auf jeden Fall kann man durch Steuern des pH-Wertes während der Extraktionsstufe die Eigenschaften des Endproduktes auf zweckmäßige Weise in eine gewünschte Richtung regeln.

Das behandelte Gewebe wird vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 25°C extrahiert, weil der Abbau von HY bei höheren Temperaturen das Molekulargewicht des Polymerisats wesentlich erniedrigen kann.

Die zum Extrahieren der größtmöglichen Menge an HY aus dem behandelten Gewebe nötige Zeit schwankt im wesentlichen mit anderen Parametern der Extraktion, beispielsweise dem pH-Wert, dem Verhältnis Flüssigkeit zu Gewebe und der Intensität des Rührens. Es hat sich gezeigt, daß beim Extrahieren von Hahnenkämmen mit Wasser gute Ergebnisse zu erzielen sind, wenn die behandelten Kämme von 6 Stunden bis zu einigen Tagen extrahiert werden.

Das Gemisch aus behandeltem Gewebe und Extraktionsmitteln kann während der Extraktion umgerührt oder stehengelassen werden. Natürlich erhöht das Rühren die Diffusionsgeschwindigkeit von HY-Molekülen aus dem Gewebe in den Extrakt. Andererseits kann aber kräftiges Rühren zum Abbau von HY und damit zu einer Erniedrigung des Molekulargewichtes führen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß kräftiges Rühren eine Desintegration des Gewebes verursacht, was es schwierig macht, das Gewebe vom Extrakt zu trennen. Deshalb wird vorzugsweise der Extraktionsschritt ohne Rühren oder mit sehr langsamem und sanftem Rühren durchgeführt.

Nach der Extraktion wird das Gewebe vom Extrakt durch Anwendung eines von mehreren bekannten Verfahren, z. B. Filtrieren, Zentrifugieren oder Dekantieren, getrennt. Als einfachster und wirtschaftlicher Weg hat sich das Filtrieren erwiesen. Je nach der Art des als Ausgangsmaterial verwendeten Gewebes kann eine zweistufige Filtration bevorzugt werden. So können im Fall von Hahnenkämmen große Gewebestücke ohne weiteres durch Trennen durch ein Nylongewebe abgetrennt werden und die feine Reinigung des Extraktes durch Filtrieren durch ein beliebiges dichtes Filtermedium, beispielsweise einen zellulosehaltigen Stoff, erzielt werden.

Die HY-Konzentration im Extrakt hängt von vielen Faktoren, einschließlich des pH-Wertes während der Extraktion, der Zeit, dem Verhältnis Flüssigkeit zu Gewebe und der Intensität beim Rühren ab und liegt meistens im Bereich von 0,3 bis 3,0 mg/ml und manchmal noch darüber. In einigen Fällen, wenn die HY-Konzentration im Extrakt zur niedrigen Seite hin liegt, hat es sich als wünschenswert erwiesen, das Gewebe ein zweites Mal zu extrahieren. Dabei hat sich gezeigt, daß das aus dem zweiten Extrakt ausgefällte Produkt meistens ein höheres Molekulargewicht im Vergleich zum HY aus dem ersten Extrakt hat. Das läßt sich dadurch erklären, daß die Fraktionen von HY mit niedrigerem Molekulargewicht leichter aus dem Gewebe in den Extrakt diffundieren und das aus dem ersten Extrakt ausgefällte Produkt mit diesen Fraktionen angereichert ist.

Es können auch mehr als zwei Extraktionen angewendet werden, um die höchstmögliche Ausbeute zu erzielen, aber die Konzentration an HY im Extrakt nimmt mit jeder nachfolgenden Extraktion ab.

HY kann aus den Filtraten mit Hilfe eines beliebigen bekannten Verfahrens gewonnen werden. Das zweckmäßigste Verfahren besteht im Ausfällen mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Azeton, Äthanol und Isopropanol. Die Ausfällung kann in Gegenwart einer Säure, wie Chlorwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure, oder in Gegenwart neutraler Elektrolyten wie Natriumacetat und Natriumchlorid, vorgenommen werden. HY und seine Salze werden üblicherweise als ein weißes, faserartiges Material oder als Pulver niedergeschlagen. Der Niederschlag kann mit dem gleichen Lösungsmittel, welches für die Ausfällung verwendet wird, oder mit einem beliebigen anderen Lösungsmittelgemisch gewaschen werden, welches das Produkt nicht auflöst, z. B. Äther. Das gewaschene Produkt kann auf beliebige bekannte Weise getrocknet oder unter einer Schicht aus Lösungsmittel, wie Azeton und Äthanol, gelagert werden. Andererseits kann das Filtrat aber auch gefriergetrocknet werden.

Es liegt auf der Hand, daß beliebige weitere bekannte Schritte, die für die Reinigung von HA angewandt werden, im Verfahren gemäß der Erfindung mit vorgesehen werden können, ohne daß der Rahmen dadurch eingeengt wird. So kann z. B. zum Entfernen von Pyrogenen oder entzündlichen Stoffen eine Extraktion mit bekannten Lösungsmitteln, wie Chloroform, vorgesehen werden, in welchem HY unlöslich, aber Lipoproteine, Glycolipide oder Glycolipoproteine lösbar oder trennbar sind.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht es, HY-Produkte zu erhalten, deren Eigenschaften in einem sehr breiten Bereich variieren und von denen die folgenden ausgewertet wurden. Die genannten Verfahren wurden angewandt, um die gemäß der Erfindung erhaltenen Produkte zu charakterisieren.

Die HY-Konzentration in Lösungen wurde unter Anwendung des automatisierten Carbazolverfahrens mittels der Hexuronsäureprüfung bestimmt [E. A. Balazs, K. O. Berntsen, J. Karossa und D. A. Swann, Analyt. Biochem. 12, 547-558 (1965)]. Der Hexosamingehalt wurde mittels des automatisierten kolorimetrischen Verfahrens bestimmt [D. A. Swan und E. A. Balazs, Biochem. Biophys. Acta 130, 112-129 (1966)]. Der Proteingehalt von HY-Lösungen wurde mittels der Phenolreagensmethode bestimmt [Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)].

Der Formaldehydgehalt im Produkt wurde mittels Hydrolyse von ca. 0,1 g der Probe in 10 ml 10%iger wäßriger Schwefelsäure während 2 Stunden unter Sieden, gefolgt von einer Dampfdestillation des freien Formaldehyds, aus der erhaltenen Lösung bestimmt, wobei das Formaldehyd im Destillat unter Anwendung eines kolorimetrischen Verfahrens mit chromotroper Säure bestimmt wurde [M. J. Boyd und M. A. Logan, J. Biol. Chem. 146, 279 (1942)].

Die begrenzende Viskositätszahl oder Grenzviskositätszahl (Grundviskosität) wird bestimmt als lim(η/ηo-l)/c, worin "η" und "ηo" die Viskositäten der Lösung bzw. des Lösungsmittels und "c" die Konzentration von HY in g/cm³ bedeuten. Die Messungen wurden in wäßrigen 0,20 M NaCl-Lösungen in einem Kapillarviskosimeter nach Ubbelohde vorgenommen. Der Wert Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht wird mittels der Gleichung [η]= 0,0228 M^0,81 berechnet [R. C. Cleland und J. L. Wang, Biopolymers 9, 799 (1970)].

Der Wert Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht wird mittels der Lichtstreumethode mit einem Niedrigwinkellaser bestimmt, wozu ein Instrument, ausgestattet mit einem auf einer Wellenlänge von 632,8 nm eingestellten Helium-Neon-Laser, verwendet wird. Der Wert Gewicht- Durchschnittsmolekulargewicht wird auch anhand der in einer analytischen Ultrazentrifuge bestimmten Sedimentations- und Diffusionskonstanten berechnet.

Das dynamische Lichtstreuverfahren wird angewandt, um die Ansammlung der Moleküle in verhältnismäßig stark konzentrierten Lösungen von HY auszuwerten und ergibt die Verteilung von Äquivalentkugeldurchmessern (ESD) in Lösung.

Die rheologischen Eigenschaften wurden mit dem Bohlin- Rheometersystem ausgewertet, bei dem es sich um ein rechnergestütztes Rheometer handelt, welches auf dreierlei Weise arbeiten kann: Viskosimetrie, Oszillation und Relaxation. Für die HY-Lösung werden folgende Parameter gemessen: Viskosität für den weiten Bereich von Schergeschwindigkeiten, dynamische Viskosität, dynamische Speichermoduli und dynamische Verlustmoduli für verschiedene Schwingungsfrequenzen und Relaxationszeit.

Wie schon erwähnt, ist das Produkt (HY) gemäß der Erfindung ein neues Polymerisat, welches als Ergebnis der chemischen Reaktion in situ zwischen HA und einem Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd, erhalten wird. Durch chemische Analyse von HY hat sich gezeigt, daß der Gehalt an gebundenem Formaldehyd in Produkten, die aus mit einem formaldehydhaltigen Gemisch behandelten Hahnenkämmen erhalten wurden, je nach den verschiedenen Parametern der Behandlung im Bereich von 0,005 bis 0,02 Gew.-%, berechnet auf der Basis des Gewichtes des Polymerisats, lag.

Das Vorhandensein des gebundenen Formaldehyds im Produkt wurde auch durch einen Versuch nachgewiesen, bei dem die Behandlung mit einem radioaktiv markierten Formaldehyd ¹⁴CH₂O durchgeführt wurde (siehe Beispiel 12 unten). Die Ergebnisse des Versuches zeigen, daß das erfindungsgemäß erhaltene Produkt gebundenes Formaldehyd enthielt, welches weder durch wiederholte Ausfällungen noch durch erschöpfende Dialyse der Polymerisatlösungen entfernt werden konnte. Das ist ein starker Beweis für das Vorliegen einer kovalenten Bindung des Formaldehyds an die polymeren Moleküle des Produktes. Um festzustellen, ob Formaldehyd speziell an HA gebunden ist, wurde die Hyaluronsäure mit bakteriellen oder Blutegel-Hyaluronidasen, Enzymen, die speziell HA abbauen, behandelt. Die Ergebnisse dieser Behandlung zeigten, daß eine merkbare Menge Formaldehyd kovalent unmittelbar an die HY-Makromoleküle gebunden war.

Der Proteingehalt in dem erfindungsgemäß erhaltenen Produkt liegt normalerweise nicht über 0,5%, berechnet auf der Basis des Gewichtes eines trockenen Polymerisats, und kann sogar nur 0,1% und noch weniger betragen.

Die chemische Modifikation der Hyaluronsäure durch homöopolare Bindung eines Vernetzungsmittels an ihre Makromoleküle, mit anderen Worten die Änderungen der Primärstruktur des Polymerisats, haben einen wesentlichen Einfluß auf die physikalisch-chemischen Parameter, wie das Molekulargewicht und die Molekulargröße, die intermolekulare Wechselwirkung und auch auf rheologische Eigenschaften der Polymerisatlösungen.

Gemäß der Erfindung erhaltenes HY kann ein sehr hohes Molekulargewicht haben. So kann die Grenzviskositätszahl über 7000 cm³/g liegen, was einem Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht von ca. 6×10⁶ entspricht: Das sich anhand der Lichtstreudaten ergebende Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht kann einen Wert von 13×10⁶ erreichen. Diese Diskrepanz zwischen Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht und Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht kann ziemlich bedeutungsvoll sein, wie noch näher erläutert wird. Es sei daran erinnert, daß ein Polymerisat mit erheblich niedrigerem Molekulargewicht, z. B. 1×10⁶ oder darunter, ohne weiteres mit dem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten werden kann, wenn das gewünscht wird. Ähnlich kann ein Polymerisat mit einem beliebigen gewünschten Molekulargewicht erhalten werden, wenn HY auf beliebiger Stufe seiner Gewinnung und Reinigung Mitteln ausgesetzt wird, von denen bekannt ist, daß sie die Glucosidbindung der Polysaccharidkette brechen. Zu diesen bekannten Mitteln gehören spezifische Enzyme, z. B. Hyaluronidase, freie Reste erzeugende Systeme, Scherkräfte, Wärme, starke Alkalien und Säuren.

Das partielle spezifische Volumen (psv) von HY in Lösung hängt von der Ionenstärke der Lösung ab. Es wurde mittels Dichtemessung für HY-Lösung in Wasser bestimmt, welches 0,15 M NaCl im Konzentrationsbereich von 0 bis 0,5 mg/ml enthielt, und betrug 0,627 cm³/g.

Fig. 4 zeigt die Verteilung der Äquivalentkugeldurchmesser (ESD) in 1%iger Lösung für eine HY-Probe, die in einer 0,15 M NaCl-Lösung aufgelöst war. Es ergibt sich anhand der dargestellten Daten, daß HY in einer sehr stark zusammengeballten Form existiert, obwohl diese Zusammenballungen stabil sind und sich nicht absetzen.

In den Fig. 1 bis 3 sind die rheologischen Eigenschaften eines typischen, erfindungsgemäß hergestellten Produktes mit ultrahohem Molekulargewicht dargestellt. Es wurde festgestellt, daß das Produkt Lösungen (0,5 Gew.-% und höher) mit bemerkenswerten viskoelastischen Eigenschaften bildet.

Die folgenden Parameter geben das beste Bild von den elastischen Eigenschaften der Polymerisatlösungen: Dynamische Speichermoduli (G′), Frequenz des "Kreuzungspunktes" (ein Punkt, an dem die dynamischen Speichermoduli G′ größer werden als die dynamischen Verlustmoduli G″), Phasenwinkel und Relaxationszeit.

HY bildet sehr viskose Lösungen in Wasser oder Wasserlösungen von Elektrolyten. Die Viskosität der Lösung hängt von der Polymerisatkonzentration, dem Elektrolytgehalt und der Temperatur ab und nimmt ab mit der Schergeschwindigkeit, d. h., daß die HY-Lösungen eine wesentliche Pseudoplastizität haben.

Bei einer Betrachtung der rheologischen Eigenschaften von HY-Lösungen ist zu bedenken, daß diese Eigenschaften stark abhängig sind vom Molekulargewicht des Produktes, wie bei jedem anderen Polymerisat auch. Es wurde schon erwähnt, daß HY mit einem Molekulargewicht erhalten werden kann, welches innerhalb weiter Grenzen schwankt, und dementsprechend unterschiedlich sind die rheologischen Eigenschaften. So hat sich gezeigt, daß bei einem Produkt mit ultrahohem Molekulargewicht (Grenzviskositätszahl über 4500 cm³/g) die Viskosität einer 1-Gew.-%-Lösung in 0,15 M NaCl-Lösung in Wasser bei einer Schergeschwindigkeit von 0,055 bis zu 1000 Pa · s und noch darüber beträgt, während sie nur ca. 2 Pa · s bei einer 1-Gew.-%-Lösung eines Polymerisats mit einer Grenzviskositätszahl von ca. 1000 cm³/g beträgt. Es hat sich gezeigt, daß die elastischen Eigenschaften von HY-Lösungen auch vom Molekulargewicht des Polymerisats abhängen. So ist der Wert der dynamischen Speichermoduli G′ für eine 1-Gew.-%-Lösung von HY mit ultrahohem Molekulargewicht in 0,15 M NaCl ca. 40 Pa bei einer Frequenz von 0,01 Hz, während dieser Wert nur ca. 0,2 Pa bei einer Lösung von HY mit einer Grenzviskositätszahl von ca. 1000 cm³/g beträgt. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes", die eine gute Charakterisierung des Verhältnisses zwischen elastischen und viskosen Eigenschaften der Polymerisatlösungen darstellt, ist meistens weniger als 0,025 Hz bei 1-Gew.-%-HY-Lösungen in 0,15 M NaCl bei 25°C, wenn das Molekulargewicht des Polymerisats im Bereich von ca. 1,5×10⁶ bis 8×10⁶ und darüber liegt.

Die physikalisch-chemischen und rheologischen Eigenschaften einer HY-Probe und deren Lösung wurden mit den gleichen Eigenschaften eines gemäß einem bekannten Verfahren erzielten HA-Produktes verglichen und sind in Tabelle 1 sowie in Fig. 4 und 5 aufgeführt. Das zum Vergleich herangezogene Produkt ist HA, gewonnen aus Hahnenkämmen durch Wasserextraktion, gefolgt von einer Entproteinisierung nach dem sogenannten Sevag-Verfahren, welches mehrere Chloroformextraktionen beinhaltet [G. Blix, O. Shellman, Arkiv for Kemi, Mineral Geol. 19A, 1 (1945)].

Tabelle 1

Physikalisch-chemische und rheologische Vergleichsdaten von HA- und HA-Proben

Die in Tabelle 1 und Fig. 4 angegebenen Daten zeigen deutliche Unterschiede zwischen HY und HA. Zunächst zeigen sich für das bekannte Produkt etwa die gleichen Werte für Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht und Gewicht- Durchschnittsmolekulargewicht (das Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht ist etwas niedriger), während für das Produkt gemäß der Erfindung der Wert Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht etwa viermal höher ist als der Wert Viskosität- Durchschnittsmolekulargewicht. Zweitens beweist der höhere Wert für psv der HY-Lösung im Vergleich zu HA, daß die Größe der HY-Makromoleküle größer ist. Drittens führt die Aggregation von HY-Makromolekülen in der Lösung zu wesentlich größeren Zusammenballungen im Vergleich zu HA-Lösungen, was nicht nur auf größere HY-Makromoleküle, sondern auch auf eine viel stärkere intermolekulare Wechselwirkung schließen läßt. Schließlich sind HY-Lösungen wesentlich stärker viskos und elastisch als gleich stark konzentrierte Lösungen von HA. Obwohl die gesteigerte Viskosität einem höheren Wert Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht zugeschrieben werden kann, ist die zu beobachtende dramatische Zunahme der Elastizität kaum mit dem gleichen Argument zu erklären.

All diese Beobachtungen haben zu dem Schluß geführt, daß die chemische Modifizierung von Hyaluronsäure in situ vor der Extraktion aus dem Gewebe, auch wenn sie nur zu geringfügigen Änderungen der chemischen Zusammensetzung des Polymerisats führt, zur gleichen Zeit doch zu einigen gewaltigen Änderungen der physikalisch-chemischen Parameter und rheologischen Eigenschaften führt. Das kann nur geschehen, wenn die Änderung in der chemischen Zusammensetzung einigen bedeutenden Änderungen in der makromolekularen Struktur entspricht.

Die Gestalt und der Bau von HA-Makromolekülen in Lösung ist anhand verschiedener Verfahren untersucht worden, und es gibt eine ganze Menge Literatur zu diesem Thema. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, daß die Makromoleküle eine gestreckte, willkürliche Wendelgestalt haben und sich bei verhältnismäßig geringer Konzentration (z. B. 0,1%) des Polymerisats in der Lösung miteinander verheddern. Es wird vermutet, daß die Lösung bei höherer Konzentration ein kontinuierliches, dreidimensionales Netzwerk von polymeren Ketten enthält. Die Glucosidbindungen in den HA-Makromolekülen haben sich als von beträchtlicher Steifheit erwiesen. Um diese Erscheinungen zu erklären, sind verschiedene Mechanismen vorgeschlagen worden, wie die Wechselwirkung zwischen Lösungsmittel und Gelöstem, die Wechselwirkung mit kleinen Mengen Protein, die in vielen HA-Zubereitungen vorhanden sind, sowie Wechselwirkungen zwischen Ketten [siehe z. B. E. A. Balazs, Physical Chemistry of Hyaluronic Acid, Fed. Proceed., 17, 1086-1093 (1958)]. Einige Autoren haben eine Doppelwendelstruktur für HA-Makromoleküle vorgeschlagen und gemeint, daß Doppelwendelsegmente die Rolle von Querverbindungen spielen könnten, welche die ungewöhnlichen rheologischen Eigenschaften von HA-Lösungen erklären [C. M. Dea, R. Moorhous, D. D. Rees, S. Arhott, J. M. Guss und E. A. Balazs, Science 179, 560-562 (1972); S. Arnott, A. R. Mitra und S. Raghunatan, J. Mol. Biol. 169, 861-872 (1983)].

Unter Berücksichtigung dieser Untersuchungen und Beobachtungen ist die Anmelderin zu der Hypothese gelangt, daß das Produkt gemäß der Erfindung, nämlich HY, eine zusätzliche Anzahl von Verknüpfungen enthalten kann, die während der Behandlung des Gewebes mit einem Proteinvernetzungsimmobilisator entstehen. Diese erfindungsgemäß eingesetzten Mittel, wie Formaldehyd, sind sehr umsetzungsfähig gegenüber verschiedenen chemischen Gruppen, wobei ihr Umsetzungsvermögen wesentlich von Umsetzungsbedingungen, wie dem pH-Wert, der Temperatur und der Konzentration, abhängt. Die Hydroxylgruppen von Hyaluronsäure werden offensichtlich mit diesen Mitteln unter den Behandlungsbedingungen nicht umgesetzt, da das nach der Behandlung erhaltene Produkt immer in Wasser löslich ist und folglich keinen nennenswerten Grad an vernetztem Polymerisat enthält. Die Menge der während der Behandlung in das Polymerisat eingeführten zusätzlichen Verknüpfungen ist vermutlich so klein, daß sie keine Unlöslichkeit des Polymerisats hervorruft, aber andererseits signifikant genug, um die Wechselwirkung zwischen Makromolekülen und folglich die Elastizität der Polymerisatlösung merklich zu erhöhen. Verschiedene Kandidaten für eine solche Umsetzung mit einem Behandlungsmittel sind die Acetamido-Gruppen von Hyaluronsäure, nichtacetylierte Amino-Gruppen, die in kleinen Mengen in HA vorhanden sein können, und Amido-, Amino- und andere umsetzungsfähige Gruppen von Proteinen, die in der interzellulären Matrix des Gewebes während der Behandlung vorhanden sind. Es ist kaum wahrscheinlich, daß die Acetamido-Gruppen von HA selbst die intermolekulare Verknüpfung herstellen können. In den Untersuchungen über die Umsetzung von Proteinen mit Formaldehyd (siehe z. B. J. F. Walker, Formaldehyde, Reinhold Publ. Corp., NY, 1953, S. 312-317) wurde festgestellt, daß Amid-Gruppen eines Proteins selbst keine Verknüpfung hervorrufen, und eine der am wahrscheinlichsten auftretenden Reaktionen bei der Bildung der Verknüpfung ist eine Umsetzung von Formaldehyd mit Amino-Gruppen, die N-Methylol-amino-Gruppen ergibt, welche ihrerseits mit Amid-Gruppen reagieren.

Folglich sind zwei Mechanismen möglich, um eine begrenzte Anzahl von Verknüpfungen in HA-Makromolekülen hervorzurufen. Der erste Mechanismus beinhaltet die Umsetzung zwischen einem Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd und Acetamido- und freien Amino-Gruppen von HA, deren Vorhandensein in HA ziemlich wahrscheinlich ist [E. A. Balazs, Fed. Proceed. 25, 1817-1822 (1966)].

Der zweite mögliche Mechanismus läßt auf die Beteiligung von Proteinen oder Polypeptiden an der Vernetzungsreaktion schließen. Es gibt beharrliche Berichte, daß Proteine oder Polypeptide kovalent an das HA-Molekül gebunden sind (Yuko Mikum-Takagaki und B. P. Toole, J. Biol. Chem. 256 (16), 8463-8469 (1981)] oder auf andere Weise mit HA-Molekülen assoziiert werden können. In diesem Fall können Verknüpfungen zwischen einem HA-Makromolekül und einem Protein und einem weiteren HA-Makromolekül oder zwischen einem kovalent an zwei HA-Makromoleküle gebundenen Protein gebildet werden.

Keiner dieser Mechanismen sollte jedoch als einschränkend für die Erfindung aufgefaßt werden. Es sei darauf hingewiesen, daß auch andere Mechanismen für die Einführung kleiner Mengen kovalenter Verknüpfungen in das Produkt gemäß der Erfindung möglich sind.

Auf jeden Fall besteht das wesentliche Merkmal der Erfindung in der chemischen Modifizierung von HA im Gewebe während des Gewinnungsprozesses, vermutlich durch Einführen kleiner Zahlen von Verknüpfungen in die HA-Makromoleküle, wobei der Grad der Modifizierung ausreicht, um die elastischen Eigenschaften der Polymerisatlösungen wesentlich zu erhöhen, ohne eine nachteilige Auswirkung auf die günstigen Eigenschaften von HA zu haben, wie dessen Fähigkeit, stark viskose Lösungen in wäßrigem Medium zu liefern und der Biokompatibilität.

Die erfindungsgemäß hergestellte, chemisch modifizierte Hyaluronsäure, nämlich HY, kann erfolgreich für viele Zwecke auf dem biomedizinischen Gebiet und in der Kosmetik eingesetzt werden, z. B. als Werkzeug in der Organchirurgie, als Beschichtung, um die Biokompatibilität verschiedener Stoffe zu verbessern, als Bestandteil verschiedener pharmazeutischer Produkte und für Hautpflegeerzeugnisse. Die verbesserten Eigenschaften dieses Polymerisats, wie seine größere Elastizität, ergeben beim Gebrauch von HY wesentliche Vorteile.

HY kann auch als Ausgangsstoff für neue Produkte benutzt werden, die durch zusätzliche chemische Modifizierung, beispielsweise Verknüpfung mittels herkömmlicher Vernetzungsmittel, erhalten werden. So wurde festgestellt, daß die besonderen Eigenschaften chemisch modifizierter HA gemäß der Erfindung und ihrer Lösungen die Möglichkeit bieten, die vorstehend genannten, zusätzlich modifizierten Erzeugnisse zu erhalten, die gleichfalls einige ungewöhnliche Eigenschaften haben. Ein in Wasser unlösliches, gallertartiges Material kann z. B. aus dem Erzeugnis gemäß der Erfindung durch Vernetzung mit Divinylsulfon in alkalischer Lösung erhalten werden. Hierbei handelt es sich um ein stark gequollenes Gel. Die Konzentration des Polymerisats in dem Gel hängt von der Zusammensetzung der flüssigen Phase ab, bei der es sich um Wasser oder Lösungen in Wasser von verschiedenen Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Elektrolyten handeln kann. Im Fall einer physiologischen Salzlösung (0,15 M NaCl in Wasser) kann die Polymerisatkonzentration im Bereich von 0,15 bis 0,40 Gew.-% liegen. Dieser Stoff hat sehr interessante rheologische Eigenschaften (Fig. 5, 6 und 7). So ist die elastische Komponente der komplexen dynamischen Moduli (G′) höher als die Verlustmoduli (G′′) bei allen untersuchten Frequenzen. Gleichzeitig verhält sich der Stoff wie ein pseudoplastischer Körper bei niedrigen Schergeschwindigkeiten, mit anderen Worten, er hat eine wesentliche Viskosität, die mit der Schergeschwindigkeit abnimmt. Der Stoff zeichnet sich auch durch eine sehr lange Relaxationszeit aus. Es wird stark vermutet, daß es sich um eine einmalige Struktur von Lösungen von erfindungsgemäß erhaltenem HY handelt, die es möglich macht, das vorstehend genannte gallertartige Produkt mit diesen speziellen rheologischen Eigenschaften zu erhalten. Anders ausgedrückt, die chemischen Änderungen in HA, die in dem erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahren auftreten, beeinflussen nicht nur die Struktur und Eigenschaften von HY, sondern auch die Eigenschaften von daraus erhaltenen Produkten. So wurde festgestellt, daß bei Verwendung von gemäß bekannter Verfahren erhaltener HA, nämlich durch Proteinentfernung mit Chloroformextraktionen als Ausgangsstoff für die Vernetzung mit Divinylsulfon ein unlösliches Material erhalten wurde, dessen rheologische Eigenschaften wesentlich schlechter waren als die gemäß der Erfindung.

Es sei darauf hingewiesen, daß durch zusätzliche Modifizierung des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes viele weitere modifizierte Stoffe erhalten werden können, z. B. stark vernetzte Gele, unlösliche Filme und Beschichtungen.

Die nachfolgenden Beispiele geben bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung wieder, ohne diese jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

Hahnenkämme wurden ausgiebig mit einer 1%igen Lösung von Cetylpyridinchlorid in Wasser und dann mit entionisiertem Wasser gewaschen und schließlich gefroren. Die gefrorenen Kämme wurden in einer Schnitzelmaschine in Stücke mit einer Dicke von ca. 1-2 mm geschnitten. Es wurde ein Gemisch aus 1000 g Aceton, 100 g eines 37%igen Formalin und 50 g Natriumacetat zubereitet und diesem 1000 g geschnitzelte Kämme hinzugefügt. Das Gemisch aus Kämmen und Behandlungsflüssigkeit (pH 6,7) wurde unter langsamem Rühren 24 Stunden auf einer Temperatur von ca. 20°C gehalten. Dann wurde die Flüssigkeit durch Filtrieren durch ein Nylonsieb von den Kämmen getrennt. Die behandelten Kämme wurden dann mit 500 g Aceton gewaschen und an Luft auf ein endgültiges Gewicht von 500 g getrocknet. Die getrockneten Kämme wurden mit 2,5 l entionisiertem Wasser gemischt und eine Extraktion 72 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20°C unter langsamem Rühren durchgeführt. Die Kämme wurden vom Extrakt durch Filtrieren durch eine Nylonmaschenware getrennt, und der Extrakt wurde zusätzlich durch zellulosehaltiges Filtermaterial filtriert ("Micro-media®"). Die HA-Konzentration dieses ersten Extraktes betrug 0,92 mg/ml. Dann wurden 2 l dieses Extraktes mit 4 l Aceton und 20 g Natriumacetat gemischt. Dabei bildete sich eine weiße, fasrige Abscheidung, die gesammelt, mit Aceton gewaschen und in einem Vakuumofen bei 35°C getrocknet wurde. Als Produkt wurde 1,75 g erhalten. Das Verhältnis Hexosamin zu Hexuronsäure für das Produkt erwies sich als 1±0,05. Der Formaldehydgehalt im Produkt war 0,0150%. Das Produkt wurde so als Hylan identifiziert. Der Proteingehalt des Produktes betrug 0,35% und die Grenzviskositätszahl war 4320 cm³/g.

Nach der ersten Extraktion wurden die Kämme mit 2,5 l entionisiertem Wasser gemischt und die Extraktion 48 Stunden lang bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Kämme wurden abgesondert und der Extrakt filtriert, wie vorstehend beschrieben. Die HA-Konzentration im zweiten Extrakt betrug 0,65 mg/ml. Aus dem Extrakt wurde durch Ausfällung wie oben beschrieben 1,26 g an Produkt erhalten. Diese Fraktion wurde auch als chemisch modifiziertes Natriumhyaluronat gekennzeichnet, dessen Formaldehydgehalt 0,014% betrugt. Der Proteingehalt war 0,27% und die Grenzviskositätszahl 4729 cm³/g. Es wurden die rheologischen Eigenschaften in Wasser einer 1-Gew.-%-Lösung in wäßriger 0,15 M NaCl-Lösung ausgewertet. Diese Daten sind in Tabelle 1 angegeben.

Es wurde auch eine dritte Wasserextraktion der Kämme wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die HA-Konzentration im dritten Extrakt betrug 0,33 mg/ml und aus diesem Extrakt wurde 0,60 g HA gewonnen, dessen Proteingehalt 0,20% betrug und dessen Grenzviskositätszahl 4830 cm³/g und der Formaldehydgehalt 0,0115% war.

Somit wurde aus 1 kg Hahnenkämmen insgesamt 3,61 g chemisch modifiziertes Natriumhyaluronat gewonnen.

Beispiel 2

1 kg geschnitzelter, gemäß Beispiel 1 zubereiteter Hahnenkämme wurde mit einem Gemisch aus 1 kg Aceton und 150 g einer 40-Gew.-%-Lösung von Glutaraldehyd in Wasser gemischt. Der pH-Wert des Gemisches war 6,9. Das Gemisch wurde unter langsamem Rühren (ca. 1 min^-1) 16 Stunden lang auf Umgebungstemperatur (ca. 20°C) gehalten. Dann wurden die Kämme von der Flüssigkeit getrennt, mit Aceton gewaschen und an Luft auf die Hälfte des ursprünglichen Gewichts getrocknet. Die getrockneten Kämme wurden mit 3 l entionisiertem Wasser 96 Stunden bei einer Temperatur von ca. 20°C extrahiert. Der Extrakt wurde von den Kämmen getrennt und filtriert, wie im Beispiel 1 beschrieben. Der HA-Gehalt im Extrakt betrug 1,4 mg/ml. Das Produkt hatte nach einer Abscheidung mit Aceton gemäß Beispiel 1 einen Proteingehalt von 0,42% und eine Grenzviskositätszahl von 3700 cm³/g.

Beispiel 3

Das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde, abgesehen davon, daß statt der Glutaraldehydlösung eine 40- Gew.-%-Lösung von Glyoxal in Wasser benutzt wurde, wiederholt. Die HA-Konzentration im Extrakt betrug 0,92 mg/ml. Der Proteingehalt im Produkt war 0,5% und die Grenzviskositätszahl 3930 cm³/g.

Beispiel 4

Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt und mit dem Aceton-Formaldehydgemisch gemäß Beispiel 1 behandelt. Die Kämme wurden, nachdem sie auf die Hälfte des ursprünglichen Gewichts getrocknet worden waren, mit 2,5 l einer 0,05 M Natriumhydroxidlösung in Wasser (pH-Wert größer als 11) 120 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20°C extrahiert. Der Extrakt wurde dann wie im Beispiel 1 beschrieben getrennt und filtriert. Die HA-Konzentration im Extrakt war 3,6 mg/ml. Es wurde mit einer Aceton-Natriumacetatmischung ein weißes Produkt ausgefällt, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Erhalten wurde 7,5 g eines Produktes mit einem Proteingehalt von 0,2% und einer Grenzviskositätszahl von 1310 cm³/g.

Beispiel 5

Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt, und dann wurde 1 kg Kämme mit einem 1 kg Isopropanol, 100 g eines 37%igen Formalins, 50 g Natriumacetat und 100 g Chloroform enthaltenden Gemisch versetzt. Die Behandlung wurde unter langsamem Rühren 16 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20°C durchgeführt. Die Extraktion und Abscheidung erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben. Die HA-Konzentration des Extraktes betrug 0,68 mg/ml. Der Proteingehalt des Produktes war 0,46% und die Grenzviskositätszahl 4900 cm³/g.

Beispiel 6

Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt, mit einem Aceton-Formaldehydgemisch behandelt, mit Aceton gewaschen, getrocknet und mit Wasser extrahiert, wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extrakt wurde mit einem Gemisch aus 2 l Aceton und 1 l Chloroform versetzt. Es wurde ein weißes, faserartiges Produkt von 1,9 g mit einem Proteingehalt von 0,05% und einer Grenzviskositätszahl von 4400 cm³g erhalten.

Beispiel 7

Es wurde 1 kg geschnitzelter Kämme wie im Beispiel 1 beschrieben zubereitet und mit einem Gemisch, welches 1 kg Aceton, 50 g eines 37%igen Formalins und 50 g Natriumacetat enthielt, 24 Stunden bei einer Temperatur von ca. 20°C unter langsamem Rühren behandelt. Der Extrakt wurde getrennt und gefiltert und das Produkt wie im Beispiel 1 beschrieben abgeschieden. Es wurde 1,6 g eines weißen Produktes mit einem Proteingehalt von 0,45%, einer Grenzviskositätszahl von 5300 cm³/g und einem gebundenen Formaldehydgehalt von 0,008% erhalten.

Beispiel 8

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß die Kämme nach der Aceton-Formaldehydbehandlung auf ein Drittel ihres ursprünglichen Gewichts getrocknet und die erste Extraktion mit Wasser 96 Stunden lang durchgeführt wurde.

Die HA-Konzentration des ersten Extraktes betrug 1,05 mg/ml. Das aus diesem Extrakt ausgefällte Erzeugnis hatte einen Proteingehalt von 0,25% und eine Grenzviskositätszahl von 4930 cm³/g. Ein Schwingungsversuch mit einer 1-Gew.-%-Lösung dieses Produktes in wäßriger 0,15 M NaCl- Lösung ergab einen "Kreuzungspunkt" bei einer Frequenz von 0,020 Hz.

Die HA-Konzentration im zweiten Extrakt betrug 0,58 mg/ ml. Die aus diesem Extrakt erhaltene Fraktion hatte einen Proteingehalt von 0,19% und eine Grenzviskositätszahl von 7300 cm³/g. Der Gehalt an gebundenem Formaldehyd betrug 0,01%. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes" beim Schwingungstest war 0,005 Hz.

Insgesamt wurde 3,5 g chemisch modifizierter HA bei drei aufeinanderfolgenden Extraktionen erhalten.

Beispiel 9

Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt, und 1 kg der Schnitzel wurde mit 1 kg Aceton, 200 g eines 37%igen Formalins und 100 g Chloroform gemischt. Der pH- Wert des Gemisches wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt. Die HA-Konzentration im ersten Extrakt betrug 0,58 mg/ml. Das Erzeugnis wurde aus dem Extrakt durch Ausfällung mit Aceton-Natriumacetat gemäß Beispiel 1 gewonnen. Der Proteingehalt des Produktes betrug 0,12%, die Grenzviskositätszahl war 4025 cm³/g. Das Produkt enthielt gebundenes Formaldehyd in einer Menge von 0,02%. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes" beim Schwingungstest bei einer 1-Gew.-%-Lösung des Produktes in wäßriger 0,15 M NaCl-Lösung war 0,006 Hz.

Beispiel 10

Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt und 1 kg der Schnitzel mit einem Aceton-Formaldehydgemisch behandelt, wie im Beispiel 1 beschrieben, außer daß der pH-Wert des Gemisches mit Natriumhydroxid auf 11,0 eingestellt wurde. Die Kämme wurden getrocknet und mit Wasser wie beim Beispiel 1 extrahiert. Die HA-Konzentration im Extrakt betrug 0,69 mg/ml. Das Produkt wurde aus dem Extrakt gemäß Beispiel 1 ausgefällt, außer daß statt des Acetons Isopropanol verwendet wurde. Es wurde 1,3 g eines weißen, fasrigen Stoffs erhalten, der einen Proteingehalt von 0,45%, eine Grenzviskositätszahl von 5050 cm³/g und einen Formaldehydgehalt von 0,012% hatte. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes" beim Schwingungstest für eine 1-Gew.-%-Lösung des Produktes in wäßriger 0,15 M NaCl-Lösung war 0,012 Hz.

Beispiel 12 Behandlung von Hahnenkämmen mit ¹⁴CH₂O

Radioaktiv markiertes Paraformaldehyd (¹⁴CH₂O) mit einer spezifischen Aktivität von 500 mCi/g wurde in einer 5,0 mCi entsprechenden Menge mit 1,0 ml einer 37-Gew.-%-Lösung von Formaldehyd in Wasser gemischt und diesem 0,1 ml einer 1 N Natriumhydroxidlösung in Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wurde in einen eng verschlossenen Behälter gefüllt und auf 60°C erwärmt, um das Paraformaldehyd aufzulösen. Danach wurde das Gemisch auf 0°C abgekühlt und mit 0,1 ml einer wäßrigen 1 N Essigsäure neutralisiert. Die Radioaktivität der erhaltenen Lösung wurde in 10 ml Hydrofluor®, einem flüssigen Szintillationszählmedium unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers mit Rechnerkorrektur für den Wirkungsgrad auf der Grundlage der externen Standardmethode gemessen. Die Formaldehydkonzentration wurde mit einem kolorimetrischen Verfahren mit chromotroper Säure bestimmt. Die gemessene spezifische Aktivität der erhaltenen Lösung betrug 0,555 mCi/mmol CH₂O. Die markierte Formaldehydlösung wurde mit 7,5 g Aceton, 1 g Chloroform und 0,5 g Natriumacetat gemischt. In die Lösung wurde 7,5 g geschnitzelter Hahnenkämme eingemischt und die Behandlung 18 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20°C durchgeführt. Die Kämme wurden von der Flüssigkeit getrennt, mehrmals mit Aceton gewaschen und in Luft auf die Hälfte ihres ursprünglichen Gewichts getrocknet. Den Kämmen wurde 15 ml doppeltdestilliertes Wasser hinzugefügt, und dann ließ man die Extraktion 96 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20°C vor sich gehen. Der Extrakt wurde von den Kämmen getrennt und durch verschiedene Schichten Filterpapier (Whatman® Nr. 1) filtriert. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, um einen zweiten Extrakt der Kämme zu erhalten. Aus den Extrakten wurde HY durch Hinzufügen von CH₃OONa zu den Extrakten in solcher Menge, daß sich eine 1-Gew.-%-Lösung und 4 Volumen von 95% Äthanol ergaben, als weißer, faserartiger Stoff abgeschieden. Der faserartige Stoff wurde abgesondert, ausgiebig mit Aceton gewaschen, getrocknet und dann in Wasser neu aufgelöst, um eine Lösung zu bilden, deren HY-Konzentration ca. 1 mg/ml betrug. Aus dieser Lösung wurde das HY in der vorstehend beschriebenen Weise erneut ausgefällt und wiederum gründlich mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die trockene Substanz wurde erneut in destilliertem Wasser aufgelöst, um eine Lösung zu erhalten, die 0,84 mg/ml HY enthielt. Die spezifische Aktivität dieser Lösung wurde mit 194 dpm/µg HA gemessen. Eine erschöpfende Dialyse dieser Lösung gegen 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 M NaCl enthielt, reduzierte die Radioaktivität auf 103 dpm/µg HY. Eine erschöpfende Dialyse dieser Lösung gegen 4 M Guanidiumhydrochlorid verringerte die Aktivität auf 101 dg/µg HY, was anzeigte, daß selbst nach der Behandlung der Lösung unter Protein dissoziierenden Bedingungen Formaldehyd im Produkt verblieben war. Auf der Grundlage dieser gemessenen Radioaktivität des Produktes und der spezifischen Aktivität der Formaldehydausgangslösung wurde der Gehalt an Formaldehyd in Beziehung zu HY mit ca. 0,2 Gew.-% berechnet. Um abzuschätzen, wie viel des radioaktiv markierten Formaldehyds mit einem enzymatischen Abbau mit Streptomyces Hyaluronidase zugänglichen HY assoziiert war, wurde eine weitere Lösung des Produktes zubereitet, die 0,8 mg/ml HY enthielt und eine Aktivität von 1250 dpm/10 µl Lösung hatte. 2 ml dieser Lösung wurde 0,1 ml eines Citrat-Phosphatpuffers (pH 5,6) hinzugefügt, der 33 TRU Streptomyces Hyaluronidase enthielt, spezifische Aktivität 2000 TRU/mg HA, proteolytische Aktivität weniger als 5×10¹⁴ Einheiten pro TRU). Einem weiteren Anteil von 2 ml der gleichen Lösung wurde 0,1 ml des Puffers ohne Enzym hinzugefügt. Beide Anteile wurden 20 Stunden lang gegen 1000 Volumen des Citrat-Phosphatpuffers dialysiert. Nach der Dialyse waren die Volumen der beiden Proben gleich. Die nicht mit Enzym behandelte Probe hatte eine HY-Konzentration von 0,76 mg/ml und eine Radioaktivität von 552 dpm/10 µl. Die HY-Konzentration in der mit Enzym behandelten Probe war unter wahrnehmbare Pegel reduziert (10 µg/ml) und die Radioaktivität betrug 414 dpm/10 µl Lösung. Die für Hyaluronidase empfängliche Radioaktivität entsprach 20 dpm/µg HY, was 0,049 Gew.-% mit enzymatisch verdaubarem HY assoziiertem Formaldehyd entsprach. Derartig markierte Proben des Produktes wurden ferner anhand einer Gelpermeationschromatographie in einer 1,6×90 cm Glassäule analysiert, die mit Glyceryl - CPG 3000® einer Porengröße von 2869±8,3% gefüllt war. Für die Eluierung wurde ein entgaster 0,02 M Boratpuffer (pH 7,5) verwendet, der 0,15 M NaCl enthielt. Das ausgeschlossene Volumen der Säule (Vo) wurde mit einer Probe HY mit einem Molekulargewicht von 4×10⁶ bestimmt und das Gesamtvolumen der Säule (Vt) mit Sucrose. Die Eluierung erfolgte mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Std. bei 6°C. Es wurden 5 ml Fraktionen gesammelt und auf HY- Konzentration und Radioaktivität analysiert. Es zeigte sich, daß die Radioaktivität gemeinsam mit HY im Leervolumen eluiert und daß die enzymatische Digestion sowohl HY als auch die Radioaktivität aus den Leervolumenfraktionen entfernt. Berechnungen zeigten, daß die mit dem Leervolumen-HY assoziierte spezifische Aktivität 14,6 dpm/µg HY betrug, was 0,036 Gew.-% Formaldehyd im Polymerisat entspricht. Diese Ziffer steht gut in Übereinstimmung mit der beim Dialyseversuch erhaltenen Zahl.

Claims (1)

1. Chemisch modifizierte wasserlösliche Hyaluronsäurezubereitung, die natürlich vorkommendes Protein enthält, gekennzeichnet durch die Anwesenheit von 0,005 bis 0,05 Gew.-% kovalent an die Hyaluronsäurepolymerketten und an das Protein gebundener Aldehydvernetzungsgruppen.