KR102400586B1 - 히알루론산 가교물, 히알루론산 수화 겔 및 이들의 제조방법 - Google Patents

히알루론산 가교물, 히알루론산 수화 겔 및 이들의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분말 상의 히알루론산 가교물 및 이의 제조방법과 상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 사용하여 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 우수한 유변학적 특성을 나타내며, 대량생산이 용이하고 품질 균일성이 우수하다.

Description

히알루론산 가교물, 히알루론산 수화 겔 및 이들의 제조방법{Crosslinked hyaluronic acids, hyaluronic acid hydrogel and process for preparation thereof}
본 발명은 히알루론산 가교물, 히알루론산 수화 겔 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위(repeating unit)가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 동물의 태반, 안구의 유리액, 관절의 활액, 또는 닭벼슬 등에 많이 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, 히알루론산은 스트렙토코코스속 미생물(예: Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus) 또는 스타필로코코스속 미생물에 의한 발효에 의해서도 생산되는 것으로 알려져 있다.
현재 미국에는 1회 투여만으로 6 개월간 효과가 지속되는 히알루론산 가교물 주사제인 Synvisc-one® 이 시판되고 있다. Synvisc-one® 은 닭 벼슬의 히알루론산을 포르말린 함유 수용액으로 추출하면서 얻어진 히알루론산 가교물을 함유하며, 히알루론산에 연결된 단백질이 포르말린에 의해 약하게 가교되어 낮은 점탄성을 가진다(특허문헌 1). 상기 약하게 가교된 히알루론산은, 추가로 가교제 DVS(divinyl sulfone)에 의해 더욱 가교되어 증가된 점탄성을 갖는 히알루론산 가교물과 조합되어 인체의 관절강에 적용하기 적절한 점탄성을 갖는 복합 히알루론산 가교물(Synvisc-one® )을 구성한다.
그러나 종래의 히알루론산 가교물의 경우, 여과를 할 수 없어 겔에 포함된 이물질의 제거에 많은 노력이 소요되며, 가교제의 세척을 위해 대량의 세척 버퍼가 요구되었다. 이에 더하여 종래 히알루론산 가교물은 제조 배치마다 제조된 히알루론산의 점탄성 등 유변학적 특성이 편차가 심하여 품질의 균일성에 많은 문제가 있었다. 따라서 품질 관리가 용이하지 않고 대량 생산을 위해 복잡한 공정이 필요하고 많은 비용이 소요되었다.
미국특허등록공보 4,713,448 대한민국공개공보 10-2017-0090965
본 발명의 일 양상은 경제적이며 대량생산에 최적화된 분말 상의 히알루론산 가교물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 일 양상은 경제적이며 대량생산에 최적화된 분말 상의 히알루론산 가교물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 일 양상은 우수한 유변학적 특성을 나타내며 품질균일성이 우수한 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 일 양상은 우수한 유변학적 특성을 나타내며 품질균일성이 우수한 가교된 히알루론산 수화 겔에 관한 것이다.
본 발명은 경제적이며 대량생산에 최적화된 분말 상의 히알루론산 가교물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 분말 상의 히알루론산 가교물의 제조방법은,
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교 반응시키는 단계;
상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 가교 반응은 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액에 가교제를 첨가하여 10 내지 40℃, 예컨대 25℃ 내지 35℃에서, 2 내지 8시간, 예컨대 4 내지 6시간 동안, 50 내지 350rpm, 예를 들어 150 내지 350rpm, 예컨대 250 rpm으로 교반하면서 가교 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 방법에서 상기 수용액 상에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올의 투입 속도는 20 mL/min 내지 1000 mL/min일 수 있다.
본 발명의 상기 방법에서 상기 수용액 상에 에탄올을 첨가하는 동안 혼합액 전체 부피에 대한 에탄올의 부피변화 속도는 0.5%(v/v)/min 내지 35%(v/v)/min일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액은 가교제를 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물 1 g에 대하여 10 μl 내지 500 μl의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액과 수용액에 첨가되는 에탄올의 부피비는 1: 1 내지 10일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 히알루론산 입자를 포함하는 수용액을 가교 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 수용액 중에 첨가된 가교제에 의한 가교 반응을 지속시키는 단계일 수 있다. 상기 단계에서 히알루론산의 입자를 포함하는 수용액은 수용액 중 반응하고 남은 가교제와 추가로 가교 반응할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 추가의 가교 반응은 히알루론산의 입자를 포함하는 수용액을 15 내지 30℃, 예컨대 25℃에서 24시간 이하 동안 50 내지 350rpm, 예컨대 250rpm으로 교반하면서 가교 반응시키는 것일 수 있다. 상기 추가의 가교 반응에서의 교반 속도는 에탄올 첨가 전 가교 반응에서의 교반 속도와 동일하게 할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교 반응 후 히알루론산 입자로 고체화하여 얻은 히알루론산 가교물, 또는 수용액 중 남은 가교제와 추가로 가교 반응시켜 얻은, 얻은 히알루론산 가교물을 에탄올 또는 에탄올을 포함하는 용액으로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 D90이 80 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 D10이 2.5 ㎛ 내지 6 ㎛, D50이 8 ㎛ 내지 20 ㎛ 및 D90이 25 ㎛ 내지 80 ㎛의 입도분포를 나타낼 수 있다.
본 발명은 위 방법들에 의해 제조된 분말 상의 히알루론산 가교물을 제공한다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산 가교물은 시판제품 예컨대 Synvisc-one®와 유사한 점탄성을 보이고, 동등이상의 안정성, 및 동등이상의 가교변형률(Degree of　Modification, MoD)을 보일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산 가교물은 천연 히알루론산(HA) 또는 Synvisc-one®보다 펜던트 가교변형률(pendant MoD)(%), 교차결합 가교변형률(crosslink MoD)(%), 및 총 가교변형률(total MoD)(%)의 증가를 보일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 히알루론산(HA)의 가교변형률(Degree of　Modification, MoD) 분석은 HPLC 시스템을 이용할 수 있다. 상기 분석방법에서, 다당류(polysaccharide)인 HA (glucuronic acid와 N-acetyl-D-glucosamine의 반복 구조)가 히알루론산 분해효소(hyaluronidase)에 의해 분해되어 더 작은 폴리머(polymer)가 형성되며, 가교제에 의해 변형된 HA와 미변형된 HA는 크로마토그램 차이와 변형률을 상대비교하여 구분할 수 있다. 상기 분석방법에서 히알루론산 분해효소 (Streptomyces hyalurolyticus 로부터 얻은 Hyaluronidase)를 이용하여 pH 5.0, 36℃조건에서 히알루론산(HA)을 분해(digestion) 후, Dionex CarboPac PA100 (Thermo Scientific) HPLC 컬럼을 이용하여 UV 흡광도(232 nm)에서 분해된 당량체(saccharide unit)을 측정할 수 있다. 히알루론산이 분해효소에 의해 완전분해되면 4량체(Tetramer)와 6량체(Hexamer)가 되며, 가교결합된 히알루론산은 4량체와 6량체보다 약간 큰 당량체, 그리고 그 이상의 올리고머(Oligomer) 등으로 분리되어 크로마토그램을 나타낼 수 있다. 각 크로마토그램의 면적으로 변형률(MoD)을 구할 수 있으며, 8량체(Octamer) 이상의 올리고머의 peak는 교차결합 가교변형률(crosslink MoD)(%)로 구분할 수 있고, 4량체와 6량체의 main peak를 제외한 8량체 보다 작은 올리고머의 peak는 펜던트 가교변형률(pendant MoD)(%)로 구분할 수 있으며, 이 둘을 합하여 총 가교변형률(total MoD)(%)로 할 수 있다.
히알루론산 가교물은 가교 반응이 많이 일어날수록 가교변형률(Degree of　Modification, MoD)(%)의 증가를 보일 수 있고, 또한 과다한 가교 반응에 의해 제조된 히알루론산은 충분한 물을 흡수할 수 없는 구조로 될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산 가교물은 0.1% 내지 10%의 총 가교변형률(total Degree of　Modification, total MoD)(%)을 보일 수 있다. 또한, 상기 가교변형률을 만족하는 히알루론산 가교물은 충분한 물을 흡수할 수 있는 구조를 가지며, 충분한 수화를 나타낼 수 있는 점탄성 값을 보일 수 있다.
본 발명은 우수한 유변학적 특성을 나타내며 품질 균일성이 우수한 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법은,
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교 반응시키는 단계;
상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;
상기 히알루론산의 입자를 포함하는 수용액의 가교 반응을 지속시켜 분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 분말 상의 히알루론산 가교물을 수화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 방법에서 상기 수용액 상에 상기 에탄올 첨가 시, 에탄올의 투입 속도가 20 mL/min 내지 1000 mL/min 가 되도록 첨가될 수 있다.
본 발명의 상기 방법에서 상기 수용액 상에 에탄올을 첨가하는 동안 혼합액 전체 부피에 대한 에탄올의 부피 농도 변화 속도는 0.5%(v/v)/min 내지 35%(v/v)/min일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수화시키는 단계는, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 물 또는 물을 포함하는 용액에 첨가하는 단계일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 물 또는 물을 포함하는 용액 1 mL에 대하여 5 mg 내지 15 mg으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 240 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 D10이 25 ㎛ 내지 40 ㎛, D50이 70 ㎛ 내지 110 ㎛, D90이 190 ㎛ 내지 240 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 가교된 히알루론산 수화 겔을 필터를 사용하여 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 여과 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 120 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 여과 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D10이 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 80 ㎛ 내지 120 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명은 위 방법들에 의해 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔을 제공한다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성이 30 내지 200 Pa이고 점성이 10 내지 100 Pa일 수 있다.
본 발명은 무정형의 가교된 히알루론산 수화 겔을 제공한다. 상기 히알루론산 수화 겔은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 5와 같을 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산 수화 겔은 D90이 120 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산 수화 겔의 입도분포는 D10이 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 80 ㎛ 내지 120 ㎛일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성이 30 내지 200 Pa이고 점성이 10 내지 100Pa일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성이 100 내지 150 Pa이고 점성이 10 내지 60Pa일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 25℃에서 8개월 보관 시 탄성감소율이 30% 이하일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 30℃에서 8개월 보관 시 탄성감소율이 25% 이하일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 40℃에서 8개월 보관 시 탄성감소율이 40% 이하일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 60℃에서 8개월 보관 시 탄성감소율이 90% 이하일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 25℃에서 8개월 보관 시 점성감소율이 35% 이하일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 30℃에서 8개월 보관 시 점성감소율이 20% 이하일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 40℃에서 8개월 보관 시 점성감소율이 18% 이하일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 60℃에서 8개월 보관 시 점성감소율이 50% 이하일 수 있다.
히알루론산은 온도, 효소 등의 요인에 의해 중합체 사슬(polymer chain)이 분해, 감소되어 점탄성, 유변학적 특성(Rheological properties)이 감소하며, 이에 따라 점성 보충(Viscosupplementation) 성능이 저하될 수 있다. 이와 비교하여, 가교된 히알루론산은 분해저항성이 향상되어 비가교 히알루론산 대비 체내 유지기간이 향상될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 히알루론산 대비 분해저항성이 향상되고, 비가교 히알루론산 대비 분해저항성이 향상될 수 있다.
본 발명의 분말 상의 히알루론산 가교물은 가교 정도가 균일하며, 적은 양의 세척액으로 용이하게 세척이 가능하고, 품질 균일성이 우수하다. 또한, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 사용하여 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔은 작은 기공 크기를 가지는 필터를 사용하여 여과가 가능하여 이물질을 용이하게 제거할 수 있으며, 품질 균일성이 우수하다. 따라서 본 발명에 따른 분말 상의 히알루론산 가교물 및 이를 사용하여 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔은 대량 생산에 적합하며 경제적이다.
도 1은 원료물질인 히알루론산 나트륨 및 실시예 1-1 내지 1-3에 따른 분말 상태의 히알루론산 가교물의 입도분포를 보여주는 도이다. 상기 도 1에서 세로축은 volume density (%)이며, 가로축은 입도(㎛)을 나타낸다.
도 2는 실시예 6 및 실시예 10에 따른 가교된 히알루론산 수화 겔의 입도 분포를 보여주는 도이다. 상기 도 2에서 세로축은 Channel (%)이며, 가로축은 입도(㎛)을 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 따른 분말 상태의 히알루론산 가교물의 X선 분말 회절 분석 결과를 보여주는 도이다. 도 3에서 세로축은 강도(cps)를 나타내며 가로축은 2θ(°)를 나타낸다.
도 4는 실시예 6에 따른 가교된 히알루론산 수화 겔의 X선 분말 회절 분석 결과를 보여주는 도이다. 도 4에서 세로축은 강도(cps)를 나타내며 가로축은 2θ (°)를 나타낸다.
도 5는 실시예 10에 따른 여과 후의 가교된 히알루론산 수화 겔의 X선 분말 회절 분석 결과를 보여주는 도이다. 도 5에서 세로축은 강도(cps)를 나타내며 가로축은 2θ (°)를 나타낸다.
도 6은 실시예 12에 따른 히알루론산 수화 겔에 대해 측정한 시간 및 온도 변화에 따른 탄성(Pa at 2.5 Hz, 25℃)을 나타낸다.
도 7은 실시예 12에 따른 히알루론산 수화 겔에 대해 측정한 시간 및 온도 변화에 따른 점성(Pa at 2.5 Hz, 25℃)을 나타낸다.
도 8은 실시예 13에 따른 히알루론산 수화 겔에 대해 측정한 시간 및 온도 변화에 따른 탄성(Pa at 2.5 Hz, 25℃)을 나타낸다.
도 9는 실시예 13에 따른 히알루론산 수화 겔에 대해 측정한 시간 및 온도 변화에 따른 점성(Pa at 2.5 Hz, 25℃)을 나타낸다.
도 10은 비교제품(Synvisc-one®)에 대해 측정한 시간 및 온도 변화에 따른 탄성(Pa at 2.5 Hz, 25℃)을 나타낸다.
도 11은 비교제품(Synvisc-one®) 에 대해 측정한 시간 및 온도 변화에 따른 점성(Pa at 2.5 Hz, 25℃)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용 전부는 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 명세서에서 DX가 Y 라는 것은 분말 상의 히알루론산, 히알루론산 겔 또는 가교된 히알루론산 수화 겔의 입자 크기를 누적곡선에 의해 나타낼 때, 입자 크기가 작은 순으로 누적하여 X% (%는 수, 부피 또는 중량을 기준으로 계산됨)가 되는 지점의 입자 크기가 Y임을 의미한다. 예를 들어, D10은 분말 상의 히알루론산, 히알루론산 겔 또는 가교된 히알루론산 수화 겔의 입자 크기를 작은 순으로 누적하여 10%가 되는 지점의 입자의 입자 크기를, D50은 분말 상의 히알루론산, 히알루론산 겔 또는 가교된 히알루론산 수화 겔의 입자 크기를 작은 순으로 누적하여 50%가 되는 지점의 입자의 입자 크기를, D90은 분말 상의 히알루론산, 히알루론산 겔 또는 가교된 히알루론산 수화 겔의 입자 크기를 작은 순으로 누적하여 90%가 되는 지점의 입자의 입자 크기를 표현한다.
입자 크기 분포 DX가 수, 부피, 또는 중량 중 어떠한 것을 기준으로 전체 누적 입자 중의 퍼센트를 나타내는지는 입자 크기 분포를 측정하는데 사용하는 방법에 따라 달라진다. 입자 크기 분포를 측정하는 방법과 이와 관련한 %의 유형은 이 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 잘 알려진 레이저 회절법에 의해 입자 크기 분포를 측정하는 경우, DX 중 X 값은 부피 평균에 의해 계산된 퍼센트를 나타낼 수 있다. 특정 방법에 의해 얻어진 입자 크기 분포 측정 결과는 통상적인 실험에 의해 경험을 바탕으로 하여 다른 기술로부터 얻은 것과 상관관계에 있을 수 있음을 이 분야의 통상의 기술자는 잘 알고 있다. 예를 들어, 레이저 회절법은 입자의 부피에 감응하여 부피 평균 입도를 제공하는데, 이는 밀도가 일정한 경우 중량 평균 입도에 상당한다.
본 명세서에서 점탄성은 저장 탄성률(storage modulus, G')과 손실 탄성률(loss modulus, G")을 의미한다. 상기 점탄성은 회전형 레오미터로 측정되며, 동적 점탄성 측정은 지름이 20 mm인 Geometry를 이용하였으며, Geometry와 플레이트(Plate) 사이의 측정거리(GAP)은 0.5 mm이며, 온도는 25℃로 분석 종료 전까지 일정하게 유지하고, 콘트롤 프로그램(control program)으로 주파 진동(frequency oscillation)을 이용하였으며, 주파수의 범위를 0.1~10 Hz 로 설정하여 저장 탄성률 및 손실 탄성률을 측정한다. 본 명세서에서는 저장 탄성률(storage modulus, G')에 탄성으로 표기하며, 손실 탄성률(Loss modulus, G")은 손실된 에너지는 점성으로 나타낼 수 있다.
본 발명의 분말 상의 히알루론산 가교물의 제조방법은,
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교 반응시키는 단계; 및
상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;를 포함한다.
상기 방법에서 수용액 상에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올은 일정 시간에 걸쳐 천천히 첨가된다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 수용액 상에 에탄올을 일정시간에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 균일한 입자 크기를 가지는 미세한 입자 형태의 고체의 히알루론산이 형성되며, 상기 고체 상태의 히알루론산 입자가 가교제와 반응하여 균일한 가교 반응이 진행된다. 이에 의해 가교도가 균일한 분말 상의 히알루론산 가교물이 형성될 수 있으며, 각각의 제조공정에서 분말 수준의 미세 입자 크기를 가지면서 입자크기(입도), 점성 및 탄성 등의 물리적 물성이 적합하고 균일한 히알루론산 가교물이 수득될 수 있다. 그 결과 최적의 효과를 나타내는 입도, 점성 및 탄성을 가지는 히알루론산 가교물을 재현성 있게 반복적으로 대량 생산할 수 있다.
상기 수용액 상에 에탄올을 투입하는 속도는 에탄올 첨가에 따라 생성되는 고체의 히알루론산이 입자 형태로 생성될 수 있도록 조정될 수 있다. 구체적으로 상기 에탄올 투여 속도에 따른 전체 반응액의 에탄올 농도 변화 속도를 조절하여 원하는 고체의 히알루론산 입자 크기 및 물리적 특성을 가지는 히알루론산 가교물을 생산할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계는, 상기 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 염기성 물질을 포함하는 알칼리 수용액에 첨가하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서, 상기 히알루론산은 히알루론산 자체, 히알루론산의 염, 또는 이들의 혼합물을 지칭할 수 있다. 따라서 히알루론산을 포함하는 수용액은 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 의미할 수 있다. 또한, 히알루론산 입자는 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 사용하여 형성된 입자를 의미할 수 있다.
상기 히알루론산의 염은 생체에 적용하기에 적합한 임의의 염 형태일 수 있으며, 구체적으로는 알칼리염, 알칼리토금속염, 아미노산염, 유기 염기와의 염 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 예를 들어 히알루론산의 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트, 히알루론산 테트라부틸암모늄염, 히알루론산 디에탄올아민, 히알루론산 시클로헥실아민 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 히알루론산의 염은 히알루론산 나트륨일 수 있다.
상기 히알루론산 또는 이의 염의 분자량은 약 100,000 Da 내지 약 6,000,000 Da 일 수 있으며, 일 구체 예에서, 상기 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨의 분자량은 약 100,000 Da 내지 약 6,000,000 Da, 구체적으로는 약 500,000 Da 내지 약 6,000,000 Da, 보다 구체적으로는 약 1,000,000 Da 내지 약 4,000,000 Da 일 수 있다.
상기 히알루론산은 당해 기술분야에 공지된 임의의 히알루론산을 포함하며, 임의의 원료로부터 얻은 히알루론산을 이용할 수 있다. 상기 히알루론산은 동물(예: 동물 태반, 닭벼슬)일 수도 있고, 발효시 히알루론산을 생산할 수 있는 임의의 미생물 (예: 스타필로코코스속(Staphylococcus) 미생물, 스트렙토코코스속(Streptococcus) 미생물) 유래의 히알루론산일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 히알루론산은 미생물 유래의 히알루론산이며, 예를 들어 스트렙토코커스(Streptococcus)속 미생물 유래의 히알루론산이다. 미생물 유래의 히알루론산은 동물 기원 히알루론산의 바이러스 문제 혹은 원료 품질의 균일성 문제로부터 자유로울 수 있어 의약품으로서 제조 시 품질관리의 측면에서 우수한 장점이 있다.
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액은 히알루론산 가교물의 제조에 사용될 수 있는 것으로 공지된 임의의 염기성 물질을 포함하는 알칼리 수용액일 수 있다. 예를 들면, 상기 알칼리 수용액은 pH 9 ~ 13의 알칼리 수용액일 수 있으며, 상기 알칼리 수용액은 수산화나트륨 함유 수용액, 수산화칼륨 함유 수용액, 또는 암모니아 함유 수용액일 수 있으며, 일 구체예에서, 상기 알칼리 수용액은 수산화나트륨 함유 수용액일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액은 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 수용액 전체 부피를 기준으로 약 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v) 되도록 포함할 수 있으며, 구체적으로는 약 1%(w/v) 내지 4%(w/v)가 되도록 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 히알루론산 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액은 히알루론산 나트륨을 약 2 %(w/v)가 되도록 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액이 염기성 물질로 수산화나트륨을 포함하고 히알루론산 나트륨을 첨가하여 제조되는 경우 상기 수용액은 나트륨 이온을 0.2 M 이상으로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액은 가교제를 더 포함할 수 있다. 상기 가교제는 하나 이상의 관능기를 가지는 화합물로, 구체적으로는 하나 이상의 알데하이드기, 카보다이이미드, 에폭시기 또는 비닐설폰기를 가지는 화합물일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 가교제는 두 개 이상의 에폭시기를 가지는 화합물 또는 다이비닐 설폰일 수 있다. 예를 들면, 상기 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDCIㆍHCl), 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드-메토-p-톨루엔술포네이트, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 히드로클로라이드, 글루타르알데하이드, 다이비닐설폰(divinyl sulfone), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether) 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 일 구현예로 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르, 다이비닐설폰 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일 구현예로 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)일 수 있다. 일 구현예로 상기 가교제는 다이비닐 설폰(DVS)일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액은 가교제를 히알루론산, 히알루론산 염 또는 이들의 혼합물 1몰에 대하여 0.005몰 내지 1몰, 구체적으로는 0.01몰 내지 0.8몰로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액은 가교제를 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물 1g에 대하여 약 10 μl ~ 500 μl, 구체적으로는 약 50 μl ~ 400 μl 으로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액 상에 에탄올을 첨가하여 고체의 히알루론산 입자를 포함하는 혼합액을 제조하는 단계에서 상기 에탄올은 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액 1 부피에 대하여 약 1 내지 약 10 부피로 첨가될 수 있다. 구체적으로 상기 혼합액의 제조 시, 상기 수용액과 첨가되는 에탄올을 부피비는 약 1: 1 내지 10, 보다 구체적으로는 약 1: 2 내지 8일 수 있다. 상기 범위로 에탄올이 첨가됨으로써 상기 고체 형태의 히알루론산 입자를 사용하여 제조된 히알루론산 겔이 우수한 유변학적 특성을 나타낼 수 있으며, 관절염 치료 또는 예방에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액에 에탄올 첨가 시, 에탄올의 투입 속도는 일정할 수도 있고 변동될 수도 있다. 구체적으로 에탄올 투입 속도는 일정할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액에 에탄올을 첨가하는 공정 동안 상기 수용액과 에탄올의 혼합액은 계속적으로 교반 될 수 있다. 구체적으로는 상기 에탄올 첨가 공정 동안 혼합액은 약 50 rpm 내지 300 rpm, 보다 구체적으로는 약 50 rpm 내지 250 rpm으로 교반될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 혼합액의 교반 속도는 일정할 수도 있고 변동될 수도 있다. 구체적으로 상기 혼합액의 교반속도는 일정할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수용액 상에 에탄올 첨가 시 상기 에탄올은 서서히 일정 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다. 히알루론산은 선형의 고분자로 에탄올에 의해 탈수되면서 실(실뭉치)와 같은 형태로 추출되는 특성이 있다. 구체적으로 상기 수용액 상에 에탄올은 섬유 상(실뭉치)의 히알루론산 고체 또는 덩어리 형태의 히알루론산 고체가 형성되지 않을 정도로 천천히 첨가될 수 있다. 보다 구체적으로 수용액 상에 에탄올은 히알루론산이 분말과 같이 미세 입자의 형태로 석출될 수 있도록 천천히 첨가될 수 있다. 상기 에탄올 첨가 속도가 하기 범위를 초과하는 경우, 섬유 상의 히알루론산으로 추출되어, 세척 시 pH 조절이 불가능하고 세척이 용이하지 않으며, 최종 생성물질이 갈변화되거나, 점탄성이 낮아져 액체 상태로 생산될 수 있다. 상기 수용액 상에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올의 투입 속도는 약 20 mL/min 내지 1000 mL/min일 수 있다. 구체적으로는 상기 에탄올의 투입 속도는 약 20 mL/min 내지 700 mL/min일 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 에탄올의 투입 속도는 약 20 mL/min 내지 500 mL/min일 수 있다. 상기 속도로 에탄올 투입 시 히알루론산이 뭉치지 않고 분말과 같이 미세 입자의 형태로 석출될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 에탄올의 첨가 시, 히알루론산 함유 수용액 및 에탄올을 포함하는 혼합액의 부피에 대한 에탄올의 부피 변화 속도가 약 0.5%(v/v)/min 내지 35%(v/v)/min가 되도록 첨가될 수 있다.
이와 같이 에탄올이 서서히 일정 시간에 걸쳐 첨가되는 경우, 균일한 미세 입자의 형태로 히알루론산 입자가 석출될 수 있다.
또한 균일한 미세 입자의 형태로 수득된 히알루론산은 가교 반응 후 에탄올 또는 에탄올을 포함하는 용액으로 세척이 가능하며, 세척 동안 분말 상의 히알루론산 가교물이 팽윤되는 현상이 거의 없거나 최소화할 수 있다. 따라서 가교제 또는 불순물의 세척 시 적은 양의 세척액으로도 세척이 충분히 가능하고, 히알루론산 가교물 물성의 균질성을 향상시킬 수 있어 대량 생산이 가능하며, 경제적이다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 고체 히알루론산의 입자와 가교제가 반응하여 가교 반응이 진행될 수 있으며, 상기 가교 반응에 의해 미세한 입자인 분말 상의 히알루론산 가교물이 형성될 수 있다. 상기 미세한 입자인 분말 상의 히알루론산 가교물은 균일한 입자 크기를 가지며 가교도가 균일할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 고체 상태의 히알루론산 입자와 상기 가교제의 가교 반응은 약 20 내지 40℃에서 약 6 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 상기와 같은 반응 조건에서 히알루론산의 분해를 최소화할 수 있어 사슬 길이가 긴 히알루론산 가교물이 형성될 수 있다. 또한, 관절염 치료에 적합한 가교도를 나타내며, 우수한 물성을 가지는 히알루론산 가교물이 형성될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 미세 분말 형태의 히알루론산 가교물은 D90이 약 80 ㎛ 이하일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 균일한 미세 분말 형태의 히알루론산 가교물은 D10이 약 2.5 ㎛ 내지 6 ㎛, D50이 약 8 ㎛ 내지 20 ㎛, D90이 약 25 ㎛ 내지 80 ㎛일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 미세 분말 형태인 히알루론산 가교물의 입도는 레이저 입도 분석법에 의해 측정될 수 있으며, 구체적으로는 건식법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 무정형일 수 있으며, X-선 분말 회절 분석 패턴이 할로 패턴을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 3과 같을 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 무정형이며, 상기 가교물의 입자는 D10이 약 2.5 ㎛ 내지 6 ㎛, D50이 약 8 ㎛ 내지 20 ㎛, D90이 약 25 ㎛ 내지 80 ㎛일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교 반응 수행 후 혼합액의 pH를 9 미만으로 조절하여 가교 반응을 종료시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 가교 반응 수행 후 염산(HCl)을 첨가하여 혼합액의 pH를 6 이상 9미만으로 조정하여 가교 반응을 종료시킬 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교 반응 종료 후 상기 미세 입자인 분말 상의 히알루론산 가교물은 여과를 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 분말 상의 히알루론산 가교물은 분말 형태를 가지므로 교반하지 않는 경우, 용액 속에 가라앉아 있으며, 단순한 여과 공정을 통해 용이하게 분말 상의 히알루론산 가교물을 액체와 분리하여 수득할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 분말 상의 히알루론산 가교물을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척에 의해 분말 상의 히알루론산 가교물에 잔류되어 있는 가교제 및 불순물들이 제거될 수 있다. 상기 세척은 에탄올 또는 에탄올을 포함하는 용액을 사용하여 1회 이상 수행될 수 있으며, 예를 들면, 상기 세척은 약 70%(w/w), 약 95%(w/w)의 에탄올 수용액을 사용하여 수회 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 수득된 분말 상의 히알루론산 가교물은 약 70%(w/w), 약 95%(w/w)의 에탄올 수용액을 서로 교환하면서 3회 내지 5회 걸쳐 세척될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 세척단계는 pH 9 미만 조건하에서 수행될 수 있으며, 구체적으로는 pH 6 내지 pH 9 미만의 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 세척 단계는 종래 방법들과 비교하여 순수한 물 또는 인산 완충액과 같은 수용액 완충액이 아니라 에탄올 또는 에탄올 수용액과 같은 에탄올을 포함하는 용액을 사용함으로써 히알루론산 가교물이 세척 동안 팽윤되는 현상을 억제할 수 있어 품질 관리가 용이하며, 세척단계 동안 팽윤이 거의 되지 않거나 최소화되어 소량의 세척액으로 충분히 가교제 및 불순물을 제거할 수 있어 용이하게 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 세척 후 상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 건조는 진공건조일 수 있으며, 약 35℃내지 약 70℃에서 약 10 내지 40시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명은,
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교 반응시키는 단계; 및
상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;를 포함하며,
상기 에탄올은 상기 수용액 상에 일정 시간에 걸쳐 천천히 첨가되는 것인 방법에 의해 제조된 분말 상의 히알루론산 가교물을 제공한다.
상기 방법은 히알루론산 입자를 포함하는 수용액을 가교 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 단계는 히알루론산 입자를 포함하는 수용액의 가교 반응을 지속시키는 것일 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 분말 상의 히알루론산 가교물은 미세입자로 취급이 용이하며, 가교도가 균질하다. 또한, 세척단계 동안 팽윤되지 않고 분말과 같이 미세 입자 형태를 그대로 유지하고 있어 세척이 용이하며 대량 생산이 가능하다.
또한, 세척단계 동안에 분말 상태의 가교물에 대한 NaOH, 미반응물 BDDE와 같은 가교제의 세척이 용이하며 pH 조절이 가능하고, 추후 최종 겔의 적절한 점탄성을 유도할 수 있으며, pH에 따른 히알루론산 가교물의 변성인 갈변 반응을 최소화 및 억제할 수 있다.
본 발명의 분말 상의 히알루론산 가교물의 입도 분포는 D90이 약 80 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 상기 균일한 미세 분말 형태의 히알루론산 가교물은 D10이 약 2.5 ㎛ 내지 6 ㎛, D50이 약 8 ㎛ 내지 20 ㎛, D90이 약 25 ㎛ 내지 80 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 미세 분말 형태의 히알루론산 가교물의 입도는 레이저 입도 분석법에 의해 측정될 수 있으며, 구체적으로는 건식법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 분말 상의 히알루론산 가교물은 무정형일 수 있으며, X-선 분말 회절 분석 패턴이 할로 패턴을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 3과 같을 수 있다.
상기 분말 상의 히알루론산 가교물의 제조방법 및 상기 히알루론산 가교물의 물성은 앞서 살핀 바와 같다.
본 발명은 우수한 유변학적 특성을 나타내며 이물 제거가 용이하고 경제적이며 대량생산에 최적화된 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법은,
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교 반응시키는 단계;
상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;
상기 히알루론산의 입자를 포함하는 수용액의 가교 반응을 지속시켜 분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 단계; 및
상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 수화시키는 단계를 포함한다.
상기 방법에서 수용액 상에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올은 상기 수용액 상에 일정 시간에 걸쳐 천천히 첨가된다.
상기 분말 상의 히알루론산 가교물의 제조방법 및 히알루론산 가교물의 물성은 앞서 살핀 바와 같다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔은 관절염 예방 또는 치료에 최적화된 유변학적 특성을 나타낸다. 또한, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 필터로 여과가 가능하므로 이물질 제거가 쉬워 의약품으로 제제화 시 불순물 관리가 용이하여 경제성 및 대량 생산 면에서 현저히 우수한 장점을 가진다. 또한 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 품질 균일성이 우수하며 배치별로 제조된 가교된 히알루론산 겔의 유변학적 특성이 거의 동일하여 균질한 물성을 나타내며 재현성이 우수하다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔의 탄성(storage modulus, G') 및 점성(loss modulus, G")은 인체 관절 보충액으로 사용하기에 적절한 범위를 나타낼 수 있다.
상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성은 약 30 내지 200 Pa이고 점성은 약 10 내지 100 Pa 일 수 있으며, 구체적으로는 탄성은 약 100 내지 150 Pa이고 점성은 약 10 내지 60 Pa 일 수 있다. 본 발명의 가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성은 약 30 내지 200 Pa이고 점성은 약 10 내지 100 Pa일 수 있으며, 필터를 통한 여과 공정 수행이 가능하다.
본 발명의 가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성은 약 30 내지 200 Pa이고 점성은 약 10 내지 100 Pa일 수 있으며, 입도는 D90이 240 ㎛이하일 수 있으며, 보다 구체적으로는 D10이 약 25 ㎛ 내지 40 ㎛, D50이 약 70 ㎛ 내지 110 ㎛, D90이 약 190 ㎛ 내지 240 ㎛의 입도 분포, 또는 D10이 약 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 약 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 약 80 ㎛ 내지 120 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있고, 필터를 통한 여과 공정 수행이 가능하다.
상기 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법에서 분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 단계는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 수화시키는 단계는 상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 물 또는 물을 포함하는 용액과 혼합하는 단계일 수 있다. 여기서 상기 물을 포함하는 용액은 완충액일 수 있으며, 구체적으로 인산 완충액일 수 있다.
상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 상기 물 또는 물을 포함하는 용액에 대하여 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 농도로 첨가될 수 있다. 상기 분말 상의 히알루론산 가교물이 물 또는 물을 포함하는 용액에 위 농도로 첨가되는 경우, 가교된 히알루론산 겔이 관절염 치료에 적절한 점성 및 탄성을 나타내며, 여과가능한 정도의 유변학적 특성을 나타내어 이물질 제거가 용이하며 그에 따른 품질관리가 용이하고, 주사기 충진 시 적절한 주사압력을 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 가교된 히알루론산 수화겔을 균질화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 균질화는 균질기를 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 균질기를 이용하여 약 7000 rpm 이하, 예를 들어 약 2000 내지 약 7000 rpm으로 약 3분 내지 약 20분간 균질화 될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 가교된 히알루론산 수화 겔을 약 5 ㎛ 내지 30 ㎛의 기공 크기(pore size)를 가지는 필터로 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 작은 기공 크기를 가지는 필터를 통해 여과할 수 있어 히알루론산 수화 겔로부터 이물질을 쉽게 제거할 수 있어 품질 관리가 용이하여, 이물질 포함에 따른 위험성을 낮출 수 있고, 수화 겔의 물리적인 특징이 크게 변화되지 않고 유지되면서 입도 및 입도 분포의 균질성을 향상시킬 수 있어 높은 품질 향상을 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 이용한 여과는 감압 상태 또는 진공 상태에서 수행될 수 있으며, 구체적으로는 약 80 kPa에서 20 kPa 압력 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 이용한 여과는 1회 이상 수행될 수 있으며, 구체적으로는 1회 또는 2회 수행될 수 있다. 필터를 통한 여과 공정의 수행 횟수가 증가하여도 히알루론산 수화 겔의 특성은 동일하게 유지되며, 입도가 감소될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 통한 여과 공정 수행 전의 히알루론산 수화 겔은 D90이 약 240 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 필터를 통한 여과 공정 수행전의 히알루론산 수화 겔은 D10이 약 25 ㎛ 내지 40 ㎛, D50이 약 70 ㎛ 내지 110 ㎛, D90이 약 190 ㎛ 내지 240 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 통한 여과 공정 수행 전의 가교화된 히알루론산 수화 겔은 무정형일 수 있으며, X-선 분말 회절 분석 패턴이 할로 패턴을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 히알루론산 수화 겔은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 4와 같을 수 있다.
본 발명의 가교된 히알루론산 수화겔은 겔은 무정형으로, X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 4와 같으며, D90이 240 ㎛이하인 입도 분포를 나타낼 수 있으며, 보다 구체적으로는 D10이 약 25 ㎛ 내지 40 ㎛, D50이 약 70 ㎛ 내지 110 ㎛, D90이 약 190 ㎛ 내지 240 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 수화겔은 필터를 통한 여과 공정 수행이 가능하다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 이용한 여과 공정 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 약 120 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 이용한 여과 공정 후의 히알루론산 수화 겔은 D10이 약 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 약 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 약 80 ㎛ 내지 120 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 필터를 통한 여과 공정 수행 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 무정형일 수 있으며, X-선 분말 회절 분석 패턴이 할로 패턴을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 히알루론산 수화 겔은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 5와 같을 수 있다.
본 발명의 가교된 히알루론산 수화겔은 겔은 무정형으로, X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 5와 같으며, D90이 120 ㎛ 이하인 입도 분포를 나타낼 수 있으며, 보다 구체적으로는 D10이 약 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 약 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 약 80 ㎛ 내지 120 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 수화겔은 필터를 통한 여과 공정 수행이 가능하다.
본 발명에 있어서 상기 가교된 히알루론산 수화 겔의 입도는 레이저 입도 분석법에 의해 측정된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔의 입도는 습식법에 의해 측정된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 여과하는 단계는 균질화하는 단계 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 가교된 히알루론산 수화겔을 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 멸균은 약 100℃이상에서 약 10분 이상 수행될 수 있으며, 구체적으로는 약 121℃이상에서 약 15분 이상 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 멸균은 상기 가교된 히알루론산 수화겔을 주사기에 충진하기 전에 수행되거나 또는 주사기에 충진 한 후 수행될 수 있으며, 구체적으로는 상기 가교된 히알루론산 겔을 주사기에 충진한 후 수행될 수 있다.
본 발명은,
히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교 반응시키는 단계;
상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;
상기 히알루론산의 입자를 포함하는 수용액의 가교 반응을 지속시켜 분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 단계; 및
상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 수화시키는 단계를 포함하는
방법에 의해 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔을 제공한다.
상기 방법에서 수용액 상에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올은 상기 수용액 상에 일정 시간에 걸쳐 천천히 첨가될 수 있다.
상기 히알루론산 수화 겔은 퇴행성 관절염에 의한 통증완화, 예방 및 치료에 최적화된 유변학적 특성을 나타낸다. 또한, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 작은 기공 크기를 가지는 필터로 여과가 가능하므로 이물질 제거가 쉬어 의약품 및 의료기기로 제제화 시 불순물 관리가 용이하여 경제성 및 대량 생산 면에서 현저히 우수한 장점을 가진다. 또한 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은 품질 균일성이 우수하며 배치별로 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔의 유변학적 특성이 거의 동일하여 균질한 물성을 나타내며 재현성이 우수하다.
본 발명의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 약 240 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D10이 약 25 ㎛ 내지 40㎛, D50이 약 70 ㎛ 내지 110 ㎛, D90이 약 190 ㎛ 내지 240 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 가교된 히알루론산 수화 겔은 무정형일 수 있으며, X-선 분말 회절 분석 패턴이 할로 패턴을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 히알루론산 수화 겔은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 4와 같을 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 가교된 히알루론산 수화 겔은 약 5 ㎛ 내지 30 ㎛의 기공 크기(pore size)를 가지는 필터로 여과될 수 있다.
본 발명의 여과 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 약 120 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 여과 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 D10이 약 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 약 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 약 80 ㎛ 내지 120 ㎛의 입도 분포를 나타낼 수 있다.
본 발명의 여과 후의 가교된 히알루론산 수화 겔은 무정형일 수 있으며, X-선 분말 회절 분석 패턴이 할로 패턴을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상기 여과후의 히알루론산 수화 겔은 X선 분말 회절 패턴(XRD)이 도 5와 같을 수 있다.
본 발명에서 상기 분말 상의 히알루론산 가교물 입자 및 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법과 분말 상의 히알루론산 가교물 입자의 물성 및 가교된 히알루론산 수화 겔의 물성은 앞서 살핀 바와 같다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 여과 단계 후 수득된 히알루론산 수화 겔은 탄성은 30 내지 200 Pa이고 점성은 10 내지 100 Pa일 수 있으며, 구체적으로 탄성은 100 내지 150 Pa이고 점성은 10 내지 60 Pa 일 수 있다.
본 발명은 상기 가교된 히알루론산 수화 겔이 충진된 주사기를 제공한다. 상기 주사기는 인체에 적용 시, 주사에 적절한 압력을 나타낼 수 있으며 가교된 히알루론산 겔의 우수한 유변학적 특성으로 인해 우수한 퇴행성 관절염에 의한 통증완화, 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있다.
[실시예]
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
실시예 1-1
0.2~0.3 M NaOH 수용액(pH > 9)에 부탄디올디글리시딜에테르(butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 혼합하고, 히알루론산 나트륨(Na-HA, 분자량: 1.0~4.0 MDa)의 농도가 2%(w/v)가 되도록 반응물을 제조하였다. 이 때, BDDE와 히알루론산 나트륨의 비율은 100 μl(BDDE)/1 g(HA)이었다.
상기 반응물을 상온에서 교반하여 히알루론산 나트륨을 용해시켜 히알루론산 나트륨 포함 수용액(Na-HA solution) 250 mL를 제조하고, 25 내지 35℃에서 4 내지 6시간 동안 250 rpm으로 교반하면서 가교 반응 시켰다. 상기 히알루론산 나트륨 포함 수용액에 히알루론산 나트륨 포함 수용액과 에탄올의 부피비가 1: 5가 될 때까지 에탄올을 첨가하였으며, 이 때 에탄올을 히알루론산 나트륨이 뭉치지 않도록 20 mL/min 속도로 첨가하였다.
히알루론산 나트륨이 분말 형태로 석출된 후, 25℃에서 24시간 이하 동안 250rpm으로 교반하면서 가교 반응시켰다. 이 가교 반응 후, 2.0M 이하의 HCl 용액을 투입하여 pH를 조정(pH 6.0~9.0 미만)하여 반응을 종료시켰다. 필터링을 통해 고형화된 히알루론산 가교물을 회수하였다. 고형화된 히알루론산 가교물을 95%(w/w) 에탄올과 70%(w/w) 에탄올을 번갈아 교환하여 수회 세척하였다. 세척 후, 회수된 가교된 히알루론산은 60℃이하에서, 24시간 이하 동안 진공 건조하여 에탄올 및 수분을 제거하여 분말형태의 히알루론산 가교물을 수득하였다.
실시예 1-2
히알루론산 나트륨 포함 수용액에 에탄올을 80 mL/min의 속도로 첨가한 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일한 방법으로 분말 형태의 히알루론산 가교물을 수득하였다.
실시예 1-3
히알루론산 나트륨 포함 수용액에 에탄올을 200 mL/min의 속도로 첨가한 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일한 방법으로 분말 형태의 히알루론산 가교물을 수득하였다.
실시예 2
히알루론산 나트륨 포함 수용액과 에탄올의 부피비가 1: 3이 될 때까지 히알루론산 나트륨 포함 수용액에 에탄올을 첨가한 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시예 3
히알루론산 나트륨 포함 수용액과 에탄올의 부피비가 1: 7이 될 때까지 히알루론산 나트륨 포함 수용액에 에탄올을 첨가한 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시예 4
가교제로 BDDE 대신에 DVS를 100μl (DVS)/1 g(HA) 되도록 첨가하고, 히알루론산 나트륨 포함 수용액과 에탄올의 부피비가 1: 3이 될 때까지 히알루론산 나트륨 포함 수용액에 에탄올을 첨가한 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시예 5
실시예 1-1에서 제조된 분말형태의 히알루론산 가교물을 PBS (Phosphate buffered saline)에 10~15 mg/mL로 첨가하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 수화 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 겔 대해서, 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 6
실시예 2에서 제조된 분말형태의 히알루론산 가교물을 PBS (Phosphate buffered saline)에 10~15mg/mL로 용해하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 수화 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 겔에 대해서 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 7
실시예 3에서 제조된 분말 형태의 가교 히알루론산을 PBS (Phosphate buffered saline)에 10~15mg/mL로 용해하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 수화 겔에 대해서 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 8
실시예 4에서 제조된 분말 형태의 가교 히알루론산을 PBS (Phosphate buffered saline)에 10~15mg/mL로 용해하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 수화 겔에 대해서 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 9
실시예 2에서 제조된 분말 형태의 가교 히알루론산을 PBS (Phosphate buffered saline)에 6~8mg/mL로 용해하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 수화 겔에 대해서 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 겔을 수득하였다.
실시예 10
실시예 2와 동일한 방법으로 분말 형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
제조된 분말 형태의 히알루론산 가교물을 PBS (Phosphate buffered saline)에 10~15 mg/mL로 용해하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 수화 겔을 감압 여과 장치에 S.S 여과장치 (Solid suspension Filtering, with joint) 를 사용하여 여과하였으며, 이 때 필터는 25㎛ 이하 Nylon Filter paper를 사용하였으며 약 80 kPa 압력 이하에서 여과를 진행하였다. 여과된 수화 겔을 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 11
실시예 2와 동일한 방법으로 분말 형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
제조된 분말 형태의 히알루론산 가교물을 PBS (Phosphate buffered saline)에 10~15 mg/mL로 용해하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 균질화된 수화 겔을 감압 여과 장치에 S.S 여과장치 (Solid suspension Filtering, with joint) 를 사용하여 2회 순차적으로 여과하였으며, 이 때 필터는 25㎛ 이하 Nylon Filter paper를 사용하였으며 약 80 kPa 압력 이하에서 여과를 진행하였다. 여과된 수화겔을 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
비교예 1
8~12% (w/w)의 비율로 에탄올을 함유하는 0.8~1.2% (w/w) 수산화 나트륨 수용액에 히알루론산나트륨을 가하여 완전히 용해시킨 다음, BDDE를 50~100 μl /히알루론산나트륨 1 g의 비율로 가하고 혼합하였다. 상기 혼합이 완료되면 반응온도 약 40~50℃, 반응시간 약 6시간 이하로 가교 반응을 수행시켰다. 반응이 완료된 하이드로겔 형태의 히알루론산 가교물을 PBS 용액 (Phosphate Buffered saline)에 투석하였다. 투석 후 얻어진 하이드로겔을 BDDE를 제거하기 위해 증류수로 세척하고 중성화된 하이드로겔을 95% (w/w) 에탄올 수용액에 추출하여 분말상의 히알루론산 1차 가교물을 수득하였다.
상기 히알루론산 1차 가교물에 2차 가교 반응을 수행하였다. 상기 분말상의 히알루론산 1차 가교물은 0.8~1.2% (w/w) 수산화 나트륨 수용액 중에 1:4~6의 중량비로 혼합하여 완전히 용해시켰다. 얻어진 반응 혼합물에 BDDE를 50~100 μl/1차 가교물 1g의 비율로 가하여 혼합하였다. 상기 혼합이 완료되면, 반응 온도 40~50℃로 약 12시간 이하로 가교 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 후 생성된 2차 가교물을 PBS 용액으로 약 12 ~ 24 시간 동안 투석을 수행하였다. 투석 후 얻어진 입자를 BDDE를 제거하기 위해 증류수로 세척하고 중성화 된 하이드로겔을 95% (w/w) 에탄올 수용액에 추출하여 분말상의 히알루론산 2차 가교물을 수득하였다.
상기 히알루론산 1차 가교물 및 히알루론산 2차 가교물을 PBS 중에 9:1의 중량비로 최종 농도가 2%(w/w)이 되도록 겔 제조한 다음, 상기 겔을 물리적 힘을 가하여 500 μm의 메쉬의 체를 통과시켜 분쇄하는 공정을 수행함으로써 최종적인 히알루론산 가교물을 수득하였다.
실험예 1: 히알루론산 수화 겔의 점탄성 측정 (1)
상기 실시예에서 제조된 가교된 히알루론산 수화겔에 대해 점탄성을 측정하였다. 점탄성은 회전형 레오미터인 Kinexus Pro Rheometer(Malvern, Worchestershire, UK)을 이용하여 측정하였다.
동적 점탄성 측정을 위하여 지름이 20 mm인 Geometry를 이용하였으며, Geometry와 플레이트(Plate) 사이의 측정거리(GAP)은 0.5 mm이며 온도는 25℃로 분석 종료 전까지 일정하게 유지하였다. 콘트롤 프로그램(control program)으로 주파 진동(frequency oscillation)을 이용하였으며, 주파수의 범위를 0.1~10 Hz 로 설정하여 2.5 Hz에 해당하는 저장 탄성률(storage modulus, G'), 손실 탄성률(loss modulus, G") 측정하였다.
실시예에 따른 수화 겔의 점탄성 측정 결과는 표 1과 같으며, 상기 표 1에서 탄성은 저장 탄성률(storage modulus, G')을 의미하며 점성은 손실 탄성률(loss modulus, G")을 의미한다.
[표 1]
Figure 112019126229848-pat00001
실험예 2: 히알루론산 수화 겔의 점탄성 측정 (2)
실시예 10 및 비교예 1의 방법에 따라 가교된 히알루론산 수화겔을 3회 별도로 제조하였다. 상기 각각의 가교된 히알루론산 수화겔에 대해 실험예 1과 같이 점탄성을 측정하였고 그 평균값 및 표준편차를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112019126229848-pat00002
위 표 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 10의 방법에 따르면, 가교된 히알루론산 수화 겔의 탄성 및 점성은 표준 편차가 상당히 낮은 값을 나타내어 각 배치마다 거의 일정한 물성을 나타내었다. 반면, 비교예 1의 방법에 따르면, 가교된 히알루론산 겔의 탄성 및 점성은 제조 시마다 큰 차이를 나타내었다.
이로부터 본원발명에 따르면 균일한 물성을 가지는 가교된 히알루론산 수화 겔이 제조될 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3: 분말형태의 히알루론산 가교물의 입도 분석
실시예 1-1 내지 실시예 1-3에서 사용된 원료물질인 분말 형태의 히알루론산 나트륨(분자량: 1.0~4.0 MDa) 및 실시예 1-1 내지 실시예 1-3에 따른 분말 형태의 히알루론산 가교물의 입도를 입도 분석기 (Mastersizer 3000, Malvern社, England)를 이용하여 건식법으로 분석하였으며, 그 결과는 상기 도 1 및 표 3과 같다.
[표 3]
Figure 112019126229848-pat00003
상기 도 1 및 표 3에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1-1 내지 1-3에 따른 분말 상태의 히알루론산 가교물은 원료물질인 히알루론산 나트륨보다 보다 미세한 분말 상태의 가교물로 수득되었다.
또한, 에탄올 투입 속도가 높을수록 입도가 증가하는 경향을 나타내었으며, 입도분포에서 D90의 값이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4: 가교된 히알루론산 수화 겔의 입도 분석
실시예 6, 실시예 10, 실시예 11의 가교된 히알루론산 수화 겔을 입도분석기(Microtrac, Montgomeryville, PA)를 이용하여 습식법으로 입도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2 및 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112019126229848-pat00004
상기 도 2 및 표 4에 따르면, 가교된 히알루론산 수화 겔은 여과가 가능하며, 여과를 통해 입도가 감소되고, 보다 균일한 입도 분포를 나타내었다.
이로부터 여과 공정을 통해 가교된 히알루론산 수화 겔은 보다 균질화 되어 입도의 균일성이 향상되는 것을 알 수 있다.
실험예 5: 가교된 히알루론산 겔의 XRD 구조 분석
실시예 2에 따른 분말 상태의 히알루론산 가교물과 실시예 6 및 10에 따른 가교된 히알루론산 수화 겔의 물리적인 상태를 X선 회절 분석을 통하여 확인하였다. 측정된 XRD스펙트럼에서 구한 면간 거리(d)와 비례 반사강도(I/Io)를 비교하여 RIR (Semi- Quantitative) method 로 결정 구조의 peak 를 비교하였다.
X-선 회절 스펙트럼 측정의 기기 및 조건은 다음과 같다.
<분말 X-선 회절 스펙트럼 측정방법>
- 제조사: PANalytical 社 (Almelo, Netherlands)
- 모델명: X'pert pro MPD
- X선의 파장: CuKγ의 1.5405Å
상기 X선 회절 분석 결과는 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
하기 도 3 내지 도 5에서 확인되는 바와 같이, 실시예 2에 따른 분말 상태의 히알루론산 가교물과 실시예 6 및 10에 따른 가교된 히알루론산 수화 겔 모두 무정형 상태임을 확인할 수 있었다.
실시예 2에 따른 분말 상태의 히알루론산 가교물은 2θ 값이 약 22°~ 23°인 위치에서 완만한 피크를 나타냈으며, 실시예 6 및 10에 따른 가교된 히알루론산 수화겔은 2θ 값이 약 28° 인 위치에서 완만한 피크를 나타내었다.
실시예 12
1% NaOH 수용액에 에탄올을 동량 첨가하고, 여기에 히알루론산 나트륨(Na-HA, 분자량: 1.0~4.0 MDa)을 첨가하여 혼합물의 농도가 3%(w/v)가 되도록 혼합하였다. 여기에 BDDE을 첨가하여 반응물을 제조하였다. 이 때, BDDE와 히알루론산 나트륨(Na-HA)의 비율은 100 μL(BDDE)/1 g(HA)이었다.
상기 반응물을 30℃에서 200 rpm 이하의 속도로 교반하여 5시간 동안 가교 반응 시켰다. 여기에 반응물과 에탄올의 부피비가 1:5가 될 때까지 100 mL/min 이하 속도로 에탄올을 투입하였다. 히알루론산 나트륨(Na-HA)이 분말 상태로 석출된 후 침전된 상태로 16시간 더 가교 반응 시켰다. 이 가교 반응 후, 1.2M HCl 용액을 투입하여 pH를 조정(pH 8이하)하여 반응을 종료시키고, 에탄올로 수회 세척하였다.
세척 후, 건조감량 10%이하로 건조시켜 분말형태의 히알루론산 가교물을 얻었다. PBS (Phosphate buffered saline)에 상기 히알루론산 가교물을 10 mg/mL이 되도록 첨가하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 수화 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 겔 대해서, 121℃에서 20분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 13
1% NaOH 수용액과 에탄올의 혼합액에 히알루론산 나트륨(Na-HA)을 첨가하여 혼합물의 농도가 2%(w/v)가 되도록 혼합하고, 여기에 BDDE을 히알루론산 나트륨(Na-HA)과 비율 125 μl(BDDE)/1 g(HA)로 첨가하여 반응물을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 12와 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실험예 6: 가교된 히알루론산 수화겔의 보관 안정성 평가, 점탄성 측정 (3)
실시예 12 및 13에서 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔을 각각 25℃, 30℃, 40℃, 60℃에서 8개월 동안 보관하며 1개월 마다 주기적으로 점탄성을 측정하였다. 점탄성의 측정은 회전형 레오미터인 Kinexus Pro Rheometer(Malvern, Worchestershire, UK)을 이용하여 실험예 1과 동일한 조건에서 측정하였다. 또한, 시판되고 있는 히알루론산 가교물 주사제인 Synvisc-one®(사노피社)을 비교제품으로 사용하여 동일한 조건에서 점탄성을 측정하였다. 표 5 및 표 6에서 실험이 종료되어 측정하지 않은 값(빈칸=Not measured)의 경우 *로 표시하였다.
실시예 12 및 13 또는 비교제품에 따른 수화 겔의 탄성 및 점성의 측정 결과는 표 5 내지 표 7과, 도 6 내지 도 11에 나타내었다.
[표 5]
온도 및 보관기간에 따른 탄성 결과
Figure 112019126229848-pat00005
[표 6]
온도 및 보관기간에 따른 점성 결과
Figure 112019126229848-pat00006
[표 7]
8개월 후 점탄성 감소율
Figure 112019126229848-pat00007
표 5에서 탄성은 저장 탄성률(storage modulus, G', Pa at 2.5 Hz)을 의미하며, 표 6에서 점성은 손실 탄성률(loss modulus, G", Pa at 2.5 Hz)을 의미한다. 표 7은 실시예 12 및 13 또는 비교제품에 따른 수화 겔을 각각 25℃, 30℃, 40℃, 60℃에서 8개월 동안 보관 후 측정한 탄성감소율 및 점성감소율을 나타낸다.
상기 표 5 및 표 6과, 도 6 내지 도 11에서와 같이, 실시예 12 및 13에 따른 수화 겔은 비교 제품(Synvisc-one®) 대비 동등이상의 안정성을 보였다. 또한, 실시예 12 및 13 또는 비교제품에 따른 수화 겔에서 보관조건의 온도가 높을수록 점탄성이 감소하는 경향을 보였으며, 점성보다 탄성의 저하율이 높았다.
실시예 14
실시예 14-1
1% NaOH 수용액에 에탄올을 6:4비율로 첨가하고, 여기에 히알루론산 나트륨(Na-HA, 분자량: 1.0~4.0 MDa)을 첨가하여 혼합물의 농도가 2.5%(w/v)가 되도록 혼합하였다. 여기에 BDDE을 첨가하여 반응물을 제조하였다. 이 때, BDDE와 히알루론산 나트륨(Na-HA)의 비율은 100 μl(BDDE)/1 g(HA)이었다.
상기 반응물을 30℃에서 170 rpm의 속도로 교반하여 5시간 동안 가교 반응 시켰다. 여기에 반응물과 에탄올의 부피비가 1:5가 될 때까지 100 mL/min 이하 속도로 에탄올을 투입하였다. 히알루론산 나트륨(Na-HA)이 분말 상태로 석출된 후 침전된 상태로 16시간 더 가교 반응 시켰다. 이 가교 반응 후, 1.2M HCl 용액을 투입하여 pH를 조정(pH 8이하)하여 반응을 종료시키고, 에탄올로 수회 세척하였다.
세척 후, 건조감량 10%이하로 건조시켜 분말형태의 히알루론산 가교물을 얻었다. PBS (Phosphate buffered saline)에 상기 히알루론산 가교물을 10 mg/mL이 되도록 첨가하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 수화 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 겔 대해서, 121℃에서 21분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 14-2
BDDE을 히알루론산 나트륨(Na-HA)과 비율 120 μl(BDDE)/1 g(HA)로 첨가하여 반응물을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 14-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시예 14-2
BDDE을 히알루론산 나트륨(Na-HA)과 비율 140 μl(BDDE)/1 g(HA)로 첨가하여 반응물을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 14-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시예 15
실시예 15-1
1% NaOH 수용액에 에탄올을 6:4비율로 첨가하고, 여기에 히알루론산 나트륨(Na-HA, 분자량: 1.0~4.0 MDa)을 첨가하여 혼합물의 농도가 2.5%(w/v)가 되도록 혼합하였다. 여기에 BDDE을 첨가하여 반응물을 제조하였다. 이 때, BDDE와 히알루론산 나트륨(Na-HA)의 비율은 120 μl(BDDE)/1 g(HA)이었다.
상기 반응물을 25℃에서 170 rpm의 속도로 교반하여 5시간 동안 가교 반응 시켰다. 여기에 반응물과 에탄올의 부피비가 1:5가 될 때까지 100 mL/min 이하 속도로 에탄올을 투입하였다. 히알루론산 나트륨(Na-HA)이 분말 상태로 석출된 후 침전된 상태로 16시간 더 가교 반응 시켰다. 이 가교 반응 후, 1.2M HCl 용액을 투입하여 pH를 조정(pH 8이하)하여 반응을 종료시키고, 에탄올로 수회 세척하였다.
세척 후, 건조감량 10%이하로 건조시켜 분말형태의 히알루론산 가교물을 얻었다. PBS (Phosphate buffered saline)에 상기 히알루론산 가교물을 10 mg/mL이 되도록 첨가하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 수화 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 겔 대해서, 121℃에서 21분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시 예 15-2
반응 온도를 30℃로 하여 반응물을 가교 반응 시킨 것을 제외하고는, 실시예 15-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시 예 15-3
반응 온도를 35℃로 하여 반응물을 가교 반응 시킨 것을 제외하고는, 실시예 15-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시 예 16
실시 예 16-1
1% NaOH 수용액에 에탄올을 6:4비율로 첨가하고, 여기에 히알루론산 나트륨(Na-HA, 분자량: 1.0~4.0 MDa)을 첨가하여 혼합물의 농도가 2.5%(w/v)가 되도록 혼합하였다. 여기에 BDDE을 첨가하여 반응물을 제조하였다. 이 때, BDDE와 히알루론산 나트륨(Na-HA)의 비율은 120 μl(BDDE)/1 g(HA)이었다.
상기 반응물을 30℃에서 50 rpm의 속도로 교반하여 5시간 동안 가교 반응 시켰다. 여기에 반응물과 에탄올의 부피비가 1:5가 될 때까지 100 mL/min 이하 속도로 에탄올을 투입하였다. 히알루론산 나트륨(Na-HA)이 분말 상태로 석출된 후 침전된 상태로 16시간 더 가교 반응 시켰다. 이 가교 반응 후, 1.2M HCl 용액을 투입하여 pH를 조정(pH 8이하)하여 반응을 종료시키고, 에탄올로 수회 세척하였다.
세척 후, 건조감량 10%이하로 건조시켜 분말형태의 히알루론산 가교물을 얻었다. PBS (Phosphate buffered saline)에 상기 히알루론산 가교물을 10 mg/mL이 되도록 첨가하여 수화 겔을 수득하였다. 상기 수화 겔을 균질기로 7000 rpm 이하에서 균질화하였다. 상기 균질화된 겔 대해서, 121℃에서 21분 이하로 멸균을 진행하여 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하였다.
실시예 16-2
반응물의 교반 속도를 130 rpm으로 한 것을 제외하고는, 실시예 16-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실시예 16-3
반응물의 교반 속도를 200 rpm으로 한 것을 제외하고는, 실시예 16-1과 동일한 방법으로 분말형태의 히알루론산 가교물을 제조하였다.
실험예 7: 히알루론산 가교물의 가교도 분석
히알루론산(HA)은 글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 반복 결합된 다당류(polysaccharide)이며, 히알루론산에 스트렙토마이세스 히알루로니다아제(Streptomyces hyaluronidase)을 처리하면 환원 말단(non-reducing end)에 4,5-불포화 글루코로노실 잔기(4,5-unsaturated glucuronosyl residue)을 갖는 올리고당(oligosaccharide)으로 분해되는 것으로 알려져 있다. 완전분해(complete digestion)된 미변형 HA는 테트라사카라이드(tetrasaccharide) (4량체, tetramer)와 헥사사카라이드(hexasaccharide)(6량체, hexamer)의 두 생성물로 되며, 옥타사카라이드(octasaccharide (8량체, octamer)는 효소분해의 최소크기 기질이다. 효소분해가 진행됨에 따라 작은 단위의 올리고당으로 HA가 분해되는데, BDDE 등의 가교제에 의해 변형된 HA는 효소에 의해 분해되어도 가교제가 결합된 올리고당(HA-BDDE-HA, HA-BDDE) 형태로 생성되므로, HPLC 분석 시 미변형 HA와 머무름 시간(retention time)에 차이가 발생한다.
따라서, 히알루론산에 가교제가 결합하여 변형된 정도를 가교변형률(Dgree of Modification, MoD)로 하며, 가교제의 양쪽에 히알루론산이 가교된 것(HA-BDDE-HA)을 교차결합 가교변형률 (Crosslink MoD), 가교제의 한쪽에 히알루론산이 가교된 것(HA-BDDE)을 펜던트 가교변형률 (pendant MoD)로 하였다.
히알루론산(HA)의 분해(digestion)에 사용된 히알루론산 분해효소(Streptomyces hyalurolyticus로부터 얻은 Hyaluronidase) Merck (Sigma Aldrich)社의 제품을 사용했다. HPLC 분석을 위한 칼럼은 Dionex CarboPac PA100 (Thermo Scientific 社)을 사용했다.
가교제에 의해 변형된 HA는 히알루론산 분해효소를 이용해 pH 5.0, 36℃ 조건에서 분해되었다. 분해된 HA는 HPLC 시스템을 이용해 4량체(Tetramer), 6량체(Hexamer), 그리고 그 이상의 올리고머(Oligomer)를 뚜렷하게 분리할 수 있었다. 232 nm에서 UV 흡광도를 통해 각 분리된 피크(peak)의 크기를 비교하였다. 히알루론산이 분해효소에 의해 완전분해되면 4량체와 6량체가 되며, 가교결합된 히알루론산은 4량체와 6량체보다 약간 큰 당량체, 그리고 그 이상의 올리고머 등으로 분리되어 크로마토그램을 나타낸다. 각 크로마토그램의 면적으로 변형률(MoD)을 구할 수 있으며, 8량체(Octamer) 이상의 올리고머의 peak는 교차결합 가교변형률(crosslink MoD)(%), 4량체(Tetramer)와 6량체(hexamer)의 main peak를 제외한 8량체보다 작은 올리고머의 peak는 펜던트 가교변형률(pendant MoD)(%)로 구분하였으며, 이 둘을 합하여 총 가교변형률(total MoD)(%)로 구하였다.
실시예 12에서 제조한 히알루론산 가교물, 비교제품으로 사용한 Synvisc-one®(Sanofi 社), 및 천연 히알루론산(HA)의 가교도를 분석하여 표 8에 나타내었다. 또한, 실시예 14-1~16-3에서 제조한 히알루론산 가교물의 가교도를 분석하여 표 9에 나타내었다.
[표 8]
Figure 112019126229848-pat00008
[표 9]
Figure 112019126229848-pat00009
상기 표 8에서와 같이, 실시예 12에서 제조한 히알루론산 가교물은 비교제품으로 사용한 Synvisc-one®와 유사한 점탄성을 보이고, 동등이상의 안정성을 보였다. 또한, 실시예 12에서 제조한 히알루론산 가교물은 천연 히알루론산(HA) 보다 펜던트 가교변형률(pendant MoD)(%), 교차결합 가교변형률(crosslink MoD)(%), 및 총 가교변형률(total MoD)(%)의 증가를 보였다. 또한, 실시예 12에서 제조한 히알루론산 가교물은 Synvisc-one®와 동등이상의 펜던트 MoD (%), 교차결합 MoD (%), 및 총 MoD (%)를 보였다.
상기 표 9에서와 같이, 가교 반응이 많이 일어날수록 가교변형률(Degree of　Modification, MoD)(%)의 증가를 보였다. 일반적으로 가교 반응은 가교제 투입량(BDDE:HA 몰비)이 높을수록 증가하며, 가교 반응이 증가할수록 가교변형률 (또는 변형도, 가교도)(MoD)(%)의 증가를 보였다. 예를 들어, 가교제(예컨대 BDDE) 농도를 달리하여 제조한 실시예 14-1~14-3에 따른 히알루론산 가교물의 가교도 분석 결과, 가교제 농도가 증가할수록 가교변형률(MoD)(%)의 증가를 보였다.
또한, 상기 표 9에서와 같이, 반응 온도를 달리하여 제조한 실시예 15-1~15-3에 따른 히알루론산 가교물의 가교도 분석 결과, 반응 온도가 증가할수록 가교변형률(MoD)(%)의 증가를 보였다. 한편, 가교 반응 시 교반 속도(BDDE 투입 후 5시간 이하)를 달리하여 제조한 실시예 16-1~16-3에 따른 히알루론산 가교물의 가교도 분석 결과, 교반 속도에 따른 가교변형률(MoD)(%) 차이는 크지 않았다.
일반적으로 가교변형률(MoD)(%) 값이 클수록 점탄성 즉, 저장 탄성률(storage modulus, G', Pa at 2.5 Hz)로 표현되는 탄성과 손실 탄성률(loss modulus, G", Pa at 2.5 Hz)로 표현되는 점성이 높게 나타나지만, 점탄성 값은 제형 등 다른 요인에도 영향을 받기 때문에 항상 일정한 경향을 나타내지는 않았다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (28)

  1. 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
    상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 4 내지 6시간 동안 가교 반응시키는 단계;
    상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계; 및
    히알루론산 입자를 포함하는 수용액을 6 내지 24시간 동안 가교 반응시키는 단계;를 포함하고,
    상기 수용액에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올은 20 mL/min 내지 1000 mL/min의 속도로 첨가되는 것이고,
    히알루론산 가교물은 D90이 80㎛ 이하의 입도 분포를 나타내는 것이고,
    상기 히알루론산 가교물의 수화 겔은 탄성이 30 내지 200 Pa이고 점성이 10 내지 100Pa인 것인,
    분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 에탄올을 첨가하는 동안 혼합액 전체부피에 대한 에탄올의 부피변화 속도는 0.5%(v/v) /min 내지 35%(v/v) /min인 것인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가교제를 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물 1 g에 대하여 10 μL 내지 500 μL의 양으로 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수용액과 수용액에 첨가되는 에탄올의 부피비는 1: 1 내지 10인 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    제조된 히알루론산 가교물을 에탄올 또는 에탄올을 포함하는 용액으로 세척하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제1항, 제3항 내지 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 분말 상의 히알루론산 가교물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 히알루론산 가교물은,
    D10이 2.5㎛ 내지 6㎛, D50이 8㎛ 내지 20㎛ 및 D90이 25 ㎛ 내지 80㎛의 입도분포를 나타내는 것인 분말 상의 히알루론산 가교물.
  11. 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
    상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 4 내지 6시간 동안 가교 반응시키는 단계;
    상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;
    상기 히알루론산 입자를 포함하는 수용액의 가교 반응을 6 내지 24시간 동안 지속시켜 분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 분말 상의 히알루론산 가교물을 수화시키는 단계를 포함하고,
    상기 수용액에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올은 20 mL/min 내지 1000 mL/min의 속도로 첨가되는 것이고,
    가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 240 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타내는 것이고,
    가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성이 30 내지 200 Pa이고 점성이 10 내지 100Pa인 것인,
    가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 수화시키는 단계는,
    상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 물 또는 물을 포함하는 용액에 첨가하는 것인 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 분말 상의 히알루론산 가교물은 물 또는 물을 포함하는 용액 1 mL에 대하여 5 mg 내지 15 mg으로 첨가되는 것인 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔을 필터를 사용하여 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 가교된 히알루론산 수화 겔의 제조방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서, 상기 가교된 히알루론산 수화 겔은
    D10이 25 ㎛ 내지 40 ㎛, D50이 70 ㎛ 내지 110 ㎛, D90이 190 ㎛ 내지 240 ㎛의 입도 분포를 나타내는 것인 가교된 히알루론산 수화 겔.
  18. 삭제
  19. 히알루론산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액을 제조하는 단계;
    상기 수용액에 가교제를 첨가하여 히알루론산을 4 내지 6시간 동안 가교 반응시키는 단계;
    상기 수용액에 에탄올을 첨가하여 히알루론산을 입자로 고체화하는 단계;
    상기 히알루론산 입자를 포함하는 수용액의 가교 반응을 6 내지 24시간 동안 지속시켜 분말 상의 히알루론산 가교물을 제조하는 단계;
    상기 분말 상의 히알루론산 가교물을 수화시켜 가교된 히알루론산 수화 겔을 수득하는 단계; 및
    상기 가교된 히알루론산 수화 겔을 여과하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 가교된 히알루론산 수화 겔로서,
    상기 수용액에 에탄올 첨가 시, 상기 에탄올은 20 mL/min 내지 1000 mL/min의 속도로 첨가되는 것이고,
    여과 단계 수행 후 수득된 가교된 히알루론산 수화 겔은 D90이 120 ㎛ 이하의 입도 분포를 나타내는 것이고,
    가교된 히알루론산 수화 겔은 탄성이 30 내지 200 Pa이고 점성이 10 내지 100Pa인 것인, 가교된 히알루론산 수화겔.
  20. 삭제
  21. 제19항에 있어서, 여과 단계 수행 후 수득된 가교된 히알루론산 수화 겔은 D10이 10 ㎛ 내지 30 ㎛, D50이 35 ㎛ 내지 65 ㎛, D90이 80 ㎛ 내지 120 ㎛의 입도 분포를 나타내는 것인 가교된 히알루론산 수화 겔.
  22. 삭제
  23. 제19항에 있어서, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE), 다이비닐설폰(DVS) 또는 이들의 혼합물인 것인 가교된 히알루론산 수화 겔.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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